本發(fā)明涉及含有VEGF拮抗劑并包含不含硅酮的塑料筒的預(yù)填充注射器(pre-filled syringe)、包含該注射器的藥盒和所述注射器用于在眼部疾病的治療中施用VEGF拮抗劑的用途。

背景技術(shù)：

眼部疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫是由眼睛中血管的不受控制的生長引起的。因此，治療這些和類似疾病的一種選擇是抑制眼睛中的血管發(fā)生。因為VEGF是刺激血管生成的關(guān)鍵因子，所以它是下調(diào)血管生成的有吸引力的靶標(biāo)。

以名稱銷售的阿柏西普(Aflibercept)是重組融合蛋白，其由與人IgG1免疫球蛋白之Fc部分融合的來自人VEGF受體1和2的胞外結(jié)構(gòu)域之VEGF結(jié)合部分組成。其被批準(zhǔn)用于治療濕性黃斑變性。以名稱銷售的雷珠單抗(Ranibizumab)是針對VEGF的人源化鼠單克隆抗體的Fab片段，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療眼部疾病例如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫。此外，也針對VEGF的全長抗體貝伐單抗(bevacizumab)的適應(yīng)癥外使用用于治療眼部疾病是常見的。雷珠單抗和貝伐單抗在治療新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性方面似乎具有相似的功效譜，盡管罕見的不良事件似乎更經(jīng)常發(fā)生于貝伐單抗(Johnson和Sharma(2013)Curr.Opin.Ophthalmol.：24(3)：205-12)。

貝伐單抗和雷珠單抗兩者都存在于玻璃小瓶中，在注射入眼睛之前，通常用注射器將它們從玻璃小瓶中抽出。為了使用這些抗體的商售小瓶的全部內(nèi)容物，一些公司在無菌條件下將其重新包裝到即用的塑料注射器中，從而允許多于一個注射器從一個玻璃小瓶中進(jìn)行抽取。然而，在再包裝的注射器中，已觀察到硅油微滴和蛋白質(zhì)聚集體(Liu等(2011)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.52(2)：1023-1034)。這種硅油污染物和蛋白質(zhì)聚集體可能引起在用貝伐單抗或雷珠單抗治療的患者中觀察到的眼內(nèi)壓升高(Kahook等(2009)Ophthalmic Surg.Lasers Imaging 40：293-295；Good等(2011)Br.J.Ophthalmol.95(8)：1111-1114)。

AU 2012101677 A4公開了含有VEGF拮抗劑的預(yù)填充注射器，其中注射器具有低的硅酮含量。該文獻(xiàn)的整個公開內(nèi)容集中在玻璃注射器的使用，因此教導(dǎo)了在注射器內(nèi)必須存在少量的硅酮。

此外，最近，預(yù)填充的雷珠單抗注射器已經(jīng)被歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)批準(zhǔn)。該注射器筒由硼硅酸鹽玻璃組成，其噴涂有硅酮水包油乳液，隨后熱固定(所謂的“燒固的硅酮”)(Clunas等在2014年3月20-23日的the 5^th World Congress on Controversies in Ophthalmology的海報報告；Michaud等在the ARVO Annual Meeting 2014的海報報告)。

相比于小瓶和分開提供的注射器，預(yù)填充注射器具有許多益處，例如改善的方便性、可購性、準(zhǔn)確性、無菌性和安全性。預(yù)填充注射器的使用導(dǎo)致更好的劑量精度、導(dǎo)致降低在從小瓶抽取藥物時可能發(fā)生的針刺損傷的可能性、導(dǎo)致預(yù)先測量的劑量減少由于需要重新配制和/或?qū)⑺幬锍槿〉阶⑸淦髦兴a(chǎn)生的劑量誤差，并且導(dǎo)致注射器的更少的過度填充，通過最小化藥物浪費來幫助降低成本。

然而，與塑料注射器相比，玻璃注射器例如批準(zhǔn)的雷珠單抗預(yù)填充注射器易于破裂并重量相對大。

此外，它們必須用硅酮處理以使塞子在玻璃筒內(nèi)正確移動，從而有效且準(zhǔn)確地給藥。已經(jīng)顯示，經(jīng)玻璃體內(nèi)施用VEGF拮抗劑后，硅油滴出現(xiàn)在玻璃體腔中，并且推測該硅油來源自用于注射的針和注射器(Bakri和Ekdawi(2008)Retina 28：996-1001)。

另外，對于將嵌入的針(staked-in needle)附接到玻璃注射器所必需的膠可能導(dǎo)致雜質(zhì)或蛋白質(zhì)氧化的提高(Adler在the 2011PDA Europe The Universe of Pre-Filled Syringes and Injection Devices，Basel，2011年11月7-11日的報告；Markovic在the PDA Single Use Systems Workshop，Bethesda，2011年6月22-23日的報告)。

最后，在玻璃可預(yù)填充的注射器的制造期間，通常使用鎢針。已經(jīng)顯示，在預(yù)填充注射器中發(fā)現(xiàn)的可溶性鎢導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和蛋白質(zhì)氧化(Liu等(2010)PDA J.Pharm.Sci.Technol.64(1)：11-19；Seidl等(2012)Pharm.Res.29：1454-1467)。

