本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵食品如發(fā)酵蕎麥等中提取的提取組合物。更詳細(xì)地，涉及一種至少包含乙酰膽堿和丙酰膽堿、口服給藥時(shí)顯示出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用的發(fā)酵食品提取組合物及其提取方法。本發(fā)明還涉及一種作為活性成分包含該提取組合物的食品或藥物組合物。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明人對(duì)發(fā)酵食品尤其是蕎麥發(fā)芽體榨汁的發(fā)酵物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵物的凍干粉末顯示出ACE抑制作用，該粉末組成的功能性食品或功能性飲料已有報(bào)告(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，進(jìn)一步地，該ACE抑制物質(zhì)的分餾方法及使用該方法分離的餾分也有報(bào)告(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。然后，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)具有更高功能性的蕎麥植物體粉碎物的乳酸發(fā)酵物(發(fā)酵蕎麥)，為了離析并純化該發(fā)酵蕎麥中包含的降血壓作用和血管擴(kuò)張作用活性成分，進(jìn)行反復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)了作為其活性成分包含一些新型肽的發(fā)酵蕎麥提取物，從而進(jìn)行了專(zhuān)利申請(qǐng)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。另一方面，迄今為止，已報(bào)告了各種關(guān)于具有血管擴(kuò)張作用的蕎麥來(lái)源化合物及含有這些的組合物(專(zhuān)利文獻(xiàn)4～7)。本發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)包含于發(fā)酵蕎麥中的降血壓作用和血管擴(kuò)張作用活性成分進(jìn)行深入研究，分餾了與上述專(zhuān)利文獻(xiàn)3的活性成分不同的血管擴(kuò)張作用成分。此外，對(duì)包含于該餾分中的成分進(jìn)行鑒定確認(rèn)后，發(fā)現(xiàn)至少包含乙酰膽堿和丙酰膽堿的將多種膽堿酯作為主體包含的烷基季銨化合物。膽堿酯中，已知乙酰膽堿是作為哺乳類(lèi)的神經(jīng)傳遞素在生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)。此外，1929年，從馬的脾臟中離析出與組胺不同的降血壓物質(zhì)，已化學(xué)鑒定其活性物質(zhì)為乙酰膽堿(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。人們很久開(kāi)始就知道動(dòng)物組織中存在這種乙酰膽堿。進(jìn)一步地，闡明了麥角的降血壓物質(zhì)為乙酰膽堿，并被確認(rèn)菌類(lèi)產(chǎn)生乙酰膽堿(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。乙酰膽堿包含于食用植物、食用菌類(lèi)、蜂王漿、牛乳等，乙酰膽堿還存在于枯草菌、酵母等；還報(bào)告了以生物化驗(yàn)確認(rèn)作為一種乳酸菌的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)產(chǎn)生乙酰膽堿(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3～7)。此外，還發(fā)現(xiàn)了乙酰膽堿的其他多種膽堿酯類(lèi)。1953年從牛的脾臟中發(fā)現(xiàn)了比乙酰基長(zhǎng)一個(gè)碳鏈的具有丙?；谋Ｄ憠A(非專(zhuān)利文獻(xiàn)8、9)。然后，已確認(rèn)在公牛精液中、歐洲小龍蝦、美國(guó)馬蹄蟹、歐洲鳥(niǎo)蛤、軟殼蛤、紫貽貝、無(wú)齒蚌、蘋(píng)果蝸牛中的血淋巴和平滑肌中、電魚(yú)的發(fā)電組織培養(yǎng)中、變?nèi)~木、綠豆、車(chē)前草、楊木、樺木中等中產(chǎn)生丙酰膽堿(非專(zhuān)利文獻(xiàn)10～13)。但是，迄今為止，沒(méi)有任何關(guān)于發(fā)酵食品中存在丙酰膽堿的報(bào)告或啟示。此外，1954年，從腦提取物中發(fā)現(xiàn)了丁酰膽堿(非專(zhuān)利文獻(xiàn)14)，表明了與乙酰膽堿、丙酰膽堿一起存在于節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物中(非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)。進(jìn)一步地，除了丙酰膽堿、丁酰膽堿之外，從軟體動(dòng)物中還確認(rèn)了一些膽堿酯類(lèi)。例如，從骨螺科的一種中確定了咪唑丙烯酰膽堿(ウロカノイルコリン)結(jié)構(gòu)，從瘤巖螺的一種中確定了β,β-二甲基丙烯酰膽堿(異戊烯酰膽堿)結(jié)構(gòu)，從蛾螺科的一種中確定了丙烯?；憠A結(jié)構(gòu)，從瘤巖螺的一種中確定咪唑丙酰膽堿結(jié)構(gòu)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)15～18)。然而，迄今為止，化學(xué)上還完全沒(méi)有證實(shí)發(fā)酵食品中存在膽堿酯類(lèi)，也沒(méi)有任何關(guān)于其提取、分餾方法的報(bào)告或啟示?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1：特開(kāi)2005-304355號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2：特開(kāi)2008-239498號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3：特開(kāi)2012-162503號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4：特開(kāi)2007-254410號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5：特開(kāi)2006-76903號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)6：特開(kāi)2006-76904號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)7：特開(kāi)平5-97798號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：DaleHH,DudleyHW.Thepresenceofhistamineandacetylcholineinthespleenoftheoxandthehorse.JPhysiol68:97-123,1929.非專(zhuān)利文獻(xiàn)2：EwinsAJ.Acetylcholine,anewactiveprincipleofergot.BiochemJ8:44-49,1914.非專(zhuān)利文獻(xiàn)3：桃木芳枝，植物中的乙酰膽堿，植物的化學(xué)調(diào)節(jié)，30(1)，49-61(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4：川島纮一郎，乙酰膽堿的根源和非神經(jīng)性乙酰膽堿，基礎(chǔ)老化研究，34(4)，12-24(2010)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5：筱田雅人等，關(guān)于蜂王漿中的血流增加因子，藥學(xué)雜志，98(2)，139-145(1978)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6：WhittakerVP.AcetylcholineinMilk.Nature181:856-857,1958.非專(zhuān)利文獻(xiàn)7：StephensonM,RowattE.TheproductionofacetylcholinebyastrainofLactobacillusplantarum.JGenMicrobiol1(3):279-298,1947.