本發(fā)明涉及含有槲皮素糖苷的肌肉萎縮抑制劑。

背景技術(shù)：

針對(duì)日本迎來了超高齡社會(huì)、中老年人的社會(huì)參與或閑暇的度過方式等提出了多項(xiàng)議案。另一方面，伴隨著人口的高齡化而顯著化的運(yùn)動(dòng)器官障礙的問題，由于其對(duì)象數(shù)量極多，而且存在重癥例、多種疾病并發(fā)的例子等，從而是僅通過迄今為止的想法的延伸而難以應(yīng)對(duì)的新課題。尤其是，肌肉萎縮引起的運(yùn)動(dòng)器官功能的降低會(huì)帶來摔倒風(fēng)險(xiǎn)提高、骨折、長期臥床、進(jìn)而肌肉萎縮以及運(yùn)動(dòng)器官功能低下這樣的惡性循環(huán)，是運(yùn)動(dòng)器官不穩(wěn)定癥、運(yùn)動(dòng)器官綜合癥等的主要原因之一。進(jìn)而，由于肌肉萎縮性的運(yùn)動(dòng)器官功能障礙會(huì)提高代謝障礙、感染癥的并發(fā)頻率等，不僅使生活的品質(zhì)(生活質(zhì)量(QOL))變差而且使原疾病的預(yù)后也變差，故而在迎來超高齡化社會(huì)之際，是必須解決的緊迫課題。目前，作為上述運(yùn)動(dòng)器官功能低下的預(yù)防方法，除康復(fù)等的運(yùn)動(dòng)療法以外，研究了營養(yǎng)學(xué)的方法，從而發(fā)現(xiàn)了可增強(qiáng)肌肉量的成分(參考專利文獻(xiàn)1及2)。

已知肌肉萎縮會(huì)因各種要因而發(fā)生，認(rèn)為尤其是糖皮質(zhì)激素的水平的提高與肌肉萎縮有關(guān)。由于作為合成糖皮質(zhì)激素的一種的去氫氫化可的松在肌肉組織內(nèi)使參與肌肉分解的Atrogin-1及MuRF-1的表達(dá)提高，故而糖皮質(zhì)激素處理的培養(yǎng)肌管細(xì)胞作為肌肉萎縮模型而通用。已知在肌肉組織中，去氫氫化可的松與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后，促進(jìn)具有糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合區(qū)域的基因的表達(dá)，進(jìn)而該基因表達(dá)參與肌肉蛋白的分解亢進(jìn)、作為肌肉母細(xì)胞的衛(wèi)星細(xì)胞的分化抑制(參考非專利文獻(xiàn)1)。起因于該去氫氫化可的松的代謝變化與在動(dòng)物、人的肌肉萎縮中所觀察到的變化類似，從而去氫氫化可的松誘發(fā)性肌肉萎縮模型在肌肉萎縮的機(jī)制分析中通用。

在此，已知肌肉生長抑制素(以下，省略為Mstn)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族，承擔(dān)著負(fù)向控制肌肉生長的功能(參考非專利文獻(xiàn)2)。據(jù)報(bào)道該Mstn抑制衛(wèi)星細(xì)胞的分化，介由Akt經(jīng)路及Foxo1的抑制而促進(jìn)肌肉分解，進(jìn)而介由mTOR經(jīng)路而抑制肌肉合成(參考非專利文獻(xiàn)3)。而且，還已知在Mstn缺陷小鼠中，不會(huì)發(fā)生去氫氫化可的松誘發(fā)性的肌肉萎縮(參考非專利文獻(xiàn)4)。據(jù)報(bào)道Mstn除參與肌肉量增加以外，還參與脂肪組織的肥大化、心功能的惡化，與野生型小鼠相比，在Mstn缺陷小鼠中脂肪組織少而且應(yīng)激負(fù)荷引起的對(duì)心功能的負(fù)擔(dān)減輕(參考非專利文獻(xiàn)5)。迄今為止，作為抑制Mstn的組合物，報(bào)道了紅茶提取物(參考專利文獻(xiàn)3)。