玻璃預(yù)填充注射器的問題已導(dǎo)致過去的數(shù)次產(chǎn)品召回。

已經(jīng)描述了數(shù)種非玻璃預(yù)填充注射器。WO 2011/117878 A1公開了聚碳酸酯注射器，但是不清楚該注射器筒是否已經(jīng)涂覆有硅酮以及注射器是否適合眼內(nèi)施用。WO 2009/099641 A2公開了在沒有潤滑劑的環(huán)烯烴聚合物注射器中，與涂覆有硅酮的玻璃注射器中相比，形成的可見顆粒更少。然而，不清楚該注射器是否可用于眼科應(yīng)用。

因此，仍然需要能夠安全地將藥物遞送至眼睛并且避免使用玻璃注射器的上述缺點而其中藥物在儲存期間穩(wěn)定的非玻璃注射器。

發(fā)明概述

本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)抗體在被填充到包含不含硅酮的塑料注射器筒的預(yù)填充注射器中時，抗VEGF抗體溶液是穩(wěn)定的，即抗體在儲存期間不顯著改性并且不顯著聚集，盡管已經(jīng)假定塑料注射器對于諸如氧的氣體比玻璃注射器更具滲透性，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾(見例如Dierick和Yoshino(2015)OnDrugDelivery No.55：10-16)。因此，注射器不必與氧吸收劑一起包裝。此外，本發(fā)明的預(yù)填充注射器不含顯著量的顆粒。最后，從本發(fā)明的預(yù)填充注射器注射溶液所需的力與從玻璃注射器注射所需的力相當(dāng)。

因此，本發(fā)明的預(yù)填充注射器克服了上述玻璃注射器的缺點，并且可以用于向眼睛施用VEGF拮抗劑。

因此，本發(fā)明提供了含有VEGF拮抗劑之液體制劑并包含注射器筒的預(yù)填充注射器，其中所述注射器筒由塑料制成并且不含硅酮。

在一個優(yōu)選的實施方案中，該VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體或此類抗體的抗原結(jié)合片段或可溶性VEGF受體融合蛋白，更優(yōu)選地該抗VEGF拮抗劑是雷珠單抗或阿柏西普。

優(yōu)選地，所述拮抗劑濃度為1至100mg/ml。

在本發(fā)明的一個方面中，該預(yù)填充注射器每ml液體制劑含有的直徑為10μm或更大的顆粒少于50個。

在本發(fā)明的另一方面中，該預(yù)填充注射器每ml液體制劑含有的直徑為25μm或更大的顆粒少于5個。

在本發(fā)明的其他方面中，該預(yù)填充注射器具有小于或等于10N的滑動力(glide force)。

在一個優(yōu)選的實施方案中，該預(yù)填充注射器還包含不含硅酮的塞子。

優(yōu)選地，所述注射器筒由環(huán)烯烴聚合物或環(huán)烯烴共聚物制成。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述注射器筒包含不是硅酮涂層的內(nèi)部涂層。

還優(yōu)選地，該預(yù)填充注射器包含嵌入式針(staked needle)。

本發(fā)明還提供了藥盒，其包含一個或更多個根據(jù)本發(fā)明的預(yù)填充注射器。優(yōu)選地，該藥盒為泡罩包裝(blister pack)。

該預(yù)填充注射器可以用于向患有眼部疾病的患者施用VEGF拮抗劑，所述患者優(yōu)選地患有選自以下的眼部疾?。耗挲g相關(guān)性黃斑變形(age-related macular degeneration，AMD)、由于糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular oedema，DME)引起的視覺損傷、由繼發(fā)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion)(分支RVO或中央RVO)的黃斑水腫引起的視覺損傷、糖尿病性黃斑水腫患者的糖尿病性視網(wǎng)膜病變或繼發(fā)于病理性近視的脈絡(luò)膜新血管形成(choroidal neovascularisation，CNV)引起的視覺損傷。

優(yōu)選地，對所述患者施用30至100μl體積的所述液體制劑。

附圖簡述

圖1：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，在列于表1的注射器中直徑為10μm或更大的顆粒之?dāng)?shù)目；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖2：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，在列于表1的注射器中直徑為25μm或更大的顆粒之?dāng)?shù)目；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖3：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，通過RP-HPLC分析測量的在列于表1的注射器之內(nèi)容物中親水性物質(zhì)的百分比；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖4：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，通過RP-HPLC分析測量的在列于表1的注射器之內(nèi)容物中疏水性物質(zhì)的百分比；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖5：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，通過陽離子交換色譜法測量的在列于表1的注射器之內(nèi)容物中酸性變體的百分比；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖6：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，通過陽離子交換色譜法測量的在列于表1的注射器之內(nèi)容物中堿性變體的百分比；在5分鐘和2周后的分析中未測量注射器10。

圖7：從針到塞旋轉(zhuǎn)5分鐘(a)、2周(b)、4周(c)后以及5次冷凍/解凍循環(huán)(d)后，通過尺寸排阻色譜法對列于表1的注射器之內(nèi)容物的蛋白質(zhì)聚集進(jìn)行分析。

