本發(fā)明涉及可以用于脂質(zhì)代謝活化劑、抗糖尿病劑或肥胖癥、生活習(xí)慣病等的預(yù)防·改善等的PPARγ活化劑。

背景技術(shù)：

香醋（香醋）是主要使糯米發(fā)酵并長時間熟化而制造的發(fā)酵食品，在中國自古以來被用作醋調(diào)味料。香醋與在日本一般使用的醋即米醋相比，氨基酸等有機(jī)化合物的含有率高，近年來在日本也作為有益于健康的保持增進(jìn)的健康食品而人氣升高。

例如，本發(fā)明人們在專利文獻(xiàn)1中公開了含有香醋的低級鏈烷醇萃取物作為有效成分的過氧化物酶體增殖劑激活受體α活化劑及γ活化劑。據(jù)此，記載了在香醋的低級鏈烷醇萃取物中確認(rèn)到了參與脂肪酸氧化的刺激及血清脂質(zhì)的介導(dǎo)作用并改善糖代謝的過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）α的活化作用、以及參與脂肪細(xì)胞的分化并帶來血糖值及血中脂質(zhì)的降低等的PPARγ的活化作用。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2009-249322號公報

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

然而，專利文獻(xiàn)1中公開的PPAR活化劑是通過將香醋以低級鏈烷醇進(jìn)行萃取而得到的萃取物，關(guān)于該萃取物的PPARγ活化作用的效果確認(rèn)，在參照一般生物體內(nèi)而調(diào)整了反應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行，確認(rèn)在將香醋的低級鏈烷醇萃取物以1.0%（即10000ppm）這樣高的比例添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中的情況下，可見PPARγ活化作用。因而，在將該香醋的低級鏈烷醇萃取物作為PPARγ活化劑使用時，必須將其大量地添加或攝取。

此外，專利文獻(xiàn)1中公開的香醋的低級鏈烷醇萃取物是包含多種成分的混合物，沒有示出作為PPAR活化劑的有效成分具體是何物。

因此，本發(fā)明的目的在于鑒定香醋中包含的具有優(yōu)異的PPAR活化作用的有效成分，提供包含該有效成分的PPAR活化劑。

用于解決問題的方法

為了解決上述課題，本發(fā)明人們對香醋實(shí)施各種分級處理，并對所得到的分級物進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了具有優(yōu)異的PPAR活化作用的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。即，本發(fā)明的PPARγ活化劑含有式（1）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物或其藥學(xué)上容許的鹽。

[化學(xué)式1]

[式（1）中，R¹表示氫原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)為1～4的烷基或也可以具有取代基的糖殘基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、芐基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。]

該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物具有PPARγ配體活性，且具有使PPARγ活化的作用。此外，該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物特別具有將白色脂肪細(xì)胞變得褐色脂肪細(xì)胞化而使脂質(zhì)代謝活化的作用。進(jìn)而，該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物對糖尿病、胰島素抵抗性、高脂血癥、高血壓、動脈硬化、內(nèi)臟脂肪型肥胖、皮下脂肪蓄積、體重增加、瘦素抵抗性、脂肪肝或生活習(xí)慣病等PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病的預(yù)防、改善或治療等是有效的。

此外，本發(fā)明的PPARγ活化劑優(yōu)選在上述的式（1）中，R¹為氫原子、磷酸基或也可以具有取代基的糖殘基，R²為苯基、4-甲基苯基、芐基或4-甲基芐基。由此，可選擇具有水溶性的性質(zhì)且作為PPARγ活化劑而適合的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。

此外，本發(fā)明的藥物為用于預(yù)防或治療選自由糖尿病、胰島素抵抗性、肥胖癥、體重增加、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、瘦素抵抗性、脂質(zhì)代謝異常、高脂血癥、動脈硬化及代謝綜合征組成的組中的至少一種疾病的藥物，含有上述的PPARγ活化劑。由此，可選擇包含上述的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的PPARγ活化劑的適合的用途。

此外，本發(fā)明的補(bǔ)充劑為用于預(yù)防或改善選自由糖尿病、胰島素抵抗性、肥胖癥、體重增加、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、瘦素抵抗性、脂質(zhì)代謝異常、高脂血癥、動脈硬化及代謝綜合征組成的組中的至少一種疾病的補(bǔ)充劑，包含上述的PPARγ活化劑。由此，選擇包含上述的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的PPARγ活化劑的適合的用途。

此外，本發(fā)明的PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病的治療、預(yù)防、抑制或改善用組合物含有式（2）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物或其藥學(xué)上容許的鹽作為有效成分。

[化學(xué)式2]

[式（2）中，R¹表示氫原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)為1～4的烷基或也可以具有取代基的糖殘基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、芐基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。]

PPARγ為主要參與糖·脂質(zhì)代謝的因子，參與代謝綜合征、代謝性疾病、體重增加、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、肥胖、糖尿病、胰島素抵抗性、高血壓、動脈硬化、高脂血癥、炎癥性疾病及惡性腫瘤等增殖性疾病。上述的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物由于具有PPARγ配體活性，且具有使PPARγ活化的作用，所以被有效用于PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病的預(yù)防、改善、抑制或治療。

此外，作為PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病，優(yōu)選為選自由糖尿病、胰島素抵抗性、肥胖癥、體重增加、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、瘦素抵抗性、脂質(zhì)代謝異常、高脂血癥、動脈硬化及代謝綜合征組成的組中的1種以上的病理狀態(tài)、癥狀或疾病。由此，可選擇上述的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的特別適合的用途。該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物除了具有使白色脂肪細(xì)胞變得褐色脂肪細(xì)胞化、促進(jìn)利用了脂質(zhì)的熱產(chǎn)生、使脂質(zhì)代謝活化的作用以外，還具有體重增加抑制作用、內(nèi)臟脂肪蓄積抑制作用、皮下脂肪蓄積抑制作用、脂聯(lián)素增強(qiáng)作用、胰島素分泌抑制作用及瘦素分泌抑制作用等。因此，能夠治療、預(yù)防、抑制或改善這些PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，可得到具有高的PPARγ活化作用的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物除了具有使白色脂肪細(xì)胞變得褐色脂肪細(xì)胞化而將脂質(zhì)代謝活化的作用以外，還具有體重增加抑制作用、內(nèi)臟脂肪蓄積抑制作用、脂聯(lián)素增強(qiáng)作用、胰島素分泌抑制作用及瘦素分泌抑制作用等。因此，可以為了治療、預(yù)防、抑制或改善胰島素抵抗性、糖尿病、體重增加、肥胖癥、高脂血癥、高血壓、動脈硬化、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、脂肪肝或代謝綜合征等PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病而使用。像這樣，可得到有益于預(yù)防或改善上述那樣的病理狀態(tài)等的能夠廣泛應(yīng)用于食品、補(bǔ)充劑、藥劑等中的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。

附圖說明

圖1是簡略地說明由香醋制造作為本發(fā)明的PPARγ活化劑的有效成分的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的方法的流程圖。

