根據(jù)35U.S.C.§119(e)的規(guī)定本申請要求于2014年3月10日提交的美國臨時專利申請序號61/950,536的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容通過引用并入本申請。

序列表

本申請引用以電子ASCII.txt文件形式提交的命名為“2004837-0044_Sequences.txt”的序列表。該.txt文件于2015年3月9日創(chuàng)建，大小為1Kb。

背景

具有自組裝成凝膠結(jié)構(gòu)能力的肽試劑在治療和研究背景下具有多種多樣的用途。此類肽試劑的一種，例如合成的，具有精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸重復(fù)序列的16個氨基酸的多肽(即RADARADARADARADA[SEQ ID NO:1]，也稱為“RADA16”)是可以購買獲得的，其來自三維矩陣醫(yī)藥技術(shù)公司(3-D Matrix Medical Technology)，商品名為和PuraMatrix并且已證實其在實驗室和臨床上具有廣泛應(yīng)用，包括細(xì)胞培養(yǎng)，藥物遞送，加速軟骨和骨生長，以及CNS、軟組織和心肌的再生并且還能作為能夠與一種或多種檢測試劑、生物活性劑、細(xì)胞和/或細(xì)胞成分結(jié)合的基質(zhì)、支架或系鏈。

概述

除了其他以外，本發(fā)明提供了用于處理肽組合物的方法及相關(guān)技術(shù)。本申請?zhí)峁┑慕虒?dǎo)可以特別地用于高粘度的肽組合物和/或自組裝肽的組合物。

除了其他以外，本申請顯示了某些肽組合物(例如特定濃度和/或具有特定流變性質(zhì)的特定肽組合物)具有某些特性和/或其可能不適于某些操作和/或處理步驟，例如過濾(例如滅菌過濾)。

本申請還顯示了某些特定的肽組合物對能夠破壞多種肽組合物的一種或多種處理(例如在高壓滅菌程序中應(yīng)用的熱處理)具有令人吃驚的穩(wěn)定性。

因此，本申請?zhí)峁┝伺c對肽組合物的處理特別是滅菌相關(guān)的多種技術(shù)。

在一些實施方式中，本申請顯示了特定的肽組合物可能具有一種或多種有用的和/或令人吃驚的特性(例如對熱處理的破壞具有抗性，對剪切力具有流變學(xué)響應(yīng)性和/或從剪切力的應(yīng)用中恢復(fù)等)。

除了其他以外，本申請?zhí)峁┝擞糜跍缇慕M合物的系統(tǒng)，和/或用于確定應(yīng)用于特定肽組合物的適宜的此類系統(tǒng)的系統(tǒng)。

在一些實施方式中，可以例如通過一個或多個選自下組的特征定義特定的肽組合物：肽序列、肽濃度、粘度、硬度、對熱處理的敏感性、對應(yīng)用剪切力的流變學(xué)響應(yīng)性、從剪切力的應(yīng)用中流變學(xué)恢復(fù)等。

除了其他以外，本申請?zhí)峁┝丝梢酝ㄟ^高壓處理滅菌的某些肽組合物。

在一些實施方式中，本申請?zhí)峁┝藢崿F(xiàn)對某些肽組合物過濾的某些技術(shù)，特別是用于改變肽組合物的流變性質(zhì)(如由肽的特性和序列所定義的)以使得其適于過濾。例如，在一些實施方式中，可以在過濾前降低待過濾的肽組合物的粘度。在一些實施方式中，可以向肽組合物應(yīng)用剪切力，以使得其流變性質(zhì)改變。例如，可以在過濾前降低肽組合物的粘度和/或硬度；在一些實施方式中，這種降低是暫時性的。

在一些實施方式中，所提供的技術(shù)能夠過濾比使用常規(guī)的過濾技術(shù)可過濾的更高濃度的肽組合物。例如，本申請所述的技術(shù)能夠過濾RADA16，并且特別是在其濃度高于2.5％時通過過濾滅菌。

在一些特定的實施方式中，本申請?zhí)峁┝艘环N用于滅菌液體肽組合物的方法，所述液體肽組合物的序列包含一系列重復(fù)的IEIK單元，所述方法包括對組合物進(jìn)行高壓滅菌處理。在一些實施方式中，方法不包括滅菌過濾。

在一些實施方式中，本申請?zhí)峁┝艘环N用于滅菌液體肽組合物的方法，所述液體肽組合物的序列包含一系列重復(fù)的IEIK單元，所述方法包括對組合物進(jìn)行加熱處理。在一些實施方式中，加熱處理在約121℃下進(jìn)行約25min。

在一些實施方式中，本申請?zhí)峁┝艘环N用于滅菌液體肽組合物的方法，所述液體肽組合物在振蕩應(yīng)力為在1Pa的條件下具有范圍在約300至約5,000Pa內(nèi)的初始儲能模量，所述方法包括步驟：向液體肽組合物施加高剪切應(yīng)力，以使得組合物的儲能模量暫時降至所述初始儲能模量約0.01％至80％范圍內(nèi)的水平，和當(dāng)其粘度處于該降低的水平時將組合物過濾。

在一些實施方式中，向所述組合物施加高剪切應(yīng)力的步驟利用至少一個剪切稀化部件。

在一些實施方式中，至少一個剪切稀化部件是或者包括至少一個針。在一些實施方式，至少一個針的長度至少為10mm。在一些實施方式中，至少一個針的規(guī)格在約25號至約35號的范圍內(nèi)。

在一些實施方式中，至少一個剪切稀化部件是或者包括至少一個具有微米或納米級孔的篩網(wǎng)。在一些實施方式中，微米或納米級孔具有范圍在約0.5μm至約200μm內(nèi)的最大尺寸。在一些實施方式中，孔之間的夾點為約5μm至約10mm。在一些實施方式中，篩網(wǎng)至少部分地由選自下組的材料制成：不銹鋼、鎢、鈦、硅、陶瓷、塑料及其組合。在一些實施方式中，篩網(wǎng)的厚度為約10μm至約10mm。