作為在植物中富含的多酚之一的槲皮素直接或以糖苷(蘆丁、槲皮苷等)的形式包含于柑橘類、洋蔥、蕎麥、槐樹等各種植物中。已知槲皮素或其糖苷具有血小板的凝集抑制及粘結(jié)抑制作用、血管擴(kuò)張作用、抗癌作用等多種生理功能。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1日本特開2009-62346號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2WO2011/108487A1號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)3日本特開2013-91608號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1Yanjun,et al,PLos One,2013,8(13),e58554

非專利文獻(xiàn)2David,et al,Med Sci Sports Exerc,2011,43(10),1828-1835

非專利文獻(xiàn)3Elkina,et al,J Cachexia Sarcopenia Muscle,2011,2,143-151

非專利文獻(xiàn)4H.Gilson,et al,Endocrinology,2007,148(1),452-460

非專利文獻(xiàn)5Mellisa,et al,Journal of Endocrinology,2012,213,263-275

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在肌肉萎縮抑制劑的開發(fā)中，需要找到抑制參與肌肉分解促進(jìn)及肌肉合成抑制的Mstn的成分。然而，目前僅報(bào)道紅茶提取物的Mstn抑制作用(參考專利文獻(xiàn)3)，還沒有已找到來自天然產(chǎn)物的單一成分的Mstn抑制作用的例子。本發(fā)明所要解決的技術(shù)課題在于提供含有可安全地長期攝取的成分的新型肌肉萎縮抑制劑。

本發(fā)明者為了達(dá)到上述目的，使用作為合成糖皮質(zhì)激素的去氫氫化可的松誘發(fā)性的肌肉萎縮模型進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)作為植物等中所包含的多酚的一種的槲皮素糖苷具有肌肉萎縮抑制效果。作為基因表達(dá)評(píng)價(jià)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)槲皮素糖苷抑制參與肌肉分解促進(jìn)及肌肉合成抑制的Mstn的表達(dá)。進(jìn)而還發(fā)現(xiàn)槲皮素糖苷通過以Mstn的表達(dá)抑制為起點(diǎn)，作用于肌肉分解經(jīng)路及肌肉合成經(jīng)路等的各因子，從而可抑制肌肉萎縮，最終完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。

1)一種肌肉萎縮抑制劑，其特征在于，含有槲皮素糖苷。

2)根據(jù)1)所述的制劑，其特征在于，肌肉萎縮抑制起因于Mstn的表達(dá)抑制。

3)根據(jù)1)或2)中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，肌肉萎縮抑制起因于選自Atrogin-1、MuRF-1、Foxo1及Redd1中的一個(gè)以上基因的表達(dá)抑制。

4)根據(jù)1)～3)中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，具有肌肉分解抑制作用。

5)根據(jù)4)所述的制劑，其特征在于，肌肉分解抑制作用起因于選自Atrogin-1、MuRF-1及Foxo1中的一個(gè)以上基因的表達(dá)抑制。

6)根據(jù)1)～3)中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，具有肌肉合成促進(jìn)作用。

7)根據(jù)6)所述的制劑，其特征在于，肌肉合成促進(jìn)作用起因于Redd1的表達(dá)抑制。

8)根據(jù)1)～7)中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，用于運(yùn)動(dòng)器官功能低下或運(yùn)動(dòng)器官障礙的預(yù)防或處置。

9)根據(jù)1)～7)中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，用于藥物誘發(fā)性肌肉萎縮的預(yù)防或處置。

10)一種組合物，其特征在于，包含1)～9)中任一項(xiàng)所述的制劑。

根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)㈤纹に靥擒沼糜谝约∪馕s抑制為目標(biāo)的制劑。根據(jù)本發(fā)明的肌肉萎縮抑制的實(shí)現(xiàn)關(guān)系到提供有益于患病者、高齡者的QOL改善的新方法。