圖2是簡略地說明實(shí)施例1中的由香醋調(diào)制為正相柱分級物的方法的流程圖。

圖3是表示實(shí)施例1中的正相柱分級物的PPARγ配體活性的圖表。

圖4是簡略地說明實(shí)施例2中的調(diào)制為反相柱分級物的方法的流程圖。

圖5是表示實(shí)施例2中得到的反相柱分級物（fr.1～5）和實(shí)施例1中得到的正相柱分級物（分級前fr.1）的HPLC分析結(jié)果的色譜。橫軸表示保留時間（分鐘）。

圖6是表示實(shí)施例2中的反相柱分級物的PPARγ配體活性的圖表。

圖7是表示實(shí)施例3中的峰分級物的PPARγ配體活性的圖表。

圖8是表示實(shí)施例3中得到的峰分級物中的峰5的HPLC分析結(jié)果的色譜?？v軸表示檢測強(qiáng)度，橫軸表示保留時間（分鐘）。

圖9是表示實(shí)施例3中的峰5的分級物及實(shí)施例2中得到的反相柱分級物的級分5的PPARγ配體活性的圖表。

圖10是表示實(shí)施例4中的峰5的分級物的LC/MS的結(jié)果的圖?？v軸表示檢測強(qiáng)度，橫軸表示m/z值。

圖11是表示實(shí)施例5中的UCP-1基因的表達(dá)量的結(jié)果的圖表。

圖12是表示實(shí)施例7中的5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯合成品的PPARγ配體活性的圖表。

圖13是表示實(shí)施例8中的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的PPARγ配體活性的圖表。

圖14是表示實(shí)施例9中的由5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯的投與而帶來的小鼠的體重增加抑制效果的圖表。

圖15是表示實(shí)施例10中的小鼠血液中包含的脂聯(lián)素的量的圖表。

圖16是表示實(shí)施例11中的小鼠血液中包含的胰島素的量的圖表。

圖17是表示實(shí)施例12中的小鼠血液中包含的瘦素的量的圖表。

圖18是表示實(shí)施例13中的由5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯的投與而帶來的小鼠的皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的蓄積抑制效果的圖表。

具體實(shí)施方式

以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的PPARγ活化劑中包含上述的式（1）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物作為有效成分。該式（1）中，作為R¹所示的原子，優(yōu)選氫原子，作為分子，可列舉出磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)為1～4的烷基或也可以具有取代基的糖殘基。作為脂肪酸基，可列舉出月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸或硬脂酸等。作為碳原子數(shù)為1～4的烷基，可列舉出甲基、乙基、各種丙基或各種丁基。此外，磷酸基、由糖殘基形成的糖苷從在體外的穩(wěn)定性及在體內(nèi)的吸收性的觀點(diǎn)出發(fā)是優(yōu)選的，作為糖，沒有特別限定，可使用各種葡萄糖、各種半乳糖或各種甘露糖等，特別是葡萄糖作為形成適合的糖苷的糖被使用。

此外，R²優(yōu)選為苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、芐基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基，特別是從作用效果的觀點(diǎn)出發(fā)，適宜使用苯基、4-甲基苯基、芐基或4-甲基芐基。

作為該式（1）所表示的化合物中的特別是從藥理活性的方面出發(fā)優(yōu)選的化合物，除了以下式（3）所示的5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯、以下式（4）所示的5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯以外，還可列舉出5-羥基-4-（4-甲基芐基）丁烯羥酸內(nèi)酯、5-羥基-4-芐基丁烯羥酸內(nèi)酯，像后述那樣，作為PPARγ活化劑，特別優(yōu)選從香醋中發(fā)現(xiàn)的5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯或5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯。

[化學(xué)式3]

[化學(xué)式4]

式（3）所示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物、即5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯可以從作為發(fā)酵食品的香醋中萃取得到。作為由香醋得到該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的方法，沒有特別限定，但作為一個例子，如圖1的流程圖中所示的那樣，由（準(zhǔn)備）香醋（的工序）S0、將香醋中包含的脂質(zhì)成分除去的脫脂處理工序S1、使用溶劑萃取目標(biāo)成分的溶劑萃取處理工序S2、利用正相色譜法的分級工序S3、和利用反相色譜法的分級工序S4簡略構(gòu)成。

該香醋S0是在糯米中添加酒曲使醇發(fā)酵，添加稻殼使醋酸發(fā)酵，添加水進(jìn)行萃取并使該萃取液熟化一定時間而得到的物質(zhì)。

圖1中所示的脫脂處理S1是為了將香醋S0中包含的多余的脂質(zhì)成分除去而進(jìn)行的。通過進(jìn)行香醋S0的脫脂處理，由于香醋中包含的多余的脂質(zhì)成分被除去，所以在后面進(jìn)行的溶劑萃取處理S2、分級工序S3及S4中，能夠有效地萃取式（3）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。具體而言，雖然沒有特別限定，但是可以通過如下方式進(jìn)行：在香醋S0中加入有機(jī)溶劑并充分?jǐn)嚢?，使多余的脂質(zhì)成分移動到有機(jī)溶劑相中后，使用離心分離機(jī)等分離成水相和有機(jī)溶劑相，并將水相回收。該操作優(yōu)選進(jìn)行多次。作為有機(jī)溶劑，只要是具有脫脂效果的溶劑即可，例如，適宜使用石油系有機(jī)溶劑、醇類等，特別適宜使用正己烷。作為使用的有機(jī)溶劑的量，優(yōu)選為香醋的10重量%到1000重量%左右，最優(yōu)選為香醋的量的一半到2倍左右。

接著，在圖1中所示的溶劑萃取處理S2中，在經(jīng)脫脂處理的香醋中加入溶劑，使作為目標(biāo)的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物移動到所加入的溶劑中。作為使用的溶劑，可適宜使用有機(jī)溶劑，沒有特別限定，可以使用正丁醇或乙醇等鏈烷醇、醋酸乙酯、丁二醇及氯仿等。這些溶劑萃取處理S2不限于單一的處理，也可以進(jìn)行多次以相同溶劑的萃取處理、或?qū)⒍喾N溶劑萃取處理組合進(jìn)行。

作為上述的溶劑萃取處理S2的一個例子，對使用氯仿作為有機(jī)溶劑時的萃取處理進(jìn)行說明。在該氯仿萃取處理中，在經(jīng)脫脂的香醋中加入氯仿，使作為目標(biāo)成分的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物高效地移動到氯仿相中。具體而言，例如通過將香醋與氯仿使用分液漏斗進(jìn)行分配并回收氯仿相來進(jìn)行。該情況下，分配優(yōu)選進(jìn)行多次。作為氯仿的添加量，優(yōu)選為水相（香醋）的10重量%到1000重量%左右，最優(yōu)選為水相的量的一半到2倍左右?；厥盏穆确孪嗫梢酝ㄟ^減壓濃縮處理等將溶劑簡單地除去，能夠得到固體或濃縮的香醋的氯仿萃取物。