非專(zhuān)利文獻(xiàn)8：BanisterJ,WhittakerVP,WijesunderaS.Theoccurrenceofhomologuesofacetylcholineinoxspleen.JPhysiol121(1):55-71,1953.非專(zhuān)利文獻(xiàn)9：GardinerJE,WhittakerVP.Theidentificationofpropionylcholineasaconstituentofoxspleen.BiochemJ58(1):24-29,1954.非專(zhuān)利文獻(xiàn)10：BishopMR,SastryBV,StavinohaWB.Identificationofacetylcholineandpropionylcholineinbullspermatozoabyintegratedpyrolysis,gaschromatographyandmassspectrometry.BiochimBiophysActa500(2):440-444,1977.非專(zhuān)利文獻(xiàn)11：WolfgangW,JuttaN,DettmarW.Distributionofcholinestersandcholinesterasesinhaemolymphsandsmoothmusclesofmolluscs.CompBiochemPhysC61(1):121-131,1978.非專(zhuān)利文獻(xiàn)12：O'ReganS.Thesynthesis,storage,andreleaseofpropionylcholinebytheelectricorganofTorpedomarmorata.JNeurochem39(3):764-772,1982.非專(zhuān)利文獻(xiàn)13：MiuralGA,ShinTM.Identificationofproprionylcholineinhigherplants.PhysiolPlant62:341-343,1984.非專(zhuān)利文獻(xiàn)14：HoltzP,SchumannHJ.Butyrylcholineinbrainextracts.Naturwissenschaften41:306,1954.非專(zhuān)利文獻(xiàn)15：ErspamerV,BenatiO.Identificationofmurexineasβ-[imidazolyl-(4)]acrylcholine.Science117:161-162,1953.非專(zhuān)利文獻(xiàn)16：KeylMJ,MichaelsonIA,WhittakerVP.Physiologicallyactivecholineestersincertainmarinegastropodsandotherinvertebrates.JPhysiol139:434,1957.非專(zhuān)利文獻(xiàn)17：WhittakerVP.Acrylylcholine:anewnaturallyoccurringpharmacologicallyactivecholineesterfromBuccinumundatum.BiochemPharmacol1(4):342-346,1959.非專(zhuān)利文獻(xiàn)18：RoseghiniM.Occurrenceofdihydromurexine(imidazolepropionylcholine)inthehypobranchialglandofThais(purpura)haemastoma.Experientia27(9):1008-1009,1971.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供具有降血壓作用和血管擴(kuò)張作用且作為有效成分包含有用的新型發(fā)酵食品提取物、該提取物或包含于該提取物的活性成分的至少一部分的功能性健康食品或藥物組合物。本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行反復(fù)的深入研究，從而完成了本發(fā)明。即，對(duì)發(fā)酵食品，尤其是蕎麥植物體的乳酸發(fā)酵物(發(fā)酵蕎麥)中包含的成分進(jìn)行反復(fù)研究后，成功分離出發(fā)揮極顯著的降血壓作用和血管擴(kuò)張作用的活性成分，并且鑒定其中一些活性成分，從而完成了本發(fā)明。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及一種發(fā)酵食品提取組合物：[1]一種發(fā)酵食品提取組合物，其中，至少包含乙酰膽堿和丙酰膽堿，口服給藥時(shí)顯示出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用；[2]根據(jù)[1]所述的提取組合物，其中，發(fā)酵食品為選自發(fā)酵蕎麥、黑醋、酸奶、納豆以及日本清酒的組中的一種；[3]根據(jù)[2]所述的提取組合物，其中，發(fā)酵食品為發(fā)酵蕎麥；以及[4]根據(jù)[1]所述的提取組合物，其中，還包含選自丁酰膽堿、乳酰膽堿、乙酰丙酰膽堿、肉毒堿、甲基肉毒堿、三甲基甘氨酸(甜菜堿)、甲基甜菜堿、乙基甜菜堿、丙酰基甜菜堿以及磷酰膽堿的組中的至少一種。本發(fā)明還涉及一種食品或藥物組合物：[5]一種作為活性成分包含[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的提取組合物的食品或藥物組合物；[6]根據(jù)[5]所述的食品或藥物組合物，其中，作為活性成分還包含選自酪氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的組中的至少一種；以及[7]根據(jù)[5]或[6]所述的食品或藥物組合物，其中，還包含選自乳酸、乙酸以及檸檬酸的組中的至少一種。本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵食品提取組合物的制造方法：[8]一種根據(jù)[1]所述的發(fā)酵食品提取組合物的制造方法，其特征是，包括：(1)在丙酮中懸浮發(fā)酵蕎麥凍干物或濃縮物，搖動(dòng)攪拌后，對(duì)離心分離得到的上清液進(jìn)行減壓濃縮(工序1)；(2)使用由苯基鍵合的載體填充的固相萃取柱，作為洗脫液使用含酸水，對(duì)該減壓濃縮物進(jìn)行洗脫(工序2)；以及(3)使用由五氟苯基鍵合的載體填充的柱(PFP柱)，作為流動(dòng)相使用含酸性甲醇水，對(duì)該洗脫物進(jìn)行分餾、純化(工序3)；以及[9]根據(jù)[8]所述的制造方法，其特征是，(1)工序2中，作為固相萃取柱使用固相萃取柱(GLScienceInertSep)(注冊(cè)商標(biāo))，作為洗脫液使用含0.01％甲酸的水；(2)工序3中，作為反相柱使用PFP柱(YMC-TriartPFP)，作為流動(dòng)相使用含0.01％甲酸-33％甲醇的水。本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵食品提取組合物：[10]一種發(fā)酵食品提取組合物，其特征是，所述發(fā)酵食品提取組合物利用[8]或[9]所述的制造方法進(jìn)行制造，至少包含乙酰膽堿和丙酰膽堿，口服給藥時(shí)顯示出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用。發(fā)明效果本發(fā)明的新型的發(fā)酵食品提取物具有顯著的降血壓作用和血管擴(kuò)張作用，可用作功能性健康食品或藥物組合物的有效成分。附圖說(shuō)明圖1是示出使用PFP柱的發(fā)酵蕎麥固相萃取物的成分分離條件檢測(cè)試驗(yàn)中，甲醇含量變化帶來(lái)的乙酰膽堿的洗脫行為變化的檢測(cè)峰的圖；圖2是示出使用PFP柱的發(fā)酵蕎麥固相萃取物的成分分離條件檢測(cè)試驗(yàn)中，酸含量變化帶來(lái)的乙酰膽堿的洗脫行為變化的檢測(cè)峰的圖；圖3是示出同樣的發(fā)酵蕎麥固相萃取物的成分分離條件檢測(cè)試驗(yàn)中，酸含量(0.01％)固定條件下甲醇含量變化帶來(lái)的發(fā)酵蕎麥純化物中乙酰膽堿的洗脫行為的檢測(cè)峰的圖；圖4是示出同樣的發(fā)酵蕎麥固相萃取物的成分分離條件檢測(cè)試驗(yàn)中，酸含量(0.01％)固定條件下，進(jìn)一步細(xì)微變動(dòng)甲醇含量(38％、36％、33％)時(shí)，酸含量(0.01％)固定條件下甲醇含量變化帶來(lái)的發(fā)酵蕎麥純化物中乙酰膽堿的洗脫行為的檢測(cè)峰的圖；圖5是示出同樣的發(fā)酵蕎麥固相萃取物的成分分離條件檢測(cè)試驗(yàn)中，在含0.01％甲酸-33％甲醇的水中設(shè)置30℃和40℃的分離溫度檢測(cè)分離時(shí)，分離溫度帶來(lái)的發(fā)酵蕎麥純化物中乙酰膽堿的洗脫行為的圖；圖6是示出鑒定膽堿化合物的血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果的圖表；圖7是示出鑒定膽堿化合物給藥后的收縮壓變化的圖表；圖8-1是凝膠過(guò)濾物的LC-MS分析試驗(yàn)中乳酰膽堿的質(zhì)譜圖；圖8-2是凝膠過(guò)濾物的LC-MS/MS分析試驗(yàn)中乳酰膽堿的質(zhì)譜圖；圖9-1是同樣的凝膠過(guò)濾物的LC-MS分析試驗(yàn)中乙酰丙酰膽堿的質(zhì)譜圖；圖9-2是同樣的凝膠過(guò)濾物的LC-MS/MS分析試驗(yàn)中乙酰丙酰膽堿的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式乳酸發(fā)酵蕎麥植物體所得的“發(fā)酵蕎麥”對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有優(yōu)異的降血壓作用。