而且，槲皮素糖苷為多酚化合物的一種，具有血液循環(huán)改善作用、抗癌作用等各種生理活性。加之，由于來自植物故而安全性極高。因此，本發(fā)明可提供還可期待槲皮素糖苷的除肌肉萎縮抑制作用以外的有用的生理作用且安全并可持續(xù)攝取的制劑。

附圖說明

圖1表示槲皮素糖苷(QG)對(duì)去氫氫化可的松(DEX)誘發(fā)性肌肉萎縮的抑制效果。

圖2表示槲皮素糖苷(QG)對(duì)Mstn及其下游基因表達(dá)的抑制效果。

圖3表示槲皮素糖苷(QG)與槲皮素(Q)對(duì)去氫氫化可的松(DEX)誘發(fā)性肌肉萎縮抑制效果的對(duì)比。

圖4表示槲皮素糖苷(QG)與槲皮素(Q)對(duì)Mstn的下游基因表達(dá)的抑制效果的對(duì)比。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及含有槲皮素糖苷的肌肉萎縮抑制劑。

本發(fā)明的含有槲皮素糖苷的肌肉萎縮抑制劑以槲皮素糖苷作為有效成分。

在本發(fā)明中，“槲皮素糖苷”意味著作為多酚的一種的槲皮素的糖苷，將其用下式表示。

(式中，(X)n表示糖鏈，n為1以上的整數(shù)。)

在此，構(gòu)成通過在槲皮素上進(jìn)行糖苷鍵合的X所表示的糖鏈的糖，例如有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等，優(yōu)選葡萄糖、鼠李糖。而且，只要n為1以上就沒有特別限制，優(yōu)選1～16、進(jìn)一步優(yōu)選1～8。n為2以上時(shí)，X部分可以由1種糖鏈構(gòu)成，也可以由多種糖鏈構(gòu)成。

本發(fā)明的槲皮素糖苷還包含將已有的槲皮素糖苷通過酶等進(jìn)行處理從而使糖轉(zhuǎn)移的槲皮素糖苷。具體而言，本發(fā)明提到的槲皮素糖苷包含蘆丁、酶處理蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷。

在本發(fā)明中，可單獨(dú)使用槲皮素糖苷所包含的一個(gè)化合物，還可混合多種化合物來使用。對(duì)于本發(fā)明中使用的皮素糖苷的來源、制法沒有特別限制。例如，作為包含大量槲皮素或槲皮素糖苷的植物，已知有蕎麥、槐樹、刺山柑、蘋果、茶、洋蔥、葡萄、西蘭花、長蒴黃麻、覆盆子、越橘、蔓越莓、仙人掌、葉菜類、柑橘類等，從上述植物可得到槲皮素糖苷。用于本發(fā)明的槲皮素糖苷可使用將來自天然產(chǎn)物的提取物通過濃縮、純化等操作提高了槲皮素糖苷的物質(zhì)，例如，含槲皮素糖苷提取物的濃縮物或純化物。濃縮方法或純化方法可使用現(xiàn)有的方法。

在本發(fā)明特別優(yōu)選的方式中，作為槲皮素糖苷，使用蘆丁的酶處理物。作為酶處理蘆丁的特別優(yōu)選的例子，有將槲皮素糖苷進(jìn)行酶處理從而除去鼠李糖糖鏈部分的異槲皮苷、將異槲皮苷通過糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行處理從而結(jié)合了由1～7個(gè)葡萄糖構(gòu)成的糖鏈的物質(zhì)、及以其混合物作為主成分的物質(zhì)。

槲皮素糖苷是糖鏈在槲皮素上進(jìn)行了糖苷鍵合的化合物，具體而言，是1個(gè)以上的糖鏈在3位的羥基上進(jìn)行了糖苷鍵合的一系列化合物的總稱。對(duì)于槲皮素與槲皮素糖苷而言，化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)特性均大不相同。