接著，對圖1中所示的利用正相色譜法的分級工序S3進(jìn)行說明。在該分級工序S3中，以將工序S2中得到的溶劑萃取物中包含的目標(biāo)成分即丁烯羥酸內(nèi)酯化合物純化分離為目的。作為一個例子，對利用正相硅膠柱色譜法的分級處理進(jìn)行說明。具體而言，雖然沒有特別限定，但是通過在填充有硅膠的柱色譜管上放置吸附有溶劑萃取物的硅膠，從其上方開始流過規(guī)定的流動相使其洗脫來進(jìn)行。作為流動相，沒有特別限定，適宜使用苯-丙酮，例如通過以將苯：丙酮的比設(shè)定為40：1到0：1的梯度的流動相進(jìn)行洗脫，從而能夠適宜地分離。在確認(rèn)所得到的分級物中的哪個分級物中包含目標(biāo)物質(zhì)時，可以進(jìn)行后述的PPARγ活化試驗(yàn)、或測定PPARγ所參與的基因（UCP-1基因等）的表達(dá)量的試驗(yàn)等。

接著，對圖1中所示的利用反相色譜法的分級工序S4進(jìn)行說明。在該分級工序S4中，以將工序S3中得到的正相柱分級物中包含的目標(biāo)成分即丁烯羥酸內(nèi)酯化合物進(jìn)一步進(jìn)行純化分離、粗略離析為目的。作為一個例子，對利用反相硅膠柱色譜法的分級處理進(jìn)行說明。具體而言，雖然沒有特別限定，但是通過將以十八烷基甲硅烷基（C₁₈）修飾的硅膠填充到柱中，并將工序S3中得到的分級物添加到柱中后，流過規(guī)定的流動相使其洗脫來進(jìn)行。作為流動相，沒有特別限定，但適宜使用甲醇-水，例如通過以將甲醇：水的比設(shè)定為1：9到1：0的梯度的流動相進(jìn)行洗脫，從而能夠適宜地離析。在確認(rèn)所得到的分級物中的哪個分級物中包含目標(biāo)物質(zhì)的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物時，可以進(jìn)行后述的PPARγ活化試驗(yàn)、或PPARγ所參與的基因（UCP-1基因等）的表達(dá)量的測定試驗(yàn)等。此外，對所得到的分級物進(jìn)行HPLC分析，確認(rèn)色譜，通過確認(rèn)是否得到單一峰可以確認(rèn)是否將丁烯羥酸內(nèi)酯化合物進(jìn)行了離析。

另外，上述的分級處理S3、S4不限于單一的處理，也可以進(jìn)行多次利用相同填充材料或不同填充材料的分級處理、或?qū)⒗孟嗤鲃酉嗷虿煌鲃酉嗟姆旨壧幚斫M合進(jìn)行。

此外，式（3）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物除了從香醋中萃取分離而得到的方法以外，還能夠通過公知的合成方法來制造。例如可以通過使苯乙醛與乙醛酸酯進(jìn)行羥醛縮合得到3-苯基-4-氧代-2-羥基-丁酸酯后，在水的存在下使酸發(fā)生作用（日本特開平6-211825號公報）；使苯乙醛與乙醛酸酯在嗎啉鹽酸鹽存在下反應(yīng)（日本特開平11-152280號公報）等，從而制造本發(fā)明的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物。同樣地，對于式（4）及式（1）所表示的其他的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物，也可以通過公知的合成方法（參照J(rèn).Org.Chem.、1981年、第46卷、pp.4889-4894及Tetrahedron Letters、2013年、第54卷、pp.5322-5324等）來制造。

作為上述的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的藥理學(xué)上容許的鹽，只要是與酸或堿形成的鹽即可，沒有特別限定。此外，該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物或其鹽可以是水合物、醇等有機(jī)溶劑合物等，也可以是無水物。此外，也包含各種異構(gòu)體、外消旋體、或它們的混合物等。進(jìn)而，該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物或其鹽也可以是分子結(jié)構(gòu)中包含的官能團(tuán)經(jīng)修飾等的、通過生物體的代謝作用而顯示效果的前體藥物。

式（1）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物具有使PPARγ活化的作用。另外，本發(fā)明中，所謂PPARγ活化劑是指與PPARγ結(jié)合等而使PPARγ活化、能夠調(diào)整靶基因的表達(dá)的物質(zhì)。作為PPARγ的靶基因，可列舉出例如脂聯(lián)素、UCP-1、脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)或aP2等。此外，在本說明書中，PPARγ配體活性與PPARγ激動劑活性含義相同。

本發(fā)明的PPARγ活化劑可以用于PPARγ所參與的病理狀態(tài)、癥狀或疾病的治療、預(yù)防、抑制或改善。這里的治療、病理狀態(tài)的改善中也包含對于這些疾病或病理狀態(tài)的預(yù)防或預(yù)后的處置。PPARγ所參與的疾病中廣泛包含參與脂肪細(xì)胞的分化或代謝的疾病，特別是包含胰島素抵抗性、糖尿病、高脂血、高血壓、內(nèi)臟脂肪型肥胖、內(nèi)臟脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積、脂肪肝、體重增加、肥胖、瘦素抵抗性、動脈硬化、炎癥性疾病、惡性腫瘤或代謝綜合征或與它們相關(guān)聯(lián)的疾病。本發(fā)明的PPARγ活化劑被用于針對這些疾病中的一個或多個的治療或改善、對癥狀或病理狀態(tài)的抑制、預(yù)防等。

此外，本發(fā)明的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物由于具有將使脂肪蓄積的白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換成使脂肪燃燒的褐色脂肪細(xì)胞的作用，所以可以作為脂質(zhì)代謝活化劑使用。另外，作為脂質(zhì)代謝活化劑的作用機(jī)制并不僅限定于上述的使白色脂肪細(xì)胞變得褐色脂肪細(xì)胞化，本發(fā)明的化合物具有PPARγ活化作用，與PPARγ的靶基因的轉(zhuǎn)錄亢進(jìn)也有關(guān)。

進(jìn)而，由于式（1）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物具有PPARγ活化作用，所以可以作為抗糖尿病劑、胰島素抵抗性治療劑、抗肥胖癥劑、體重增加抑制劑、內(nèi)臟脂肪蓄積抑制劑、皮下脂肪蓄積抑制劑、瘦素抵抗性治療劑、脂質(zhì)代謝異常治療劑、抗高脂血癥劑、動脈硬化治療劑及代謝綜合征抑制劑來使用。

本發(fā)明的PPARγ活化劑等包含上述的式（1）所表示的丁烯羥酸內(nèi)酯化合物作為有效成分，可以作為用于人或動物的醫(yī)藥品、醫(yī)藥部外品及食品使用。食品中也包含補(bǔ)充劑、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等。

在將本發(fā)明的PPARγ活化劑等作為醫(yī)藥品或醫(yī)藥部外品使用的情況下，可以通過以往慣用的方法調(diào)制成各種形態(tài)。該情況下，可以使用普通制劑用的藥理學(xué)上容許的載體或賦形劑、潤滑劑、分散劑、崩解劑、緩沖劑、溶劑、增量劑、保存劑、香料或穩(wěn)定化劑等作為醫(yī)藥品的添加劑而容許的添加劑進(jìn)行制劑化。進(jìn)而，為了提高該丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的生物有效度或穩(wěn)定性，也可以使用包含微膠囊、脂質(zhì)體制劑、微粉末化或使用了環(huán)糊精等的包合化等制劑技術(shù)的施藥系統(tǒng)。