在一些實施方式中，至少一個剪切稀化部件是或者包括至少一個具有微米或納米級孔的膜。在一些實施方式中，孔具有范圍從約0.45μm至約120μm的尺寸。

在一些實施方式中，用于滅菌的高剪切力的范圍從約30至約200Pa。

在一些實施方式中，液體肽組合物包括RADA16、IEIK13或KLD12。

在一些實施方式中，液體肽組合物在過濾前加壓。在一些實施方式中，進(jìn)一步在真空下貯存液體肽組合物。

附圖詳述

圖1A和1B顯示了高壓滅菌處理前后對RADA16進(jìn)行的用以評估其熱敏感性的質(zhì)譜分析的示例。圖1A為高壓滅菌處理前的質(zhì)譜圖。圖1B為高壓滅菌處理后的質(zhì)譜圖。圖1C顯示了示例性RADA16的分子結(jié)構(gòu)；在所分析的特定肽組合物中，蛋白由RADARADARADARADA組成，其中N末端和C末端被乙?；桶被Ｗo(hù)。

圖2A和2B顯示了高壓滅菌處理前后對IEIK13進(jìn)行的用以評估其熱敏感性的質(zhì)譜分析的示例。圖2A為高壓滅菌處理前的質(zhì)譜圖。圖2B為高壓滅菌處理后的質(zhì)譜圖。圖2C顯示了示例性IEIK13的分子結(jié)構(gòu)；在所分析的特定肽組合物中，蛋白由IEIKIEIKIEIKI組成，其中N末端和C末端被乙酰基和氨基保護(hù)。

圖3A和3B顯示了高壓滅菌處理前后對KLD12進(jìn)行的用以評估其熱敏感性的質(zhì)譜分析的示例。圖3A為高壓滅菌處理前的質(zhì)譜圖。圖3B為高壓滅菌處理后的質(zhì)譜圖。圖3C顯示了示例性KLD12的分子結(jié)構(gòu)；在所分析的特定肽組合物中，蛋白由KLDLKLDKKLDL組成，其中N末端和C末端被乙酰基和氨基保護(hù)。

圖4顯示了示例性的在高壓滅菌處理前后對RADA16和IEIK13進(jìn)行的時間掃描測試。

圖5提供了肽和過濾粘稠的肽溶液所需的裝置的照片，例如RADA16、KLD12和IEIK13。通過30號針向肽溶液施加剪切力(中間)，以便將肽溶液過濾(右側(cè))。

圖6顯示了在1Pa和10rad/s下對1％和2.5％RADA16進(jìn)行的時間掃描測試的示例。將RADA16注射通過30號針，以便應(yīng)用剪切力降低肽的剛性。從注射后1分鐘開始測定。

圖7顯示了在1Pa和10rad/s下對1％和2.5％KLD12進(jìn)行的時間掃描測試的示例。將KLD12注射通過30號針，以便應(yīng)用剪切力降低肽的剛性。從注射后1分鐘開始測定。

圖8顯示了在1Pa和10rad/s下對2.5％IEIK13進(jìn)行的時間掃描測試的示例。將IEIK13注射通過30號針，以便應(yīng)用剪切力降低肽的剛性。從注射后1分鐘開始測定。

圖9顯示了對2.5％RADA16溶液從剪切速率0.003至1000 1/sec進(jìn)行的流動粘度測試的示例。

圖10顯示了對1.5％IEIK13溶液從剪切速率0.003至1000 1/sec進(jìn)行的流動粘度測試的示例。

圖11顯示了以時間函數(shù)表示的對2.5％RADA16進(jìn)行的用以顯示粘度恢復(fù)情況的粘度檢測的示例。在時間＝0時，向肽施加剪切力，以使得粘度降低。水平線表示2.5％RADA16的原始粘度。

圖12顯示了以時間函數(shù)表示的對1.5％IEIK13進(jìn)行的用以顯示粘度恢復(fù)情況的粘度檢測的示例。在時間＝0時，向肽施加剪切力，以使得粘度降低。水平線表示1.5％IEIK13的原始粘度。

圖13顯示了用于過濾粘性肽溶液的裝置的示例，所述粘性肽溶液例如RADA16、KLD12和IEIK13。通過具有多個孔的剪切稀化部件施加剪切力。使用頂部(i)上的注射器分散肽溶液。使肽溶液通過第一剪切稀化室(25mm濾器支架，密理博(ii))，其中插入了具有孔或洞的剪切稀化部件以暫時降低肽溶液的粘度。然后使肽溶液通過第二過濾室(25mm濾器支架，密理博(iii))，其中插入了濾膜以便對肽溶液滅菌或從肽溶液中除去微粒。在用于輸出的瓶(iv)中接收過濾后的溶液。高壓分散器與分散注射器(v)連接。高壓氮氣與高壓分散器(vii)連接。

圖14顯示了向2.5％KLD12溶液和1.5％IEIK13溶液施加剪切力后粘度的目測觀察結(jié)果。上面一行包括了2.5％KLD的照片。下面一行包括了1.5％IEIK13的照片。最左邊一列的溶液在小瓶上部。最右邊一列的溶液(施加剪切力后)具有較低粘度，這樣大部分材料處于小瓶的底部。

圖15A、15B、15C和15D顯示了用于過濾粘性肽溶液的材料和裝置(具有微米或納米級孔的篩網(wǎng))，所述粘性肽溶液如RADA16、KLD12和IEIK13。圖15A、15B和15C顯示了示例性剪切稀化部件具有微米級孔的篩網(wǎng)的性質(zhì)，可以將其用于圖13所示的裝置中?？淄ㄟ^激光鉆孔技術(shù)產(chǎn)生?？梢詫⑦@種篩網(wǎng)插入第一室中以便在實際過濾通過第二室的膜之前降低肽溶液的粘度。圖15D顯示了使用具有微米或納米級孔的篩網(wǎng)向2.5％KLD12施加剪切力后粘度的目測觀察結(jié)果。

定義

在本申請中使用的術(shù)語“試劑”可以指任意化學(xué)類別的化合物或?qū)嶓w，包括例如多肽、核酸、糖類、脂質(zhì)、小分子、金屬或其組合。在一些實施方式中，試劑是或者包含自然界發(fā)現(xiàn)和/或從自然界獲得的天然產(chǎn)物。在一些實施方式中，試劑是或者包含一種或多種人造的實體，其是由人工設(shè)計、工程改造和/或生產(chǎn)的和/或在自然界中未被發(fā)現(xiàn)。在一些實施方式中，試劑可以以分離的或純的形式使用；在一些實施方式中，試劑可以以粗品形式使用。在一些實施方式中，以集合或試劑庫形式提供潛在的試劑，例如可以對其進(jìn)行篩選以鑒定或表征其中的活性劑?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的試劑的一些特定的實施方式包括小分子、抗體、抗體片段、適體、核酸(例如siRNA、shRNA、DNA/RNA雜交體、反義寡核苷酸、核酶)、肽、肽模擬物等。在一些實施方式中，試劑是或包括聚合物。在一些實施方式中，試劑不是聚合物和/或基本上無任何聚合物。在一些實施方式中，試劑含有至少一個聚合物部分。在一些實施方式中，試劑缺乏或基本上無任何聚合物部分。