本發(fā)明人對(duì)該發(fā)酵蕎麥中的降血壓物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一些包含新型的肽的發(fā)酵蕎麥提取物，進(jìn)行了專(zhuān)利申請(qǐng)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。本發(fā)明人對(duì)發(fā)酵蕎麥中的血管擴(kuò)張成分進(jìn)行進(jìn)一步研究，開(kāi)發(fā)了新的分餾、純化方法，并成功分餾、純化該發(fā)酵蕎麥中的血管擴(kuò)張成分。本發(fā)明的分餾、純化中使用的發(fā)酵蕎麥?zhǔn)莗H3.6酸性，對(duì)12周齡的雄性SHR的胸部大動(dòng)脈血管標(biāo)本，從0.5μg/mL顯示出血管擴(kuò)張作用，EC50是8.30μg/mL。該發(fā)酵蕎麥中添加氫氧化鈉溶液，以pH12在室溫中放置時(shí)，則0.5小時(shí)中失去了血管擴(kuò)張活性。此外，調(diào)查了發(fā)酵蕎麥凍干物的有機(jī)溶劑提取物的血管擴(kuò)張作用，其結(jié)果是乙酸乙酯提取物中沒(méi)有血管擴(kuò)張作用，乙醇和丙酮提取物中有活性，丙酮提取物的血管擴(kuò)張作用最強(qiáng)。從以上結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分需要在酸性或中性條件下純化或給藥，在丙酮中可有效提取。接著，通過(guò)色譜分析法檢測(cè)血管擴(kuò)張成分的純化條件。首先，以凝膠過(guò)濾色譜分析純化發(fā)酵蕎麥凍干物的丙酮粗提取物并比較了活性。其結(jié)果是從洗脫時(shí)間判斷包含較低分子量的餾分中發(fā)現(xiàn)了血管擴(kuò)張作用。由于發(fā)酵蕎麥的血管擴(kuò)張成分在堿性中失去活性，因此研究了在酸性條件下操作的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中的純化。其結(jié)果，在強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理中的鹽酸洗脫餾分中發(fā)現(xiàn)了比較強(qiáng)的血管擴(kuò)張作用。推測(cè)之所以出現(xiàn)這一結(jié)果是由于發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分具有正電荷，因此與樹(shù)脂上具有負(fù)電荷的交換基團(tuán)亞磺酸基相互作用。但是，對(duì)于血管擴(kuò)張成分對(duì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附較強(qiáng)，為了回收足夠的血管擴(kuò)張成分反復(fù)進(jìn)行鹽酸洗脫操作而產(chǎn)生大量的洗脫液，而從大量的洗脫液中去除鹽酸和溶劑的操作非常繁雜。因此想到利用血管擴(kuò)張成分的正電荷與具有π電子的苯基之間的陽(yáng)離子-π相互作用，進(jìn)行有效分離，使用苯基鍵合載體進(jìn)行固相萃取后，能夠分離僅濃縮血管擴(kuò)張成分的餾分。認(rèn)為這是由于與血管擴(kuò)張成分共存的其他化合物相比形成了特別強(qiáng)的陽(yáng)離子-π相互作用，在研究了使用具有更強(qiáng)陽(yáng)離子-π相互作用的由五氟苯基鍵合的載體填充的柱(PFP柱)的HPLC分離條件后，能夠進(jìn)一步濃縮、分離血管擴(kuò)張成分?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，確立了如下所示本發(fā)明的發(fā)酵食品提取物的制造方法。即，例如，通過(guò)(工序1)，在丙酮中懸浮發(fā)酵蕎麥凍干物或濃縮物，搖動(dòng)攪拌后，對(duì)離心分離得到的上清液進(jìn)行減壓濃縮；(工序2)，使用由苯基鍵合的載體填充的固相萃取柱，作為洗脫液使用含酸水，對(duì)該減壓濃縮物進(jìn)行洗脫；接著，(工序3)，使用由五氟苯基鍵合的載體填充的柱(PFP柱)，作為流動(dòng)相使用含酸性甲醇水，對(duì)該洗脫物進(jìn)行分餾、純化，從而制造出口服給藥時(shí)表現(xiàn)出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用的發(fā)酵食品提取組合物。本發(fā)明的制造方法中使用的發(fā)酵蕎麥，可通過(guò)特開(kāi)2012-162503號(hào)公報(bào)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)記載的制造方法制造。具體地，將培養(yǎng)床和去除種殼的蕎麥芽浸漬在100ppm的次氯酸鈉中，進(jìn)行10分鐘殺菌后，切割、粉碎，然后將該粉碎物放入密封容器中，每1.0kg粉碎物添加25mL的乳酸菌發(fā)酵劑(植物乳桿菌)，置換氮?dú)夂?，室溫中靜置6天使其發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾或離心分離，得到紅褐色液體的發(fā)酵蕎麥，凍干或減壓濃縮該發(fā)酵蕎麥，可得到發(fā)酵蕎麥的凍干物或減壓濃縮物。作為工序2中使用的固相萃取柱，可列舉例如固相萃取柱(HyperSepPhenylSPEColumns，ShimadzuSTRATAPhenyl，AgilentBondElutPH)等，最優(yōu)選固相萃取柱(GLScienceInertSep)(注冊(cè)商標(biāo))。此外，作為洗脫液使用的含酸水，可列舉含鹽酸水、含乙酸水、含三氟乙酸(TFA)水、含磷酸水等，優(yōu)選含甲酸水，最優(yōu)選含0.01％甲酸的水。作為工序3中使用的反相柱，可列舉例如苯基柱(ImtaktUnisonUK-Phenyl,GLScienceInertSustainPhenyl,GLScienceInertsilPh-3,COSMOSIL5PFPPackedColumn)等，最優(yōu)選PFP柱(YMC-TriartPFP)。此外，作為流動(dòng)相使用的含酸性甲醇水，可列舉含鹽酸、甲醇的水、含乙酸、甲醇的水、含TFA、甲醇的水、含磷酸、甲醇的水等，優(yōu)選含甲酸、甲醇的水，最優(yōu)選含0.01％甲酸-33％甲醇的水。通過(guò)上述分餾、純化方法，分餾了發(fā)酵蕎麥的血管擴(kuò)張作用成分，可離析更佳純度的乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿，通過(guò)NMR和質(zhì)譜確定了結(jié)構(gòu)。此外，使用PFP柱的LC-MS/MS分析中，除這三種膽堿酯外，還確定了乳酰膽堿、乙酰丙酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯、乙基酯以及丙?；ズ土柞Ｄ憠A。本研究結(jié)果中第一次將乳酰膽堿確認(rèn)為天然物，并且迄今為止沒(méi)有任何關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的分餾、純化方法離析的乙酰丙酰膽堿的報(bào)告或啟示。使用通過(guò)本發(fā)明的分餾、純化方法離析、純化的乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的鹽酸鹽，對(duì)SHR的胸部大動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行了血管等長(zhǎng)張力試驗(yàn)以及SHR單劑量口服給藥試驗(yàn)。在血管等長(zhǎng)張力試驗(yàn)中，乙酰膽堿從10-9M開(kāi)始顯示出血管擴(kuò)張作用，10-6M中最大擴(kuò)張率為89.9％，EC50為2.72×10-8M。丙酰膽堿從10-7M開(kāi)始顯示出擴(kuò)張反應(yīng)，10-4M中最大擴(kuò)張率為95.2％，EC50為2.27×10-6M。