在將本發(fā)明的PPARγ活化劑等作為經(jīng)口投與制劑使用的情況下，可以以片劑、顆粒劑、膠囊劑或內(nèi)服用液劑等形態(tài)使用，但優(yōu)選以適于從消化道吸收的形態(tài)使用。此外，在由于流通性、保存性等理由而提供所期望的形態(tài)的制劑的情況下，也可以使用以往的制劑技術(shù)。此外，在作為外用劑等非經(jīng)口投與劑使用的情況下，可以制成注射劑、坐劑及膠帶劑、外敷軟膏劑等經(jīng)皮吸收劑等形態(tài)。此外，在由于流通性、保存性等理由而使用固形制劑時，也可以用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂笫褂茫材軌蛲ㄟ^以往的制劑技術(shù)以液劑及半固形劑的形態(tài)提供。

此外，在將本發(fā)明的PPARγ活化劑等作為食品使用的情況下，可列舉出片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿制劑等補(bǔ)充劑形態(tài)、湯、粥、飲料、面類、果凍、谷類食物、面包、乳制品、調(diào)味料、食用油、糕點(diǎn)等形態(tài)。此外，也可以作為動物用食品（飼料、寵物食物；干式、濕式、動物用補(bǔ)充劑、動物用飲料等）使用。在作為食品使用時，也可以添加各種來源于香醋的提取物等的成分、或維他命、礦物質(zhì)或氨基酸等營養(yǎng)素等。

本發(fā)明的PPARγ活化劑等的投與量或有效攝取量由于根據(jù)作為目標(biāo)的治療效果、投與方法、投與對象及劑型而發(fā)生變化，所以沒有特別限定，但作為一天的經(jīng)口投與量，以有效成分計約為0.01μg/60kg體重～約300mg/60kg體重，優(yōu)選為0.05μg/60kg體重～約100mg/60kg體重，優(yōu)選將其分成1～3次進(jìn)行投與。此外，作為一天的非經(jīng)口的投與量，優(yōu)選以有效成分計約為0.01μg/60kg體重～100mg/60kg體重，優(yōu)選為約0.03μg/60kg體重～50mg/60kg體重。

接著，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。

實(shí)施例

以下的實(shí)施例中的PPAR活化試驗(yàn)的測定方法如下所述。

（1）PPARγ活化試驗(yàn)

（1-1）準(zhǔn)備

準(zhǔn)備表達(dá)由來自人的PPARγ配體結(jié)合域和來自酵母的GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域構(gòu)成的嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的pM-PPARγ、和按照通過該嵌合蛋白質(zhì)來控制表達(dá)的方式設(shè)計的在GAL4應(yīng)答序列的下游連結(jié)有來自海螢的熒光素酶結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒的p4×UASg-tk-luc。此外，作為轉(zhuǎn)染效率修正用質(zhì)粒，準(zhǔn)備具有在細(xì)胞內(nèi)恒常表達(dá)的病毒性表達(dá)啟動子的來自海腎的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒的pRL-CMV。另一方面，作為CV-1細(xì)胞（來自非洲綠猴腎臟）的培養(yǎng)基，使用10%FBS/DMEM，在100mm培養(yǎng)皿中按照成為4.5×10⁵cells的方式播種CV-1細(xì)胞，在37℃、5%CO₂環(huán)境下用孵化器進(jìn)行培養(yǎng)。

（1-2）CV-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

對培養(yǎng)24小時后的CV-1細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染2.0μg的pM-PPARγ、4.0μg的p4×UASg-tk-luc、及0.04μg的pRL-CMV，進(jìn)行CV-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化以脂質(zhì)體法來進(jìn)行，使用LipofectAMINE（注冊商標(biāo)）Reagent（Invitrogen公司制品）。在轉(zhuǎn)化操作后，在37℃、5%CO₂環(huán)境下進(jìn)行3.5小時培養(yǎng)。

（1-3）待檢試樣的添加

孵化后，通過胰蛋白酶處理將CV-1細(xì)胞回收，在96孔板中按照成為1×10⁵cells/mL的濃度的方式播種50mL。將待檢試樣用4%FBS/DMEM進(jìn)行稀釋，按照成為最終濃度的2倍濃度的方式進(jìn)行調(diào)整，在上述的96孔板中添加50mL。另外，作為對照物質(zhì)，使用DMSO。添加待檢試樣及對照物質(zhì)（DMSO）后，在37℃、5%CO₂環(huán)境下進(jìn)行24小時孵化。

（1-4）熒光素酶活性的測定

熒光素酶活性的測定使用Dual-Luciferase（注冊商標(biāo)）Reporter Assay System（Promega Corporation制品）來進(jìn)行。從96孔板中除去培養(yǎng)液，將細(xì)胞用PBS（-）進(jìn)行洗滌，用紙巾除去水分。加入30mL細(xì)胞溶解液（Passive Lysis Buffer），將96孔板振蕩15分鐘。將細(xì)胞萃取液各10mL地轉(zhuǎn)移到96孔熒光板中。添加發(fā)光基質(zhì)液70mL，以測定時間10秒的設(shè)定使用照度計（Micro Lumat Plus、Berthold Japan co.ltd.制品）測定由熒光素酶產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。

待檢試樣的PPARγ活化作用以相對于對照的比例（%）進(jìn)行評價。為了修正轉(zhuǎn)染效率，求出測定的海螢·熒光素酶活性值（A）除以測定的海腎·熒光素酶活性值（B）而得到的值（A/B）。算出對照組的A/B值的平均值，將該平均值作為100。算出待檢試樣的A/B值，將相對于對照的平均值的比例（%）作為待檢試樣的PPARγ活化能力。

[實(shí)施例1正相柱分級物的調(diào)制及活性測定]

通過圖2中所示的分級流程，由香醋調(diào)制為7個正相柱分級物。以下，對分級流程的各處理進(jìn)行詳述。

（1）己烷脫脂處理

在香醋（制品名；8年熟化恒順香醋、日本恒順株式會社制品）1L中加入等量的正己烷并充分?jǐn)嚢韬螅?000rpm進(jìn)行10分鐘離心分離，回收水層。將該分配操作進(jìn)行3次，除去香醋中包含的多余的脂質(zhì)成分。

（2）氯仿萃取處理

接著，在回收的水層中加入等量的氯仿，使用分液漏斗進(jìn)行3次分配操作，回收氯仿層。對回收的氯仿層進(jìn)行減壓下的濃縮而除去溶劑，得到3970mg的氯仿萃取物。