在本申請中使用的術(shù)語“氨基酸”從最廣義講是指能夠例如通過形成一個或多個肽鍵摻入多肽鏈的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方式中，氨基酸具有通式結(jié)構(gòu)H2N–C(H)(R)–COOH。在一些實施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實施方式中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些實施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些實施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”指在天然存在的肽中常見的20個標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸中的任意一個。“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”指標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以外的任意氨基酸，無論其是否是合成制備的或由天然來源獲得的。在一些實施方式中，與上述通式結(jié)構(gòu)相比氨基酸(包括在多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以含有結(jié)構(gòu)修飾。例如，在一些實施方式中，與通式結(jié)構(gòu)相比，可以通過甲基化、酰胺化、乙?；?或取代對氨基酸進(jìn)行修飾。在一些實施方式中，與含有在其他方面相同的未經(jīng)修飾氨基酸的多肽相比，此類修飾可能例如改變含有經(jīng)修飾氨基酸的多肽的循環(huán)半衰期。在一些實施方式中，與含有在其他方面相同的未經(jīng)修飾氨基酸的多肽相比，此類修飾不會顯著改變含有經(jīng)修飾氨基酸的多肽的相對活性。從上下文中將明確，在一些實施方式中，使用術(shù)語“氨基酸”指代游離氨基酸；在一些實施方式中，其用于指代多肽的氨基酸殘基。

在本申請中使用的術(shù)語“大約”或“約”當(dāng)用于一個或多個目標(biāo)值時指的是與所陳述的基準(zhǔn)值相似的值。在某些實施方式中，除非另有規(guī)定或從上下文中可以明顯看出(除非這些數(shù)目將超出可能值的100％)，術(shù)語“大約”或“約”指落入陳述的基準(zhǔn)值兩個方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或以下之內(nèi)的值的范圍。

作為在本申請中使用的術(shù)語，如果一個事件或?qū)嶓w的存在、水平和/或形式與另一個的是相關(guān)聯(lián)的，則兩個事件或?qū)嶓w彼此之間是“相關(guān)的”。例如，如果特定的實體的存在、水平和/或形式與疾病、病癥或狀況的發(fā)病率和/或易感性(例如在相關(guān)人群中)是相關(guān)聯(lián)的，則認(rèn)為該特定的實體(例如多肽、基因特征、代謝物等)與特定疾病、病癥或狀況具有相關(guān)性。在一些實施方式中，如果兩個或多個實體直接或間接地相互作用，以使得其是且/或保持物理上彼此接近，則其彼此之間在物理上是“相關(guān)的”。在一些實施方式中，物理上彼此相關(guān)的兩種或多種實體彼此之間共價連接；在一些實施方式中，物理上彼此相關(guān)的兩種或多種實體彼此之間不是共價連接的，而是非共價結(jié)合的，例如通過氫鍵、范德華相互作用、疏水性相互作用、磁性及其組合的方法。

在本申請中使用術(shù)語“可比較的”描述兩個(或多個)條件、情況、個體或群體的集合彼此之間是非常相似的以使得能夠?qū)Λ@得的結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象進(jìn)行比較。在一些實施方式中，可比較的條件、情況、個體或群體的集合的特征為具有多個基本上相同的特征以及一個或少數(shù)不同的特征。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，當(dāng)通過足夠數(shù)量和種類的相同特征來表征以確保得到“在不同情況、個體或人群下或使用不同情況、個體或人群獲得的結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象中的差別是由上述變化的特征的改變引起的或表明了上述變化的特征的改變”的合理結(jié)論時，多組情況、個體或人群彼此之間是可比較的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本申請中使用的相對用語(例如增強(qiáng)、活化、減少、抑制等)將通常指在可比較的條件下進(jìn)行的比較。

本申請描述的某些方法包括“確定”步驟。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本說明書時將理解這些“確定”可以利用或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的各種技術(shù)中的任意一種完成，包括例如本申請中明確提及的特定技術(shù)。在一些實施方式中，確定包括對物理樣品的操作。在一些實施方式中，確定包括對數(shù)據(jù)或信息的考慮和/或操作，例如利用計算機(jī)或適于進(jìn)行相關(guān)分析的其他處理單元。在一些實施方式中，確定包括從來源接收相關(guān)信息和/或材料。在一些實施方式中，確定包括將樣品或?qū)嶓w的一個或多個特征與可比較的對照進(jìn)行比較。

在本申請中使用的術(shù)語“凝膠”指其流變性質(zhì)不同于液體、固體等的粘彈性材料。在一些實施方式中，如果組合物的儲能模量(G′)大于其模量(G″)則認(rèn)為其是凝膠。在一些實施方式中，如果在溶液中具有化學(xué)或物理交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)，則認(rèn)為組合物是凝膠，其不同于粘稠溶液中纏結(jié)的分子。

在本申請中使用的術(shù)語“體外”指在人工環(huán)境中(例如在試管或反應(yīng)容器中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中等)而非多細(xì)胞生物體內(nèi)發(fā)生的事件。

在本申請中使用的術(shù)語“體內(nèi)”指在多細(xì)胞生物體(如人和非人動物)體內(nèi)發(fā)生的事件。在基于細(xì)胞系統(tǒng)的背景下，該術(shù)語可以用于指在活細(xì)胞中發(fā)生的事件(相對于例如在體外系統(tǒng)中)。

