本申請(qǐng)要求2014年11月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/083,022、2014年6月18日提交的62/013,994以及2014年3月14日提交的61/953,294的優(yōu)先權(quán)，各個(gè)以全部?jī)?nèi)容并入文本用于所有目的。

關(guān)于對(duì)在聯(lián)邦政府資助的研發(fā)下作出的發(fā)明的權(quán)利的聲明

不適用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種固相支持體組合物，具有生物相容的固相支持體，至少一結(jié)合(劑)，以及具有約1至約10個(gè)連接原子的連接體，每個(gè)結(jié)合劑共價(jià)連接至生物相容的固相支持體。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種生物活性組合物，其具有治療或診斷劑，可以是反式環(huán)辛烯或四嗪的結(jié)合劑，以及具有約1至約10個(gè)連接原子的連接體，結(jié)合劑共價(jià)連接至治療或診斷劑。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供

的組合物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于選擇性遞送有效量的治療劑或診斷劑至患者的目標(biāo)器官或組織的第一位置的方法。該方法包括在患者的目標(biāo)器官或組織的第一位置植入本發(fā)明的固相支持體組合物，其中，固相支持體組合物包含第一結(jié)合劑。該方法還包括給患者施用本發(fā)明的生物活性組合物，其中，生物活性組合物包括第二結(jié)合劑，且其中第一和第二結(jié)合劑在接觸后彼此結(jié)合，從而選擇性遞送有效量的治療或診斷劑至患者的目標(biāo)器官或組織的第一位置。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于選擇性遞送有效量的治療劑或診斷劑至患者的目標(biāo)器官或組織的第一位置的方法。該方法包括在患者的目標(biāo)器官或組織的第一位置植入固相支持體組合物，其具有生物相容的固相支持體和連接到固相支持體的第一結(jié)合劑。該方法還包括給患者施用生物活性組合物，其具有治療劑或診斷劑、與第一結(jié)合劑互補(bǔ)的第二結(jié)合劑以及連接治療或診斷劑和第二結(jié)合劑的可釋放的連接體，以使第一和第二結(jié)合劑在接觸后彼此結(jié)合。該方法還包括釋放診斷或治療劑，從而將診斷或治療劑遞送至目標(biāo)器官或組織的第一位置。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A和圖1B示出本發(fā)明的方法，涉及初始注射共價(jià)連接到TCO的生物材料。隨后是全身注射偶聯(lián)到四嗪部分的治療劑。當(dāng)兩個(gè)實(shí)體接近時(shí)，它們共價(jià)反應(yīng)連接治療至固相載體，從而定位治療劑。含有放射性¹¹¹Im(銦)的Tz放射性探針2用作分子探針。

圖2示出體外研究，預(yù)稱重的凝膠盤(實(shí)驗(yàn)或?qū)φ?與Tz放射性探針2的溶液混合10分鐘或14小時(shí)。在10分鐘的暴露期，樣本TCO-凝膠1結(jié)合1.78nmoles/g Tz放射性探針2，而對(duì)照凝膠維持0.75nmoles/g Tz放射性探針2。在14小時(shí)內(nèi)，連接到對(duì)照凝膠的Tz放射性探針的量保持不變?yōu)?.86nmoles/g。TCO-凝膠1結(jié)合2.78nmoles/g。誤差條代表三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)顯著性(p值<0.05)。

圖3A和圖3B顯示Tz放射性探針2的生物分布結(jié)果。a、接受皮下TCO-凝膠1(平均0.23克[0.10-0.29克])和對(duì)照凝膠(平均0.23克[0.16-0.25克])的小鼠，經(jīng)尾靜脈注射Tz放射性探針2(平均44μCi[39.2–48.4μCi])。b、在特定時(shí)間點(diǎn)TCO-凝膠1與對(duì)照凝膠的平均差異。柱體表示在特定時(shí)間點(diǎn)(1，4，24，48小時(shí))每個(gè)器官的％ID/克。誤差條表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)顯著性(p值<0.05)。

圖4示出接受皮下TCO-凝膠1(170mg,綠色區(qū)域)和對(duì)照凝膠(230mg,黃色區(qū)域)的小鼠。植入后3小時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射遞送Tz放射性探針2(1.05mCi)并通過(guò)SPECT在4，24，48小時(shí)成像。

圖5示出固相支持體組合物TZ-Me-凝膠的合成制備。

圖6示出通過(guò)非可釋放的連接體與TCO連接的熒光素與四嗪固相支持體之間的反應(yīng)。R代表完整二乙胺熒光素部分，仍共價(jià)地連接到固相支持體。

圖7示出通過(guò)可釋放的連接體與TCO連接的熒光素與四嗪固相支持體之間的反應(yīng)。如所預(yù)期的，熒光素二乙胺(MW：418.40)和二氧化碳從固相支持體釋放。

圖8提供除去凝膠后的上清液樣品，用于推斷未反應(yīng)的TCO-X-熒光素的量及TCO-X-熒光素和TZ-Me-凝膠之間的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，方法涉及：形成和稱重Tz-凝膠，加入1毫升含預(yù)定濃度的TCO-X-熒光素(10，20，50納摩爾)的PBS鹽水，將板置于孔板混合器(速度200)預(yù)定量的時(shí)間(10，50，100，180分鐘)，在特定時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)移上清液至另一板，和通過(guò)IVIS光譜儀檢測(cè)殘留在上清液中熒光的量(490nm激發(fā)熒光素，515nm發(fā)射)。

圖9示出基于實(shí)驗(yàn)值的熒光團(tuán)量和相關(guān)的輻射(熒光)的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其中利用已知納摩爾量的TCO-NR-熒光素，用IVIS光譜儀檢測(cè)的輻射(490nm激發(fā)熒光素，515nm發(fā)射)。

圖10示出當(dāng)和TZ-Me-凝膠在37℃混合0至70分鐘時(shí)，上清液中TCO-NR-熒光素隨時(shí)間減少。

圖11示出結(jié)合到凝膠的TCO-NR-熒光素和上清液中檢測(cè)到的未結(jié)合的量的理論相互性。

圖12示出根據(jù)圖10的數(shù)據(jù)，結(jié)合到TZ-Me-凝膠的TCO-NR-熒光素分子的計(jì)算量?；诮o出的數(shù)據(jù)，當(dāng)TZ-Me-凝膠盤與50納摩爾TCO-NR-熒光素混合時(shí)，70分鐘后，每1毫克TZ-Me-凝膠有0.66nmolesTCO-NR-熒光素反應(yīng)(0.66nmoles/mg)。即使只在70分鐘后，是如圖2所示用TCO-凝膠14小時(shí)后獲得的量(2.78nmoles/g)的約200倍。

圖13顯示在37℃孵育預(yù)定量時(shí)間(0-3天)后TZ-Me-凝膠的活性。在規(guī)定的孵育后，加入50納摩爾TCO-NR-熒光素激發(fā)50毫克凝膠90分鐘，依照前圖計(jì)算結(jié)合量。

圖14示出將TCO-R-熒光素加到TZ-Me-凝膠多個(gè)時(shí)間點(diǎn)后未結(jié)合分子的預(yù)期與觀察量?？紤]到TCO-R-熒光素和TCO-NR熒光素之間的相似之處，預(yù)計(jì)反應(yīng)模式類似。假設(shè)是上清液中回收熒光的量的差異是由于二乙基熒光素的釋放，如圖7所示。

圖15示出將特定量TCO-R-熒光素(10、20、50納摩爾)加入TZ-Me-凝膠后釋放的熒光素的總量。此外，采用LC-MS分析在時(shí)間點(diǎn)60分鐘上清液中化合物的具體特性并顯示存在熒光素二胺(分子量418.40)為主要化合物，還證實(shí)存在TCO-R-熒光素與TZ-Me-凝膠的捕獲和釋放反應(yīng)的消除產(chǎn)物。

圖16A和圖16B示出使用捕獲和釋放連接體的本發(fā)明的方法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，該方法首先包括含點(diǎn)擊化學(xué)載體改性的固體載體的定位，在該特定實(shí)例中為四嗪。接著氨基甲酸酯(綠色)和反式環(huán)辛烯基團(tuán)改性的載物暴露于材料(無(wú)論體外或體內(nèi))。兩試劑原位反應(yīng)，根據(jù)四嗪取代基，載物或從固體載體釋放或固定到固體載體。

圖17示出暴露于不同的四嗪修飾的瓊脂糖珠后TCO-R-羅丹明的釋放動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，如圖16所示在X和Y具有雜環(huán)取代基的瓊脂糖1a，導(dǎo)致緩慢釋放(紅線)，大概是由于吸電子基團(tuán)引起的衰減。另一方面，在X上具有芳族取代基和在Y上具有烷基取代基導(dǎo)致羅丹明二乙胺的快速釋放。值是三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖18示出未植入凝膠或植入Tz-凝膠，或僅植入海藻酸，然后注入TCO-R-羅丹明或TCO-NR-羅丹明的小鼠在70分鐘，5小時(shí)和3天輻射值。