（3）正相硅膠柱處理

將通過氯仿萃取而得到的萃取物3970mg溶解到少量的丙酮中，吸附到130g的硅膠（硅膠60，0.040-0.063mm柱色譜法用；Merck Millipore Corporation制品）上。接著，在玻璃柱色譜管（柱色譜管的長度為60cm、直徑為2.7cm、容量為343mL）中填充130g的硅膠，在其上放置吸附有香醋的氯仿萃取物的硅膠。按照苯：丙酮=20：1、10：1、5：1、3：1、2：1、1：1及丙酮100%的溶劑的順序各550mL地流過各溶劑，將每種溶劑洗脫的分級物分開，作為正相柱分級物（級分1～7）回收。將回收的分級物分別在減壓下濃縮而除去溶劑，測定所得到的分級物的固體重量。按照成為PPARγ配體活性測定中的最終濃度的1000倍以上的濃度的方式，將所得到的分級物的一部分溶解到適量的二甲基亞砜（DMSO、Nacalai Tesque株式會社制品）中。

（4）正相柱分級物的活性測定

將實(shí)施例1中得到的7個正相柱分級物作為待檢試樣，進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)，評價各分級物的PPARγ配體活性。各分級物的最終濃度設(shè)定為100μg/mL及50μg/mL。將各分級物的PPARγ配體活性示于圖3中。這些圖的縱軸為分級物的活性相對于對照物質(zhì)（DMSO）的活性的比例。如圖3中所示的那樣，關(guān)于級分1的分級物（洗脫溶劑為苯：丙酮=20：1），可見濃度依賴性的PPARγ配體活性。

[實(shí)施例2反相柱分級物的調(diào)制及活性測定]

（1）反相ODS柱處理

如圖4的分級流程中所示的那樣，對于實(shí)施例1中得到的見到PPARγ活化作用的級分1的正相柱分級物，進(jìn)一步進(jìn)行反相色譜法，調(diào)制為5個反相柱分級物。反相色譜法如下進(jìn)行。將ODS硅膠（YMC*GEL ODS-A 6nm S-150μm；YMC CO.,LTD.制品）50g用甲醇懸浮后填充到玻璃柱色譜管（柱色譜管的長度為40cm、直徑為2.2cm、容量為152mL）中作為填充材料。將脫氣后的甲醇100%按照不產(chǎn)生氣泡的方式注入100mL使其流入該填充材料中。接著，以填充材料的10倍量（760mL）的脫氣后的甲醇10%水溶液將填充材料進(jìn)行平衡化。將實(shí)施例1中得到的級分1的分級物117mg溶解到甲醇中，將該溶液從填充材料上方進(jìn)行添加。然后，將甲醇濃度為10%、20%、30%、40%及100%的脫氣后的甲醇水溶液按照該濃度的順序從填充材料的上方開始各180mL地流過，將每種溶劑洗脫的分級物分開，作為反相柱分級物（級分1～5）回收。所得到的反相柱分級物在減壓下濃縮而除去溶劑，將所得到的分級物的一部分溶解到適量的二甲基亞砜中。對于所回收的分級物，使用高效液相色譜法（使用柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mmI.D.S-5μm 30nm、流動相：甲醇20%水溶液-甲醇70%水溶液、流速：1mL/分鐘、柱溫度：40℃、檢測條件UV：280nm）進(jìn)行分離狀況的確認(rèn)。將各分級物的HPLC的結(jié)果示于圖5中。圖5的橫軸表示保留時間（分鐘）。

（2）反相柱分級物的活性測定

將實(shí)施例2中得到的反相柱分級物（級分1～5）及實(shí)施例1中得到的正相柱分級物的級分1作為待檢試樣，進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)，評價各分級物的PPARγ配體活性。各分級物的最終濃度設(shè)定為100μg/mL。此外，對作為PPARγ激動劑的曲格列酮（Tro）也進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)。曲格列酮的最終濃度設(shè)定為1μM。將PPARγ配體活性示于圖6中。這些圖的縱軸為分級物的活性相對于對照物質(zhì)（DMSO）的活性的比例。如圖6中所示的那樣，關(guān)于反相柱分級物的級分4（洗脫溶劑為水：甲醇=60：40）及級分5（洗脫溶劑為甲醇100%），見到了PPARγ配體活性。

[實(shí)施例3峰分級物的調(diào)制及活性測定]

（1）利用高效液相色譜法的分級

若看圖5中所示的反相柱分級物的HPLC色譜，則在見到PPARγ活化作用的級分4及5中，可見多個特異性的峰。因此，對級分4及5進(jìn)行顯示特異性的峰的物質(zhì)的分級，嘗試將活性物質(zhì)純化。分級使用反相高效液相色譜法（使用柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mmI.D.S-5μm 30nm、流動相：甲醇20%水溶液-甲醇70%水溶液、流速：1mL/分鐘、柱溫度：40℃、檢測條件UV：280nm）來進(jìn)行。

（2）峰分級物的活性測定

將實(shí)施例3中得到的峰分級物及曲格列酮（Tro）作為待檢試樣，進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)，評價各分級物的PPARγ配體活性。各分級物的最終濃度設(shè)定為100μg/mL，曲格列酮的最終濃度設(shè)定為1μM。將結(jié)果示于圖7中。如圖7中所示的那樣，在級分4的峰5的分級物中可見明確的PPARγ配體活性。另外，將該峰5的分級物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果作為單峰被檢測到（參照圖8），獲知能夠作為單一成分而離析。

進(jìn)而，對實(shí)施例3中得到的峰5的分級物、實(shí)施例2中得到的反相柱分級物的級分5及曲格列酮，進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)，評價各分級物的PPARγ配體活性。峰5的分級物的最終濃度設(shè)定為低濃度：50μg/mL、及高濃度：100μg/mL，反相柱分級物的級分5的最終濃度設(shè)定為25μg/mL及50μg/mL，曲格列酮的最終濃度設(shè)定為10μM。將結(jié)果示于圖9中。如圖9中所示的那樣，可見峰5的分級物的PPARγ配體活性為濃度依賴性地上升。

[實(shí)施例4峰分級物的結(jié)構(gòu)決定]

對實(shí)施例3中得到的峰5的分級物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。關(guān)于結(jié)構(gòu)解析，進(jìn)行LC/MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC及HSQC。將LC/MS的結(jié)果示于圖10中。圖10的橫軸表示m/z值，縱軸表示檢測強(qiáng)度。由圖10啟示了峰5的分級物的分子量為176.1687，示性式為C₁₀H₈O₃。此外，由¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC及HSQC的結(jié)果明白，峰5中包含的成分為5-羥基-4-苯基丁烯羥酸內(nèi)酯（以下，稱為“5H4PB”）。

[實(shí)施例5 UCP-1基因表達(dá)量的測定]

線粒體解偶聯(lián)型蛋白質(zhì)（Uncoupling Protein；UCP）具有使線粒體內(nèi)膜中的氧化的磷酸化反應(yīng)解偶聯(lián)、并將能量作為熱而消耗的功能。其中，UCP-1在進(jìn)行利用脂肪燃燒而產(chǎn)生熱的褐色脂肪細(xì)胞中特異性地表達(dá)。近年來，報道了特定的PPARγ合成激動劑使儲藏脂肪的白色脂肪細(xì)胞變化成使脂肪燃燒的褐色脂肪細(xì)胞（H.Ohno等、Cell metabolism、2012年、Vol.15、pp.395-404）。因此，為了確認(rèn)見到了PPARγ配體活性的峰5的分級物、即5H4PB是否具有使白色脂肪細(xì)胞變得褐色脂肪細(xì)胞化的作用，進(jìn)行了測定UCP-1基因的表達(dá)量的試驗(yàn)。