在本申請中使用的術(shù)語“肽”通常指相對較短的多肽，例如長度小于約100個氨基酸、小于約50個氨基酸、小于20個氨基酸或者小于10個氨基酸。

在本申請中使用的術(shù)語“多肽”指氨基酸的任意聚合鏈。在一些實施方式中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些實施方式中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些實施方式中，多肽具有經(jīng)過工程改造的氨基酸序列，所述氨基酸序列由人工設(shè)計和/或生產(chǎn)。在一些實施方式中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或兩者或由天然氨基酸、非天然氨基酸或兩者組成。在一些實施方式中，多肽可以僅包含天然氨基酸或僅包含非天然氨基酸或者僅由天然氨基酸組成或僅由非天然氨基酸組成。在一些實施方式中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或者兩者。在一些實施方式中，多肽可以僅包含D-氨基酸。在一些實施方式中，多肽可以僅包含L-氨基酸。在一些實施方式中，多肽在其N末端、其C末端或任意組合可以包括一個或多個側(cè)基或其他修飾，例如修飾或連接至一個或多個氨基酸側(cè)鏈。在一些實施方式中，此類側(cè)基或修飾可以選自下組：乙?；?、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其組合。在一些實施方式中，多肽可以是環(huán)狀的，和/或可以包含環(huán)狀部分。在一些實施方式中，多肽不是環(huán)狀的和/或不包含任何環(huán)狀部分。在一些實施方式中，多肽是線型的。在一些實施方式中，多肽可以是或包括裝訂肽。在一些實施方式中，可以將術(shù)語“多肽”附加在參照多肽的名稱、活性或結(jié)構(gòu)之后；在這種情況下，其在本申請中指共享相關(guān)活性或結(jié)構(gòu)的多肽，并且因此可以將其認(rèn)為是相同的多肽分類或家族的成員。對于每個這種分類而言，本說明書提供了和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到在該分類中的氨基酸序列和/或功能已知的示例性多肽；在一些實施方式中，此類示例性多肽是該多肽分類或家族的參照多肽。在一些實施方式中，多肽分類或家族的成員與該分類中的參照多肽(在一些實施方式中是與該分類中的所有多肽)顯示出顯著的序列同源性或同一性、與其共享共有序列基序(例如特征性序列元件)和/或與其共享共同的活性(在一些實施方式中在可比較的水平或在指定范圍內(nèi))。例如，在一些實施方式中，一個多肽成員與參照多肽顯示出至少約30-40％，并且通常超過約50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的總的序列同源性或同一性程度且/或包括至少一個顯示出非常高的序列同一性(通常超過90％或者甚至95％、96％、97％、98％或99％)的區(qū)域(例如保守區(qū)，其在一些實施方式中可能是或者包括特征性序列元件)。此類保守區(qū)通常包括至少3-4個和通常可達(dá)20個或更多的氨基酸；在一些實施方式中，保守區(qū)包括至少一個具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個連續(xù)氨基酸的延展。在一些實施方式中，有用的多肽可以包含親本多肽的片段或由親本多肽的片段組成。在一些實施方式中，有用的多肽可以包含多個片段或由多個片段組成，其中的每個片段均以相對于目標(biāo)多肽中存在的彼此之間不同的空間排列方式存在于相同親本多肽中(例如在親本中直接連接的片段在目標(biāo)多肽中可以是空間上分隔的，或者反之亦然，和/或片段可以以與親本不同的順序存在于目標(biāo)多肽中)，以使得目標(biāo)多肽是其親本多肽的衍生物。

在本申請中使用的術(shù)語“參照”描述了進(jìn)行比較所相對的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ?。例如，在一些實施方式中，將目?biāo)試劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值與參照或?qū)φ赵噭游?、個體、群體、樣品、序列或值進(jìn)行比較。在一些實施方式中，對參照或?qū)φ盏臋z測和/或確定與對目標(biāo)的檢測或確定基本上同時進(jìn)行。在一些實施方式中，參照或?qū)φ帐菤v史參照或?qū)φ?，任選地存在于有形介質(zhì)中。通常地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在與評估的那些可比較的條件或情況下對參照或?qū)φ者M(jìn)行確定或表征。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解當(dāng)存在足夠的相似性時才能證明特定可能的參照或?qū)φ盏目煽啃院?或與特定可能的參照或?qū)φ毡容^是合理的。

對某些實施方式的詳細(xì)描述

本發(fā)明提供了用于肽組合物滅菌的技術(shù)。在一些實施方式中，所公開的方法特別適于具有較高粘度和/或剛性的肽溶液。在一些實施方式中，本申請定義了可以通過高壓滅菌處理對其進(jìn)行滅菌的特定的肽溶液。在一些實施方式中，本申請定義了特定的肽溶液，除非且直到對其進(jìn)行處理以改變其流變性質(zhì)，否則其可能不適于過濾。在一些實施方式中，本申請?zhí)峁┝丝梢詴簳r降低肽溶液的粘度和/或剛性至足以使其能夠被過濾的技術(shù)。在一些實施方式中，本申請教導(dǎo)了便于某些肽溶液的操作、處理和/或過濾的技術(shù)，例如通過施加改善其流變性質(zhì)的高剪切力。

肽和肽組合物

根據(jù)一個或多個實施方式，本申請教導(dǎo)的肽組合物可以是具有約6個至約200個氨基酸殘基的兩親性肽的組合物。在某些實施方式中，相關(guān)的肽可以具有至少約7個氨基酸的長度。在某些實施方式中，肽可以具有約7個至約17個氨基酸的長度。在某些實施方式中，肽可以具有至少8個氨基酸、至少約12個氨基酸或至少約16個氨基酸的長度。

在一些實施方式中，如本領(lǐng)域中所理解的，兩親性多肽是指其序列同時包括親水性氨基酸和疏水性氨基酸。在一些實施方式中，此類親水性氨基酸和疏水性氨基酸可以交替鍵合，以使得該肽具有親水性和疏水性氨基酸交替的氨基酸序列。在一些實施方式中，此類肽具有是或包含Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)重復(fù)的氨基酸序列；在一些實施方式中，此類肽具有是或包含Lys-Leu-Asp(KLD)重復(fù)的氨基酸序列；在一些實施方式中，此類肽具有是或包含Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)重復(fù)的氨基酸序列。

在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽通?？梢允亲越M裝的，且/或在某些條件下可以在水溶液中顯示出β片層結(jié)構(gòu)。

在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽具有如名為的市售產(chǎn)品中的氨基酸序列，即具有氨基酸序列Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala(即RADA16,又稱為[RADA]4；SEQ ID NO:1)。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽具有氨基酸序列：Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu(即KLDL12,又稱為[KLDL]3,又稱為KLD12；SEQ ID NO:2)。根據(jù)本發(fā)明使用的肽具有氨基酸序列：Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile(即IEIK13,又稱為(IEIK)3I；SEQ ID NO:3)。

在一些實施方式中，與本申請可能相關(guān)的肽組合物是具有某些流變性質(zhì)特征的那些。在一些實施方式中，相關(guān)的流變性質(zhì)可以是或包括損耗模量、剛性、流變性恢復(fù)時間、儲能模量、粘度、屈服應(yīng)力等。在一些實施方式中，通過測定評估流變性質(zhì)；在一些實施方式中，可以通過目測觀察評估一種或多種流變性質(zhì)。