發(fā)明詳述

可以在不存在本文未具體公開的任何元件、限制的情況下適當(dāng)?shù)貙嵤┤缦抡f明性描述的本發(fā)明。

將相對于具體實施方案描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于此，而是僅由權(quán)利要求限制。

當(dāng)在本說明書和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包含”時，其不排除其它要素。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“由......組成”被認(rèn)為是術(shù)語“包含”的優(yōu)選實施方案。如果在下文中將一個組限定為包含至少一定數(shù)量的實施方案，也應(yīng)理解為公開了優(yōu)選僅由這些實施方案組成的組。

為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“獲得的”被認(rèn)為是術(shù)語“可獲得的”的優(yōu)選實施方案。

除非另有具體說明，否則沒有數(shù)量詞修飾的詞語表示一個/種或更多個/種。

“預(yù)填充注射器”是由制造者提供的處于填充狀態(tài)的注射器，即當(dāng)購買時待施用的已測量劑量的藥物已經(jīng)存在于注射器中并且準(zhǔn)備好進(jìn)行施用。特別地，含有藥物的藥物組合物不必通過使用空的注射器從含有該組合物的小瓶中抽取。在本發(fā)明含義內(nèi)的術(shù)語預(yù)填充注射器不是指其內(nèi)容物在重新包裝過程中從小瓶抽取的注射器。

包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體，在2至8℃的溫度下穩(wěn)定至少6個月，優(yōu)選至少9個月，更優(yōu)選至少一年，特別優(yōu)選至少18個月，且最優(yōu)選約兩年。包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白且更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普，在室溫下，即在20℃至25℃之間的溫度下，穩(wěn)定至少24小時，優(yōu)選至少三天或一周，更優(yōu)選至少兩周或三周，且最優(yōu)選約4周。包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白，更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普，在約40℃的溫度下穩(wěn)定至少1小時或2小時，優(yōu)選至少4或6小時，更優(yōu)選至少10或12小時，且最優(yōu)選至少18或24小時。

注射器內(nèi)的藥物的穩(wěn)定性可以例如通過離子交換色譜法來確定，通過該離子交換色譜法可以檢測藥物的修飾，如氧化和脫酰胺的物質(zhì)；或者通過尺寸排阻色譜法確定可以檢測藥物的聚集體。在實施例部分中提供了對這種分析的描述。

如果包含聚集體和化學(xué)修飾的物質(zhì)的所有雜質(zhì)的總和小于未修飾的非聚集藥物的量的2％，優(yōu)選小于1.5％，更優(yōu)選小于1.2％，最優(yōu)選小于1％，則該藥物即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體被認(rèn)為是穩(wěn)定的。

包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白，更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普，當(dāng)在2至8℃的溫度下儲存時保持其生物活性至少6個月，優(yōu)選至少9個月，更優(yōu)選至少1年，特別優(yōu)選至少18個月，且最優(yōu)選約2年。包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白且更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普，當(dāng)在室溫下即在20℃至25℃之間的溫度下和60％相對濕度下儲存時保持其生物活性至少一天，優(yōu)選三天或一周，更優(yōu)選兩周或三周，且最優(yōu)選約一個月。包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的藥物，即VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白且更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普，當(dāng)在約40℃的溫度和75％相對濕度下儲存時保持其生物活性至少1小時或2小時，優(yōu)選至少4或6小時，更優(yōu)選至少10或12小時，且最優(yōu)選至少18或24小時。

VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白且更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普的生物活性可以通過以下確定：將在上述條件下儲存的拮抗劑的不同稀釋液與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和VEGF孵育并在拮抗劑存在下測量VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(即通過獲自Promega的細(xì)胞活力測定)，與未與拮抗劑一起孵育的細(xì)胞進(jìn)行比較。由于VEGF拮抗劑抑制VEGF誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如果樣品中存在生物活性VEGF拮抗劑，則VEGF誘導(dǎo)的增殖將降低。

VEGF拮抗劑，優(yōu)選抗VEGF抗體或VEGF受體融合蛋白且更優(yōu)選雷珠單抗或阿柏西普在預(yù)填充注射器中儲存之后保持其生物活性，使得在HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的增殖被抑制。

預(yù)填充注射器的部件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且基本上包含注射器筒和柱塞。

注射器筒含有限定體積的液體組合物，當(dāng)柱塞被推入并沿著筒移動時，該液體組合物可以通過位于筒的一端上的出口從筒排出。注射器筒通常具有基本上圓柱形的形狀。出口可以包含從出口端的突出部，通過該突出部延伸具有比注射器筒的其余部分直徑更小的通道。出口可以適于例如通過魯爾鎖型連接(luer lock type connection)，用于與針或其他附件連接，例如能夠密封筒體并且可以移除以允許針附接到注射器的密封裝置。這種密封可以通過使用已知的密封裝置例如Vetter Pharma International GmbH的OVS^TM系統(tǒng)來實現(xiàn)。