丁酰膽堿在10-4M添加中顯示出7.14％的擴(kuò)張較弱的血管擴(kuò)張作用。單劑量口服給藥試驗(yàn)中，考慮發(fā)酵蕎麥的單劑量試驗(yàn)結(jié)果和含量，在口服給藥10-11mol/kg中進(jìn)行了試驗(yàn)。其結(jié)果是乙酰膽堿給藥組和丙酰膽堿給藥組中，給藥9個(gè)小時(shí)后，與對(duì)照組進(jìn)行比較，引起顯著的降血壓作用。本結(jié)果推翻了以往公認(rèn)的口服給藥乙酰膽堿時(shí)不會(huì)引起生理活性的理論。此外，迄今為止沒(méi)有任何關(guān)于口服給藥丙酰膽堿時(shí)引起生理活性這一研究結(jié)果的報(bào)告或啟示。從發(fā)酵蕎麥中混合其他烷基季銨化合物(丁酰膽堿、乳酰膽堿、乙酰丙酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯和乙酯以及丙?；?引起優(yōu)異的血管擴(kuò)張作用、降血壓作用的推測(cè)中，認(rèn)為即使單獨(dú)時(shí)的血管擴(kuò)張作用、降血壓作用較弱，但是這些化合物協(xié)同乙酰膽堿或丙酰膽堿有助于起到降血壓作用。此外，認(rèn)為發(fā)酵蕎麥包含的有機(jī)酸類(lèi)(乳酸、乙酸、檸檬酸)，使溶液保持酸性，從而使乙酰膽堿或丙酰膽堿等膽堿酯穩(wěn)定，有助于提高口服給藥時(shí)的效果，已知的降血壓成分氨基酸類(lèi)(酪氨酸、GABA)等也協(xié)同乙酰膽堿和丙酰膽堿有助于起到降血壓作用。關(guān)于本發(fā)明的發(fā)酵食品原料，只要是植物來(lái)源的莖葉、種子(谷類(lèi)、豆類(lèi))等、動(dòng)物來(lái)源的乳等可食用品，就不做特別限定。此外，關(guān)于本發(fā)明的發(fā)酵食品的發(fā)酵中使用的菌，只要不是病原性的，就都可以，對(duì)此不做特別限定。本發(fā)明人對(duì)發(fā)酵蕎麥以外的發(fā)酵食品進(jìn)行同樣的分餾、純化，并進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在酸奶、黑醋、納豆、日本清酒中包含乙酰膽堿、丙酰膽堿、乳酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿、三甲基甘氨酸及其甲基酯以及乙基酯。特別是可確認(rèn)上述發(fā)酵食品中顯示出丙酰膽堿具有較高的含量。本研究結(jié)果是迄今為止沒(méi)有任何報(bào)告或啟示的新研究結(jié)果。其他還發(fā)現(xiàn)黑醋中包括丁酰膽堿、乳酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯和乙基酯；酸奶中包括乳酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯、乙基酯以及丙?；?；納豆中包括丁酰膽堿、乳酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯、乙基酯以及丙?；ィ蝗毡厩寰浦邪ǘ□Ｄ憠A、乳酰膽堿、磷酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯以及乙基酯。從上述事項(xiàng)中可以推測(cè)，至少在上述的酸奶、黑醋、納豆、日本清酒等發(fā)酵食品中，通過(guò)本發(fā)明的發(fā)酵蕎麥提取組合物的制造方法進(jìn)行活性成分的分餾、純化，從而能夠得到顯示出與發(fā)酵蕎麥提取組合物相同活性的提取組合物。本發(fā)明的提取組合物可用作各種功能性健康食品或藥物組合物的有效成分。作為食品時(shí)，可與適當(dāng)?shù)氖称诽砑游锝Y(jié)合作為食品用組合物使用。此外，不限于這種食品用組合物，還可以與綠茶、紅茶、烏龍茶、粗糧茶等混合作為飲料，或與餅干、面包、糖果等混合作為食品，以日?？蓴z取的形態(tài)提供。此外，還可以按照下述藥物制劑以適當(dāng)?shù)膭┬彤?dāng)作所謂保健品使用。作為藥物時(shí)，與適當(dāng)?shù)乃幬锾砑觿┙Y(jié)合，可以按照通常的制劑方法以各種劑型使用。這種劑型可列舉口服劑，例如散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、片劑等固體制劑，以及水劑，懸浮劑，乳劑等液體制劑。作為食品使用本發(fā)明的提取物時(shí)，不僅作為一般性食品使用，還可以作為可發(fā)揮特定功能促進(jìn)健康的功能性健康食品使用。此時(shí)的具體形態(tài)可列舉作為有效成分包含本發(fā)明組合物的由膠囊劑、片劑、粉末劑、顆粒劑等組成的保健品類(lèi)；面包、蛋糕、餅干等焙烤食品類(lèi)；醬汁、湯、調(diào)味品、蛋黃醬等調(diào)味料類(lèi)；牛奶、酸奶、奶油等乳制品類(lèi)；巧克力、糖等糖果類(lèi)；或者綠茶、紅茶、烏龍茶、麥茶、粗糧茶、果汁、蔬菜、乳飲料、清涼飲料以及碳酸飲料等各種飲料類(lèi)等。作為藥物組合物的有效成分使用本發(fā)明的提取組合物時(shí)的給藥量根據(jù)各成分的比例而不同，并且，根據(jù)患者年齡、體重、性別、癥狀、給藥方式等各種要因而不同，但成人在每日口服給藥時(shí)，可在約0.1mg～100g范圍內(nèi)選擇，非口服給藥時(shí)，可在約0.1mg～1000mg范圍內(nèi)選擇。并且根據(jù)癥狀的改善程度，可適當(dāng)增減。給藥次數(shù)可分為1日1次～幾次。作為食品使用本發(fā)明的提取組合物時(shí)的攝取量，可按照上述藥物的口服給藥時(shí)的情況選擇。但是，不同于藥物的情況，飲食物的情況時(shí)由于不能特別限定劑量和次數(shù)，因此只要不出現(xiàn)特別嚴(yán)重的癥狀就不局限于上述范圍，以健康為目的，同時(shí)考慮美味性、適口性，可選擇攝取量。實(shí)施例下面，結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是本發(fā)明并不局限于下述的例子。實(shí)施例1發(fā)酵蕎麥的制造根據(jù)特開(kāi)2012-162503號(hào)公報(bào)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)中記載的制造方法制造了發(fā)酵蕎麥。從沙拉科斯莫(SaladCosmo)有限公司購(gòu)買(mǎi)了播種后培養(yǎng)約10天而收獲的蕎麥芽。將培養(yǎng)床和去除種殼的蕎麥芽(10kg)浸漬在100ppm的次氯酸鈉(20L)中，進(jìn)行10分鐘殺菌后，以2.0cm左右的長(zhǎng)度切割，并弄碎。將粉碎物放入密封容器(10L)中，每1.0kg粉碎物添加25mL的乳酸菌發(fā)酵劑(植物乳桿菌)，置換氮?dú)夂螅覝刂徐o置6天使其發(fā)酵，對(duì)該發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾或離心分離，得到了紅褐色液體的發(fā)酵蕎麥(6.8kg)。然后通過(guò)常用方法，對(duì)所得發(fā)酵蕎麥進(jìn)行凍干或真空壓縮得到發(fā)酵蕎麥的凍干物或減壓濃縮物，并將其用于血管擴(kuò)張成分的離析純化。實(shí)施例2發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的分餾[試驗(yàn)例1]血管擴(kuò)張成分的純化條件研究首先，使用從2kg的發(fā)酵蕎麥得到的凍干物，明確發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行純化條件研究。對(duì)發(fā)酵蕎麥(2kg)進(jìn)行離心分離(3220g，30min，4℃)后，去除殘余物，得到上清液，對(duì)該上清液進(jìn)行凍干處理，得到深紅色的吸濕性的發(fā)酵蕎麥凍干物(產(chǎn)率2.05％)。各條件研究中，通過(guò)各純化階段中的血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)，確定顯示出血管擴(kuò)張作用的餾分，從而確認(rèn)了活性成分的濃縮。pH穩(wěn)定性試驗(yàn)本條件檢測(cè)中使用的發(fā)酵蕎麥(液體)為pH3.6的酸性，對(duì)12周齡的雄性SHR的胸部大動(dòng)脈血管標(biāo)本，從0.5μg/mL顯示出血管擴(kuò)張作用，EC50是8.30μg/mL。為了試驗(yàn)發(fā)酵蕎麥的pH穩(wěn)定性，將發(fā)酵蕎麥凍干物(10mg)溶解于凈化水中，添加1N氫氧化鈉，調(diào)整至pH7.0、pH9.0、pH12.0后，添加凈化水直至1mL。將溶解于凈化水(1mL)中的發(fā)酵蕎麥凍干物(10mg)用作對(duì)照試樣(pH4.0)。