在某些實施方式中，儲能模量與剛性呈正相關(guān)；在通常情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解較高的儲能模量與較高的剛性具有相關(guān)性。

在一些實施方式中，具有較高粘度的肽組合物的特征為在頻率為1rad/sec和振蕩應(yīng)力為1Pa條件下儲能模量的范圍在約300至約5,000Pa內(nèi)。

在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽組合物的肽濃度在約0.01％至約10％范圍內(nèi)。

在一些實施方式中，向其應(yīng)用一種或多種本申請所述方法的肽組合物是商業(yè)規(guī)模量的。

在一些實施方式中，向其應(yīng)用一種或多種本申請所述方法的肽組合物已經(jīng)貯存了一段時間。在一些實施方式中，肽組合物已被貯存在加壓容器中。

在一些實施方式中，將已向其應(yīng)用一種或多種本申請所述方法的肽組合物貯存在例如儲存容器中，隨后進(jìn)行包裝。

對性能進(jìn)行改善

本申請注意到與例如高粘度和/或剛性相關(guān)的困難復(fù)雜化了某些肽組合物(例如特別是某些自組裝肽組合物和/或肽濃度較高的組合物)的制備和/或處理。本申請?zhí)貏e表明某些肽組合物不適于過濾，特別是通過除菌濾器過濾。

本申請還注意到過濾面臨的挑戰(zhàn)可能使得對此類肽組合物的滅菌變得復(fù)雜或者對其造成阻礙。本申請?zhí)峁┝耸沟媚承╇慕M合物能夠過濾和/或以其他方式滅菌的技術(shù)。

高壓滅菌處理

高壓滅菌處理是一種常規(guī)的滅菌方法，其包括在121℃下向材料施加高壓飽和蒸汽。根據(jù)本領(lǐng)域的通常理解使用高熱，如高壓滅菌處理中所涉及的高熱，能夠?qū)е码慕到狻?/p>

本發(fā)明令人吃驚的證明了某些肽組合物對熱處理是穩(wěn)定的，特別是對高壓滅菌處理。除了其他以外，本申請證明了此類肽組合物可以使用高壓滅菌處理滅菌。在一些實施方式中，可以在約121℃下對此類組合物熱處理約25分鐘進(jìn)行滅菌。

在一些實施方式中，可以進(jìn)行熱處理和/或高壓滅菌處理的肽組合物是IEIK13組合物。在一些此類實施方式中，IEIK13組合物的濃度在約0.01％至約10％范圍內(nèi)。

在一些實施方式中，可以進(jìn)行熱處理和/或高壓滅菌處理的肽組合物是KLD12組合物。在一些實施方式中，然而，不對KLD12組合物進(jìn)行依據(jù)本發(fā)明的高壓滅菌處理。

在一些實施方式中，不對RADA16組合物進(jìn)行依據(jù)本發(fā)明的高壓滅菌處理。

不希望受到任何特定理論的束縛，本申請?zhí)岢隽四承㊣EIK13組合物對熱處理如高壓滅菌處理是穩(wěn)定的可能至少部分地是由于在組合物中缺乏天冬氨酸(Asp,D)，而RADA16和KLD12具有天冬氨酸。

在一些實施方式中，能夠適于依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行熱處理如高壓滅菌處理的肽組合物的特征為當(dāng)暴露于此類處理時對降解具有抗性和/或當(dāng)進(jìn)行此類處理時流變性質(zhì)(例如粘度和/或剛性)具有穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，可以將目標(biāo)肽組合物暴露于熱處理如高壓滅菌處理，并且例如在處理前后可以對該組合物的一個或多個性質(zhì)(例如肽的降解和/或一個或多個流變性質(zhì))進(jìn)行評估，以便可以確定是否適合通過高壓滅菌處理對此類化合物進(jìn)行滅菌(參見例如實施例2)。

流變性質(zhì)的變化

本申請證明了可以通過將其暴露于改變一個或多個流變性質(zhì)的處理(例如改變粘度和/或剛性)使某些肽組合物適于過濾。

在某些特定的實施方式中，通過暴露于剪切力實現(xiàn)流變性質(zhì)的改變。

不希望受到任何特定理論的束縛，本申請?zhí)岢鱿虮旧暾埶龅碾慕M合物施加高剪切力能夠破壞自組裝結(jié)構(gòu)。本申請還提出恢復(fù)時間可能為再形成此類結(jié)構(gòu)所需的時間。

在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約20Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約30Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約40Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約50Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約60Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約60Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約80Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約90Pa。在一些實施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少約100Pa。在一些實施方式中，例如根據(jù)上文所述的RADA16 2.5％、IEIK13 1.5％和2.5％以及KLD12 2.5％的屈服應(yīng)力，剪切應(yīng)力的量可以是至少約30-100Pa。

在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力顯著下降。在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力下降至少10％。在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力下降至少30％。在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力下降至少50％。在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力下降至少70％。在一些實施方式中，肽溶液的粘度可以隨著施加剪切力下降至少90％。

在一些實施方式中，流變性質(zhì)的改變是暫時的。在一些實施方式中，肽組合物表征為具有流變性恢復(fù)特征。例如，在一些實施方式中，此類組合物表征為其一種或多種流變性質(zhì)在范圍約1min至約48小時的時間段內(nèi)恢復(fù)。

在一些實施方式中，當(dāng)一種或多種流變性質(zhì)返回至其初始值至少20％的水平時，認(rèn)為實現(xiàn)了流變性恢復(fù)。

在一些實施方式中，當(dāng)施加剪切力后觀察到的一種或多種流變性質(zhì)的改變恢復(fù)至少30％時，認(rèn)為實現(xiàn)了流變性恢復(fù)。

在一些實施方式中，肽組合物可以在施加剪切力后恢復(fù)其儲能模量。在一些實施方式中，肽溶液在1min內(nèi)可以恢復(fù)其原始儲能模量的約0.1至100％。在一些實施方式中，肽溶液在1min內(nèi)可以恢復(fù)其原始儲能模量的約0.1至10％。在一些實施方式中，肽溶液在20min內(nèi)可以恢復(fù)其原始儲能模量的約20至100％。在一些實施方式中，肽溶液在20min內(nèi)可以恢復(fù)其原始儲能模量的約20至60％。

在一些實施方式中，肽溶液可以在過濾后隨著時間的推移恢復(fù)其粘度。在一些實施方式中，肽溶液在1min內(nèi)可以恢復(fù)其初始粘度的約0.1至30％。在一些實施方式中，肽溶液在1min內(nèi)可以恢復(fù)其初始粘度的約0.1至100％。在一些實施方式中，肽溶液在20min內(nèi)可以恢復(fù)其初始粘度的約20至100％。在一些實施方式中，肽溶液在20min內(nèi)可以恢復(fù)其初始粘度的約20至60％。