在本說明書中，“糖皮質(zhì)激素”是肌肉分解中的重要因子，是在骨格肌中誘發(fā)泛素-蛋白酶體經(jīng)路依存性的蛋白分解的腎上腺皮質(zhì)激素之一。已知作為合成糖皮質(zhì)激素的一種的去氫氫化可的松能夠使骨格肌中參與肌肉分解的Atrogin-1及MuRF1的表達(dá)提高(參考非專利文獻(xiàn)1)。因去氫氫化可的松帶來的代謝變化與在動(dòng)物、患者的肌肉萎縮中所觀察到的變化類似，從而去氫氫化可的松誘發(fā)性肌肉萎縮模型通用于肌肉萎縮的機(jī)制分析。

以下，對(duì)本說明書所記載的基因/蛋白質(zhì)進(jìn)行說明。

在本說明書中，“Akt經(jīng)路”是介導(dǎo)作為與各種細(xì)胞功能的控制有關(guān)的激酶的Akt的信號(hào)經(jīng)路的總稱。Akt活性起因于營養(yǎng)或生長因子、運(yùn)動(dòng)等各種刺激而被調(diào)節(jié)。經(jīng)活化的Akt介由mTOR(mammalian target of rapamycin)而將參與肌肉合成的S6K(ribosomal protein S6kinase)活化。而且，已知經(jīng)活化的Akt通過抑制促進(jìn)肌肉分解的Foxo1從而間接地抑制肌肉分解。

在本說明書中，“Mstn(Myostatin)”是屬于TGF-β超家族的蛋白質(zhì)，作為肌肉抑制因子，在骨格肌或心肌、脂肪組織中特異性表達(dá)。Mstn在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化成活性體，通過介由Smad(small mothers against decapentaplegic)的磷酸化/活化來抑制Akt，從而促進(jìn)肌肉分解并抑制肌肉合成。據(jù)報(bào)道Mstn抑制衛(wèi)星細(xì)胞的分化、介由Akt經(jīng)路的抑制從而促進(jìn)肌肉分解、及介由mTOR經(jīng)路而抑制肌肉合成(參考非專利文獻(xiàn)3)。而且，已知在Mstn缺陷小鼠中，不會(huì)引起去氫氫化可的松誘發(fā)性的肌肉萎縮(參考非專利文獻(xiàn)4)。

在本說明書中，已知“Atrogin-1”及“MuRF1(muscle RING-finger protein-1)”都是參與作為肌肉分解經(jīng)路之一的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的泛素連接酶，在骨格肌、心肌中表達(dá)。

在本說明書中，“Foxo1”是指Forkhead型轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box protein O1)。Foxo1通常以磷酸化的狀態(tài)局在于細(xì)胞質(zhì)中，伴隨著脫磷酸化而移動(dòng)到核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。已知Foxo1的表達(dá)增加與肌肉萎縮一同被發(fā)現(xiàn)，參與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)引起的蛋白分解、自噬的亢進(jìn)、進(jìn)而蛋白合成的抑制等各種機(jī)制。

在本說明書中，“Redd1”是指regulated in development and DNA damage response1。已知Redd1在低氧條件下等表達(dá)被誘導(dǎo)，通過抑制mTOR經(jīng)路來抑制肌肉合成。

在本說明書中，“肌肉萎縮”是指肌肉合成與肌肉分解的代謝更傾向于分解，從而肌肉細(xì)胞減少或縮小且肌肉量降低。肌肉萎縮大致分為由長期的安靜臥床、骨折等引起的石膏固定、疾病、加齡等導(dǎo)致。因此，“肌肉萎縮抑制”是指抑制上述原因引起的運(yùn)動(dòng)器官的功能低下、肌肉量的降低。