在室溫中放置0.5、1、3、6、12、24小時(shí)后，在血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中，確認(rèn)了發(fā)酵蕎麥濃度50μg/mL中的各溶液的血管擴(kuò)張作用。其結(jié)果是對(duì)照試樣在pH7.0中經(jīng)過(guò)24小時(shí)后還維持血管擴(kuò)張作用，但是在pH9.0中經(jīng)過(guò)6小時(shí)后，其血管擴(kuò)張作用已消失，在pH12.0中經(jīng)過(guò)0.5小時(shí)后，其血管擴(kuò)張作用已消失。有機(jī)溶劑提取試驗(yàn)將發(fā)酵蕎麥凍干物(100mg)分別懸浮于1mL的乙醇、丙酮、乙酸乙酯中，使用振蕩培養(yǎng)箱(1811g，6小時(shí)，室溫)搖晃后，離心分離(3220g，30min，4℃)，得到上清液和沉淀物。將沉淀物再次懸浮于各有機(jī)溶劑中，同樣進(jìn)行離心分離，得到上清液和沉淀物。合并上清液進(jìn)行減壓濃縮后，用真空泵完全去除溶劑。各有機(jī)溶劑提取物產(chǎn)量為乙醇提取物975μg(0.98％)，丙酮提取物512μg(0.51％)，乙酸乙酯提取物210μg(0.21％)。血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中，確認(rèn)了各提取物濃度50μg/mL中的各溶液的血管擴(kuò)張作用。其結(jié)果是乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物的血管擴(kuò)張率分別是22％、49％、0％。凝膠過(guò)濾色譜分析法將發(fā)酵蕎麥凍干物(1.25g)溶解于純水(10mL)中，注入到填充截留分子量為700～1500的交聯(lián)葡聚糖凝膠G-15(SephadexG-15)(30g)的空心柱(4.2cm×50cm)。除掉空隙體積300mL后，每次取出50mL，進(jìn)行凝膠過(guò)濾得到餾分1～8。凍干每次取出的各餾分，凍干物供血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)使用。通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜分析法分餾之時(shí)的各餾分的產(chǎn)量和產(chǎn)率如表1所示。[表1]表1凝膠過(guò)濾餾分產(chǎn)量餾分12345678合計(jì)產(chǎn)量(mg)77.2109.0160.1238.0192.9136.1116.236.21103.3產(chǎn)率(％)6.28.712.819.015.410.99.32.988.3血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中確認(rèn)了各餾分25μg/mL中的血管擴(kuò)張作用，其結(jié)果是凝膠過(guò)濾餾分3、4中發(fā)現(xiàn)血管擴(kuò)張作用。通過(guò)累計(jì)添加檢查凝膠過(guò)濾餾分3～5的血管擴(kuò)張作用，其結(jié)果是凝膠過(guò)濾餾分3在添加1.0ng/mL中顯示出4.80％的擴(kuò)張率，觀察到依賴于劑量的血管擴(kuò)張反應(yīng)，最大擴(kuò)張率為添加5.0μg/mL時(shí)的61.9％。凝膠過(guò)濾餾分4在添加1.0ng/mL的中顯示出2.74％的擴(kuò)張率，最大擴(kuò)張率為添加5.0μg/mL時(shí)的71.2％。凝膠過(guò)濾餾分3和4中，在發(fā)酵蕎麥的1/500的低濃度中開(kāi)始了血管擴(kuò)張，由此知曉包括具有很強(qiáng)血管擴(kuò)張作用的物質(zhì)。另一方面，凝膠過(guò)濾餾分5中觀察到依賴于劑量的血管收縮反應(yīng)，發(fā)酵蕎麥中不僅包括血管擴(kuò)張成分還包括血管收縮成分。認(rèn)為通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜分析法去除了包含于凝膠過(guò)濾餾分5中的血管收縮成分，且血管擴(kuò)張物質(zhì)被濃縮。離子交換處理強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理將發(fā)酵蕎麥凍干物(2000mg)溶解于純水(5mL)中，用1N氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整至pH7，然后離心分離(3220g，4℃，20分鐘)，回收上清液，用量筒稀釋至10mL。將該上清液(2.5mL)加入到質(zhì)子型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(AmberLightIR120B，5mL)和純水(2mL)的懸浮液中，緩慢攪拌的同時(shí)，在室溫中處理2小時(shí)后，過(guò)濾分離了處理溶液和樹(shù)脂。將樹(shù)脂用純水(15mL)清洗2次，并與處理溶液合并。清洗后的樹(shù)脂中加入2N鹽酸(HCl)(30mL)緩慢攪拌的同時(shí)，在室溫中處理30分鐘，洗脫吸附成分，過(guò)濾分離了鹽酸洗脫液和樹(shù)脂。進(jìn)一步地，對(duì)所得處理溶液反復(fù)進(jìn)行2次使用離子交換樹(shù)脂處理的操作，并混合各操作中得到的所有洗脫液。將處理溶液(99mL)和鹽酸洗脫液(90mL)分別用量筒稀釋至300mL后，稀釋4倍，在血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中確認(rèn)了血管擴(kuò)張作用。其結(jié)果是鹽酸洗脫餾分中發(fā)現(xiàn)血管擴(kuò)張作用，添加100μL鹽酸洗脫餾分時(shí)為56.0％。假設(shè)發(fā)酵蕎麥中的所有血管擴(kuò)張成分被吸附到離子交換樹(shù)脂中，此時(shí)的發(fā)酵蕎麥濃度相當(dāng)于10μg/mL。在處理溶液中未發(fā)現(xiàn)血管擴(kuò)張作用。弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理將發(fā)酵蕎麥凍干物(2000mg)溶解于純水(5mL)中，用1N氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整至pH7，然后離心分離(3220g，4℃，20分鐘)，回收上清液，用量筒稀釋至10mL。將該上清液(2.5mL)加入到鈉型弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(AmberLightIRC76，5mL)和純水(2mL)的懸浮液中，緩慢攪拌的同時(shí)，在室溫中處理2小時(shí)后，過(guò)濾分離了處理溶液和樹(shù)脂。將樹(shù)脂用純水(15mL)清洗2次，并與處理溶液合并。清洗后的樹(shù)脂中加入2N鹽酸(HCl)(30mL)緩慢攪拌的同時(shí)，在室溫中處理30分鐘，洗脫吸附成分，過(guò)濾分離了鹽酸洗脫液和樹(shù)脂。進(jìn)一步地，對(duì)所得處理溶液反復(fù)進(jìn)行2次使用離子交換樹(shù)脂處理的操作，并混合各操作中得到的所有洗脫液。將處理溶液(94mL)和鹽酸洗脫液(90mL)分別用量筒稀釋至300mL后，稀釋4倍，在血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中確認(rèn)了血管擴(kuò)張作用。其結(jié)果是處理溶液和鹽酸洗脫餾分中都發(fā)現(xiàn)了血管擴(kuò)張作用，添加100μL處理溶液時(shí)血管擴(kuò)張率為7.3％，添加100μL鹽酸洗脫餾分時(shí)為23.3％。認(rèn)為弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的吸附不充分。固相萃取用甲醇(30mL)活化固相萃取柱(GLScienceInertSepPH，5g)(注冊(cè)商標(biāo))，用含0.01％甲酸的水(30mL)清洗并用純水(30mL)平衡后，將發(fā)酵蕎麥丙酮提取物(1.0g)溶解于純水(2.5mL)中應(yīng)用，用純水(30mL)和含0.01％甲酸的水(30mL)進(jìn)行洗脫。對(duì)純水洗脫餾分和含0.01％甲酸水洗脫餾分進(jìn)行凍干，在血管等長(zhǎng)張力測(cè)定試驗(yàn)中確認(rèn)了血管擴(kuò)張作用。其結(jié)果是含0.01％甲酸水洗脫分餾中發(fā)現(xiàn)血管擴(kuò)張作用，0.5μg/mL時(shí)血管擴(kuò)張率為35.6％。在純水洗脫餾分中未發(fā)現(xiàn)血管擴(kuò)張作用。HPLC分離條件使用五氟苯基鍵合的反相柱(YMC-TriartPFP，5μm，4.6mm×250mm)研究發(fā)酵蕎麥固相萃取物(1mg/mL)中的血管擴(kuò)張成分分離條件。