本發(fā)明涉及包含混合草藥提取物的用于治療和預(yù)防男性不育癥的組合物，具體而言涉及包含巴戟天(Morinda Officinalis)根、菟絲子(Cuscuta)種子以及洋蔥(Allium cepa)鱗莖(bulb)的混合草藥提取物的用于預(yù)防和治療男性不育癥的組合物及其用途。

背景技術(shù)：

[文獻(xiàn)1]Agarwal A,Deepinder F,Cocuzza M,Agarwal R,Short RA,Sabanegh E等(2007)Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters:new meta-analytical approach.Urology 70,532-538.

[文獻(xiàn)2]Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A&Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility.Urology 73,461-469.

[文獻(xiàn)3]Cheng D,Zheng XM,Li SW,Yang ZW&Hu LQ.(2006)Effects of epidermal growth factor on sperm content and motility of rats with surgically induced varicoceles.Asian J Androl 8,713-717.

[文獻(xiàn)4]Ding H,Tian JQ,Du W,Zhang LY,Wang HZ&Wang ZP.(2012)Open non-microsurgical,laparoscopic or open microsurgical varicocelectomy for male infertility:a meta-analysis of randomized controlled trials.BJU Int 110,1536-1542.

[文獻(xiàn)5]Evers JL&Collins JA.(2003)Assessment of efficacy of varicocele repair for male subfertility:a systematic review.The Lancet 361,1849-1852.

[文獻(xiàn)6]Ficarra V,Cerruto MA,Liguori G,Mazzoni G,Minucci S,Tracia A等(2006)Treatment of varicocele in subfertile men:the Cochrane reviewa contrary opinion.Eur Urol 49,258-263.

[文獻(xiàn)7]Fisch H&Hyun G.(2012)Varicocele repair for low testosterone.Curr Opin Urol 22,495-498.

[文獻(xiàn)8]Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937.

[文獻(xiàn)9]Mehta A&Goldstein M.(2012)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60.

[文獻(xiàn)10]Mehta A &Goldstein M.(2013)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60.

[文獻(xiàn)11]Sharma R,Agarwal A,Mohanty G,Hamada AJ,Gopalan B,Willard B等(2013)Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress.Reprod Biol Endocrinol 11,48.

[文獻(xiàn)12]Tanriverdi O,Miroglu C,Horasanli K,Altay B,Caliskan KC&Gumus E.(2006)Testicular blood flow measurements and mean resistive index values after microsurgical and high ligation varicocelectomy.Urology 67,1262-1265.

[文獻(xiàn)13]Mark sigman,Stacy Glass,Janice Campagnone,John L.Reyor,Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial,Fertility and Sterility Vol 85,No 5,2006.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明涉及包含混合草藥提取物的用于治療和預(yù)防男性不育癥的組合物，具體而言涉及包含巴戟天根、菟絲子種子以及洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為有效成分的用于預(yù)防和治療男性不育癥的組合物。