在本說明書中，“肌肉分解”是指由于與Akt經(jīng)路、組織蛋白酶系統(tǒng)或泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、自噬系統(tǒng)等相關(guān)的基因的表達(dá)被誘導(dǎo)，從而肌肉纖維蛋白質(zhì)的分解/異化亢進(jìn)。更具體而言，是指Mstn基因、作為肌肉蛋白分解經(jīng)路之一的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)的基因(Atrogin-1、MuRF1及Foxo1等)的表達(dá)誘導(dǎo)所引起的肌肉纖維蛋白質(zhì)分解的亢進(jìn)。

在本說明書中，“肌肉合成”是指肌肉纖維蛋白質(zhì)的合成/同化亢進(jìn)。更具體而言，是指通過Mstn基因、Redd1基因的表達(dá)抑制，誘導(dǎo)骨格肌中的作為翻譯控制因子的激酶復(fù)合體mTOR的活化，從而促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成。

本發(fā)明的槲皮素糖苷抑制肌肉合成以及肌肉分解等與肌肉代謝相關(guān)的因子(Mstn、Atrogin-1、MuRF-1、Foxo1及Redd1)的表達(dá)。具體而言，如后述的實(shí)施例2所示，本發(fā)明的槲皮素糖苷顯示作為骨格肌形成抑制因子的Mstn的表達(dá)抑制作用(實(shí)施例2)。而且，本發(fā)明的槲皮素糖苷介由伴隨著Mstn表達(dá)抑制的Akt經(jīng)路的抑制，抑制與肌肉分解有關(guān)的因子Atrogin-1、MuRF-1及Foxo1的表達(dá)，并抑制肌肉分解(實(shí)施例2)。進(jìn)而，伴隨著本發(fā)明的槲皮素糖苷引起的Mstn表達(dá)抑制，抑制與肌肉合成有關(guān)的mTOR經(jīng)路的Redd1的表達(dá)被抑制，從而肌肉合成被促進(jìn)(實(shí)施例1及2)。即，本發(fā)明通過抑制成為與肌肉合成及肌肉分解這樣的肌肉代謝的一系列過程有關(guān)的信號(hào)經(jīng)路的起點(diǎn)的Mstn的表達(dá)，從而能夠促進(jìn)肌肉的肥大·再生，提高肌肉力量，調(diào)節(jié)·增加肌肉量，預(yù)防或抑制肌肉萎縮等。

而且，在肌肉萎縮模型中，在槲皮素糖苷中發(fā)現(xiàn)的肌肉萎縮抑制效果及肌肉萎縮相關(guān)基因的表達(dá)抑制效果在槲皮素中并沒有發(fā)現(xiàn)(實(shí)施例3)。因此，槲皮素糖苷可得到槲皮素所無法達(dá)到的優(yōu)異效果。

本發(fā)明的肌肉萎縮抑制劑被用于運(yùn)動(dòng)器官功能低下或運(yùn)動(dòng)器官障礙的預(yù)防或處置。例如，包括起因于長期的安靜臥床、骨折等引起的石膏固定、疾病、加齡等的運(yùn)動(dòng)器官障礙、運(yùn)動(dòng)器官綜合癥等的預(yù)防或處置，但并不限定于此。該使用為在人或非人動(dòng)物中的使用，而且既可以是治療性使用也可以是非治療性使用。在此，“非治療性”是指不包括醫(yī)療行為，即通過治療進(jìn)行的對(duì)人體的處理行為的概念。

本發(fā)明的肌肉萎縮抑制劑被用于藥物誘發(fā)性肌肉萎縮的預(yù)防或處置。例如，包含類固醇激素的長期攝取引起的肌肉萎縮的預(yù)防或處置，但并不限定于此。該使用為在人或非人動(dòng)物中的使用，而且既可以為治療性使用也可以為非治療性使用。

作為一個(gè)例子，本發(fā)明能夠以醫(yī)藥品等的制劑的形態(tài)提供，但并不限定于該形態(tài)。

本發(fā)明的含有槲皮素糖苷的肌肉萎縮抑制劑還可作為包含該制劑的組合物來提供。作為一個(gè)例子，能夠以醫(yī)藥組合物等的形態(tài)提供，但并不限定于該形態(tài)。