本申請?zhí)貏e地舉例說明了在施加剪切力后(例如特別地在通過針后，例如具有特定結(jié)構(gòu)的)對某些肽組合物的流變性質(zhì)進(jìn)行的適當(dāng)調(diào)整(參見實施例4)。在這個實施例中的結(jié)果顯示了從注射后1分鐘開始儲能模量的對數(shù)增加，如針對RADA16的圖10、針對KLD12的圖11和針對IEIK13的圖12所示。

除了其他以外，本申請?zhí)峁┝死闷淇梢韵蛞粋€或多個某些肽組合物施加高剪切力的方法，以便將其一種或多種流變性質(zhì)調(diào)整至適宜水平(例如降低粘度)，以使得該組合物變得適合過濾，并且在滅菌過濾的一些實施方式中，在向其施加選定的剪切力后的一段時間內(nèi)對該組合物進(jìn)行這種過濾，以使得進(jìn)行過濾的同時仍保持經(jīng)調(diào)整的流變性質(zhì)(例如在這些性質(zhì)顯著恢復(fù)或完全恢復(fù)發(fā)生之前)。

總體來說，如本申請所描述的，可以通過向肽組合物應(yīng)用(和/或使肽組合物通過)剪切稀化部件施加剪切力。在一些實施方式中，剪切稀化部件是或者包括針、膜和/或篩網(wǎng)。在一些實施方式中，例如，使用多個單獨的剪切稀化部件，以使得能夠?qū)崿F(xiàn)高通量過濾。

在一些實施方式中，本發(fā)明提供了能夠?qū)崿F(xiàn)商業(yè)化規(guī)模的肽組合物過濾的裝置和方法。

作為剪切稀化部件的針

在一些非限制性實施方式中，可以經(jīng)由注射通過一個或多個針施加剪切力。因此，在一些實施方式中，可以將一個或多個針作為剪切稀化部件。

在一些實施方式中，針可以是至少約1mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約2mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約5mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約10mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約15mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約20mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約30mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約40mm長。在一些實施方式中，針可以是至少約50mm長。

在一些實施方式中，針的規(guī)格可以在約20號至約34號范圍內(nèi)。在一些實施方式中，針的規(guī)格可以在約25號至約34號范圍內(nèi)。在一些實施方式中，針的規(guī)格可以在約27號至約34號范圍內(nèi)。

圖5公開了根據(jù)一個或多個非限制性實施方式的滅菌裝置的一個非限制性實施方式。如圖所示，可以將肽組合物(例如自組裝肽的粘性溶液)(左側(cè))轉(zhuǎn)移至帶有針的第一注射器中，注射至第二注射器中(右側(cè))，然后進(jìn)行過濾。

作為剪切稀化部件的膜

在一些實施方式中，用于向本申請所述的肽組合物施加剪切力的剪切稀化部件可以是特征為具有微米級或納米級孔的裝置或?qū)嶓w。圖13描述了根據(jù)本申請的一個或多個非限制性實施方式的滅菌裝置的一個非限制性實施方式。如圖所示，可以將肽溶液(例如自組裝肽的粘性溶液)轉(zhuǎn)移至分散注射器(或壓力容器)中，遞送至用于提供剪切力的具有孔的第一室中，然后在第二室中過濾。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，膜直徑的尺寸可以根據(jù)肽溶液的量而改變。

在一些實施方式中，剪切稀化部件的孔徑可以是約0.45μm至120μm。在一些實施方式中，剪切稀化部件的孔徑可以是約1μm至100μm。在一些實施方式中，剪切稀化部件的孔徑可以是約3μm至80μm。在一些實施方式中，剪切稀化部件的孔徑可以是約4μm至50μm。

作為剪切稀化部件的篩網(wǎng)

在一些實施方式中，剪切稀化部件可以具有微米級或納米級孔。在一些實施方式中，孔可以形成圖案或者在一些實施方式中可以在厚度約10μm至10mm的板上鉆孔。圖15描述了根據(jù)本申請的一個或多個非限制性實施方式的滅菌裝置的一個非限制性實施方式。可以將剪切稀化部件插入圖13所示的第一過濾室中。

在一些實施方式中，在本申請所述的剪切稀化部件的實施方式中的孔可以具有的最大尺寸在約0.5μm至200μm范圍內(nèi)。在一些實施方式中，此類尺寸可以在約0.5μm至100μm范圍內(nèi)。在一些實施方式中，此類尺寸可以在約0.5μm至80μm范圍內(nèi)。在一些實施方式中，此類尺寸可以在約0.5μm至50μm范圍內(nèi)。

在一些實施方式中，該實施方式的一個剪切稀化部件可以在孔之間具有范圍從約5μm至約10mm內(nèi)的夾點。

在一些實施方式中，剪切稀化部件可以全部或部分由選自下組的材料制成：不銹鋼、鎢、鈦、類似金屬、硅、陶瓷或塑料材料及其組合。

應(yīng)用

在一些實施方式中，將應(yīng)用了本申請所述技術(shù)的肽組合物隨后用于一個或多個涉及細(xì)胞生物、組織或生物體的應(yīng)用中(例如以使得滅菌組合物具有特別效用)。

如本領(lǐng)域所公知的，已證實某些肽組合物(例如某些自組裝的肽組合物)可用作細(xì)胞在體內(nèi)和/或體外生長的基質(zhì)，和/或作為空隙填充物、止血劑、液體流動的屏障、傷口愈合劑等。在一些實施方式中，此類組合物形成了具有一種或多種所需性質(zhì)(例如孔和/或通道的尺寸、強(qiáng)度、可變形性、凝膠形成可逆性、透明度等)的肽水凝膠。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本申請之后將立即意識到此類肽組合物(包括凝膠組合物和特別是包括可逆的膠凝組合物)在多種應(yīng)用其的背景下的用途。特別值得關(guān)注的是在體內(nèi)的應(yīng)用(例如外科應(yīng)用或其他應(yīng)用，特別是允許或獲益于通過可施用或應(yīng)用組合物的套管類裝置(如針)遞送的那些)。