已經(jīng)存在報(bào)道稱，男性因素不育癥的最可能得到治療的起因精索靜脈曲張(varicocele)是以精索內(nèi)蔓狀叢的靜脈的彎折和擴(kuò)張為特征。精索靜脈曲張的患病率在患有原發(fā)性不育的男性中為19％-41％，而在患有繼發(fā)性不育的男性中為高于80％(Agarwal A,Deppinder F,Cocuzza M,Agarwal R,Short RA,Sabanegh E等(2007)Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters:new meta-analytical approach.Urology 70,pp532-538；Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A &Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility,Urology 73,pp461-469)。用于治療由精索靜脈曲張引起的男性不育癥的最常實(shí)施的外科手術(shù)是自多年前開始實(shí)施的曲張精索靜脈切除術(shù)，其包括非顯微外科手術(shù)方法、腹腔鏡或顯微外科曲張精索靜脈切除術(shù)(Mehta A及Goldstein M.(2012)Microsurgical varicocelectomy：a review.Asian J.Androl.，15，56-60頁(yè))。就不育癥男性患者的精索靜脈曲張進(jìn)行的手術(shù)矯正而言，盡管在進(jìn)行曲張精索靜脈切除術(shù)的患者中有50％-80％顯示出改善的參數(shù)(妊娠率31％-74％)(Cheng D,Zheng XM,Li SW,Yang ZW&Hu LQ.(2006)Effects of epidermal growth factor on sperm content and motility of rats with surgically induced varicoceles.Asian J Androl 8,713-717；Ding H,Tian JQ,Du W,Zhang LY,Wang HZ&Wang ZP.(2012)Open non-microsurgical,laparoscopic or open microsurgical varicocelectomy for male infertility:a meta-analysis of randomized controlled trials.BJU Int 110,1536-1542；Fisch H&Hyun G.(2012)Varicocele repair for low testosterone.Curr Opin Urol 22,495-498；Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937；Mehta A&Goldstein M.(2013)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60；Tanriverdi O,Miroglu C,Horasanli K,Altay B,Caliskan KC&Gumus E.(2006)Testicular blood flow measurements and mean resistive index values after microsurgical and high ligation varicocelectomy.Urology 67,1262-1265)，然而，一些報(bào)道認(rèn)為，由于在不育癥術(shù)后顯示出高的妊娠失敗率，因此精索靜脈曲張修復(fù)對(duì)于男性而言似乎并非有效的治療(Evers JL&Collins JA.(2003)Assessment of efficacy of varicocele repair for male subfertility:a systematic review.The Lancet 361,1849-1852；Ficarra V,Cerruto MA,Liguori G,Mazzoni G,Minucci S,Tracia A等(2006)Treatment of varicocele in subfertile men:the Cochrane review a contrary opinion.Eur Urol 49,258-263)。盡管精索靜脈曲張患者的睪丸功能受損導(dǎo)致不育的確切機(jī)制目前為止尚未完全闡明，然而已經(jīng)提出了一些假設(shè)的機(jī)制來(lái)對(duì)各種精索靜脈曲張相關(guān)的睪丸機(jī)能障礙進(jìn)行研究，這些障礙包括睪丸中的血流變化、陰囊溫度升高、異常激素值、活性氧(ROS)過(guò)多等(Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A &Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility.Urology 73,461-469；Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937)。

作為重要的生理性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的調(diào)節(jié)劑，ROS(活性氧物質(zhì))是由氧代謝和能量產(chǎn)生過(guò)程再生的副產(chǎn)物之一。少量ROS在對(duì)男性生殖道中精子功能的控制中起重要作用。在異常條件下，隨著ROS水平增加或抗氧化能力降低發(fā)生氧化應(yīng)激。具體而言，氧化應(yīng)激引起精子中表達(dá)的蛋白質(zhì)水平改變，導(dǎo)致分子和基因產(chǎn)生缺陷(Sharma R,Agarwal A,Mohanty G,Hamada AJ,Gopalan B,Willard B等(2013)Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress.Reprod Biol Endocrinol 11,48)。

正常地，健康夫婦的妊娠率在性關(guān)系后第一個(gè)月達(dá)到20％-25％，半年時(shí)達(dá)到75％，并在一年時(shí)達(dá)到85％-90％。在臨床上，在將性關(guān)系后一年內(nèi)妊娠失敗的情況定義為“不育”的條件下，認(rèn)為韓國(guó)已婚夫婦中不育患者比例為約13％-20％(約1,400,000對(duì)夫婦)。其中，35％-50％的不育是由男性健康問題引起的，并且約30％的問題是由精子活力降低造成的。男性不育是門診患者的重要和嚴(yán)重疾病之一，占泌尿科醫(yī)院門診患者人數(shù)的4％。

近來(lái)，由于生殖生物學(xué)或ART(輔助生殖技術(shù))的進(jìn)步，已經(jīng)開發(fā)了諸如IVF(體外受精)、顯微操作技術(shù)等各種ART。然而，這些技術(shù)也有著一些缺點(diǎn)和問題，例如，僅有20％至40％的低妊娠率、需要過(guò)多費(fèi)用、由于抱怨疼痛而難以應(yīng)用于女性、發(fā)生并發(fā)癥等。體外受精則可能引發(fā)遺傳問題，并主要限于對(duì)自然妊娠的關(guān)注。