試驗(yàn)如下進(jìn)行。將間充質(zhì)細(xì)胞株10T1/2按照成為1×10⁴cells/mL的方式播種到12孔板中。培養(yǎng)至細(xì)胞變得融合后，按照最終濃度成為100μg/mL的方式添加峰5的分級物（5H4PB）。此外，作為對照物質(zhì)，使用DMSO。自樣品添加起24小時后，從細(xì)胞中回收mRNA，對mRNA量進(jìn)行定量。mRNA定量使用LightCycler（注冊商標(biāo)、Roche Applied Science公司）來進(jìn)行。將結(jié)果示于圖11中。圖的縱軸為峰5的分級物的UCP-1表達(dá)量相對于對照物質(zhì)（DMSO）的UCP-1表達(dá)量的比值。如圖11中所示的那樣，獲知峰5的分級物具有使UCP-1的表達(dá)水平上升的作用。UCP-1的表達(dá)量的增加表示來自脂質(zhì)的熱產(chǎn)生的亢進(jìn)。由該結(jié)果獲知，峰5的分級物、即5H4PB介由UCP-1的活化而有助于脂質(zhì)代謝的改善、促進(jìn)。

[實(shí)施例6 5H4PB的合成]

為了確認(rèn)通過化學(xué)合成而得到的5H4PB具有與從香醋中萃取得到的5H4PB同樣的PPARγ活化作用，合成了5H4PB。合成如下進(jìn)行。使乙醛酸一水合物100mg和嗎啉150mg分散到1,4-二噁烷450μL中，一滴一滴地加入水55μL。加入苯乙醛140mg，在室溫下靜置1小時后，加熱回流24小時。將生成物進(jìn)行減壓濃縮，用二乙基醚2.5mL進(jìn)行萃取。在萃取的二乙基醚層中加入無水硫酸鎂使其脫水干燥后，再次進(jìn)行減壓濃縮。將濃縮物溶解到丙酮/氯仿混合溶液中，通過再結(jié)晶得到140mg的5H4PB。對所得到的合成5H4PB，進(jìn)行液相色譜質(zhì)量分析（LC/MS），確認(rèn)與由香醋中萃取得到的5H4PB（實(shí)施例3中得到的峰5的分級物）相同。

[實(shí)施例7合成品的活性測定]

將實(shí)施例6中得到的5H4PB合成品作為待檢試樣，進(jìn)行PPARγ活化試驗(yàn)。合成5H4PB的最終濃度設(shè)定為3.5μM。將結(jié)果示于圖12中。這些圖的縱軸為合成品的活性相對于對照物質(zhì)（DMSO）的活性的比例。如圖12中所示的那樣，關(guān)于通過化學(xué)合成得到的5H4PB，也可見與香醋來源物同樣高的PPARγ配體活性。

[實(shí)施例8各種丁烯羥酸內(nèi)酯化合物的合成及各合成品的活性測定]

化學(xué)合成了以5H4PB為代表的各種丁烯羥酸內(nèi)酯化合物，測定各種濃度下的PPARγ配體活性。本實(shí)施例中，5H4PB及各種丁烯羥酸內(nèi)酯的合成如以下那樣進(jìn)行。首先，關(guān)于上述式（3）所表示的5H4PB，在1L容量的四口燒瓶中依次加入嗎啉53mL（0.6mol）和1,4-二噁烷120mL，邊進(jìn)行冰浴邊依次滴加地加入50%乙醛酸水溶液62mL（0.6mol、1.5當(dāng)量）及濃鹽酸50mL。將該混合物加熱至內(nèi)溫87℃，緩慢地滴加將苯乙醛（48%鄰苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）用1,4-二噁烷稀釋3倍而得到的溶液，使該混合液回流一整夜。使用薄層色譜法確認(rèn)回流后的反應(yīng)液中不包含醛，將反應(yīng)液放冷至室溫。將反應(yīng)液濃縮后加入200mL的醋酸乙酯。用飽和碳酸氫鈉水進(jìn)行洗滌，將所得到的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾及濃縮而得到一部分油狀的黃色固體101g。在該黃色固體中加入200mL的醋酸乙酯使其溶解，加入氧化鋁（堿性）攪拌并進(jìn)行成批處理（batch treatment）。將氧化鋁過濾而除去后，將濾液濃縮而得到黃色固體（一部分油）96g。將其溶解到0.5倍量的醋酸乙酯中，加入1倍量的己烷進(jìn)行攪拌，濾取析出的固體而得到30.2g（收率為40%、GC純度為98.6%）乳白色固體的5H4PB。

此外，關(guān)于上述式（4）所表示的5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：甲基苯基）的化學(xué)合成，使用4-甲基苯乙醛（48%鄰苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）來代替苯乙醛，將該醛的滴加溫度設(shè)定為混合物的內(nèi)溫60℃，在滴加結(jié)束后加熱至內(nèi)溫87℃，除此以外與本實(shí)施例的5H4PB的合成方法（各藥劑的摩爾比、反應(yīng)時間等）同樣地進(jìn)行。所得到的化合物的收率為30%，GC純度為97.6%。

此外，關(guān)于以下式（5）中所示的5-羥基-4-（4-甲基芐基）丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：甲基芐基）的化學(xué)合成，除了使用3-（4-甲基苯基）丙醛（48%鄰苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）來代替苯乙醛以外，與上述的5H4PB的合成方法同樣地操作，使混合液回流一整夜而進(jìn)行反應(yīng)。使用薄層色譜法確認(rèn)回流后的反應(yīng)液中不包含醛，將反應(yīng)液放冷至室溫。將反應(yīng)液濃縮后加入2倍量的醋酸乙酯。將該溶液用稀鹽酸和飽和碳酸氫鈉水進(jìn)行洗滌，除去用柱難以分離的成分。將所得到的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾及濃縮而得到粗制固體。將該固體溶解到10倍量的己烷/醋酸乙酯=1的混合溶劑中，用硅膠（PQS100B）3倍量進(jìn)行成批處理。在所得到的濃縮液中加入己烷，濾取析出的固體而以收率24%、GC純度99.2%得到無色固體的5-羥基-4-（4-甲基芐基）丁烯羥酸內(nèi)酯。

[化學(xué)式5]

進(jìn)而，關(guān)于以下式（6）中所示的5-羥基-4-芐基丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：芐基）的化學(xué)合成，除了使用3-苯基丙醛（48%鄰苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）來代替苯乙醛以外，與上述的5H4PB的合成方法同樣地操作，使混合液回流一整夜而進(jìn)行反應(yīng)。使用薄層色譜法確認(rèn)回流后的反應(yīng)液中不包含醛，將反應(yīng)液放冷至室溫。將反應(yīng)液濃縮后加入2倍量的醋酸乙酯。用飽和碳酸氫鈉水進(jìn)行洗滌，將所得到的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾及濃縮而得到粗制固體。將該粗制固體用硅膠（PQS100B、展開溶劑：己烷/醋酸乙酯=4→2.3）進(jìn)行純化。在所得到的濃縮液中加入己烷，濾取析出的固體而以收率60%、GC純度99.6%得到無色固體的5-羥基-4-芐基丁烯羥酸內(nèi)酯。