在本發(fā)明的預(yù)填充注射器中，注射器出口與針牢固連接，從而為預(yù)填充注射器提供嵌入式針，并且不需要在使用前組裝。在這種情況下，在注射之前組裝注射器期間被針刺傷的風(fēng)險降低。嵌入式針可以附接到本發(fā)明的預(yù)填充塑料注射器而不使用粘合劑，因為它可以被模制到注射器中。相反，需要粘合劑將針附接到玻璃注射器并且可能導(dǎo)致雜質(zhì)或增加蛋白質(zhì)氧化(Adler在the 2011PDA Europe The Universe 0f Pre-Filled Syringes and Injection Devices，Basel，2011年11月7-11日的報告；Markovic在the PDA Single Use Systems Workshop，Bethesda，2011年6月22-23日的報告)。

對于玻璃體內(nèi)施用，針尺寸通常為30號，但是也可以使用31-、32-、33-和34-號針。預(yù)填充注射器可以配備有被動針安全防護(hù)裝置，以進(jìn)一步避免注射后針刺的危險。

本發(fā)明的預(yù)填充注射器包括由塑料材料制成的注射器筒。優(yōu)選地，塑料材料選自環(huán)烯烴聚合物和環(huán)烯烴共聚物。

環(huán)烯烴共聚物可以通過環(huán)狀單體如8，9，10-三降冰片-2-烯(8，9，10-trinornorn-2-ene)或1，2，3，4，4a，5，8，8a-八氫-1，4；5，8-二甲萘與乙烷的鏈?zhǔn)焦簿刍a(chǎn)。合適的共聚物是Topas^TM類型的那些，其可以多種等級獲得。

環(huán)烯烴聚合物可以例如通過多種環(huán)狀單體的開環(huán)易位聚合，然后氫化來制備。由環(huán)烯烴聚合物材料制成的合適的市售可得容器包括由CZ^TM樹脂、Zeonor^TM和Zeonex^TM制造的容器。

根據(jù)本發(fā)明，注射器筒是不含硅酮的，這意味著注射器筒的內(nèi)表面沒有用硅油處理。因此，在本發(fā)明的預(yù)填充注射器中不會檢測到硅油。

硅酮層的存在和厚度可以通過已知的方法確定，例如也可以用于測量注射器筒內(nèi)的硅油量的rap.ID Layer應(yīng)用。注射器筒內(nèi)的硅油的量也可以通過差動稱量法測量，并通過在合適的溶劑中稀釋的油的紅外光譜進(jìn)行定量。

優(yōu)選地，預(yù)填充注射器是未涂覆的，即環(huán)烯烴聚合物或共聚物材料與其中包含的液體組合物直接接觸，并且注射器筒不合有除了制造注射器的塑料材料之外的任何材料。

或者，預(yù)填充注射器可包含不是硅酮涂層的內(nèi)部涂層。術(shù)語“內(nèi)部涂層”旨在表示在與藥物溶液接觸的注射器筒的內(nèi)側(cè)上的涂層。這種內(nèi)部涂層的實例包括由改性乙烯-四氟乙烯共聚物制成的氟碳膜(也稱為膜，可得自West Pharmaceutical Services)，和通過大氣壓等離子體固定^TM(Atmospheric Plasma Immobilization^TM)工藝交聯(lián)的全氟聚醚膜(也稱為可從TriboFilm Research獲得并描述于WO 2005/094214 A2中)。內(nèi)部涂層的另一個實例是施加到塑料表面的硅氧化物屏障涂層(silicon-oxide barrier coating)?？梢韵蚬柩趸?silicone oxide)層施加另外的涂層，得到多層涂層。涂覆有硅氧化物屏障涂層和任選地另外的涂層的這種塑料注射器可從SiO₂獲得，并且描述于ONdrug Delivery Magazine 2013年10月45期和2014年2月47期以及WO 2014/059012 A1中。

預(yù)填充注射器還可以包含在注射器的塑料主體內(nèi)的層，從而注射器從外部到內(nèi)部包含三層：與環(huán)境接觸的外部塑料層，由不同于外部的材料制成的中間層，以及由與外部層相同的塑料材料或不同于外部層的另一種塑料材料制成并且與藥物溶液接觸的內(nèi)部塑料層。中間層可以包含氧吸收性樹脂，使得注射器可以從外部到內(nèi)部包含以下三層：環(huán)烯烴共聚物-氧吸收性樹脂-環(huán)烯烴共聚物。此類注射器由Mitsubishi Gas Chemical Company以名稱Oxy-Capt^TM銷售，并且例如描述在WO 2014/136914 A1中。

或者，注射器還可以在注射器的外表面上包含與環(huán)境接觸的涂層，如氧屏障涂層(oxygen barrier coating)。

注射器筒也是不含鎢的，即它不含有任何鎢的痕跡，因為在注射器制造過程中不必使用鎢。因此，沒有鎢誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集的風(fēng)險。

在一個實施例中，注射器筒包括標(biāo)記，例如印刷在注射器筒上的線，該線允許注射液體組合物的人將塞子或柱塞的預(yù)定部分(例如前表面的尖端)與標(biāo)記相比對。從而，從注射器筒中除去任何過量的液體組合物和潛在的氣泡，允許向患者安全地施用精確的預(yù)定劑量。