盡管不育癥的治療已得到發(fā)展，然而迄今為止尚未開發(fā)治療男性不育癥和提高精子活力的有效治療劑，并且?guī)缀鯖]有關(guān)于可提高妊娠率的藥物的研究。作為對(duì)精子活力低的男性的精液參數(shù)進(jìn)行改善的現(xiàn)有方法之一，除內(nèi)科和外科方法之外，已經(jīng)開發(fā)出L-肉堿作為治療劑，然而據(jù)報(bào)道該藥物幾乎未顯示出明顯功效(Mark sigman,Stacy Glass,Janice Campagnone,John L.Reyor,Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial,Fertility and Sterility Vol 85,No 5,2006)。

巴戟天根：據(jù)報(bào)道，屬于茜草科(Rubiaceae)并分布于中國(guó)南方地區(qū)的巴戟天的根含有維生素C、糖等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp 927-928,1998)。

菟絲子種子：據(jù)報(bào)道，屬于旋花科(Convolvulaceae)的日本菟絲子(Cuscuta japonica)等的種子含有樹脂糖苷、糖、維生素A、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、teraxanthin、葉黃素等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp882-883,1998)。

洋蔥鱗莖：據(jù)報(bào)道，屬于百合科(Liliaceae)并源于西伯利亞或阿爾泰的洋蔥的鱗莖含有硫醇、二甲基二硫化物、二烯丙基二硫化物、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp155-156,1998)。

然而，任何上述引用文獻(xiàn)中均未報(bào)道或公開包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物對(duì)于男性不育癥具有治療效果，通過(guò)引用的方式將上述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容并入本文。

因此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)不懈努力，發(fā)現(xiàn)了用于治療和預(yù)防男性不育癥的有效草藥制劑，該包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥組合物對(duì)人類不育癥顯示出有效的治療效果，該效果通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，例如體外精子質(zhì)量促進(jìn)效果評(píng)價(jià)以及體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法，該方法用于對(duì)草藥提取物對(duì)體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中精子計(jì)數(shù)和活力變化的影響進(jìn)行研究。最后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述混合草藥提取物在治療和預(yù)防男性不育癥中是有效的。

技術(shù)方案

本發(fā)明的課題在于開發(fā)通過(guò)提高精子活力來(lái)提高妊娠率、最終恢復(fù)先前的高妊娠率的新方法。通過(guò)本發(fā)明，有助于提高不育夫婦的妊娠率并有助于開發(fā)國(guó)家政策中針對(duì)出生率回復(fù)和高齡化社會(huì)的應(yīng)對(duì)體系、可開發(fā)新型天然藥物并創(chuàng)造新的附加值、可復(fù)興工業(yè)并提高國(guó)家利益。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療男性不育癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為活性成分。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和改善男性不育癥的保健功能性食品，所述保健功能性食品包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為活性成分。

在本發(fā)明中，本文公開的“提取物”包括混合草藥提取物，優(yōu)選巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖基于每種草藥的干重的混合比例(w/w)為0.01-100:0.01-1:1-100(w/w)，更優(yōu)選為0.1-50:0.1-1:1-50(w/w)，進(jìn)一步更優(yōu)選為1-30:1:1-30(w/w)。

具體而言，本文公開的術(shù)語(yǔ)“提取物”包括可溶于水、C₁-C₄醇或它們的混合物的提取物，優(yōu)選可溶于水或水與乙醇的混合物的提取物，更優(yōu)選可溶于水與乙醇的混合物的提取物。

具體而言，本文公開的術(shù)語(yǔ)“男性不育癥”包括所有的男性不育癥，例如但不限于由諸如順鉑、長(zhǎng)春堿(vinblastin)、博來(lái)霉素等抗癌劑的不良反應(yīng)引起的男性不育癥；無(wú)精子癥(精子計(jì)數(shù)無(wú))、少精子癥(精子計(jì)數(shù)≤2×10⁷/ml)、弱精子癥(高活力精子比例≤40％)、畸形精子癥(正常精子比例≤40％)等與精子相關(guān)的不育癥(參見Korean Society for sexual medicine and andrology,Textbook of andrology,2010)。

下文對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明?？筛鶕?jù)以下常規(guī)提取方法得到單一草藥提取物和混合草藥提取物。