圖19A和圖19B示出TCO-R-萬(wàn)古霉素對(duì)發(fā)光MSSA的MIC(Xen 29)。

圖20示出(R,E)-N-(2-氨乙基)-2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧)乙酰胺(5)的NMR。

圖21示出未改性海藻酸凝膠的NMR。

圖22示出TCO-凝膠1的NMR。

圖23示出Tz-Me-凝膠的NMR。

圖24示出“捕獲和釋放”策略，采用生物正交TCO-四嗪化學(xué)。

圖25示出180分鐘后熒光素釋放量。計(jì)算為結(jié)合熒光團(tuán)的預(yù)期值和獲得的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值之間的差。

圖26示出60分鐘后Tz-Me-凝膠和TCO-R-熒光素混合物上清液中發(fā)現(xiàn)的熒光素二胺的峰([M+H]419.1214和[M+MeOH]453.3417)，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜確定預(yù)期的“捕獲和釋放”產(chǎn)品。

圖27示出暴露于不同四嗪改性的瓊脂糖珠后TCO-R-熒光素([M+H]is 571.21)的釋放動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，如圖16所示在X和Y具有雜環(huán)取代基的瓊脂糖1a，導(dǎo)致緩慢釋放(MX53,紅線)，大概是由于吸電子基團(tuán)引起的衰減。另一方面，在X上具有芳族取代基和在Y上具有烷基取代基導(dǎo)致羅丹明二乙胺(MX65,藍(lán)線)的快速釋放。左手邊示出通過(guò)質(zhì)譜動(dòng)態(tài)評(píng)估釋放。

圖28示出熒光素標(biāo)記的TCO從四嗪改性瓊脂糖的“捕獲和釋放”的動(dòng)力學(xué)研究設(shè)計(jì)。

圖29示出通過(guò)質(zhì)譜學(xué)方法動(dòng)態(tài)評(píng)估TCO-R-羅丹明([M+H]625.31)的釋放。如所預(yù)期在473.22發(fā)現(xiàn)釋放產(chǎn)物。

圖30示出基于以前的動(dòng)力學(xué)生物分布研究，注射TCO-R-羅丹明后在各時(shí)間點(diǎn)比較陰性對(duì)照(無(wú)凝膠注射)和釋放方案(TZ-Me-凝膠)熒光的增加。柱狀圖推斷8小時(shí)內(nèi)獲得推定總量的數(shù)據(jù)。在凝膠存在下的曲線下面積反映的劑量幾乎是雙倍的，如“釋放”柱(右)相對(duì)陰性對(duì)照(左)所示。

圖31示出小鼠的動(dòng)力學(xué)多劑量評(píng)估。在各自通過(guò)尾靜脈注射50納摩爾TCO-R-羅丹明后對(duì)三只小鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。示出如上所述處理小鼠的圖像?！瓣幮詫?duì)照”對(duì)象不接受任何凝膠注射。“釋放”對(duì)象在背部皮下接受Tz-Me-凝膠注射。“凝膠對(duì)照”對(duì)象在背部皮下接受海藻酸凝膠注射。在每次給熒光團(tuán)后5-10分鐘和110-150分鐘后用IVIS光譜儀評(píng)價(jià)小鼠。

圖32示出在給每個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組(陰性對(duì)照＝無(wú)凝膠；實(shí)驗(yàn)組＝Tz-Me-凝膠；凝膠對(duì)照＝未改性海藻酸凝膠)第二、第三和第四次注射50納摩爾TCO-R-羅丹明后5-10分鐘相較于110-150分鐘所觀察到的平均熒光值。實(shí)驗(yàn)組熒光在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于陰性或凝膠對(duì)照組。通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較(n＝3)。

具體實(shí)施方式

I.概述

本發(fā)明提供用于植入和給藥于對(duì)象的組合物，其中組合物使用短連接體，其也可以包括可釋放的組分。可釋放的連接體能將更大量的治療劑或診斷劑給藥至有需要的患者。

II.定義

“治療劑”是指能夠治療和/或減輕病癥或疾病的試劑。代表性的治療劑包括但不限于，紫杉醇，多柔比星，依托泊苷，伊立替康，SN-38，環(huán)孢菌素A，鬼臼毒素，卡氮芥，兩性霉素，伊沙匹隆，帕妥匹隆(埃博霉素epothelone類)，萬(wàn)古霉素，雷帕霉素和鉑類藥物。本發(fā)明的治療劑還包括前藥形式。

“診斷劑”是指幫助診斷病癥或疾病的試劑。代表性的診斷劑包括成像劑，如順磁性試劑，光學(xué)探針和放射性核素。順磁性試劑是在外加場(chǎng)下具有磁性的成像劑。順磁性試劑的例子包括但不限于，鐵顆粒包括納米顆粒。光學(xué)探針是可以通過(guò)一輻射波長(zhǎng)激發(fā)并在第二、不同的輻射波長(zhǎng)檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)的熒光化合物。本發(fā)明中有用的光學(xué)探針包括但不限于，Cy5.5、Alexa(亞歷克薩)680、Cy5、DiD(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸鹽)和DiR(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)。其他光學(xué)探針包括量子點(diǎn)。放射性核素是經(jīng)過(guò)放射性衰變的元素。本發(fā)明中有用的放射性核素包括但不限于：³H、¹¹C、¹³N、¹⁸F、¹⁹F、⁶⁰Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁸²Rb、⁹⁰Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁷Cs、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、Rn、Ra、Th、U、Pu和²⁴¹Am。

“目標(biāo)器官或組織”是指作為目標(biāo)用于遞送治療或診斷劑的器官或組織。作為目標(biāo)的代表性的器官和組織包括能被化學(xué)或生物靶向劑所靶向的那些，以及不能被化學(xué)或生物靶向劑靶向的那些器官和組織。代表性的器官或組織包括骨。

“選擇性遞送”是指遞送治療或診斷劑至需要治療的器官或組織部分，而不靶向不需要治療的器官或組織的其他部分。

“移植”是指手術(shù)植入到患者體內(nèi)。

“生物相容的固相支持體”是指能夠植入患者體內(nèi)且支持結(jié)合劑之一，以及結(jié)合劑結(jié)合后的治療或診斷劑的固相支持體材料。固相支持體與患者身體相容。代表性的生物相容的固相支持體包括但不限于，水凝膠如多糖水凝膠，海藻酸，纖維素，殼聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素，肝素等。

“接觸的”或“接觸”是指使兩不同物種接觸以使它們能反應(yīng)的過(guò)程。但應(yīng)理解，得到的反應(yīng)產(chǎn)物可以直接產(chǎn)生自添加試劑間的反應(yīng)或產(chǎn)生自能夠在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的一個(gè)或更多添加試劑的中間體。

“連接體”、“連接的”或“連接”是指連接本發(fā)明化合物至靶向特定類型細(xì)胞，如癌細(xì)胞，其他類型疾病細(xì)胞或正常細(xì)胞類型的生物材料的化學(xué)部分。連接可以通過(guò)共價(jià)或離子鍵形成。連接可以是兩被連接部分直接連接或間接連接，如通過(guò)連接體。本發(fā)明中有用的連接體長(zhǎng)度至多30個(gè)碳原子。優(yōu)選地，連接體長(zhǎng)度是5-15個(gè)碳原子。用于將接頭連接到本發(fā)明的化合物和生物分子的鍵的類型包括但不限于酰胺，胺，酯，氨基甲酸酯，脲，硫醚，硫代氨基甲酸酯，硫代碳酸鹽和硫脲。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它類型的鍵在本發(fā)明中是有用的。

“結(jié)合劑”是指能在生物環(huán)境中與另一結(jié)合劑形成共價(jià)鍵的任何群組。這通常被稱為生物結(jié)合或生物正交化學(xué)。代表性的結(jié)合劑包括但不限于，胺和活化酯，胺和異氰酸酯，胺和異硫氰酸酯，用于形成二硫化物的硫醇，用于形成烯胺的醛和胺，用于通過(guò)施陶丁格連接形成酰胺的疊氮化物，用于經(jīng)由點(diǎn)擊-化學(xué)形成三唑的炔烴和疊氮化物，反式-環(huán)辛烯(TCO)和四嗪等等。本發(fā)明中有用的結(jié)合劑與相應(yīng)的結(jié)合劑具有高反應(yīng)性，以致迅速反應(yīng)。

“治療”，“治療的”和“治療方法”是指治療或改善損傷，病理，病癥或癥狀(例如，疼痛)的任何成功的標(biāo)記，包括任何客觀或主觀的參數(shù)，如癥狀的減輕、緩解、減弱或使得患者更可容忍癥狀、損傷、病理或病癥；降低病癥或癥狀頻率或持續(xù)時(shí)間；或者，在某些情況下，預(yù)防癥狀或病癥的發(fā)作。癥狀的治療或改善可以基于任何客觀或主觀參數(shù)，包括例如身體檢查的結(jié)果。

“給藥”是指口服給藥，以栓劑給藥，局部接觸，胃腸外，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，病灶內(nèi)，鼻內(nèi)或皮下給藥，鞘內(nèi)給藥，或植入緩釋裝置，如，微型滲透泵，給對(duì)象。

“患者”是指需要治療的動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，包括但不限于，靈長(zhǎng)類(例如人)，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔，大鼠，小鼠等。在某些實(shí)施方式中，患者是人。