柱塞被沿著注射器筒體內(nèi)部拉動和推動，允許注射器通過出口排出液體制劑。

在與液體制劑接觸的柱塞的端部，安置有塞子。塞子部分通常由彈性體材料制成，例如天然或合成橡膠，其接合注射器筒的內(nèi)表面以形成密封，當(dāng)壓力施加到柱塞時，該密封有利于從注射器噴射液體制劑。

塞子可以涂覆有氟聚合物膜例如異障膜或聚四氟乙烯類膜如Omniflex塞子。這種類型的涂層用作藥物和彈性體之間的有效屏障，降低了所有材料固有的可提取物或可濾出物的可能性。此外，涂層降低了反向過程(其中藥物產(chǎn)品可以吸附或吸收到柱塞中)的發(fā)生。塞子優(yōu)選不含硅酮，即至少與藥物溶液接觸的塞子的表面，更優(yōu)選整個塞子沒有涂覆硅油。

注射器具有0.3ml至1.5ml，優(yōu)選0.5ml至1.0ml，最優(yōu)選0.5ml或1.0ml的標(biāo)稱最大填充體積，即可以由注射器最大程度地吸收的體積。填充到注射器中的液體組合物的體積為約0.05ml至約1ml，優(yōu)選約0.1ml至約0.5ml，更優(yōu)選0.14ml至0.3ml，最優(yōu)選0.15ml至0.2ml。

技術(shù)人員知道，注射器通常填充有大于實際施用至患者之體積的體積，以考慮注射器和針內(nèi)的任何死角以及由于注射用注射器的制備而造成的損失。因此，實際施用至患者的體積為0.01ml至1ml，優(yōu)選0.02至0.5ml，更優(yōu)選0.025至0.5ml，甚至更優(yōu)選0.03ml至0.05ml，且最優(yōu)選為實際施用至患者的體積0.05ml。

雷珠單抗通常以體積為0.05ml雷珠單抗?jié)舛葹?或10mg/ml或體積為0.03ml或0.05ml雷珠單抗?jié)舛葹?0mg/ml施用，產(chǎn)生0.3或0.5mg的遞送量。對于阿柏西普，施用體積通常為0.05ml，阿柏西普濃度為40mg/ml，產(chǎn)生2mg的遞送量。如上所述，適應(yīng)癥外使用貝伐單抗以治療眼部疾病。在這種情況下，貝伐單抗的施用體積為0.05ml，貝伐單抗?jié)舛葹?5mg/ml，產(chǎn)生1.25mg的遞送量。

因此，在一個實施方案中，注射器填充有0.15ml至0.2ml的液體組合物體積，并且向患者施用0.03ml至0.05ml的液體組合物。

術(shù)語“VEGF拮抗劑”是指與VEGF特異性相互作用并抑制其一種或多種生物活性的分子，所述活性例如其促有絲分裂、血管生成和/或血管通透性活性。其意在包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段和非抗體VEGF拮抗劑。

非抗體VEGF拮抗劑包括阿柏西普，哌加他尼(pegaptanib)和抗體模擬物。優(yōu)選地，非抗體VEGF拮抗劑是阿柏西普。目前以名稱銷售并且也稱為VEGF-捕獲劑(VEGF-trap)的阿柏西普是重組人可溶性VEGF受體融合蛋白，其中人VEGF受體1和2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的部分與人IgG1的Fc部分融合(Holash等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(17)：11393-11398；WO 00/75319 A1)。它已經(jīng)獲得了治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性、由于糖尿病性黃斑水腫患者的糖尿病性黃斑水腫(DME)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變引起的視覺損害的市場授權(quán)。目前市售的阿柏西普制劑含有磷酸鈉、氯化鈉、聚山梨酯20、蔗糖和注射用水，并以40mg/ml的濃度提供。

目前以名稱銷售的哌加他尼是聚乙二醇化抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)適配體(Bell等(1999)In Vitro Cell Dev Biol Anim.35(9)：533-42)。作為VEGF拮抗劑的抗體模擬物包括包含結(jié)合VEGF并抑制其與受體結(jié)合的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，例如MP0112(也見WO 2010/060748和WO 2011/135067)。

術(shù)語“抗VEGF抗體”是指特異性結(jié)合VEGF并抑制其一種或更多種生物活性例如其促有絲分裂、血管生成和/或血管通透性活性的抗體或抗體片段如Fab或scFV片段?？筕EGF抗體例如通過干擾VEGF與細(xì)胞受體的結(jié)合、通過在VEGF結(jié)合細(xì)胞受體后干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞活化或通過殺傷VEGF活化的細(xì)胞而起作用?？筕EGF抗體包括例如抗體A4.6.1、貝伐單抗、雷珠單抗、G6、B20、2C3和描述于例如WO 98/45331、US 2003/0190317、US 6,582,959、US 6,703,020、WO 98/45332、WO 96/30046、WO 94/10202、WO 2005/044853、EP 0 666 868 B1、WO 2009/155724和Popkov等(2004)J.Immunol.Meth.288：149-64.中的其他抗體。優(yōu)選地，存在于本發(fā)明的藥物組合物中的抗VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段是雷珠單抗或貝伐單抗。最優(yōu)選地，它是雷珠單抗或其抗原結(jié)合片段。