例如，本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的草藥提取物的方法，所述方法包括以下步驟：在第1步驟，分別對(duì)干燥的巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖進(jìn)行洗滌，并向其添加1至20倍(w/v)、優(yōu)選1至10倍(w/v)體積的水、諸如甲醇、乙醇等醇或它們的混合物，優(yōu)選水、乙醇或它們的混合物；在第2步驟，通過(guò)以下提取方法對(duì)各溶液進(jìn)行提取：在50℃～120℃、優(yōu)選約80℃～100℃的溫度下，用熱水、冷水或超聲波提取(優(yōu)選熱水提取)1至5小時(shí)、優(yōu)選2至4小時(shí)；在第3步驟，重復(fù)上述提取過(guò)程來(lái)過(guò)濾收集各濾液，通過(guò)冷凍干燥、自然空氣干燥或熱空氣干燥工序(優(yōu)選冷凍干燥工序)進(jìn)行干燥，分別獲得巴戟天根、菟絲子種子或洋蔥鱗莖的干燥提取物；以及在第4步驟，基于每種草藥的干重，以巴戟天根:菟絲子種子:洋蔥鱗莖的混合比例(w/w)為0.01-100:0.01-1:1-100(w/w)、優(yōu)選0.1-50:0.1-1:1-50(w/w)、更優(yōu)選1-30:1:1-30(w/w)混合每種草藥的干燥提取物，從而制備本發(fā)明的混合草藥提取物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于預(yù)防和治療男性不育癥的藥物組合物或保健功能性食品，其包含通過(guò)上述方法獲得的上述巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的草藥提取物作為活性成分。

本發(fā)明的巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的草藥提取物對(duì)人類不育癥顯示出有效的治療效果，這通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，例如體外精子質(zhì)量促進(jìn)效果評(píng)價(jià)以及體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法，該方法用于對(duì)草藥提取物對(duì)體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中精子計(jì)數(shù)和活力變化的影響進(jìn)行研究，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的混合提取物對(duì)精子計(jì)數(shù)和精子活力顯示出更有效的提升作用。因此，本發(fā)明的草藥提取物可以有效地用于預(yù)防和治療男性不育癥的藥物組合物、保健功能性食品和保健補(bǔ)充食品中。

本發(fā)明的用于治療目標(biāo)疾病的藥物組合物可以基于組合物的總重量包含約0.01w/w％至99w/w％的上述本發(fā)明的草藥提取物。

然而，上述組合物的量和每種組分可隨患者的狀況、患者疾病的發(fā)展、疾病的種類等而變化。

本發(fā)明的含有提取物的組合物可以根據(jù)使用方法而另外包含常規(guī)的載體、佐劑或稀釋劑。

可將本發(fā)明所述的草藥組合物配制為口服劑型，如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、氣霧劑等；局部制劑；或者注射溶液劑。本發(fā)明所述的草藥組合物可以作為含有藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物提供，所述載體、佐劑或稀釋劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、硬脂酸鎂和礦物油。所述制劑還可另外包含賦形劑，如填充劑、膨脹劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、表面活性劑、稀釋劑等。固體口服劑型包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等；所述固體口服劑型通過(guò)將至少一種賦形劑(如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠等)添加至所述草藥提取物來(lái)制備?？梢允褂弥T如硬脂酸鎂或滑石等的潤(rùn)滑劑。水性口服劑型包括混懸劑、口服溶液劑、乳劑、糖漿劑；所述水性口服劑型可包含數(shù)種賦形劑，如潤(rùn)濕劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑、以及水、液體石蠟。胃腸外劑型包括無(wú)菌水溶液劑、非水性溶劑、混懸劑、乳劑、凍干劑、栓劑等。載體的合適實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、可注射的酯(如油酸乙酯)。栓劑基質(zhì)可包括witepsol、macrogol、吐溫61、可可脂、月桂精(laurin)、甘油明膠等，但并不限于此。

本發(fā)明組合物的期望劑量根據(jù)受試者的狀況和體重、疾病嚴(yán)重程度、藥物形式、給藥途徑和周期而變化，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。然而，為了獲得期望的效果，通常推薦以如下劑量的量給予本發(fā)明的組合物：0.01mg/kg重量/天至10g/kg重量/天、優(yōu)選1mg/kg重量/天至1g/kg重量/天。所述劑量可以每天以單次劑量或多次劑量給予。因此，上述劑量并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