“治療有效量或劑量”或“治療足夠量或劑量”或“有效或足夠量或劑量”是指對(duì)被給藥者產(chǎn)生治療效果的劑量。確切的劑量取決于治療目的，由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)(參見(jiàn)，如Lieberman,藥物劑型(Pharmaceutical Dosage Forms)(卷1-3,1992)；Lloyd,制藥工藝，科學(xué)與技術(shù)(The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)(1999)；Pickar,劑量計(jì)算(Dosage Calculations)(1999)；和Remington:藥劑學(xué)科學(xué)和實(shí)踐(The Science and Practice of Pharmacy),第20版本,2003,Gennaro編.,Lippincott,Williams和Wilkins)確定。在致敏細(xì)胞中，治療有效劑量通?？梢缘陀诜侵旅艏?xì)胞傳統(tǒng)的治療有效劑量。

III.組合物

本發(fā)明提供組合物，具有短連接體或可釋放的連接體用于選擇性遞送治療或診斷劑給患者。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供固相支持體組合物，具有生物相容的固相支持體，至少一結(jié)合劑，和具有約1-約10個(gè)連接原子的連接體，將各結(jié)合劑共價(jià)連接至生物相容的固相支持體。

任何合適的生物相容的固相支持體可以用于本發(fā)明的方法。例如，生物相容的固相支持體可以是水凝膠、交聯(lián)聚合物基質(zhì)、金屬、陶瓷、塑料等等。用于本發(fā)明的水凝膠包括但不限于，多糖凝膠，海藻酸，纖維素，透明質(zhì)酸，殼聚糖，甲殼素，幾丁質(zhì)，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素，肝素等。其他糖基生物材料是現(xiàn)有技術(shù)已知的，如聚合物先進(jìn)技術(shù)(Polymer Advanced Technology)2014,25,448-460描述的那些。用作生物相容的支持體的聚合物可以包括但不限于：聚磷腈，聚酐，聚縮醛，聚(原酸酯)，聚磷酸酯，聚己內(nèi)酯，聚氨酯，聚乳酸，聚碳酸酯，聚酰胺和聚醚，以及它們的共混物/復(fù)合材料/共聚合物。代表性的聚醚包括，但不限于，聚(乙二醇)(PEG)，聚丙二醇(PPG)，三嵌段聚醚(Pluronic，[PEG]n-[PPG]m-[PEG]n)，PEG二丙烯酸酯(PEGDA)和PEG二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。生物相容的固相支持體也可以包括蛋白質(zhì)和其他聚(氨基酸)，例如膠原，明膠，彈性蛋白和彈性蛋白樣多肽，白蛋白，纖維蛋白，聚(γ-谷氨酸)，聚(L-賴氨酸)，聚(L-谷氨酸)，和聚(天冬氨酸)。

在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是水凝膠。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是海藻酸(鹽)。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是幾丁質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是透明質(zhì)酸。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是殼聚糖。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可以是瓊脂糖。

任何合適的連接體可以用于本發(fā)明以連接結(jié)合劑至生物相容的固相支持體或治療或診斷劑。代表性的連接體可以具有約1-約100個(gè)連接原子，且可包括乙烯氧基部分，胺，酯，酰胺，酮，脲，氨基甲酸酯和碳酸酯官能團(tuán)。用于本發(fā)明方法的其他連接體可以具有約1-約50個(gè)連接原子，或約1-約10個(gè)連接原子，或約5-約10個(gè)連接原子。代表性的連接體包括但不限于以下示出的那些：

適用于本發(fā)明的其他連接體包括：

任何合適的結(jié)合劑可以用于本發(fā)明的方法。可以在生物偶聯(lián)技術(shù)“Bioconjugate Techniques”Greg T.Hermanson,1996和ACS化學(xué)生物學(xué)(ACS Chemical Biology)2014,9,592-605中找到代表性的結(jié)合劑。例如，用于本發(fā)明方法的結(jié)合劑包括但不限于，環(huán)辛烯，四嗪，疊氮化物，炔，胺，活化的酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，硫醇，醛，酰胺，等等。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是環(huán)辛烯，四嗪，疊氮化物或炔。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是反式-環(huán)辛烯或1,2,4,5-四嗪。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是反式-環(huán)辛烯。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是4-甲基-1,2,4,5-四嗪。

在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑和連接體共同結(jié)構(gòu)為：

在一些實(shí)施方式中，組合物結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明還提供通過(guò)連接體連接到結(jié)合劑的治療劑或診斷劑的組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供生物活性組合物，具有治療或診斷劑、可以是反式-環(huán)辛烯或四嗪的結(jié)合劑，以及具有約1-約10個(gè)連接原子的連接體，共價(jià)連接結(jié)合劑至治療或診斷劑。

任何治療或診斷劑可以用于本發(fā)明的方法。代表性的治療劑包括但不限于，抗生素如萬(wàn)古霉素，紫杉醇，多柔比星，依托泊苷，伊立替康，SN-38，環(huán)孢菌素A，鬼臼毒素，卡氮芥，兩性霉素，伊沙匹隆，帕妥匹隆(埃博霉素epothelone類)，雷帕霉素和鉑類藥物。其它治療劑包括多西環(huán)素和其它MMP抑制劑。仍然其它治療劑包括達(dá)托霉素，左旋多巴，奧司他韋，頭孢氨芐，5-氨基乙酰丙酸，半胱氨酸，制霉菌素，兩性霉素B，氟胞嘧啶，恩曲他濱，甲氧芐啶，磺胺甲惡唑，阿昔洛韋，塞來(lái)考昔，尼莫地平，強(qiáng)力霉素，頭孢曲松，等等。在一些實(shí)施方式中，治療劑可以是萬(wàn)古霉素。在其他實(shí)施方式中，治療劑可以是達(dá)托霉素。在另外的實(shí)施方式中，治療劑可以是阿霉素。在另一實(shí)施方式中，治療劑可以是環(huán)磷酸腺苷(c-AMP)。

代表性的診斷劑包括成像劑，如順磁性試劑，光學(xué)探針和放射性核素。順磁性試劑在外加場(chǎng)下具有磁性的成像劑。順磁性試劑的例子包括但不限于，鐵顆粒包括納米顆粒。光學(xué)探針是可以通過(guò)一輻射波長(zhǎng)激發(fā)并在第二、不同的輻射波長(zhǎng)檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)的熒光化合物。本發(fā)明中有用的光學(xué)探針包括但不限于，Cy5.5、Alexa(亞歷克薩)680、Cy5、DiD(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸鹽)和DiR(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)。其他光學(xué)探針包括量子點(diǎn)。放射性核素是經(jīng)過(guò)放射性衰變的元素。本發(fā)明中有用的放射性核素包括但不限于：³H、¹¹C、¹³N、¹⁸F、¹⁹F、⁶⁰Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁸²Rb、⁹⁰Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁷Cs、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、Rn、Ra、Th、U、Pu和²⁴¹Am。診斷劑也可以包括螯合劑，如1,4,8,11-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、4,11-雙(羧甲基)-1,4,8,11-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷(CB-TE2A)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和1,4,7,10-四-氮雜環(huán)癸烷四乙酸(DOTA)。其它螯合劑在本發(fā)明的方法中是有用的。

任何合適的連接體可以用于本發(fā)明從而將結(jié)合劑連接到生物相容的固相支持體或治療或診斷劑。代表性的連接體可以具有約5到約100個(gè)連接原子，且可以包括乙烯-氧部分，胺，酯，酰胺，酮，脲，氨基甲酸酯和碳酸酯官能團(tuán)。本發(fā)明的方法中有用的其它連接體可具有約5至約50個(gè)連接原子，或約1至約10個(gè)連接原子，或約5至約10個(gè)連接原子。代表性的連接體包括但不限于，以下示出的那些：

任何合適的結(jié)合劑可以用于本發(fā)明的方法?？梢栽谏锱悸?lián)技術(shù)“Bioconjugate Techniques”Greg T.Hermanson,1996和ACS化學(xué)生物學(xué)(ACS Chemical Biology)2014,9,592-605中找到代表性的結(jié)合劑。例如，用于本發(fā)明方法的結(jié)合劑包括但不限于，環(huán)辛烯，四嗪，疊氮化物，炔，胺，活化的酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，硫醇，醛，酰胺，等等。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是環(huán)辛烯，四嗪，疊氮化物或炔。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是反式-環(huán)辛烯或1,2,4,5-四嗪。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是反式-環(huán)辛烯。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以是4-甲基-1,2,4,5-四嗪。

在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑和連接體共同結(jié)構(gòu)為：

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的組合物為

IV.選擇性遞送治療或診斷劑的方法

本發(fā)明提供通過(guò)將本發(fā)明的固相支持體組合物植入有此需要的患者，再將本發(fā)明的生物活性組合物給藥于患者的選擇性遞送治療或診斷劑的方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供選擇性遞送有效量的治療或診斷劑到患者目標(biāo)器官或組織的第一位置的方法。方法包括將本發(fā)明的固相支持體組合物植入患者目標(biāo)器官或組織的第一位置，其中固相支持體組合物包括第一結(jié)合劑。方法還包括將本發(fā)明的生物活性組合物給藥于患者，其中，所述生物活性組合物包括第二結(jié)合劑，其中第一和第二結(jié)合劑在接觸后互相結(jié)合，從而選擇性遞送有效量的治療或診斷劑到患者目標(biāo)器官或組織的第一位置。