“雷珠單抗”是針對VEGF-A的人源化單克隆Fab片段，其具有Y0317的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，如描述于WO 98/45331的SEQ ID No.115和116和Chen等(1999)J.Mol.Biol.293：865-81。雷珠單抗的CAS編號為347396-82-1。雷珠單抗抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管形成，并且已被批準(zhǔn)用于治療新生血管(濕性)年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，治療由糖尿病性黃斑水腫(DME)引起的視覺損傷，治療繼發(fā)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞(分支RVO或中央RVO)的黃斑水腫引起的視覺損傷，或治療由繼發(fā)于病理性近視的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)引起的視覺損傷。雷珠單抗與貝伐單抗相關(guān)并且衍生自與貝伐單抗相同的親本小鼠抗體，但其比親本分子小得多并且已經(jīng)親和力成熟以提供對VEGF-A的更強的結(jié)合。雷珠單抗在大腸桿菌(Escherichia coli)中重組產(chǎn)生，如WO 98/45331 A2中所述。目前市售的雷珠單抗制劑含有α，α-海藻糖二水合物、組氨酸鹽酸鹽一水合物、組氨酸、聚山梨酯20和注射用水，并以10mg/ml的濃度提供。

“貝伐單抗”是一種全長的人源化小鼠單克隆抗體，其識別VEGF的所有同種型，并且是雷珠單抗的親本抗體。貝伐單抗的CAS編號為216974-75-3。貝伐單抗抑制血管生成并且目前被批準(zhǔn)用于治療不同的癌癥類型。然而，其也用于適應(yīng)癥外的眼科疾病例如年齡相關(guān)性黃斑變性。目前市售的貝伐單抗制劑含有α，α-海藻糖二水合物、磷酸鈉、聚山梨酯20和注射用水，并以濃度為25mg/ml的濃縮物提供。

本發(fā)明的預(yù)填充注射器內(nèi)的抗體濃度通常為1至100mg/ml，優(yōu)選2至75mg/ml，更優(yōu)選3至50mg/ml，甚至更優(yōu)選5至30mg/ml，最優(yōu)選6或10mg/ml。如果雷珠單抗包含于本發(fā)明的預(yù)填充注射器中，則雷珠單抗?jié)舛葹?0mg/ml。

本發(fā)明的預(yù)填充注射器中的液體組合物具有低的顆粒含量。特別地，當(dāng)注射器在40℃下旋轉(zhuǎn)5分鐘、兩周或四周后，或在從+5℃至-20℃以1℃/分鐘的三個凍融循環(huán)之后，或?qū)⒆⑸淦髟?℃或25℃和60％相對濕度下儲存三個月后，其包含小于50個尺寸大于10μm的顆粒。替代或補充地，當(dāng)注射器在40℃下旋轉(zhuǎn)5分鐘、兩周或四周后，或在從+5℃至-20℃以1℃/分鐘的三個凍融循環(huán)之后，或?qū)⒆⑸淦髟?℃或25℃/60％相對濕度下儲存三個月后，其包含小于5個尺寸大于25μm的顆粒。因此，該預(yù)填充注射器針對這些顆粒尺寸滿足美國藥典＜789＞關(guān)于眼科溶液的要求。

本發(fā)明的預(yù)填充注射器還具有優(yōu)異的滑動性能。特別地，掙脫力(break loose force)(即，引發(fā)柱塞的運動所需的力)小于10N或9N，優(yōu)選小于8N或7N，更優(yōu)選小于6N，最優(yōu)選小于5N。當(dāng)注射器儲存延長的時間如8周時，掙脫力不會顯著變化，即大于10％。相比之下，在包含硅酮的注射器中，掙脫力在儲存后提高至少兩倍。

此外，滑動力(即，保持柱塞沿著注射器筒移動以排出液體組合物所需的力)小于10N，優(yōu)選小于9N，更優(yōu)選小于8N，最優(yōu)選小于7N。在特別優(yōu)選的實施例中，在松弛力和滑動力之間沒有顯著差異。

本發(fā)明還提供了包含一種或多種本發(fā)明的預(yù)填充注射器的藥盒。優(yōu)選地，藥盒包括泡罩包裝?！芭菡职b”具有通常由熱成型塑料制成的腔或袋以及紙板的背襯或者鋁箔或塑料的封蓋密封件。泡罩包裝可以在無菌條件下進(jìn)行滅菌，之后在無菌條件下將無菌注射器包裝入其中。因此，在包裝后不需要滅菌。如果預(yù)填充注射器不包含嵌入式針，則藥盒還可以包含針。藥盒還可以包含使用說明書。

優(yōu)選地，藥盒不包含通常用于降低包裝如泡罩包裝內(nèi)的氧水平的氧吸收劑。氧吸收劑通常含有如碳酸亞鐵或抗壞血酸鹽的物質(zhì)，該物質(zhì)與包裝中的任何氧以高親和力反應(yīng)，從而降低包裝的氧含量。