首先，使用候選血管擴(kuò)張成分乙酰膽堿標(biāo)本，改變洗脫液的甲醇含量和酸含量進(jìn)行了條件研究。即，注入60μL乙酰膽堿標(biāo)本(0.1mg/mL)，流速0.5mL/min，分離溫度30℃中，在洗脫液中使用含0％、5％、15％、30％、50％、60％甲醇的水以及含0.002％、0.004％、0.006％、0.008％、0.01％、0.015％甲酸的50％甲醇，檢查乙酰膽堿的洗脫行為變化。其結(jié)果是隨著甲醇含量的增加，乙酰膽堿的洗脫時(shí)間變快，同時(shí)峰形態(tài)為良好。此外，甲酸含量不太影響乙酰膽堿的保持時(shí)間，但是酸含量越多，由于干擾提升，檢測(cè)峰變小。從以上結(jié)果中可知，含0.01％甲酸-50％甲醇的水最適用于乙酰膽堿的分析。伴隨甲醇含量的變化的乙酰膽堿的洗脫行為變化如圖1所示，伴隨酸含量變化的乙酰膽堿的洗脫行為變化如圖2所示。接著，研究了發(fā)酵蕎麥固相萃取物的分離條件?；谝阴Ｄ憠A分析條件中的結(jié)果，改變甲酸含量為0.01％，甲醇含量為25％、30％、35％、40％、45％、50％，進(jìn)行HPLC分析。其結(jié)果是甲醇含量35％中的分離為良好。酸含量(0.01％)固定條件下，伴隨甲醇含量變化的發(fā)酵蕎麥純化物的行為如圖3所示。進(jìn)一步地，稍微改變了甲醇含量(38％、36％、33％)，色譜分析后半部的分離為33％甲醇時(shí)最佳。酸含量(0.01％)固定條件下，伴隨甲醇含量變化的發(fā)酵蕎麥純化物的行為如圖4所示。最后，含0.01％甲酸-33％甲醇的水中，設(shè)定30℃和40℃分離溫度檢查了分離，發(fā)現(xiàn)40℃時(shí)的分離更好。伴隨分離溫度變化的色譜變化如圖5所示。從以上結(jié)果中，確定了最佳分離條件如下：柱：YMC-Triart(注冊(cè)商標(biāo))PFP，5μm，4.6mm×250mm注入量：發(fā)酵蕎麥固相萃取物(0.1mg/mL)60μL流動(dòng)相：含0.01％甲酸-33％甲醇的水(等度)流速：0.5mL/min溫度：40℃實(shí)施例3發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的純化減壓濃縮發(fā)酵蕎麥100kg，通過(guò)丙酮提取、固相萃取、凝膠過(guò)濾色譜分析、HPLC純化了發(fā)酵蕎麥中的血管擴(kuò)張成分。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的丙酮提取對(duì)發(fā)酵蕎麥進(jìn)行離心分離(3220g，30min，4℃)，除掉離心分離后的殘余物。將所得上清液在減壓條件下用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮，得到發(fā)酵蕎麥濃縮物。2L研缽中加入發(fā)酵蕎麥濃縮物(約120g)和丙酮(300mL)，用杵研磨5分鐘，同時(shí)提取血管擴(kuò)張成分，用吸引器回收了上清液。殘余物中進(jìn)一步加入丙酮(300mL)，用杵充分研磨5分鐘后，同樣回收了上清液。重復(fù)該操作總計(jì)12次。將所得丙酮溶液在減壓條件下用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮，得到丙酮粗提取物。500mL茄子瓶中加入丙酮粗提取物(約60g)和乙酸乙酯(約200mL)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?分鐘后，10分鐘冰水冷卻后去除上清液。殘余物中再加入乙酸乙酯(約200mL)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?分鐘后，同樣的方式去除上清液。重復(fù)該操作總計(jì)12次，將所得殘余物在干燥器中減壓干燥3小時(shí)以上，得到丙酮提取物。根據(jù)固相萃取純化和凝膠過(guò)濾色譜分析的發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的分餾作為凝膠過(guò)濾色譜分析的前處理，用甲醇(300mL)活化固相萃取柱(GLScienceInertSep(注冊(cè)商標(biāo))PH，50g)，用含0.01％甲酸的水(300mL)清洗并用純水(300mL)平衡后，將發(fā)酵蕎麥丙酮提取物(10g)溶解于純水(20mL)中應(yīng)用，用純水(300mL)洗脫夾雜物后，用含0.01％甲酸的水(300mL)洗脫血管擴(kuò)張物質(zhì)。將所得洗脫液在減壓條件下用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮，得到濃縮的固相萃取物。接著，凝膠過(guò)濾色譜分析中，柱(4.2cm×50cm)中填充SephadexG-15(230g)，注入用純水調(diào)制為500mg/mL的固相萃取物(2mL)后，用純水洗脫，取410-485mL的洗脫液。將所取洗脫液減壓濃縮、凍干后，得到凝膠過(guò)濾物。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的LC-MS、LC-MS/MS分析進(jìn)行凝膠過(guò)濾物的LC-MS分析以及LC-MS/MS分析。1.5mL容量微管中加入凝膠過(guò)濾物和分析溶劑，調(diào)制1mg/mL濃度的樣品溶液，通過(guò)Millex-LH過(guò)濾器(0.45μm)(注冊(cè)商標(biāo))后，得到LC-MS分析樣品。柱使用了鍵合PFP基的反相柱YMC-Triart(注冊(cè)商標(biāo))PFP(5μm，4.6mm×250mm)，流動(dòng)相使用了含0.01％甲酸-33％甲醇的水。離子化模式ESI+，流速為0.5mL/min(LC)以及0.3mL/min(MS)，分離溫度為40℃，注入量為10μL，毛細(xì)管(Capillary)電壓為3500V，N2氣體流量(cone)為50L/h，N2源溫度為120℃，N2脫溶劑溫度為350℃。此外，進(jìn)行分析的每個(gè)峰中，以10～60V離子化電壓進(jìn)行了檢查，使用了最佳離子化的錐電壓(Conevoltage)10V、錐電壓30V的條件。對(duì)于LC-MS分析觀察到的主要的離子峰，實(shí)施中性丟失掃描，作為烷基季銨化合物限定了具有三甲胺基(質(zhì)荷比59)的化合物。并且，將特定的烷基季銨化合物的質(zhì)荷比作為前體離子進(jìn)行LC-MS分析。其結(jié)果是作為烷基季銨化合物限定了乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿、乳酰膽堿、乙酰丙酰膽堿、肉毒堿及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜堿)及其甲基酯、乙基酯以及丙酰酯和磷酰膽堿。實(shí)施例4乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的離析、純化發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的HPLC純化參照上述的LC-MS分析結(jié)果，將凝膠過(guò)濾物中包含的血管擴(kuò)張成分用HPLC純化，分離了血管擴(kuò)張成分。1.5mL容量微管中加入凝膠過(guò)濾物和HPLC分析溶劑，調(diào)制100mg/mL濃度的樣品溶液，通過(guò)Millex-LH過(guò)濾器(0.45μm)(注冊(cè)商標(biāo))后，得到分離樣品。分析系統(tǒng)使用了突出高效液相色譜系統(tǒng)(ProminenceHPLCsystem)，柱使用了YMC-TriartPFP(5μm，20mm×250mm)(注冊(cè)商標(biāo))。分析條件是流動(dòng)相為含0.01％甲酸-33％甲醇的水，流速為5.671mL/min，分離溫度為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，注入量為50μL凝膠過(guò)濾物。取包括血管擴(kuò)張成分的餾分，必要時(shí)重復(fù)進(jìn)行相同的純化，得到三種純粹的成分。最后，純化物中加入鹽酸進(jìn)行減壓濃縮、凍干，得到鹽酸鹽，用于確定結(jié)構(gòu)以及試驗(yàn)。發(fā)酵蕎麥血管成分的NMR分析對(duì)三種HPLC純化物進(jìn)行了NMR分析。對(duì)于得到的分取物，分別在凍干物(1.6mg)中加入重水(D2O，0.16mL)溶解后，得到NMR樣品。使用1H共振頻率500MHz的NMR裝置(ADVANCEDRX500，BrukerBio-Spin有限公司，橫濱)，使用累計(jì)次數(shù)為128次。