使用本發(fā)明的方法可以靶向任何合適的器官或組織。代表性的器官或組織包括但不限于，骨，軟骨，韌帶，肌腱，腸，肌肉，神經(jīng)系統(tǒng)包括腦，脊髓，心臟，神經(jīng)和其他。例如，當(dāng)器官是心臟，本發(fā)明的方法可用于心臟修復(fù)。在一些實(shí)施方式中，患者目標(biāo)器官或組織的第一位置相對(duì)于目標(biāo)器官或組織的其他位置不能有選擇地通過(guò)化學(xué)或生物靶向劑打靶。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)器官或組織可以是骨。

在以上為固相支持體組合物和生物活性組合物的更多詳述中描述了適于本發(fā)明方法的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，第一結(jié)合劑可以是反式-環(huán)辛烯，第二結(jié)合劑可以是四嗪。在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)合劑可以是1,2,4,5-四嗪。在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)合劑可以是4-甲基-1,2,4,5-四嗪。

在一些實(shí)施方式中，可植入的組合物具有結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方式中，可植入的組合物可以是：

和

生物活性組合物可以是：

其中R可以是治療劑或診斷劑。

可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式植入生物相容的固相支持體。

治療或診斷劑可以足以治療患者患有的疾病或病癥的任何合適的量給藥。給藥的劑量、頻率和時(shí)間將很大程度上取決于所選擇的治療劑，待治療的病癥的性質(zhì)，患者的情況包括年齡、體重和其他病癥或疾病癥的存在，待給藥的制劑和主治醫(yī)師的判斷。通常，治療劑或診斷劑以每天約2毫克到至多約2000毫克的劑量給藥，然而必然將發(fā)生如上所述取決于疾病靶，患者和給藥途徑的變化。本發(fā)明的治療或診斷劑可以需要的頻率給藥，包括每小時(shí)，每天，每周或每月。本發(fā)明的制劑方法中使用的治療或診斷劑以每天約0.0001mg/kg到約1000mg/kg的初始劑量給藥?？梢允褂妹咳談┝糠秶s0.01mg/kg到約500mg/kg，或約0.1mg/kg到約200mg/kg，或約1mg/kg到約100mg/kg，或約10mg/kg到約50mg/kg。但是，劑量可以根據(jù)患者的要求、治療病癥的嚴(yán)重性和使用的化合物而變化。例如，考慮特定患者診斷疾病的類型和階段憑經(jīng)驗(yàn)確定劑量。施用給患者的劑量，在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)隨時(shí)間足以產(chǎn)生有益的治療效果，但通常低于沒(méi)植入將治療或診斷劑聚集在需要治療器官或組織處的生物相容的固相支持體情況下治療患者所需的劑量。劑量大小還將由伴隨將特定化合物給藥于特定患者的任何不良副作用的存在，性質(zhì)和程度來(lái)確定。特定情況的合適劑量的確定在醫(yī)師的技術(shù)范圍內(nèi)。通常，治療開(kāi)始時(shí)用較小的劑量，它小于化合物的最佳劑量。此后，以小的增量增加劑量直至達(dá)到情況下的最佳效果。為方便起見(jiàn)，如果需要，總?cè)談┝靠梢栽谝惶旆执尾糠纸o藥。劑量可每日給予，或隔天，如由治療醫(yī)生所確定的。也可以經(jīng)更長(zhǎng)的時(shí)間(周，月或年)定期或連續(xù)給予劑量。

在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)器官或組織的第一位置的治療或診斷劑的濃度高于患者其他位置的濃度。在一些實(shí)施方式中，治療劑是萬(wàn)古霉素。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供選擇性遞送有效量的治療或診斷劑到患者目標(biāo)器官或組織的第一位置的方法。方法包括在患者目標(biāo)器官或組織的第一位置植入具有生物相容的固相支持體和連接到所述固相支持體的第一結(jié)合劑的固相支持體組合物。方法還包括將具有治療或診斷劑，與第一結(jié)合劑互補(bǔ)的第二結(jié)合劑以及連接治療或診斷劑和第二結(jié)合劑的可釋放的連接體的生物活性組合物給藥至患者，以致第一和第二結(jié)合劑在接觸后互相結(jié)合。方法還包括釋放治療或診斷劑，從而將治療或診斷劑遞送至目標(biāo)器官或組織的第一位置。

V.制劑

本發(fā)明的組合物可以以各種各樣的口服，胃腸外和局部劑型來(lái)制備。口服制劑包括適合于患者咽下的片劑，丸劑，粉末，糖衣丸，膠囊，液體，錠劑，扁囊劑，凝膠，糖漿劑，膏劑，混懸劑等。本發(fā)明的組合物也可以通過(guò)注射，即通過(guò)靜脈，肌內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，十二指腸內(nèi)，或腹腔內(nèi)給藥。此外，本文描述的組合物可通過(guò)吸入給藥，例如，鼻內(nèi)給藥。另外，本發(fā)明的組合物可以經(jīng)皮給藥。本發(fā)明的組合物還可以通過(guò)眼內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸內(nèi)給藥，包括栓劑、吹入劑、粉末和氣霧劑(類固醇吸入劑的例子，見(jiàn)Rohatagi,臨床藥理學(xué)雜志“J.Clin.Pharmacol.”35:1187-1193,1995；Tjwa,過(guò)敏哮喘免疫學(xué)年報(bào)“Ann.Allergy Asthma Immunol.”75:107-111,1995)。此外，本發(fā)明還提供藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑以及本發(fā)明的化合物。

為從本發(fā)明化合物制備藥物組合物，藥學(xué)上可接受的載體可以是固體或液體。固體形式制劑包括粉劑，片劑，丸劑，膠囊劑，扁囊劑，栓劑和可分散顆粒劑。固體載體可以是一種或多種物質(zhì)，其也可以作為稀釋劑，調(diào)味劑，粘合劑，防腐劑，片劑崩解劑，或包封材料。關(guān)于制劑和給藥技術(shù)的細(xì)節(jié)在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有很好的描述，見(jiàn)，例如，雷明頓Remington的藥物科學(xué)的最新版本，Maack出版公司，伊斯頓PA(“雷明頓的”)。

在粉劑中，載體是細(xì)碎的固體，其在含細(xì)碎活性組分的混合物中。在片劑中，活性組分以合適的比例與具有所需性能的載體混合并被壓實(shí)成所需的形狀和大小。粉劑和片劑優(yōu)選含有5％或10％到70％的本發(fā)明化合物。

合適的固體賦形劑包括但不限于，碳酸鎂；硬脂酸鎂；滑石；果膠；糊精；淀粉；黃蓍膠；低熔點(diǎn)蠟；可可脂；碳水化合物；糖，包括但不限于，乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨糖醇；來(lái)自玉米，小麥，水稻，馬鈴薯或其他植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素鈉；和樹(shù)膠，包括阿拉伯和黃蓍膠；以及蛋白，包括但不限于，明膠和膠原蛋白。如果需要，可加入崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。

糖衣丸芯具有合適的包衣如濃縮的糖溶液，其還可以含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素可加入片劑或糖衣丸包衣用于產(chǎn)品識(shí)別或表征活性化合物的量(即，劑量)。也可以口服使用本發(fā)明的藥物制劑，例如使用如甘油或山梨糖醇的包衣和明膠制成的軟的，密封膠囊，以及明膠制成的推入配合膠囊。推入配合膠囊可以含有本發(fā)明的化合物，混合有填充劑或粘合劑如乳糖或淀粉，潤(rùn)滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂，和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，本發(fā)明的化合物可以溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙二醇，有或沒(méi)有穩(wěn)定劑。

為了制備栓劑，首先將低熔點(diǎn)蠟，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物融化，本發(fā)明的化合物均勻地分散其中，例如通過(guò)攪拌。然后將熔化的均勻混合物倒入適宜大小的模具中，使其冷卻并由此固化。

液體形式制劑包括溶液，懸浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。對(duì)于腸胃外注射，液體制劑可以在水性聚乙二醇溶液中配制成溶液。

適合于口服使用的水溶液可通過(guò)將本發(fā)明的化合物溶解在水中并根據(jù)需要加入合適的著色劑，調(diào)味劑，穩(wěn)定劑和增稠劑來(lái)制備。適于口服使用的水性混懸液可以通過(guò)將細(xì)碎的活性組分分散在水中制成，水中含有粘性物質(zhì)如天然或合成樹(shù)膠，樹(shù)脂，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素，海藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮，黃蓍樹(shù)膠和阿拉伯樹(shù)膠，和分散或潤(rùn)濕劑如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，環(huán)氧烷烴與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如，聚乙二醇硬脂酸酯)，環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物(例如，十七乙烯氧基十六醇)，環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物(如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液也可含有一種或多種防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑和一種或多種甜味劑，如蔗糖，阿司帕坦或糖精。制劑可用滲透度來(lái)調(diào)節(jié)。