“眼內(nèi)新生血管疾病”是以眼部新血管形成為特征的疾病。眼內(nèi)新生血管性疾病的實例包括例如增生性視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性和其它缺血相關(guān)性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫患者的糖尿病性視網(wǎng)膜病、病理性近視、希-林病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO，Central Retinal Vein Occlusion)、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO，Branch Retinal Vein Occlusion)、角膜新血管形成和視網(wǎng)膜新血管形成。術(shù)語“年齡相關(guān)性黃斑變性”是指通常影響老年人的醫(yī)學(xué)病癥，并且由于視網(wǎng)膜的損傷導(dǎo)致視野中心(黃斑)的視覺喪失。

優(yōu)選地，該預(yù)填充注射器用于玻璃體內(nèi)注射本文定義的VEGF拮抗劑。

術(shù)語“玻璃體內(nèi)注射”是指如此施用藥物組合物，其中物質(zhì)直接注射到眼睛中。更具體地，將物質(zhì)注入玻璃體液(vitreous humour，也稱為玻璃體(vitreous body)或簡稱為玻璃體(vitreous))，其是填充人和其他脊椎動物的眼球的晶狀體和視網(wǎng)膜之間的空間的透明凝膠。

雖然在附圖和前文的描述中已經(jīng)詳細(xì)地說明和描述了本發(fā)明，但是這樣的說明和描述被認(rèn)為是說明性的或示例性的而非限制性的。本發(fā)明不限于所公開的實施方案。通過研究附圖、公開內(nèi)容和從屬權(quán)利要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員在實踐要求保護(hù)的發(fā)明時可以理解和實現(xiàn)所公開的實施方案的其它變型。

該詳細(xì)描述本質(zhì)上僅僅是示例性的，并且不旨在限制應(yīng)用和用途。以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍?；诒景l(fā)明的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種改變和修改，并且此類改變和修改也包括在本發(fā)明中。

實施例

1.在包含雷珠單抗和經(jīng)歷不同條件的不同塑料和玻璃注射器中測定不同尺寸的顆粒

將400μl含有1mg/ml抗體和組氨酸緩沖液、海藻糖二水合物、聚山梨酯20、pH 5.5的抗VEGF抗體雷珠單抗的溶液裝入以下注射器中：

表1：

將來自表1的注射器在40℃下以1個循環(huán)/10秒的速度從針至塞子旋轉(zhuǎn)5分鐘、兩周和四周，或者經(jīng)歷五個冷凍/解凍循環(huán)(以1℃/分鐘從+5至-20℃)。然后，使用系統(tǒng)軟件(VisualSpreadsheet軟件，版本3.4.8)和以下參數(shù)，以FlowCam PV臺式系統(tǒng)(Fluid Imaging Technologies Inc.，Maine，美國)測定光遮蔽(1ight obscuration)：

分析結(jié)果展示于圖1和圖2中。在所有測試條件下，預(yù)填充的不含硅酮的環(huán)烯烴聚合物注射器1和8具有低的顆粒水平。

另外，測試了表2中列出的注射器：

表2：

編號11的注射器具有與表1的注射器1相同的筒，但是配備有魯爾圓錐體而不是嵌入式針。

將來自表2的注射器在5℃下，在25℃/60％相對濕度下孵育三、六和十二個月，以及40℃/75％相對濕度孵育兩個星期、一個月和三個月，沒有旋轉(zhuǎn)，然后如上所述分析表1的注射器。

預(yù)填充的不含硅酮的環(huán)烯烴聚合物注射器11在所有測試條件下具有低的顆粒水平。

2.在經(jīng)受應(yīng)激條件的不同塑料和玻璃注射器中測定雷珠單抗穩(wěn)定性

使上表1中所列的注射器經(jīng)受實施例1中針對表1的注射器所述的應(yīng)激條件。此外，使表2中所列的注射器經(jīng)受實施例1中針對表2的注射器所述的條件。

然后，通過RP-HPLC分析親水性和疏水性物質(zhì)的存在，通過陽離子交換色譜法分析抗體的酸性和堿性變體的存在，并通過尺寸排阻色譜法分析聚集體的存在。

a)RP-HPLC分析

將來自注射器的蛋白質(zhì)樣品加樣到ZORBAX 300SB-C18，4.6×100mm，3.5μm柱上以檢測親水性和疏水性雜質(zhì)。

根據(jù)下表3，用洗脫液A(0.1％三氟乙酸于水中)和洗脫液B(0.1％三氟乙酸于70％乙腈、20％1-丙醇和10％水中)的梯度洗脫蛋白質(zhì)。

檢測洗脫的物質(zhì)并顯示在展示洗脫物質(zhì)的濃度與時間的圖上。洗脫譜顯示了具有未修飾蛋白質(zhì)的主峰和在主峰之前和之后洗脫的一些其他峰，分別代表蛋白質(zhì)的親水性和疏水性變體。測定所有峰的總面積以及單峰的面積。圖3和4分別顯示了親水物質(zhì)和疏水物質(zhì)的峰面積相對于表1的注射器的洗脫物質(zhì)之總峰面積的百分比。

b)陽離子交換分析

將來自注射器的蛋白質(zhì)樣品加載到Dionex，WCX-10，4.0×250mm，10μm柱上以檢測蛋白質(zhì)的酸性和堿性變體。

根據(jù)下表4，用流動相A(20mM磷酸鉀緩沖液，pH 6.0)和流動相B(250mM KCl，20mM磷酸鉀緩沖液，pH 6.0)的梯度洗脫蛋白質(zhì)：