而且，本發(fā)明還可以是作為寵物的餌食而加工的寵物食品、動(dòng)物飼料等，以及動(dòng)物用醫(yī)藥。

還可根據(jù)制劑的總重量，在本發(fā)明的肌肉萎縮抑制劑(醫(yī)藥組合物等)中，將槲皮素糖苷作為槲皮素?fù)Q算值，配合0.1mg～8000mg、優(yōu)選0.3mg～4000mg左右的量。相對(duì)于制劑總重量，制劑中的槲皮素糖苷的總配合比例優(yōu)選0.001～95重量％、更優(yōu)選0.01～80重量％左右為佳。

以動(dòng)物為對(duì)象進(jìn)行給藥時(shí)(相對(duì)于每1個(gè)體的小鼠，約20g)，作為槲皮素糖苷的總配合量，作為槲皮素?fù)Q算值，成為能夠攝取0.1mg～16mg、優(yōu)選0.3mg～4mg左右的量為佳。尤其是以人(成人)為對(duì)象進(jìn)行給藥時(shí)，作為槲皮素糖苷的總配合量，作為槲皮素?fù)Q算值，成為能夠攝取0.1mg～8000mg、優(yōu)選0.3mg～4000mg左右的量為佳。

本發(fā)明的組合物中的槲皮素糖苷的配合量可按照下述基準(zhǔn)確定：酶處理蘆丁的攝取量為每一個(gè)體1天0.1～20g、優(yōu)選0.3～10g。而且，每1kg體重的攝取量例如可為0.002～400mg/kg、更優(yōu)選0.006～200mg/kg。或者，相對(duì)于組合物整體，可為0.001～95重量％、優(yōu)選0.01～80重量％。

將本發(fā)明的肌肉萎縮抑制劑作為醫(yī)藥等使用時(shí)，其給藥方式可為經(jīng)口給藥，也可以注射劑等的方式給藥，只要適當(dāng)應(yīng)用公知的作為適于各種給藥的制劑即可。例如，適于經(jīng)口給藥的制劑包括片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、混懸液劑、糖漿劑等，但并不限定于此。

根據(jù)本發(fā)明的制劑的形態(tài)，除槲皮素糖苷以外，還可含有任意的添加劑、用于通常的制劑的任意的成分。作為上述添加劑及/或成分的例子，除維生素E、維生素C等的維生素類、礦物質(zhì)類、營養(yǎng)成分、香料等的生理活性成分以外，還可列舉在制劑化中配合的賦形劑、結(jié)合劑、乳化劑、等張劑(等滲劑)、緩沖劑、助溶劑、防腐劑、穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、著色劑、凝固劑、涂布劑等。

實(shí)施例

以下，通過實(shí)施例更進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將本發(fā)明的方法進(jìn)行各種變更、修飾來使用，它們也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：槲皮素糖苷對(duì)去氫氫化可的松誘發(fā)性肌肉萎縮的抑制效果

BALB/c系雄性小鼠(7周齡)從清水實(shí)驗(yàn)材料株式會(huì)社購入，使其在試驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)1周后，在適應(yīng)期間結(jié)束日測(cè)定體重，將該期間屆滿而顯示順利發(fā)育的動(dòng)物供于試驗(yàn)。飼料使用日本CLAIR公司制的CE-2(固體)，在試驗(yàn)期間自由進(jìn)食。飲料水為在適應(yīng)期間中自由攝取自來水。且，小鼠為每1籠4～5只，籠為1周更換2次。