還包括固體形式制劑，其在使用之前不久預(yù)期轉(zhuǎn)換為液體形式制劑用于口服給藥。這樣的液體形式包括溶液，懸浮液和乳液。除了活性成分外，這些制劑可以含有著色劑，調(diào)味劑，穩(wěn)定劑，緩沖劑，人工和天然甜味劑，分散劑，增稠劑，增溶劑等。

在另一實(shí)施方式中，可以配制本發(fā)明的組合物用于腸胃外給藥，如靜脈內(nèi)(IV)施用或給藥到器官的體腔或內(nèi)腔。用于給藥的制劑通常包括本發(fā)明的組合物溶解于藥學(xué)上可接受的載體形成的溶液。能夠被使用的可接受的載體和溶劑有水和林格氏溶液，等滲氯化鈉。此外，無(wú)菌固定油可以常規(guī)地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，可以采用任何溫和的固定油，包括合成的單或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸同樣可用于注射劑的制備中。這些溶液是無(wú)菌的，并且通常沒(méi)有不期望的物質(zhì)。這些制劑可以通過(guò)常規(guī)的，眾所周知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。當(dāng)需要接近生理?xiàng)l件時(shí)制劑可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑，例如，乙酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等。本發(fā)明的組合物在這些制劑中的濃度可以廣泛變化，并且將根據(jù)選擇的特定給藥模式和患者的需求主要基于流體體積，粘度，體重等進(jìn)行選擇。對(duì)于IV給藥，制劑可以是無(wú)菌可注射的制劑，如無(wú)菌可注射水性或油性懸浮液。這種懸浮液可以根據(jù)已知技術(shù)用那些適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶?rùn)劑和懸浮劑配制。無(wú)菌可注射制劑還可以是在無(wú)毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇溶液。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物的制劑可以通過(guò)使用與細(xì)胞膜融合或被內(nèi)吞的脂質(zhì)體遞送，即通過(guò)采用附著到脂質(zhì)體或直接附著到寡核苷酸的配體，其結(jié)合細(xì)胞的表面膜蛋白受體導(dǎo)致內(nèi)吞。通過(guò)使用脂質(zhì)體，特別是在脂質(zhì)體表面帶有特異于靶細(xì)胞的配體的位置，或以其它方式優(yōu)先定向特定器官，可以將本發(fā)明的組合物集中遞送到體內(nèi)的靶細(xì)胞(參見(jiàn)例如，Al-Muhammed,微膠囊雜志“J.Microencapsul.”13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。

VI.給藥

本發(fā)明的組合物可以通過(guò)任何合適的方式遞送，包括口服，腸道外和局部方法。經(jīng)皮給藥方法，通過(guò)局部途徑，可以配制成涂藥棒，溶液，懸浮液，乳液，凝膠，霜?jiǎng)?，軟膏劑，糊劑，膠凍劑，涂料，粉末和氣霧劑。

藥物制劑優(yōu)選為單位劑型。在這樣的形式中，制劑被細(xì)分為含有合適量本發(fā)明化合物的的單位劑量。單位劑型可以是包裝的制劑，含有離散量制劑的包裝，如包裝的片劑，膠囊和在小瓶或安瓿中的粉劑。此外，單位劑型可以是膠囊，片劑，扁囊劑或錠劑本身，或者它可以是合適數(shù)量的這些的包裝形式。

本發(fā)明的化合物可以任何合適的量存在，并且可以取決于各種因素，包括但不限于，對(duì)象的體重和年齡，疾病的狀態(tài)等。本發(fā)明化合物的合適劑量范圍包括約0.1毫克至約10,000毫克，或約1mg至約1000mg，或約10毫克到約750毫克，或約25毫克到約500毫克，或約50毫克至約250毫克。本發(fā)明的化合物的合適劑量包括約1毫克、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000毫克。

本發(fā)明的化合物可以任何合適的頻率，間隔和持續(xù)時(shí)間給藥。例如，本發(fā)明的化合物可以一次一小時(shí)給藥，或一個(gè)小時(shí)兩次、三次或更多次，每天一次，或每天兩次、三次或更多次，或每2，3，4，5，6或7天一次，以便提供優(yōu)選的劑量水平。當(dāng)本發(fā)明的化合物給藥多于每日一次，代表性的間隔包括5，10，15，20，30，45和60分鐘，以及1，2，4，6，8，10，12，16，20和24小時(shí)。本發(fā)明的化合物可以是施用一次，兩次，或三次或更多次，給藥一小時(shí)，1-6小時(shí)，1至12小時(shí)，1至24小時(shí)，6至12小時(shí)，12至24小時(shí)，一天，1至7天，單周，1至4周，一個(gè)月，1至12個(gè)月，一年或更多，或者甚至無(wú)限期。

本發(fā)明的化合物可與另一活性劑共同給藥。共同給藥包括在0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小時(shí)彼此施用本發(fā)明的化合物和活性劑。共同給藥還包括同時(shí)，大致同時(shí)(例如，彼此在約1、5、10、15、20或30分鐘內(nèi))，或以任何次序順序地給藥。此外，本發(fā)明的化合物和活性劑可以各自每天一次，或每天兩次、三次或更多次給藥，以提供每天優(yōu)選劑量水平。

在一些實(shí)施方式中，共同給藥可以通過(guò)共制劑實(shí)現(xiàn)，即制備包括本發(fā)明的化合物和活性劑兩者的單一的藥物組合物。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物和活性劑可以單獨(dú)配制。

本發(fā)明的化合物和活性劑可以任何合適的重量比存在于本發(fā)明的組合物中，例如從約1:100至約100:1(重量/重量)，或約1:50到約50:1，或約1:25至約25:1，或約1:10至約10:1，或約1:5至約5:1(重量/重量)。本發(fā)明的化合物和其他活性劑可以任何合適的重量比存在，例如約1:100(重量/重量)、1:50、1:25、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、25:1、50:1或100:1(重量/重量)。本發(fā)明的化合物和活性劑的其他劑量和劑量比在本發(fā)明的組合物和方法中適用。

VII.實(shí)施例

材料除非另有說(shuō)明，全部試劑和NMR溶劑購(gòu)自西格瑪-奧爾德里奇Sigma-Aldrich(圣路易斯,密蘇里州)?；衔?獲自虹膜生物技術(shù)Iris Biotech(馬克特雷德維茨,德國(guó))，而化合物8購(gòu)自Polypure(奧斯陸,挪威)。DOTA-NHS酯獲自Macrocyclics(達(dá)拉斯,德克薩斯州)。硅膠購(gòu)自Silicycle(魁北克,加拿大)，而制備TLC板(20x 20cm；厚度1000μm)購(gòu)自安萊爾科技Analtech(紐瓦克,DE)。超純海藻酸購(gòu)自ProNova生物醫(yī)學(xué)(挪威)。[¹¹¹In]氯化銦溶液購(gòu)自珀金埃爾默PerkinElmer(沃爾瑟姆,美國(guó))。稀鹽酸中的[⁶⁴Cu]氯化銅購(gòu)自華盛頓大學(xué)(圣路易斯,密蘇里州)或采用11MeV西門子RDS 111回旋加速器通過(guò)64Ni(p,n)64Cu核反應(yīng)內(nèi)部制作并通過(guò)陰離子交換色譜法(Biorad AG 1-X8)純化。Dulbecco杜氏磷酸緩沖鹽(DPBS)購(gòu)自英杰公司(卡爾斯巴德,加利福尼亞最高)。

方法采用瓦里安400MHz VNMRS儀器在CDCL₃或[D₆]DMSO中進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)。在波士頓大學(xué)化學(xué)儀器中心使用安捷倫離子阱LC/MSD SL得到高分辨率ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)，無(wú)論是陽(yáng)性或陰性測(cè)定。在有機(jī)合成階段，使用裝有沃特斯(Waters)XBridge C18柱(19×250毫米)的安捷倫Agilent 1100系列，應(yīng)用梯度含0.1％TFA的MeCN和水，進(jìn)行HPLC純化。

放射化學(xué)期間，對(duì)于體內(nèi)分析和純化，使用裝有Jupiter Proteo C-12柱(250×4.6mm,4μm,菲羅門Phenomenex,托倫斯,加利福尼亞州)以及串聯(lián)至Bioscan公司的FlowCount光電倍增管(PMT)(Bioscan,華盛頓,哥倫比亞特區(qū))的單波長(zhǎng)或二極管陣列UV檢測(cè)器(設(shè)置220和254nm)的貝克曼-柯?tīng)柼叵到y(tǒng)金(Beckman-Colter System Gold)128色譜系統(tǒng)實(shí)施反相HPLC。使用32Karat軟件包(Beckman-Colter)分析數(shù)據(jù)。流動(dòng)相由溶劑A：水中0.05％三氟乙酸和溶劑B：100％乙腈構(gòu)成，1.5毫升/分鐘的流速，注射后2分鐘開(kāi)始線性梯度，在30分鐘內(nèi)從9％溶劑B，然后增加至81％，除非另有說(shuō)明。