檢測洗脫的物質(zhì)并顯示在展示洗脫物質(zhì)的濃度與時間的圖上。洗脫譜顯示了具有未修飾蛋白質(zhì)的主峰和在主峰之前和之后洗脫的一些其他峰，分別代表蛋白質(zhì)的酸性和堿性變體。測定所有峰的總面積以及單峰的面積。圖5和圖6分別顯示了酸性變體和堿性變體的峰面積相對于表1的注射器的洗脫物質(zhì)之總峰面積的百分比。

c)尺寸排阻色譜法

將來自注射器的蛋白質(zhì)樣品加樣到Y(jié)MC-Pack Diol-200，5μm，20nm(8.0×300mm)柱上以檢測蛋白質(zhì)的聚集體。

使用0.1M磷酸鉀和0.2M氯化鈉通過等度洗脫洗脫蛋白質(zhì)。檢測洗脫的物質(zhì)并顯示在展示洗脫物質(zhì)的濃度與時間的圖上。洗脫譜顯示具有非聚集蛋白質(zhì)的主峰和表示蛋白質(zhì)的聚集形式的蛋白質(zhì)的一些其他峰。測定所有峰的面積。圖7顯示了聚集物的峰面積相對于表1的注射器的洗脫物質(zhì)之總峰面積的百分比。

從圖3至7所示的結(jié)果可以清楚看出，在所測試的條件下，雷珠單抗的穩(wěn)定性在本發(fā)明的預(yù)填充塑料注射器(注射器1和8)和玻璃注射器中是相當(dāng)?shù)摹?/p>

3.在含有雷珠單抗的不同塑料和玻璃注射器中測定滑動力

測試上述表1中列出的注射器1、2、7、8和9的塞子移動力，即掙脫力和滑動力。為此，將0.165ml含有濃度為10mg/ml的抗VEGF抗體雷珠單抗以及10mM組氨酸緩沖液、10％(w/v)海藻糖二水合物、0.01％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5的溶液填充到上述注射器中。在測試之前，將30G×0.5”的針連接到魯爾錐形注射器上。在拉伸試驗機(TH2730，Thümler)中以190mm/分鐘的塞子速度經(jīng)10.9mm的行程長度進(jìn)行測試。

測試結(jié)果如下表5所示。

表5：

預(yù)填充的不含硅酮的環(huán)烯烴聚合物注射器1和8(即本發(fā)明的注射器)的滑動特性與涂覆有硅油的注射器2和10的滑動特性相當(dāng)或甚至比其更好。

此外，測試上述表2中列出的注射器的塞子移動力，即掙脫力和滑動力。為此，將0.165ml含有10mM組氨酸緩沖液，10％(w/v)海藻糖二水合物，0.01％聚山梨酯20，pH 5.5的溶液填充到上述注射器中。在測試之前，將30G×0.5”的針連接到魯爾錐形注射器上。在拉伸試驗機(TH2730，Thümler)中以190mm/分鐘的塞子速度經(jīng)10.9mm的行程長度進(jìn)行測試。

預(yù)填充的不含硅酮的環(huán)烯烴聚合物注射器11(即本發(fā)明的注射器)的滑動特性與涂覆有硅油的注射器之滑動特性相當(dāng)或甚至比其更好。

4.在含有阿柏西普并經(jīng)歷不同條件的不同塑料和玻璃注射器中測定不同尺寸的顆粒

將400μl含有1mg/ml抗體和10mM磷酸鈉緩沖液、40mM氯化鈉、5％(重量/體積)蔗糖、0.03％(重量/體積)聚山梨酯20，pH 6.2的VEGF受體融合蛋白阿柏西普的溶液填充到以下注射器中：

表6：

將來自表6的注射器在40℃下以1個循環(huán)/10秒的速度從針至塞子旋轉(zhuǎn)5分鐘、兩周和四周，或者經(jīng)受五個冷凍/解凍循環(huán)(以1℃/分鐘從+5至-20℃)。還將該注射器在5℃下，在25℃/60％相對濕度下孵育三個月、六個月和十二個月；在40℃/75％相對濕度下孵育兩周、一個月和三個月；沒有旋轉(zhuǎn)，然后如上文所述針對表1的注射器進(jìn)行分析。

5.在含有阿柏西普的不同塑料和玻璃注射器中測定滑動力

測試上述表6中列出的注射器的塞子移動力，即掙脫力和滑動力。為此，將0.165ml含有濃度為40mg/ml的VEGF受體融合蛋白阿柏西普和10mM磷酸鈉緩沖液、40mM氯化鈉、5％(w/v)蔗糖、0.03％(w/v)聚山梨酯20，pH 6.2的溶液裝入上述注射器中。在測試之前，將30G×0.5”的針連接到魯爾錐形注射器上。在拉伸試驗機(TH2730，Thümler)中以190mm/分鐘的塞子速度經(jīng)10.9mm的行程長度進(jìn)行測試。