實施例

實施例1：高粘性肽溶液的過濾

除了其他以外，本實施例描述了不同肽組合物(即特別是自組裝肽的組合物)的流變性質(zhì)，并顯示了針對不同肽和/或針對相同肽的不同濃度顯著的參數(shù)可變性，如粘度、儲能模量(例如剛性)、損耗模量和屈服應(yīng)力。本實施例還顯示了這些溶液中的某些不適用過濾。特別地，本實施例顯示了這些肽的高粘度溶液對過濾技術(shù)構(gòu)成了挑戰(zhàn)。確定了多種肽溶液的流變性質(zhì)，特別是針對以下表1所示的濃度制備的RADA16、IEIK13和KLD12溶液。可以看出，總體來說，濃度越高的溶液顯示出的最大粘度越高。而且，具有不同序列的肽在相同濃度的溶液中顯示出不同的最大粘度。例如，2％KLD12、2.5％KLD12和1.5％IEIK13溶液的最大粘度分別為2.5％RADA16的2、3.4和3.2倍。

表1選定濃度肽溶液的流變性質(zhì)

*:在振蕩應(yīng)力1Pa的條件下

#:在已檢測的應(yīng)力范圍內(nèi)在粘度圖中獲得的最大粘度數(shù)據(jù)。

將表1中列出的每個肽溶液通過具有25mm醋酸纖維素膜的0.2μm Nalgene注射器過濾器過濾。1％和1.5％的KLD12溶液(可以看出，其特征為具有相對較低的濃度、粘度和/或剛性)成功通過過濾器。而相反的是，2％and 2.5％的KLD12溶液和1.5％的IEIK13溶液(可以看出，其特征為具有相對較高的濃度、粘度和/或剛性)不能成功通過過濾器；反而過濾器破裂。

實施例2：肽溶液的高壓滅菌處理

本實施例顯示了一些肽組合物(即，特定地如本申請所述的自組裝肽的組合物)對熱處理具有令人吃驚的穩(wěn)定性。特別地，本實施例顯示了即使在121℃下進(jìn)行25分鐘高壓滅菌處理某些肽組合物仍然保持穩(wěn)定的摩爾質(zhì)量。因此，本實施例確立了能夠通過應(yīng)用高熱(例如高壓滅菌)技術(shù)成功地對此類組合物進(jìn)行滅菌。但是，該實施例同時表明某些肽組合物對此類處理不穩(wěn)定。

圖1-3顯示了分別對RADA16、IEKI13和KLD12的某些組合物進(jìn)行高壓滅菌處理的結(jié)果。

在進(jìn)行高壓滅菌處理之前，測得RADA16的摩爾質(zhì)量為1712，這與其計算得到的摩爾質(zhì)量相匹配。但是，質(zhì)譜分析表明在高壓滅菌處理過程中RADA16發(fā)生了降解，從而表明這種技術(shù)不能用于對此類RADA16組合物滅菌。

在進(jìn)行高壓滅菌處理之前，測得IEIK13的摩爾質(zhì)量為1622，這也與其計算得到的摩爾質(zhì)量相匹配。質(zhì)譜分析表明IEIK13在高壓滅菌處理后未降解，從而表明這種技術(shù)能夠有效地用于此類IEIK13組合物的滅菌。

在進(jìn)行高壓滅菌處理之前，測得KLD12的摩爾質(zhì)量為1467，這與其計算得到的摩爾質(zhì)量相匹配。KLD12在高壓滅菌處理過程中部分降解。由于KLD12在高壓滅菌處理過程中降解，因此確定高壓滅菌處理不是對此類KLD12組合物進(jìn)行滅菌的優(yōu)選技術(shù)；對若干肽濃度的KLD12采用常規(guī)過濾方法進(jìn)行滅菌。

在高壓滅菌前后確定某些肽組合物的流變性質(zhì)。數(shù)據(jù)如圖4所示?？梢钥闯?，經(jīng)高壓滅菌的IEIK13令人吃驚的顯示出與未進(jìn)行高壓滅菌的IEIK13幾乎相同的流變強(qiáng)度，而RADA16顯示出明顯降低的流變強(qiáng)度。

可以將高壓滅菌處理用于如本申請所述的IEIK13組合物的滅菌，但應(yīng)避免用于RADA16組合物。

實施例3：應(yīng)用剪切力的肽組合物的流變性質(zhì)

本實施例表明應(yīng)用剪切力可以降低某些肽溶液的粘度和/或剛性，還表明粘度和/或剛性的這種降低能夠使這些組合物適于多種過程和/或技術(shù)(例如過濾)，如果不進(jìn)行這種處理的話這些組合物不適于這些過程和/或技術(shù)。

剪切流測試

使用帶有20mm板的流變儀(DHR-1,TA Instruments)對肽溶液進(jìn)行剪切流測試。2.5％RADA16溶液的結(jié)果如圖9所示，1.5％IEIK13溶液的結(jié)果如圖10所示。如圖所示，2.5％RADA16和IEIK13 1.5％溶液均顯示出典型的剪切稀化性質(zhì)。即隨著剪切速率的增加其粘度顯著降低。隨著剪切速率的增加，剪切力立即增加，然后當(dāng)粘度達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)時剪切力略有降低。2.5％RADA16溶液的屈服應(yīng)力為約40Pa，1.5％IEIK13溶液的屈服應(yīng)力為約60Pa。

粘度恢復(fù)

在應(yīng)用高剪切應(yīng)力后評估RADA16和IEIK13溶液的粘度恢復(fù)時間。使用DHR-1流變儀(TA Instruments)，在向樣品應(yīng)用1min 1000 1/sec的剪切速率后在0.005 1/sec剪切速率下進(jìn)行流量測試，檢測2.5％RADA16和1.5％IEIK13溶液的粘度變化。RADA16和IEIK13溶液顯示出典型的觸變性行為，這表明其粘度緩慢恢復(fù)。不希望受到任何特定理論的束縛，我們提出這些溶液的流變性質(zhì)恢復(fù)時間可能是基于肽分子重新組裝成在溶液中的結(jié)構(gòu)(例如納米纖維)。2.5％RADA16和1.5％IEIK13溶液的完全重新組裝時間為約12至48小時。2.5％RADA16溶液的結(jié)果如圖11所示，1.5％IEIK13溶液的結(jié)果如圖12所示。

儲能模量的恢復(fù)

表2中列出了將肽組合物注射通過30號針后在1min和20min恢復(fù)為原始儲能模量的百分率。IEIK13(具體地，2.5％的IEIK13溶液)的恢復(fù)速率在肽溶液中是最快的，其顯示出在20min內(nèi)100％恢復(fù)為原始儲能模量。在檢測恢復(fù)情況的那些中KLD12是最慢的；其顯示出在20min內(nèi)僅恢復(fù)為原始儲能模量的23％(2.5％的)。在一些非限制性實施方式中，其在通過針(例如注射)后，花費大約12至48小時完全恢復(fù)至原始模量。