使用海藻酸凝膠的體外實(shí)驗(yàn)期間，在裝有沃特斯2487雙吸光度檢測(cè)器(220和320毫微米)和Bioscan公司的Flow-count放射性檢測(cè)器的沃特斯微風(fēng)(Waters Breeze)色譜系統(tǒng)上實(shí)施分子篩高效液相色譜(HPLC)。采用pH 6.8，0.1M磷酸鈉，以1.0mL/min等度洗脫P(yáng)henomenex BioSep SEC-S3000柱(7.8×300mm)。

通過(guò)放射-TLC，采用ITLC-SG條(頗爾生命科學(xué)Pall Life Sciences,安阿伯,密歇根州)檢測(cè)⁶⁴Cu和¹¹¹In標(biāo)記產(chǎn)量，采用0.9％NaCl水溶液中的200mM EDTA洗脫，采用Bioscan 200成像掃描儀(Bioscan,華盛頓哥倫比亞特區(qū))實(shí)施。在這些條件下，游離的放射性核素遷移Rf＝0.9，而連接到四嗪6的放射性核素保持在原處。

使用Inveon臨床前成像站(西門子醫(yī)療解決方案)獲得PET/CT數(shù)據(jù)。

動(dòng)物處理根據(jù)加利福尼亞大學(xué)，戴維斯分校，動(dòng)物使用和管理委員會(huì)認(rèn)可的方案處理所有動(dòng)物。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組變化描述為平均值±一標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)比較單組。P<0.05的組被認(rèn)為是顯著差異的。微軟Excel版本12.8.9用于所有的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

實(shí)施例1 TCO改性海藻酸1的制備

以下描述TCO改性海藻酸的制備，首先制備TCO-連接體，然后連接至海藻酸。

(R,E)-N-(2-氨乙基)-2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧)乙酰胺(5)。化合物3(100mg,0.54mmol)、N-羥基琥珀酰胺(69mg,0.60mmol)和N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(123mg,0.60mmol)溶于CH₂Cl₂(2mL)并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。通過(guò)PVDF膜濾掉沉淀脲。采用CH₂Cl₂(1mL)清洗膜。將母液加入到攪拌中的乙二胺(324mg,5.4mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。采用水(2×10mL)洗滌反應(yīng)混合物。采用硫酸鎂干燥有機(jī)層并減壓濃縮。使用4:1的CH₂Cl₂和MeOH的混合物作為溶劑在制備型硅膠TLC上純化產(chǎn)物。化合物5的產(chǎn)量是60mg(49％)。¹H NMR(CDCl₃)δ7.08(bs,1H),5.61-5.45(m,2H),3.92(q,J＝11.23Hz,2H),3.64(dd,J1＝9.91Hz,J2＝4.73Hz,1H),3.36(q,J＝6.07Hz,2H),2.87(bs,2H),2.31-2.16(m,4H),2.08-2.04(m,1H),1.89-1.49(m,5H)。¹³C NMR(CDCl³)δ170.34,135.48,131.37,75.80,68.31,41.28,40.05,34.28,32.53,29.74,27.85。HRMS:m/z[M+H]⁺計(jì)算C₁₂H₂₃N₂O₂227.1754,實(shí)測(cè)227.1791。

在標(biāo)準(zhǔn)碳化二亞胺化學(xué)條件下每克UP MVG海藻酸與176微摩TCO-胺結(jié)合，如之前對(duì)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)和甘氨酸-組氨酸-賴氨酸(GHK)摻合所述。然后通過(guò)用含有降低鹽濃度的去離子水透析4天純化海藻酸產(chǎn)物，冷凍并凍干5-10天直到干燥。通過(guò)添加DPBS得到2.5％海藻酸溶液，并通過(guò)加入鈣制備海藻酸凝膠。通過(guò)1H-NMR研究(見(jiàn)圖20-22)證實(shí)海藻酸的共價(jià)修飾。不添加TCO的相同方案用于構(gòu)建對(duì)照凝膠。用完全相同批次的TCO-凝膠完成體外和體內(nèi)研究并在同一天使用以最大程度降低負(fù)載量或負(fù)載效率中的任何變化。

對(duì)于體外試驗(yàn)，800μl 2.5％的海藻酸溶液與200μl過(guò)飽和Ca(SO₄)₂溶液(每毫升雙蒸水(ddH₂O)0.21g Ca(SO₄)₂)。使用三通活塞混合溶液30秒從而獲得2％終濃度海藻酸。混合物在特制塑料模具內(nèi)的兩塊玻璃板之間膠凝并在室溫孵育20分鐘。總體具有與膠凝作用一致的均勻外觀。用刮鏟拾起盤片，單獨(dú)稱重。通常情況下，預(yù)制盤重約100毫克，并大致具有如下尺寸：8mm(直徑)和2mm(高度)。

對(duì)于體內(nèi)使用，2.5％的海藻酸凝膠溶液和過(guò)飽和硫酸鈣溶液按上述相同的比例迅速混合，并立即以所需量注射到動(dòng)物。

實(shí)施例2制備四嗪-改性診斷劑

如前所述合成Tz輻射探針2(R.Rossin,P.R.Verkerk,S.M.van den Bosch,R.C.Vulders,I.Verel,J.Lub,M.S.Robillard,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2010,49,3375).

實(shí)施例3制備(E)-環(huán)辛-2-烯基2-氨乙基氨基甲酸酯

根據(jù)Versteegen,R.M.等,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112-14116中描述的方案制備標(biāo)題化合物。

實(shí)施例4制備可釋放的TCO-改性診斷劑

將熒光素-NHS酯(134mg,0.283mmol)和(Z)-環(huán)辛-2-烯基2-氨乙基氨基甲酸酯(60.0mg,0.283mmol)溶于DMF(5mL)。加入三乙胺(77μL,0.566mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用1:9的MeOH:CH₂Cl₂混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。產(chǎn)量＝90mg(55.6％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.42(s,1H),8.17(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(d,J＝8.2Hz,1H),6.86(s,2H),6.57-6.50(m,4H),5.78(t,J＝12.3Hz,1H),5.47(d,J＝16.4Hz,1H),5.2(app s,1H),3.61-3.31(m,5H),2.32(bs,1H),1.98-1.88(m,3H),1.83-1.77(m,1H),1.69-1.04(m,5H),0.83-0.75(m,1H).¹³C NMR(CD₃OD,100MHz)δ168.74,161.63,158.85,156.60,154.17,137.94,135.62,132.86,132.70,130.20,125.81,125.31,113.89,111.03,103.81,75.43,41.69,41.21,37.08,36.67,30.14,25.27.HRMS(ESI-MS)m/z:計(jì)算C₃₂H₃₀N₂O₈[M+H⁺]571.2080；實(shí)測(cè)571.2025.

實(shí)施例5制備TCO-改性診斷劑

將2-((E)-環(huán)辛-2-烯基氧)-N-(2-氨乙基)乙酰胺(50.0mg,0.221mmol)和熒光素-NHS酯(105mg,0.221mmol)溶于DMF(5mL)。加入三乙胺(60μL,0.442mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用1:9的MeOH:CH₂Cl₂混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。產(chǎn)量＝51mg(39.5％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.46(s,1H),8.21(d,J＝8.2Hz,1H),7.65(bs,1H),7.28(d,J＝8.2Hz,1H),6.69(d,J＝2.7Hz,2H),6.58-6.50(m,4H),5.46-5.44(m,2H),3.91(d,J＝5.5Hz,2H),3.65-3.59(m,5H),2.67(s,1H),2.32-2.26(m,2H),2.32-2.26(m,2H),2.20-2.13(m,1H),2.08(d,J＝4.2Hz,1H),1.96-1.92(m,1H),1.79-1.67(m,3H),1.54-1.46(m,1),1.30-1.25(m,1H),1.23-1.15(m,1H)。¹³C NMR(CD₃OD,100MHz)δ173.60,170.67,168.69,154.21,137.21,137.66,136.66,136.75,132.53,130.30,125.89,125.09,113.84,110.98,103.79,77.56,69.38,41.31,40.75,40.07,39.94,35.50,33.58,30.82,29.05。HRMS(ESI-MS)m/z:計(jì)算C₃₃H₃₂N₂O₈[M+H⁺]585.2237；實(shí)測(cè)585.2183.