[化學(xué)式6]

對如上述那樣操作而合成的4種丁烯羥酸內(nèi)酯化合物、即5H4PB（式（1）中的R²：苯基）、5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：甲基苯基）、5-羥基-4-芐基丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：芐基）及5-羥基-4-（4-甲基芐基）丁烯羥酸內(nèi)酯（式（1）中的R²：甲基芐基），進(jìn)行以下表1中所示的待檢試樣濃度下的試驗(yàn)。關(guān)于PPARγ配體活性的測定，除了將添加待檢試樣后的孵化時間設(shè)定為48小時以外，與實(shí)施例7同樣地進(jìn)行。將結(jié)果示于以下表1及圖13中。以下表中所示的值及圖的縱軸為各合成品的活性相對于對照物質(zhì)（DMSO）的活性的比例（%）。在表1及圖13中，將作為待檢試樣的各種丁烯羥酸內(nèi)酯化合物以式（1）中的R²的官能團(tuán)表示。

表1

如表1及圖13中所示的那樣，獲知4種待檢試樣均具有PPARγ配體活性。其中，表1中帶*的數(shù)值的試驗(yàn)區(qū)表示與對照相比為2倍以上的活性，p<0.05（有顯著差異）。由該結(jié)果獲知，5H4PB（R²：苯基）及5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯（R²：甲基苯基）在0.8～10μg/mL的范圍內(nèi)顯示高的活性，5-羥基-4-芐基丁烯羥酸內(nèi)酯（R²：芐基）在2～4μg/mL的范圍內(nèi)顯示高的活性，5-羥基-4-（4-甲基芐基）丁烯羥酸內(nèi)酯（R²：甲基芐基）在4～20μg/mL的范圍內(nèi)顯示高的活性。其中，明白了5H4PB及5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯在低濃度范圍內(nèi)具有高的活性，特別是5-羥基-4-（4-甲基苯基）丁烯羥酸內(nèi)酯具有最高的活性。

[實(shí)施例9對于食餌性肥胖模型小鼠的抗肥胖作用的驗(yàn)證]

將實(shí)施例6中得到的5H4PB對給餌了高脂肪食的小鼠進(jìn)行投與，驗(yàn)證其抗肥胖作用。將5周齡的雄性C57BL/6J小鼠（供給源：日本Charles River株式會社）在溫度為20～26℃、濕度為35～75%、照明為12小時（7：00～19：00）的環(huán)境條件下每1籠各1只進(jìn)行單飼。馴化1周左右后，如以下表2中所示的那樣，各6～8只地分成6組。對于試驗(yàn)組中的正常組，在試驗(yàn)期間，給餌普通固體飼料CRF1（Oriental Yeast Co.,ltd.制品、3.57kcal/g），對于對照組及藥劑投與組，在試驗(yàn)期間，給餌高卡路里固體飼料D12492（Research Diets公司制品、5.24kcal/g）。飼料設(shè)定為自由攝取，飲水也設(shè)定為從給水瓶的自由飲水。

表2

對各藥劑投與組的小鼠，以表2中所示的規(guī)定的投與量1天1次在整個12周投與作為待檢物質(zhì)的5H4PB（實(shí)施例6中制造）或作為陽性對照物質(zhì)的羅格列酮（和光純藥工業(yè)株式會社制品）。另外，羅格列酮為選擇性PPARγ配體，是具有與PPARγ結(jié)合而使葡萄糖、脂肪酸、胰島素的血中濃度降低的作用的物質(zhì)。在投與時，每周進(jìn)行1次體重測定，算出對各個體的投與量。將5H4PB及羅格列酮分別懸浮到0.5w/v%甲基纖維素水溶液中，利用相同水溶液進(jìn)行稀釋，并按照投與容量成為10mL/kg的方式調(diào)整后，使用注射筒及柔軟的胃飼管對胃內(nèi)強(qiáng)制投與。另外，對正常組及對照組的小鼠，以10mL/kg的投與容量1天1次在整個12周投與僅0.5w/v%甲基纖維素水溶液。

從試驗(yàn)（投與）開始起以每周1次的頻率測定各個體的體重，求出各試驗(yàn)組的平均值。將結(jié)果示于圖14中。圖的縱軸為小鼠的體重（g），橫軸表示從試驗(yàn)開始起的天數(shù)（天）。如圖14中所示的那樣，對照組在試驗(yàn)開始21天以后，與正常組相比可見到體重的顯著性增加。此外，在投與了5H4PB的組中，與對照組相比，顯示出由高卡路里食引起的體重增加被抑制。具體而言，相對于試驗(yàn)結(jié)束時刻（第84天）的由高卡路里食引起的對照組的體重增加量（由對照組的體重減去正常組的體重的值），以0.037μg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組的體重增加被抑制25.8%，以0.01mg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組的體重增加被抑制27.8%。像這樣，認(rèn)識到5H4PB具有高的抗肥胖效果。另一方面，根據(jù)具有PPARγ配體活性的羅格列酮的投與結(jié)果，在以0.037μg/kg/天投與了羅格列酮的低用量的試驗(yàn)組中，與對照組相比體重增加，沒有觀察到抗肥胖效果。此外，關(guān)于以10mg/kg/天投與了羅格列酮的高用量的試驗(yàn)組，與以0.037μg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組相比，體重增加抑制率也低。由這些獲知，5H4PB即使為低用量的投與，也可以得到抗肥胖效果。

[實(shí)施例10食餌性肥胖模型小鼠中的血中脂聯(lián)素的測定]

脂聯(lián)素是與胰島素抵抗性或糖尿病、動脈硬化等代謝異常癥候群有關(guān)的分泌蛋白。已知脂聯(lián)素缺損小鼠與野生型小鼠相比，具有容易發(fā)生胰島素抵抗性疾病，容易罹患動脈硬化的性質(zhì)，在人體內(nèi)，脂聯(lián)素濃度的降低也與糖尿病及動脈硬化等代謝異常癥候群有關(guān)聯(lián)。因此，對于實(shí)施例9中的食餌性肥胖模型小鼠，進(jìn)行了測定血中脂聯(lián)素量的試驗(yàn)。

對于從實(shí)施例9的試驗(yàn)開始起經(jīng)過85天的雄性C57BL/6J小鼠的各個體，在2%異氟醚麻醉下使用添加了肝素的注射筒從腹部大靜脈進(jìn)行采血。采血量設(shè)定為約0.8mL。采集的血液在冰冷下保存至進(jìn)行離心分離為止，離心分離（條件：4℃、約1800×g、10分鐘）后，回收上層而得到血漿。血漿分注到采樣管中，冷凍保存至進(jìn)行測定為止。使用市售的ELISA試劑盒測定由各個體得到的小鼠血漿中包含的小鼠脂聯(lián)素濃度，求出各試驗(yàn)組的平均值。將結(jié)果示于圖15中。