其結(jié)果是三種HPLC純化物的NMR圖與市售的特級(jí)乙酰膽堿鹽酸鹽、合成的丙酰膽堿、丁酰膽堿相同，從而被鑒定為乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的質(zhì)量分析對(duì)三種HPLC純化物進(jìn)行了MALDI-TOF/MS分析。對(duì)于得到的分取物，分別用含0.1％TFA的50％乙腈(15μL)溶解凍干物(0.01mg)后，得到測(cè)定樣品。分別取1μL的樣品和作為基質(zhì)的2,5-二羥基苯甲酸的含0.1TFA50％的乙腈溶液(7500，1500，750μg/mL)在每個(gè)板上混合后，干燥器中進(jìn)行干燥。使用MALDI-TOFMS質(zhì)量分析裝置(ABSCIEXTOF/TOF5800，AB-Sciex有限公司，東京)，在反射模式、掃描范圍10～300m/z、激光強(qiáng)度5500eV中進(jìn)行了MALDI-TOFMS分析。其結(jié)果是分別觀察到相當(dāng)于乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的精密質(zhì)量的146.1182m/z(理論值：146.1176)，160.1337m/z(理論值：160.1332)，174.1497m/z(理論值：174.1489)。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張物質(zhì)的特性描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成作為離析、純化的乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的各鹽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，乙酰膽堿使用了市售的特級(jí)乙酰膽堿鹽酸鹽，丙酰膽堿、丁酰膽堿使用了本研究室中合成的HPLC中純化的鹽酸鹽的凍干物。丙酰膽堿以及丁酰膽堿可按照下述式(1)以及式(2)中所示的合成圖進(jìn)行合成。丙酰膽堿的合成[化學(xué)式1]丙酰膽堿的合成：將膽堿鹽酸鹽(0.42g，3.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF，6.0mL)，加入丙酰氯(0.56g，6.0mmol)以及二異丙基乙胺(DIPEA，0.78g，4.5mmol)，從0℃返回到室溫，使其反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾除去DMF，用二氯甲烷(DCM)-乙酸乙酯(1:1)沉淀生成物。將沉淀物用DCM-乙酸乙酯(5:1)再結(jié)晶，進(jìn)一步用DCM再結(jié)晶，得到白色粉末的丙酰膽堿鹽酸鹽。產(chǎn)率92％，1HNMR(500MHz,D2O)δ(ppm):0.96(3H,t,J＝7.8Hz,CH3),2.32(2H,q,J＝7.5Hz,CH2),3.08(9H,s,CH3),3.60(2H,t,J＝2.5Hz,CH2),4.42(2H,t,J＝2.3Hz,CH2)丁酰膽堿的合成[化學(xué)式2]丁酰膽堿的合成：將膽堿鹽酸鹽(0.42g，3.0mmol)溶解于DMF(6.0mL)，加入丁酰氯(0.62g，6.0mmol)以及DIPEA(0.78g，4.5mmol)，從0℃返回到室溫，使其反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾除去DMF，用DCM-乙酸乙酯(1:1)沉淀生成物。將沉淀物用DCM-乙酸乙酯(5:1)再結(jié)晶，進(jìn)一步用DCM再結(jié)晶，得到白色粉末的丁酰膽堿鹽酸鹽。產(chǎn)率89％，1HNMR(500MHz,D2O)δ(ppm):0.78(3H,t,J＝7.5Hz,CH3),1.49(2H,6,J＝7.5Hz,CH2),2.29(2H,t,J＝7.5Hz,CH2),3.08(9H,s,CH3),3.60(2H,t,J＝2.3Hz,CH2),4.43(2H,t,J＝2.3Hz,CH2)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照信州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)中，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用了雄性10～13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR/NCrlCrlj，日本CharlesRiver，橫濱)。在單獨(dú)的籠子中，明暗循環(huán)12小時(shí)，室溫控制在22～23℃的飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)SHR。在馴化飼養(yǎng)中，任意攝取大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料(MF；CharlesRiver有限公司)和自來(lái)水。SHR是由京都大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)的Wistar-Kyoto系大鼠中選擇交配的1963年分離的大鼠系統(tǒng)。稱(chēng)為自發(fā)性高血壓大鼠或原發(fā)性高血壓大鼠，對(duì)于分離母體Wistar-Kyoto的收縮壓，成熟雄性為約135mmHg，同種雌性為132mmHg，但是SHR的血壓在出生后到2個(gè)月幾乎都是150mmHg以上，4～5個(gè)月時(shí)達(dá)到最高，大多顯示為180～210mmHg。作為占人類(lèi)高血壓約90％的原發(fā)性高血壓的模型動(dòng)物，通常用于闡明藥理作用或食品功能、血壓上升機(jī)制。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分含有物的血管等長(zhǎng)張力測(cè)定從雄性10～12周齡的SHR中摘除胸部大動(dòng)脈用于試驗(yàn)，去除結(jié)締組織后，按2～3mm切割，制作了環(huán)標(biāo)本。將制作的環(huán)標(biāo)本安裝在由通氣95％O2-5％CO2混合氣體的37℃的克雷布斯液(119mMNaCl/4.7mMKCl/1.1mMKH2PO4/1.2mMMgSO4/25mMNaHCO3,pH7.4)充滿的器官浴槽中，負(fù)荷1.5g的靜止張力(UFERUC-05A，沙丁魚(yú)和岸本醫(yī)科產(chǎn)業(yè)，京都)。通過(guò)UFERUM-203傳感器(Transducer)測(cè)量血管張力。從安裝到60分鐘的孵化后，環(huán)標(biāo)本使用收縮劑去氧腎上腺素(終濃度0.30μM)進(jìn)行收縮。收縮的環(huán)標(biāo)本中添加作為內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張劑的市售乙酰膽堿(終濃度100μM)，根據(jù)是否有血管擴(kuò)張作用判斷了是否有血管內(nèi)皮。然后，用去除藥劑的克雷布斯液清洗環(huán)標(biāo)本，以10分鐘靜止張力孵化后，再次用0.30μM去氧腎上腺素收縮。重復(fù)進(jìn)行2次該操作后，再次添加0.30μM去氧腎上腺素，確認(rèn)收縮達(dá)到最大，累計(jì)添加溶解于克雷布斯液中的各樣品，直至終濃度達(dá)到10-9、10-8、10-7.5、10-7、10-6.5、10-6、10-5、10-4M。血管擴(kuò)張作用(擴(kuò)張率，％)以通過(guò)去氧腎上腺素收縮之時(shí)的血管張力為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表示。純化乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的血管等長(zhǎng)張力試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。純化乙酰膽堿在10-9M的添加中呈現(xiàn)1.52％的擴(kuò)張率，此后一直到10-6M呈現(xiàn)依賴劑量的擴(kuò)張反應(yīng)，但是在此以上的高濃度中有一點(diǎn)收縮。最大擴(kuò)張率為添加10-5M中的89.9％，確認(rèn)了低劑量高擴(kuò)張率。EC50為2.72×10-8M。此外，純化丙酰膽堿從10-7M中呈現(xiàn)擴(kuò)張反應(yīng)，10-4M中最大擴(kuò)張率為95.2％，EC50為2.27×10-6M。另一方面，純化丁酰膽堿在10-4M的添加中呈現(xiàn)7.14％的擴(kuò)張，與乙酰膽堿和丙酰膽堿相比具有弱擴(kuò)張作用。市售乙酰膽堿和合成丙酰膽堿、丁酰膽堿也呈現(xiàn)相同的血管擴(kuò)張作用。從以上結(jié)果中可確認(rèn)從發(fā)酵蕎麥中離析純化的乙酰膽堿和丙酰膽堿具有較強(qiáng)的血管擴(kuò)張作用。