在適應(yīng)期間結(jié)束后的7天里，在4.5g/L槲皮素糖苷以及自來水(對(duì)照)的飲水給藥后，進(jìn)行7天的去氫氫化可的松與槲皮素糖苷合用飲水給藥試驗(yàn)。將去氫氫化可的松以10mg/L溶解于自來水，另一方面，槲皮素糖苷以1.5g/L以及4.5g/L的不同濃度溶解于自來水。試驗(yàn)分為以下4組進(jìn)行：對(duì)照(自來水給藥)組、去氫氫化可的松給藥組、去氫氫化可的松與1.5g/L槲皮素糖苷合用給藥組、以及去氫氫化可的松與4.5g/L槲皮素糖苷合用給藥組。給藥試驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠通過頸椎脫臼使其安樂死后，摘取腓腸肌的組織測(cè)定重量，使用腓腸肌重量除以體重的值進(jìn)行肌肉萎縮的評(píng)價(jià)。且，所得到的數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。腓腸肌重量比的對(duì)照組與去氫氫化可的松給藥組的平均值之差使用Student的t-檢驗(yàn)(Student’s t-test)進(jìn)行檢驗(yàn)，去氫氫化可的松給藥組、去氫氫化可的松與1.5g/L槲皮素糖苷合用給藥組以及4.5g/L槲皮素糖苷合用給藥組的平均值之差使用根據(jù)Dunnett法的多重比較檢驗(yàn)(Dunnett’s test)進(jìn)行檢驗(yàn)。

結(jié)果如圖1所示。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，腓腸肌重量比因去氫氫化可的松飲水給藥而顯著降低(圖1)。另一方面，相對(duì)于去氫氫化可的松飲水給藥組，通過將去氫氫化可的松與槲皮素糖苷合用飲水給藥，腓腸肌重量比以槲皮素糖苷的濃度依存性地顯著增加(圖1)。本結(jié)果表示槲皮素糖苷對(duì)去氫氫化可的松誘發(fā)性肌肉萎縮發(fā)揮肌肉萎縮抑制效果。

實(shí)施例2：槲皮素糖苷對(duì)Mstn及其下游基因表達(dá)的抑制效果

使7周齡的BALB/c系雄性小鼠適應(yīng)1周后，使其進(jìn)行1周4.5g/L槲皮素糖苷以及自來水(對(duì)照)的自由飲水。1周后，將10mg/L的去氫氫化可的松與4.5g/L的槲皮素糖苷混合使其自由飲水，飲水后1、3、7天后進(jìn)行解剖并采集左右的腓腸肌。腓腸肌用液氮進(jìn)行瞬時(shí)冷卻后，保存于－80度的冷凍庫直至分析時(shí)為止。

其后，為了解析詳細(xì)的分子機(jī)制，在腓腸肌組織內(nèi)進(jìn)行與肌肉萎縮有關(guān)的基因表達(dá)的解析。使用ISOGEN(株式會(huì)社NIPPON GENE)以及RNeazy Mini Kit(QIAGEN)從冷凍保存的腓腸肌提取RNA。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied biosystems)進(jìn)行cDNA合成。從制成的cDNA通過使用TaqMan Fast Universal PCR master mix(Applied biosystems)的定量反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定與肌肉萎縮有關(guān)的基因(Atrogin-1、MuRF-1、Foxo1、Redd1、Mstn)及互補(bǔ)基因(18SrRNA)的信使RNA(mRNA)量。且，所得到的數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示?；虮磉_(dá)量的去氫氫化可的松給藥組、去氫氫化可的松與槲皮素糖苷合用給藥組的平均值之差使用Student的t-檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，5％以下為顯著。

結(jié)果如圖2所示?；虮磉_(dá)評(píng)價(jià)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在將去氫氫化可的松與槲皮素糖苷的合用飲水給藥期間設(shè)定為1天的試驗(yàn)中，與去氫氫化可的松飲水給藥組相比，在去氫氫化可的松與槲皮素糖苷合用飲水給藥組中，F(xiàn)oxo1的mRNA量有減少趨勢(shì)，以及Atrogin-1、MuRF-1及Redd1的mRNA量顯著減少(圖2)。進(jìn)而Mstn的mRNA量因去氫氫化可的松以及槲皮素糖苷的合用飲水給藥而完全降低到對(duì)照水平(圖2)。