可以通過(guò)各種途徑向諸如哺乳動(dòng)物的受試動(dòng)物(大鼠、小鼠、家養(yǎng)動(dòng)物或人)給予本發(fā)明的藥物組合物。所有給藥模式均在預(yù)期之內(nèi)，例如，可以口服給藥、直腸給藥或通過(guò)靜脈內(nèi)注射進(jìn)行給藥。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于預(yù)防和治療男性不育癥的精子活力改善劑，其包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為活性成分。所述精子活力改善劑可以提高體外受精的受精率。另外，可將本發(fā)明的包含所述提取物的男性不育癥治療劑用作女性用陰道用藥劑、陰道栓劑以及陰道用插入劑，用于增強(qiáng)精子活力。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在體外受精時(shí)提高受精率的、用于體外受精中的精子保存的添加劑，所述添加劑包含上述提取物。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種治療方法，所述方法包括向需要治療或預(yù)防男性不育癥的受試者給予包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物的組合物。

本發(fā)明的又一目的在于提供巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為活性成分在制造用于預(yù)防和治療人或哺乳動(dòng)物中雄性不育癥的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種用于預(yù)防或改善男性不育癥的保健功能性食品，所述保健功能性食品包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為活性成分。

本文所定義的術(shù)語(yǔ)“保健功能性食品”包括通過(guò)將本發(fā)明的提取物添加至常規(guī)食品中以對(duì)人或哺乳動(dòng)物的目標(biāo)疾病進(jìn)行預(yù)防或改善，具有增強(qiáng)的功能性(如物理功能或生理功能)，并且符合韓國(guó)保健功能性食品法6727條(the Law for Health Functional Foods 6727in Republic of Korea)規(guī)定的功能性食品。

用于預(yù)防和改善目標(biāo)疾病的保健功能性食品組合物可基于組合物的總重量包含約0.01w/w％至95w/w％、優(yōu)選1w/w％至80w/w％的上述本發(fā)明的草藥組合物。

此外，還可將本發(fā)明的提取物用作制備用于預(yù)防或改善男性不育癥、或改善睪丸功能的各種保健功能性食品和保健補(bǔ)充食品的主要成分或添加劑和助劑(aiding agent)。

本發(fā)明的用于預(yù)防或改善男性不育癥的保健功能性食品可以制備和加工為藥學(xué)上可接受的劑型(如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑等)或保健功能性食品形式(如茶袋、浸出茶(leached tea)、保健飲料等)。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于預(yù)防或改善男性不育癥的保健補(bǔ)充食品，所述保健補(bǔ)充食品包含巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物作為主要成分。

上述術(shù)語(yǔ)“作為主要成分”是指上述保健補(bǔ)充食品基于組合物的總重量包含約30w/w％至99w/w％、優(yōu)選50w/w％至99w/w％、更優(yōu)選70w/w％至99w/w％的本發(fā)明提取物(活性成分)。

當(dāng)將本發(fā)明的混合草藥提取物用作保健功能性飲料組合物中的組分時(shí)，不受限制地，類似于典型的飲料組合物，所述保健功能性飲料組合物可包含其它組分，如調(diào)味劑或天然碳水化合物。天然碳水化合物的實(shí)例包括單糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如，諸如糊精、環(huán)糊精等糖以及諸如木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等糖醇?？稍谒霰＝」δ苄燥嬃辖M合物中添加天然調(diào)味劑(索馬甜、甜葉菊提取物(萊鮑迪苷A、甘草甜素等))和合成調(diào)味劑(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的量通常為在每100ml本發(fā)明組合物中添加約1g至20g、優(yōu)選約5g至12g。

當(dāng)將本發(fā)明的混合草藥提取物用作用于預(yù)防或改善目標(biāo)疾病的保健食品的食品添加劑時(shí)，所述混合草藥提取物可以原樣添加或根據(jù)通常方法與其它食品組分共同使用。所述食品的實(shí)例包括肉制品、香腸、面包、巧克力、糖果、小吃、薄脆餅(cracker)、餅干(biscuit)、比薩餅、拉面、面條制品、口香糖、諸如冰淇淋等乳制品、湯、飲料、茶、飲品、酒精飲品、維生素復(fù)合物等，但在本文中并不限于此。