發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分含有物的單次口服給藥試驗(yàn)使用體重280～320g的雄性12周齡SHR進(jìn)行了單次口服給藥試驗(yàn)。1周馴化飼養(yǎng)后，斷食12小時(shí)，單次口服給藥樣品。將給藥樣品溶解于純水中，以10-11mol/kg(b.w.)的劑量分別對(duì)6只SHR進(jìn)行單次口服給藥。純化乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿給藥樣品水溶液的pH分別為酸性4.7、4.3、4.4。對(duì)照組中提供純水。使用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)xSoftronBP-98A(softRon有限公司，東京)根據(jù)尾套法測(cè)定了試樣給藥前和給藥3、6、9、24小時(shí)后的收縮壓和舒張壓變化。純化乙酰膽堿、丙酰膽堿、丁酰膽堿的單次口服給藥試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。其結(jié)果是乙酰膽堿給藥組在給藥9個(gè)小時(shí)后與對(duì)照組進(jìn)行比較，出現(xiàn)顯著的降收縮壓作用(p＜0.01)，此時(shí)的最大降血壓作用為24.7mmHg。此外，丙酰膽堿給藥組中，給藥9個(gè)小時(shí)后，確認(rèn)最大8.05mmHg的顯著的降收縮壓作用(p＜0.05)。另一方面，丁酰膽堿給藥組中，在10-11mol/kg中無(wú)法確認(rèn)顯著的降血壓。市售乙酰膽堿以及合成丙酰膽堿、丁酰膽堿也呈現(xiàn)相同的降壓作用。實(shí)施例5乳酰膽堿、乙酰丙酰膽堿的離析純化按照實(shí)施例3中記載的方法，作為天然物限定了初始乳酰膽堿。乳酰膽堿的LC-MS分析試驗(yàn)中的質(zhì)譜如圖8-1中所示；LC-MS/MS分析試驗(yàn)中的質(zhì)譜如圖8-2中所示。進(jìn)一步地，離析純化了認(rèn)為是新型化合物的下述式(3)中表示的乙酰丙酰膽堿。[化學(xué)式3]乙酰丙酰膽堿的LC-MS分析試驗(yàn)中的質(zhì)譜如圖9-1中所示；LC-MS/MS分析試驗(yàn)中的質(zhì)譜如圖9-2中所示。實(shí)施例6發(fā)酵蕎麥和其他發(fā)酵食品中的烷基季銨化合物的LC-MS/MS分析對(duì)包含于發(fā)酵蕎麥、黑醋、酸奶、日本清酒中的烷基季銨化合物進(jìn)行了LC-MS分析。取各凍干物(1g發(fā)酵蕎麥，黑醋、酸奶以及日本清酒各10g)到研缽，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)加入1mg卡巴膽堿。加30mL丙酮攪拌3分鐘，采集上清液放入50mL容量的離心管后，離心分離(4℃，1811g，10min)，得到上清液。進(jìn)一步重復(fù)四次在殘余物中再次加入30mL丙酮攪拌、離心分離、采集上清液的操作，得到丙酮提取物。減壓濃縮丙酮提取物后，凍干，用純水(2.5mL)溶解，使用固相萃取柱(GLScienceInertSEPPH，5g)(注冊(cè)商標(biāo))進(jìn)行固相萃取。固相萃取中，首先用甲醇(30mL)活化，用含0.01％甲酸的水清洗，用純水平衡(30mL)后，添加樣品。用純水(30mL)去除夾雜物，用含0.01％甲酸的水(30mL)洗脫，得到包括烷基季銨化合物的固相萃取物。將固相萃取物減壓濃縮、凍干后，溶解于分析溶劑(含0.01％甲酸-33％甲醇的水，1mL)中進(jìn)行了LC-MS分析。用單離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式指定由發(fā)酵蕎麥特定的烷基季銨化合物的質(zhì)荷比，進(jìn)行化合物的定量。以化合物指定的質(zhì)荷比為乙酰膽堿：146.1、丙酰膽堿：160.1、丁酰膽堿：174.2、乳酰膽堿：176.1、乙酰丙酰膽堿：202.1、磷酰膽堿：184.1、肉毒堿：162.1、甲基肉毒堿：176.1、三甲基甘氨酸：118.1、甲基甜菜堿：132.1、乙基甜菜堿：146.1、丙?；鸩藟A：160.1。其他分析條件與上述的發(fā)酵蕎麥血管擴(kuò)張成分的LC-MS分析相同。烷基季銨化合物定量結(jié)果如表2所示。各化合物含量使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的定量結(jié)果，補(bǔ)償了純化過(guò)程中的物質(zhì)損失，用乙酰膽堿當(dāng)量表示新鮮重量100g(100gFW)中的各烷基季銨化合物含量。[表2]表2發(fā)酵食品中烷基季銨化合物定量結(jié)果(μg/100gFW乙酰膽堿當(dāng)量)烷基季銨化合物發(fā)酵蕎麥黑醋酸奶納豆日本清酒乙酰膽堿295.811.85.81.141.7丙酰膽堿457.927.31576.595.2134.0丁酰膽堿94.424.1N.D.66.416.8乳酰膽堿37.310.710.537.57.5乙酰丙酰膽堿31.1N.D.N.D.N.D.N.D.磷酰膽堿16.19.711.711.72.7肉毒堿164.110.8127.021.79.8甲基肉毒堿9.4N.D.3.239.012.2三甲基甘氨酸23.830.898.63447.813.9甲基甜菜堿76.130.83.512622.120.7乙基甜菜堿147.76.783.133.248.2丙?；鸩藟A217.4N.D.4.288.1N.D.N.D.：檢測(cè)不出(檢測(cè)極限以下)工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的發(fā)酵食品提取物具有顯著的降血壓作用，通過(guò)作為活性成分包含該提取物，能夠制造功能性健康食品或高血壓等治療藥物。權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)1.一種發(fā)酵食品提取組合物，其中，至少包含乙酰膽堿以及丙酰膽堿和/或乳酰膽堿，口服給藥時(shí)顯示出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取組合物，其中，發(fā)酵食品為選自發(fā)酵蕎麥、黑醋、酸奶、納豆以及日本清酒的組中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取組合物，其中，發(fā)酵食品為發(fā)酵蕎麥。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取組合物，其中，所述提取組合物還包含選自丁酰膽堿、乙酰丙酰膽堿、肉毒堿、甲基肉毒堿、三甲基甘氨酸(甜菜堿)、甲基甜菜堿、乙基甜菜堿、丙?；鸩藟A以及磷酰膽堿的組中的至少一種。5.一種作為活性成分包含權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的提取組合物的食品或藥物組合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的食品或藥物組合物，其中，作為活性成分還包含選自酪氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的組中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的食品或藥物組合物，其中，還包含選自乳酸、乙酸以及檸檬酸的組中的至少一種。8.一種權(quán)利要求1所述的發(fā)酵食品提取組合物的制造方法，其特征在于，包括：(1)在丙酮中懸浮發(fā)酵蕎麥的凍干物或濃縮物，搖動(dòng)攪拌后，對(duì)離心分離得到的上清液進(jìn)行減壓濃縮(工序1)；(2)使用由苯基鍵合的載體填充的固相萃取柱，作為洗脫液使用含酸水，對(duì)該減壓濃縮物進(jìn)行洗脫(工序2)；以及(3)使用由五氟苯基鍵合的載體填充的柱(PFP柱)，作為流動(dòng)相使用含酸性甲醇水，對(duì)該洗脫物進(jìn)行分餾、純化(工序3)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制造方法，其特征在于，(1)工序2中，作為固相萃取柱使用固相萃取柱(GLScienceInertSep)(注冊(cè)商標(biāo))，作為洗脫液使用含0.01％甲酸的水；(2)工序3中，作為反相柱使用PFP柱(YMC-TriartPFP)，作為流動(dòng)相使用含0.01％甲酸-33％甲醇的水。10.一種發(fā)酵食品提取組合物，其特征在于，所述發(fā)酵食品提取組合物利用權(quán)利要求8或9所述的制造方法進(jìn)行制造，至少包含乙酰膽堿以及丙酰膽堿和/或乳酰膽堿，口服給藥時(shí)顯示出降血壓作用和血管擴(kuò)張作用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3