在本試驗(yàn)中，槲皮素糖苷抑制Mstn基因的表達(dá)，進(jìn)而作用于參與存在于其下游的肌肉的分化、合成、分解的因子，其結(jié)果，顯示出肌肉萎縮得到抑制。

實(shí)施例3：槲皮素糖苷與槲皮素對(duì)去氫氫化可的松誘發(fā)性肌肉萎縮抑制效果的對(duì)比

使7周齡的BALB/c系雄性小鼠適應(yīng)1周后，使其自由飲用10mg/L的去氫氫化可的松來飲水給藥。另一方面，將200mg/kg的槲皮素糖苷以及與蘆丁換算的槲皮素糖苷等量的槲皮素混懸于包含0.5％的羧甲基纖維素鈉鹽的milli Q水中，進(jìn)行5天(星期一到星期五)強(qiáng)制經(jīng)口給藥。而且，從星期五開始進(jìn)行10mg/L的去氫氫化可的松的飲水給藥。從其第二周開始，再次同時(shí)進(jìn)行槲皮素糖苷以及槲皮素的強(qiáng)制經(jīng)口給藥(星期一到星期四)以及去氫氫化可的松的飲水給藥，在星期五進(jìn)行解剖。給藥試驗(yàn)結(jié)束后的試樣回收、由腓腸肌重量比進(jìn)行的肌肉萎縮的評(píng)價(jià)以及腓腸肌組織中的基因表達(dá)量的測(cè)定參照實(shí)施例1及2進(jìn)行?；虮磉_(dá)量的去氫氫化可的松給藥組、去氫氫化可的松與槲皮素糖苷合用給藥組以及槲皮素合用給藥組的平均值之差使用Dunnett’s test進(jìn)行檢驗(yàn)，5％以下為顯著。

將結(jié)果示于圖3及圖4。強(qiáng)制經(jīng)口給藥試驗(yàn)的結(jié)果為，與對(duì)照組相比，去氫氫化可的松給藥引起的顯著降低的腓腸肌重量比通過槲皮素糖苷的強(qiáng)制經(jīng)口給藥而顯著增加(圖3)。另一方面，通過槲皮素的強(qiáng)制經(jīng)口給藥，未發(fā)現(xiàn)去氫氫化可的松給藥引起的降低的腓腸肌重量比的改善效果(圖3)?；虮磉_(dá)評(píng)價(jià)的結(jié)果為，去氫氫化可的松飲水給藥引起的增多的肌肉萎縮相關(guān)基因MuRF-1、Foxo1及Redd1通過槲皮素糖苷的強(qiáng)制經(jīng)口給藥而顯著降低(圖4)。另一方面，通過槲皮素的強(qiáng)制經(jīng)口給藥，未發(fā)現(xiàn)去氫氫化可的松給藥引起的增多的肌肉萎縮相關(guān)基因的表達(dá)抑制效果(圖4)。該結(jié)果顯示槲皮素糖苷可得到在槲皮素中未發(fā)現(xiàn)的肌肉萎縮抑制效果。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

由于本發(fā)明的肌肉萎縮抑制劑含有體內(nèi)吸收性優(yōu)異的槲皮素糖苷，故而能夠以低服用量/低攝取量發(fā)揮所期待的生理活性。而且，由于槲皮素糖苷為來自植物的成分，故而安全性極高，伴隨著服用/攝取的無法預(yù)期的有害現(xiàn)象的發(fā)生可能性低。因此，由于本發(fā)明的含有槲皮素糖苷的肌肉萎縮抑制劑能夠以低用量且安全地達(dá)到優(yōu)異的肌肉萎縮抑制效果，故而作為用于起因于肌肉萎縮等的運(yùn)動(dòng)器官障礙的預(yù)防及處置的新方法，在產(chǎn)業(yè)上的可利用性高。