實(shí)施例6制備可釋放的TCO-改性阿莫西林

將(E)-環(huán)辛-2-烯基4-硝基苯基碳酸酯(100mg,0.343mmol)和阿莫西林(82.0mg,0.224mmol)溶于DMF(5mL)。加入三乙胺(87μL,0.634mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用1:9的MeOH:CH₂Cl₂混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。產(chǎn)量＝36mg(31％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.49(bs,1H),7.57(dd,J₁＝21.8Hz,J₂＝8.2Hz,1H),7.24(d,J＝6.8Hz,2H),6.67(d,J＝6.9Hz,2H),5.81–5.76(m,1H),5.51(d,J＝16.4Hz,1H),5.29(s,1H),5.17(s,1H),4.92(s,1H),4.33(s,1H),3.62(s,3H),3.38(s,1H),2.50(s,2H),2.38(bs,1H),1.98-1.88(m,3H),1.81-1.75(m,1H),1.64-1.53(m,2H),1.37(s,3H),1.19-1.12(m,4H),0.81-0.78(m,2H)。¹³C NMR(CD₃OD,100MHz)δ170.49,156.77,154.78,132.16,131.87,131.24,130.95,128.60,114.83,72.99,65.73,59.77,59.07,57.53,57.03,56.89,51.93,48.60,35.54,35.31,28.46,27.07,26.76,23.67,23.54。HRMS(ESI-MS)m/z:計(jì)算C₃₃H₃₂N₂O₈[M+MeO^-]548.2072；實(shí)測(cè)548.2042。

實(shí)施例7制備TCO-改性阿莫西林

將2-((E)-環(huán)辛-2-烯基氧)乙酸(85.0mg,0.461mmol)、N-羥基琥珀酰胺(53.0mg,0.461mmol)和N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(95.0mg,0.461mmol)溶于CH₂Cl₂(5mL)。室溫?cái)嚢?8小時(shí)。過(guò)濾沉淀物并減壓濃縮上清液。加入阿莫西林(160mg,0.438mmol)的DMF(10mL)溶液并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用1:9的MeOH:CH₂Cl₂混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。產(chǎn)量＝20mg(8.6％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ7.33(t,J＝9.5Hz,1H),7.24(t,J＝0.6Hz,1H),6.76(d,J＝8.2Hz,2H),5.68-5.45(m,4H),4.32(bs,1H),3.99-3.09(m,2H),3.72(s,1H),3.47(bs,1H),2.67(s,6H),2.37-1.96(m,5H),1.85-1.80(m,3H),1.56(s,3H),1.47(s,3H),1.28-1.17(m,3H)。¹³C NMR(CD₃OD,100MHz)δ175.08,172.65,171.82,158.81,131.16,131.07,130.69,130.13,129.98,129.89,116.69,83.19,68.67,66.71,59.88,58.86,57.05,53.13,35.26,35.14,34.26,34.19,27.18,26.75,26.69,26.41,23.44,23.41。HRMS(ESI-MS)m/z:計(jì)算C₃₃H₃₂N₂O₈[M+MeO^-]548.2072；實(shí)測(cè)548.2042。

實(shí)施例8制備改性瓊脂糖

NHS活化瓊脂糖吸附柱購(gòu)自皮爾斯/賽默飛世爾科技公司(Pierce/Thermo Fisher Scientific)(羅克福德,伊利諾斯州)。采用制造商推薦方案將圖16B的1a或1b的胺前體連接至瓊脂糖珠。簡(jiǎn)言之，33mg干瓊脂糖與4μmol的1a或1b的胺前體在pH 7.4PBS緩沖液中孵育3小時(shí)，溫和地混合。采用PBS洗滌瓊脂糖珠數(shù)次。通過(guò)監(jiān)測(cè)洗滌獲得的上清液在520nm的吸光度估算結(jié)合到柱的1a或1b的量。瓊脂糖上未反應(yīng)的NHS基團(tuán)被1M Tris(pH 7.4)封端。

實(shí)施例9捕獲和釋放連接體的動(dòng)力學(xué)

用2微摩TCO-R-羅丹明((E)-5-((2-(((環(huán)辛-2-烯-1-基氧)羰基)氨基)乙基)氨甲酰基)-2-(3-(二甲基-⁴-偶氮烯)-6-(二甲基氨基)-3H-氧雜蒽-9-基)苯甲酸)處理采用上述方法的用1a或1b改性的瓊脂糖珠2分鐘。快速離心后收集上清，并將瓊脂糖重懸于水中。在固定時(shí)間間隔收集上清并用ESI-MS分析。

在賽默飛世爾科技公司(西棕櫚灘,加利福尼亞州)線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱(LTQ Orbitrap Velos)質(zhì)譜儀上采用石英毛細(xì)管發(fā)射器分析樣本。為便于噴霧優(yōu)化，在質(zhì)譜分析之前將10％異丙醇加到各樣本。以陽(yáng)性模式分析釋放產(chǎn)物，羅丹明乙二胺(5-((2-氨乙基)氨甲?；?-2-(3-(二甲基-⁴-偶氮烯)-6-(二甲基氨基)-3H-氧雜蒽-9-基)苯甲酸)。單獨(dú)合成釋放產(chǎn)物羅丹明乙二胺用于ESI-MS校正(圖SX)。采用校正曲線評(píng)估各步驟上清液中羅丹明乙二胺的量。

實(shí)施例10制備改性Tz-Me-海藻酸

在標(biāo)準(zhǔn)碳化二亞胺化學(xué)條件下每克UP MVG海藻酸與176微摩(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)甲胺(Tz-Me–胺)結(jié)合，如之前對(duì)RGD、GHK和TCO胺摻合所述。然后通過(guò)用含有降低鹽濃度的去離子水透析4天純化海藻酸產(chǎn)物，冷凍并凍干5-10天直到干燥。通過(guò)添加ddH2O得到2.5％海藻酸溶液，并通過(guò)加入鈣制備海藻酸凝膠。通過(guò)1H-NMR研究(見(jiàn)圖23)證實(shí)海藻酸的共價(jià)修飾。不添加TCO的相同方案用于構(gòu)建對(duì)照凝膠。用完全相同批次的TCO-凝膠完成體外和體內(nèi)研究并在同一天使用以最大程度降低負(fù)載量或負(fù)載效率中的任何變化。

對(duì)于體內(nèi)使用，800微升2.5％的海藻酸溶液和200微升過(guò)飽和硫酸鈣溶液(0.21g Ca(SO4)2/ml ddH2O)混合。采用三通活塞混合溶液30秒從而獲得2％海藻酸終濃度。立即以所需量將混合物注射給動(dòng)物。

實(shí)施例11捕獲和釋放連接體的體內(nèi)評(píng)價(jià)

IACUC批準(zhǔn)后，通過(guò)不注射或注射一種海藻酸(對(duì)照相對(duì)Tz-凝膠)在nu/nu小鼠上實(shí)施體內(nèi)熒光實(shí)時(shí)生物分布研究。然后對(duì)象接受尾靜脈注射TCO-R-F或TCO-NR-F。陰性對(duì)照為：1.無(wú)凝膠，用TCO-R-F(陰性對(duì)照，小鼠1)；2.含TCO-R-F的對(duì)照海藻酸(凝膠對(duì)照，小鼠4)。兩實(shí)驗(yàn)組為Tz-凝膠以及或者TCO-R-F(釋放方案，小鼠2)或TCO-NR-F(固定化方案，小鼠3)。采用IVIS光譜儀(珀金埃爾默，馬薩諸塞州)檢測(cè)熒光并記錄輻射。

實(shí)施例12可釋放萬(wàn)古霉素的最小抑制濃度(MIC)

我們?cè)赿dH2O中過(guò)夜制備含常規(guī)海藻酸凝膠或Tz-凝膠的萬(wàn)古霉素或TCO-R-萬(wàn)古霉素的連續(xù)稀釋液。翌日，將2.2％Mueller Winto肉湯中的發(fā)光甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(Staph.Aureus,MSSA,Xen 29,珀金埃爾默,MA)加至混合物。然后將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱24小時(shí)，并使其生長(zhǎng)24小時(shí)(n＝3)。然后采用IVIS光譜儀(珀金埃爾默，馬薩諸塞州)檢測(cè)熒光并記錄輻射率。

實(shí)施例13制備可釋放的TCO-羅丹明

如Brunet,A.；Aslam,T.；Bradley,M.Bioorg.Med.Chem.Lett.2014,24,3186-3188所描述的合成羅丹明-NHS酯。將羅丹明-NHS酯(50mg,0.095mmol)和(E)-環(huán)辛-2-烯基-2-氨乙基氨基甲酸酯(40.0mg,0.190mmol)溶于CH2Cl2(5mL)。加入三乙胺(129μL,0.95mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。采用7.5:2.5:90MeOH:Et3N:CH2Cl2混合物作為流動(dòng)相通過(guò)制備型薄層色譜純化。產(chǎn)量＝28mg(47％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.54(s,1H),8.04(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.23(d,J＝9.6Hz,1H),6.99(dd,J1＝2.7Hz,J2＝9.5Hz,1H),6.89(d,J＝2.8Hz,1H),5.85(t,J＝13.7Hz,1H),5.55(d,J＝16.4Hz,1H),5.26(s,1H),3.67-3.36(m,4H),3.32-3.21(m,9H),2.93-2.77(m,6H),2.49-2.36(m,1H),2.10-1.79(m,5H),1.78-1.41(m,4H),1.39-1.25(m,1H),1.22-1.06(m,10H),0.93-0.79(m,1H).¹³C NMR(CD3OD,100MHz)δ172.47,169.41,161.68,159.08,158.76,142.06,137.19,132.96,132.70,130.90,129.85,129.63,115.09,114.86,97.53,76.85,75.38,41.96,41.78,41.01,37.18,36.92,30.21,25.35。HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C36H41N4O6[M+1]+625.3026；實(shí)測(cè)625.2976.