表2注射通過30號針后在1min和20min恢復(fù)為原始儲能模量的情況

在將其注射通過30號針后，對RADA16和IEIK13溶液進(jìn)行流變性檢測。結(jié)果顯示從注射后1分鐘開始儲能模量呈現(xiàn)出對數(shù)增加。RADA16的結(jié)果見圖6，KLD12的結(jié)果見圖7和IEIK13的結(jié)果見圖8。

實施例4：作為剪切稀化部件的針

本實施例描述了使用針作為剪切稀化部件對肽組合物(具體地，如本申請所述的自組裝肽)進(jìn)行的過濾過程。特別地，本實施例顯示了應(yīng)用適當(dāng)?shù)募羟辛?例如經(jīng)由通過剪切稀化部件)能夠改變組合物的流變性質(zhì)(例如能夠降低粘度和/或剛性等)，以使得其能夠成功通過濾器，如滅菌濾器。

圖5顯示了根據(jù)本申請的滅菌裝置的一個非限制性實施方式。如圖所示，該裝置包括第一注射器，其向組合物應(yīng)用足以改變其流變性質(zhì)的剪切力以使其成功通過第二注射器，第二注射器配有具有合適孔徑的膜濾器以實現(xiàn)對組合物進(jìn)行滅菌。具體地，所示裝置包括具有30號針的第一注射器(0.3mm x 25mm，具有雙側(cè)通氣的內(nèi)灌洗針，Transcodent公司,德國)(中間)和帶有膜濾器的第二注射器(右側(cè))。將粘性的2.5％KLD12溶液(左側(cè))轉(zhuǎn)移至第一注射器，然后注射進(jìn)入第二注射器(右側(cè))，之后再通過膜濾器過濾。使用這種方法，成功對2.5％KLD12溶液進(jìn)行了過濾。

實施例5：高通量剪切稀化部件

本實施例描述了某些剪切稀化部件。操作原理類似上文所述的第一針。具體地，每個剪切稀化部件施加適宜的和足夠的剪切力以調(diào)整被施予剪切力的肽組合物的一個或多個流變性質(zhì)，以使得該組合物變得適于過濾，并且特別適于通過除菌濾器過濾。在一些實施方式中，可以將多個針或其等效物作為剪切稀化部件使用。

膜濾器

本實施例表明能夠使用膜濾器(孔徑>0.45μm)作為剪切稀化部件?？梢詫⒄承缘?.5％KLD12或1.5％IEIK13溶液轉(zhuǎn)移至分散注射器(或壓力容器)，使用剪切稀化部件(例如，孔徑范圍從0.45μm至120μm)遞送至第一室，然后在第二室中通過過濾膜(例如，孔徑：0.2μm)過濾。

為考察剪切稀化部件的孔徑對粘性肽溶液粘度改變的影響，使2.5％KLD12和1.5％IEIK溶液通過選定的孔徑，并評估其表觀粘度變化情況。2.5％KLD溶液通過了孔徑為41μm、20μm和5μm的剪切稀化部件。該溶液的粘度降至足夠低以使得將含有該溶液的容器翻轉(zhuǎn)時其能夠流下來。盡管通過孔徑為120μm的剪切稀化部件后的2.5％KLD溶液的粘度略低于通過前的2.5％KLD組合物的粘度，但是其仍太粘而無法在容器翻轉(zhuǎn)測試中流下來。當(dāng)通過孔徑5μm的膜時，1.5％IEIK13溶液的粘度顯著降低。結(jié)果見圖14。

使用1.0％RADA16溶液對剪切稀化部件使粘度降低的情況進(jìn)行了研究(如圖13所示)。在注射壓力50psi的條件下，使顯示出剪切稀化和觸變性行為的1.0％RADA16溶液通過剪切稀化部件。該溶液顯示出1.4～1.7mL/min的輸出。在注射壓力50psi的條件下(即事先未暴露于剪切稀化部件)，該溶液是不能通過濾器(孔徑0.2μm)的。但是，水(典型的牛頓流體)顯示輸出流速是相對恒定的。結(jié)果見表3。

表3圖13中所示系統(tǒng)對RADA16 1％溶液和水的過濾能力

*：剪切稀化部件和濾器的直徑為25mm。

如上文所示，2.5％KLD12和1.5％IEK13溶液不能過濾通過具有25mm醋酸纖維素膜的0.2μm Nalgene注射式濾器。2.5％RADA16通常不適于通過0.2μm膜過濾。暴露于剪切稀化部件后，2.5％RADA16、1.5％IEIK13和2.5％KLD12溶液在注射壓力為100psi條件下能夠過濾，其分別顯示出3.8、12.5和11.4mL/min的輸出。這些溶液不使用剪切稀化部件不能過濾?？梢猿晒κ褂脠D16中所示的剪切稀化部件對不易過濾的粘性肽溶液進(jìn)行滅菌和過濾。結(jié)果見表4。

表4圖13所示過濾系統(tǒng)對2.5％RADA16、1.5％IEIK13、2.5％KLD12溶液的過濾能力

*：膜直徑為25mm。

篩網(wǎng)

本實施例表明能夠成功使用具有微米級和/或納米級孔的篩網(wǎng)作為剪切稀化部件?？梢詫⒄承缘?.5％KLD12或1.5％IEIK13溶液轉(zhuǎn)移至分散注射器(或室)，注射至包括具有微米級和/或納米級孔的剪切稀化部件的第一室，然后通過第二室中的膜濾器(孔徑：0.2μm)過濾。可以使用高壓室代替注射用注射器遞送肽組合物?？梢赃x擇膜尺寸(例如直徑)和/或其他性質(zhì)(例如孔徑等)以適應(yīng)待通過的肽組合物的量。

表5圖13和圖15所示帶有微米級孔的篩網(wǎng)系統(tǒng)對于2.5％RADA16、1.5％IEIK13、2.5％KLD12溶液的過濾能力

*：膜直徑為25mm。

#：孔尺寸為直徑50μm、孔夾點450μm和孔深500μm。

序列表

<110> 三維矩陣有限責(zé)任公司

<120> 肽組合物的滅菌和過濾

<130> 2004837-0044

<150> 61/950536

<151> 2014-03-10

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile

1 5 10