圖的縱軸為小鼠血漿中的脂聯(lián)素的濃度（ng/mL），柱形圖的各柱從左側(cè)起表示正常組、對照組、5H4PB 0.037μg/kg/天投與組、5H4PB 0.01mg/kg/天投與組、羅格列酮0.037μg/kg/天投與組及羅格列酮10mg/kg/天投與組。根據(jù)該結(jié)果，與對照組相比，在投與了5H4PB的組中，可見脂聯(lián)素濃度上升。此外，t檢驗(yàn)的結(jié)果是，特別是在0.01mg/kg/天的投與組中，確認(rèn)到顯著的脂聯(lián)素濃度的上升。由這些結(jié)果獲知，通過5H4PB的投與，可以得到脂聯(lián)素起作用的胰島素抵抗性或糖尿病、高脂血癥、動脈硬化等的預(yù)防·改善效果。

[實(shí)施例11食餌性肥胖模型小鼠中的血中胰島素的測定]

使用市售的ELISA試劑盒測定在實(shí)施例10中由各個體得到的小鼠血漿中包含的小鼠胰島素量，求出各試驗(yàn)組的平均值。將結(jié)果示于圖16中。圖的縱軸為小鼠血漿中的胰島素濃度（ng/mL），柱形圖的各柱所表示的試驗(yàn)組與上述的圖15同樣。根據(jù)該結(jié)果，與見到了由肥胖引起的高胰島素血癥的對照組相比，在投與了5H4PB的組中，特別是低用量的組中，確認(rèn)了胰島素濃度的上升得到抑制。由這些結(jié)果獲知，通過5H4PB的投與，可以得到胰島素抵抗性或糖尿病的預(yù)防·改善效果。

[實(shí)施例12食餌性肥胖模型小鼠中的血中瘦素的測定]

已知瘦素是進(jìn)行食欲和代謝的調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)激素，但通過肥胖而導(dǎo)致血中瘦素濃度上升，產(chǎn)生瘦素抵抗性。使用市售的ELISA試劑盒測定在實(shí)施例10中由各個體得到的小鼠血漿中包含的小鼠瘦素量，求出各試驗(yàn)組的平均值。將結(jié)果示于圖17中。圖的縱軸為小鼠血漿中的瘦素濃度（pg/mL），柱形圖的各柱所表示的試驗(yàn)組與上述的圖15及圖16同樣。根據(jù)該結(jié)果，與見到了由肥胖引起的高瘦素血癥的對照組相比，在投與了5H4PB的組中，確認(rèn)到瘦素濃度的上升被用量依賴性地抑制。由這些結(jié)果獲知，通過5H4PB的投與，可以得到瘦素抵抗性或肥胖的預(yù)防·改善效果。

[實(shí)施例13食餌性肥胖模型小鼠中的皮下脂肪量及內(nèi)臟脂肪量的測定]

對于從實(shí)施例9的試驗(yàn)開始起經(jīng)過85天的雄性C57BL/6J小鼠的各個體，在2%異氟醚麻醉下采血后，使其安樂死。由各個體采集鼠蹊部皮下脂肪、精巢周圍脂肪、腎臟周圍脂肪及腸系膜脂肪，測定各脂肪的重量，求出各試驗(yàn)組的平均值。

將結(jié)果示于圖18（A）～（D）中。各圖的縱軸為測定的各脂肪組織的重量（g），柱形圖的各柱從左側(cè)起表示正常組、對照組、5H4PB 0.037μg/kg/天投與組、5H4PB 0.01mg/kg/天投與組、羅格列酮0.037μg/kg/天投與組及羅格列酮10mg/kg/天投與組。如圖18中所示的那樣，根據(jù)其結(jié)果，與對照組相比，在投與了5H4PB的組中，顯示由高卡路里食引起的皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的蓄積得到抑制。具體而言，相對于由高卡路里食引起的對照組的各脂肪組織的增加量（由對照組的脂肪組織重量減去正常組的脂肪組織重量而得到的值），在以0.037μg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組中，鼠蹊部皮下脂肪的脂肪組織的增加被抑制約35%，精巢周圍脂肪的脂肪組織的增加被抑制約18%，腎臟周圍脂肪的脂肪組織的增加被抑制約13%及腸系膜脂肪的脂肪組織的增加被抑制約16%，在以0.01mg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組中，鼠蹊部皮下脂肪的脂肪組織的增加被抑制約34%，精巢周圍脂肪的脂肪組織的增加被抑制約15%，腎臟周圍脂肪的脂肪組織的增加被抑制約13%及腸系膜脂肪量的脂肪組織的增加被抑制約40%。像這樣，認(rèn)識到5H4PB在低用量的投與中具有皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的蓄積抑制效果。此外，根據(jù)具有PPARγ配體活性的羅格列酮的投與結(jié)果，在以低用量（0.037μg/kg/天）投與了羅格列酮的試驗(yàn)組中，與對照組相比，內(nèi)臟脂肪量增加，沒有觀察到內(nèi)臟脂肪的蓄積抑制效果。由這些結(jié)果獲知，5H4PB即使是低用量的投與，也可以得到皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的蓄積抑制效果。

[實(shí)施例14由5H4PB的投與產(chǎn)生的對肝臟組織的影響的研究]

在實(shí)施例13中，由各個體采集脂肪組織時，采集肝臟進(jìn)行病理組織檢查。病理組織檢查所見如下所述。

關(guān)于正常組的個體，在肝細(xì)胞內(nèi)沒有見到脂肪滴的沉積，僅見到極輕度的炎癥性細(xì)胞的浸潤。另一方面，關(guān)于對照組的個體，在8個個體中的7個個體中，在肝細(xì)胞內(nèi)極輕度～輕度地可見小型～大型脂肪滴的沉積，與正常組同樣，極輕度地見到炎癥性細(xì)胞的浸潤。關(guān)于以0.037μg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組及以0.01mg/kg/天投與了5H4PB的試驗(yàn)組，肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴的沉積完全沒有或止于弱的沉積。在羅格列酮0.037μg/kg/天投與組中，在肝細(xì)胞內(nèi)混合存在微細(xì)·小型·大型脂肪滴，可見極輕度～輕度的沉積，在羅格列酮10mg/kg/天投與組中，這些脂肪滴增加，可見中等程度的沉積，同時肝細(xì)胞呈現(xiàn)輕度的肥大。

根據(jù)這些病理組織檢查所見，與羅格列酮投與組或?qū)φ战M相比，沒有可見由5H4PB引起的肝障礙。由此，確認(rèn)5H4PB為安全性高的成分。

以上敘述的實(shí)施例全部為例示性示出本發(fā)明的例子，并非限定性示出本發(fā)明，本發(fā)明能夠以其它各種變形方式及變更方式來實(shí)施。因此，本發(fā)明的范圍并不僅限于權(quán)利要求書及其均等范圍的規(guī)定。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明由于提供預(yù)防或改善PPARγ所參與的生活習(xí)慣病或其它病理狀態(tài)的PPARγ活化劑，所以在醫(yī)療或食品領(lǐng)域（也包括補(bǔ)充劑、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等）的產(chǎn)業(yè)中廣泛有用。