實(shí)施例14制備非-可釋放的TCO-羅丹明

將羅丹明-NHS酯(50mg,0.095mmol)和2-((E)-環(huán)辛-4-烯基氧)-N-(2-氨乙基)乙酰胺(43.0mg,0.190mmol)溶于CH2Cl2(5mL)。加入三乙胺(129uL,0.95mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用7.5:5:2.5:90的MeOH:Et₃N:CH₂Cl₂混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。產(chǎn)量＝35mg(58％).1H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.57(s,1H),8.07(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.22(d,J＝8.2Hz,2H),6.97(dd,J1＝2.7Hz,J2＝9.6Hz,2H),6.88(d,J＝2.7Hz,2H),5.61-‐5.43(m,2H),3.94(d,J＝4.1Hz,2H),3.69-‐3.55(m,6H),3.31(s,2H),2.41-‐2.31(m,2H),2.27-‐2.14(m,2H),2.03-‐1.95(m,1H),1.90(s,2H),1.84-1.71(m,4H),1.61-‐1.50(m,2H).13C NMR(CD₃OD,100MHz)δ173.49,172.35,169.46,161.47,159.04,158.71,142.12,136.97,136.88,132.70,132.57,129.84,129.65,115.02,114.83,97.55,77.65,69.44,41.40,41.00,35.58,33.62,30.88,29.10.HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C37H43N4O6[M+1]+639.3183；實(shí)測(cè)639.3151.

實(shí)施例15羅丹明釋放產(chǎn)物

將羅丹明-NHS酯(20.0mg,0.0379mmol)和N-Boc-乙二胺(13.2mg,0.0758mmol)溶于CH2Cl2(5mL)。加入三乙胺(51L,0.379mmol)并在室溫?cái)嚢?8h。高真空下蒸發(fā)溶劑并將反應(yīng)混合物重溶于甲醇。通過(guò)制備型薄層色譜采用10:5:85的MeOH:Et3N:CH2Cl2混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行純化。分離產(chǎn)物用4:1的CH2Cl2:TFA(5mL)混合物處理1h。產(chǎn)量＝18mg(81％)。¹H NMR(CD3OD,400MHz).8.83(s,1H),8.32(d,J＝9.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,1H),7.13(d,J＝9.6Hz,2H),7.05(dd,J1＝6.8Hz,J2＝2.7Hz,2H),6.96(d,J＝2.7Hz,2H),3.77(t,J＝5.4Hz,,2H),3.30(s,12H),3.22-3.17(m,2H)。¹³C NMR(CD3OD,100MHz).169.28,167.47,160.69,159.10,138.52,132.63,132.11,132.02,131.67,115.71,114.85,97.63,41.08,40.97,39.06。HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C27H29N4O4[M+1]+473.2189；實(shí)測(cè)473.2141.

實(shí)施例16可釋放的TCO-萬(wàn)古霉素

將萬(wàn)古霉素(50.0mg,0.0345mmol)和三乙胺(20μL,0.145mmol)溶于水(1mL)中。加入(E)-環(huán)辛-2-烯基4-硝基苯基碳酸酯(19.0mg,0.0652mmol)的DMF(25μL)溶液。在40℃攪拌反應(yīng)混合物18h。通過(guò)45μm PTFE膜濾掉沉淀。上清液經(jīng)HPLC純化從而獲得標(biāo)題化合物。梯度10-60％CH₃CN的水溶液用于HPLC純化。產(chǎn)量＝3mg(5.5％)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.61(s,1H),7.55-7.38(m,2H),7.19(bs,1H),7.03(s,1H),6.81(bs,1H),6.44(s,1H),6.38(s,1H),6.05(bs,1H),5.55-5.37(m,2H),5.32(s,1H),5.23(s,1H),4.68(s,36H),4.52-4.31(m,2H),4.15(s,1H),4.00(t,J＝8.2Hz,1H),3.85-3.61(m,3H),3.56(t,J＝8.2Hz,1H),3.35(s,1H),2.67(s,4H),2.03-1.88(m,2H),1.75-1.39(m,3H),1.33(s,3H),1.05(s,3H),0.75(dd,J1＝8.2Hz,J2＝13.7Hz,6H)。HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C75H87Cl2N9O26[M+1]+1602.4660；實(shí)測(cè)1602.5256.

實(shí)施例17可釋放的TCO-達(dá)托霉素

達(dá)托霉素(100mg,0.062mmol)溶于水(1mL)中。加入(E)-環(huán)辛-2-烯基4-硝基苯基碳酸酯(36mg,0.123mmol)的DMF(50μL)溶液，隨后加入三乙胺(167mg,1.65mmol)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物18小時(shí)。使用半制備型菲羅門(Phenomenex)Luna 5u C18(2)柱和梯度10-65％CH₃CN的水溶液經(jīng)HPLC純化后獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為白色泡沫。產(chǎn)量＝44mg(40％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ7.66(bs,2H),7.60-7.46(m,2H),7.39(s,1H),7.25-7.11(m,2H),7.02(s,1H),6.96(s,1H),6.83-6.78(m,1H),6.56(s,1H),6.00-5.68(m,4H),5.68-5.57(m,1H),5.54(s,1H),5.51-5.26(m,8H),5.14(bs,1H),4.96(bs,1H),4.67(s,1H),4.64(s,1H),4.58(s,1H),4.14(s,1H),3.88-3.79(m,2H),3.78-3.71(m,1H),3.59-3.43(m,2H),3.19(q,J＝8.2Hz,7H),2.95(bs,4H),2.59-2.32(m,5H),2.23-1.76(m,15H),1.56-1.44(m,8H),1.30(t,J＝8.1Hz,10H),1.23-1.16(m,5H),1.00-0.87(m,9H)。MS(ESI)m/z:計(jì)算C₇₅H₈₇Cl₂N₉O₂₆[M+H+MeCN]⁺1813.82；實(shí)測(cè)1813.80.

實(shí)施例18可釋放的TCO-阿霉素

根據(jù)Versteegen,R.M.等.,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112-14116所描述合成(E)-環(huán)辛烯阿霉素偶聯(lián)物。¹H NMR(CDCl₃)譜圖與公開(kāi)數(shù)據(jù)相符。

實(shí)施例19可釋放的TCO-環(huán)腺苷酸

環(huán)腺苷酸(80mg,0.243mmol)和(E)-環(huán)辛-2-烯基4-硝基苯基碳酸酯(142mg,0.486mmol)溶于無(wú)水DMF(8mL)。加入4-二甲基氨基吡啶(238mg,1.94mmol)并在30℃攪拌反應(yīng)混合物18h。高真空下去除溶劑，采用15％MeOH的二氯甲烷溶液作為流動(dòng)相經(jīng)制備柱色譜后獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為白色泡沫。產(chǎn)量＝45mg(38％)。¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.61(s,1H),7.57-7.41(m,2H),7.19(bs,1H),7.03(s,1H),6.81(bs,1H),6.44(s,1H),6.38(s,1H),6.06(bs,1H),5.53-5.39(m,2H),5.32(s,2H),5.24(s,1H),4.48(bs,2H),4.16(s,1H),4.00(t,J＝6.8Hz,1H),3.83-3.61(m,3H),3.60-3.50(m,1H),3.35(s,1H),2.68(s,4H),2.03-1.90(m,2H),1.75-1.40(m,3H),1.33(s,3H),1.05(s,3H),0.74(dd,J1＝8.2Hz,J2＝13.6Hz,6H)。HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C₁₉H₂₅N₅O₈P[M+1]⁺482.1441；實(shí)測(cè)482.1461.

實(shí)施例20可釋放的TCO-化合物3

化合物3(132mg,0.413mmol)和(E)-環(huán)辛-2-烯基4-硝基苯基碳酸酯(80mg,0.275mmol)溶于無(wú)水DMF(5mL)。加入三乙胺(167mg,1.65mmol)并在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物18小時(shí)。高真空下去除溶劑，采用10％MeOH的二氯甲烷溶液作為流動(dòng)相經(jīng)制備柱色譜后獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為白色泡沫。產(chǎn)量＝70mg(36％)。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.28(s,1H),5.93(d,J＝6.9Hz,1H),5.89-5.78(m,1H),5.54(bs,1H),5.28(bs,1H),4.73(t,J＝5.5Hz,1H),4.37-4.31(m,1H),4.23-4.13(m,3H),3.92(d,J＝10.9Hz,1H),3.73(d,J＝12.3Hz,1H),3.65-3.40(m,1H),3.35(s,1H),3.31(s,1H),2.47-2.30(m,1H),2.10-1.75(m,4H),1.75-1.57(m,2H),1.53(m,1H),1.26(bs,1H),1.18-1.06(m,2H),0.91-0.74(m,1H)。HRMS(ESI)m/z:計(jì)算C₂₂H₂₈N₆O₆[M+1]⁺473.2149；實(shí)測(cè)473.2117.

盡管為了清楚理解的目的以說(shuō)明和舉例的方式相當(dāng)詳細(xì)描述前述發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以作出某些改變和修改。另外，本文提供的各參考通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文，如同通過(guò)引用單獨(dú)并入各參考相同的程度。本申請(qǐng)和本文提供的參考之間存在沖突之處，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。