除上述組成之外的其它組分為各種營(yíng)養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)或電解質(zhì)、諸如天然調(diào)味劑和合成調(diào)味劑等調(diào)味劑、著色劑和改良劑(在干酪、巧克力等的情況下)、果膠酸及其鹽、藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠體粘合劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、用于碳酸飲料的碳化劑等。除上述組分之外的其它組分可以是用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的果汁。其中，上述組分可以單獨(dú)使用或組合使用。上述組分的比例并非特別重要，但是通常范圍為每100w/w％本發(fā)明組合物中約0w/w％至20w/w％。

另外，可將上述提取物添加至食品或飲料以用于對(duì)目標(biāo)疾病進(jìn)行預(yù)防和改善。作為保健功能性食品或保健補(bǔ)充食品的食品或飲料中的上述提取物的量通常可以是用于保健功能性食品組合物的食品總重量的約0.01w/w％至15w/w％。并且，本發(fā)明的提取物可在每100ml保健飲料組合物中添加0.02g至5g、優(yōu)選0.3g至1g。

有益效果

如本發(fā)明所述，本發(fā)明的混合草藥組合物對(duì)人類不育癥顯示出有效的治療效果，這通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，例如體外精子質(zhì)量促進(jìn)效果評(píng)價(jià)以及體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法，該方法用于對(duì)草藥提取物對(duì)體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中精子計(jì)數(shù)和活力變化的影響進(jìn)行研究，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的混合提取物對(duì)精子計(jì)數(shù)和精子活力顯示出更有效的提升作用。因此，本發(fā)明的草藥提取物可以有效地用于預(yù)防和治療男性不育癥的藥物組合物、保健功能性食品和保健補(bǔ)充食品中。

附圖說(shuō)明

圖1示出了測(cè)試樣品(巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥提取物)對(duì)人精液中的人精子計(jì)數(shù)和人精子活力的改善效果(在測(cè)試前，對(duì)CINTM1(10:1:10)、CINTM1(5:1:5)和CINTM1(1:1:1)的每一測(cè)試樣品進(jìn)行了初步測(cè)試)。

圖2示出了對(duì)于每種草藥的提取物和混合草藥提取物，測(cè)試樣品對(duì)人精液中的人精子計(jì)數(shù)和人精子活力的改善效果(CINThera-1：巴戟天根提取物；CINThera-2：菟絲子種子提取物；CINThera-3：洋蔥鱗莖提取物；10:1:10表示以巴戟天根:菟絲子種子:洋蔥鱗莖＝10:1:10進(jìn)行混合)。

圖3示出了測(cè)試樣品對(duì)誘導(dǎo)精索靜脈曲張的動(dòng)物組中的精子計(jì)數(shù)的改善效果(CTR：對(duì)照組，OP：手術(shù)組)。

圖4顯示了測(cè)試樣品對(duì)誘導(dǎo)精索靜脈曲張的動(dòng)物組中的精子活力的改善效果(CTR：對(duì)照組，OP：手術(shù)組)。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例和試驗(yàn)例更具體地解釋本發(fā)明。

實(shí)施例

以下實(shí)施例和試驗(yàn)例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明而不限制其范圍。

實(shí)施例1各組分(單一草藥提取物)的制備

(1)巴戟天根提取物(CINThera-1)

將3,000g購(gòu)自位于首爾的慶東市場(chǎng)的干燥巴戟天根(Dukhyundang Pharmacy)洗滌并添加至6L的95％乙醇中，用超聲提取90分鐘進(jìn)行3次提取。用濾紙對(duì)殘余物進(jìn)行過(guò)濾，得到提取物，并將過(guò)濾的提取物在真空下濃縮。用冷凍干燥器(ScanVac，Labogene)對(duì)濃縮的提取物進(jìn)行干燥，得到139.4g(產(chǎn)率：4.6％)巴戟天根提取物粉末，在4℃下儲(chǔ)存。

在用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)之前，將干燥提取物溶于生理鹽水溶液中并在室溫下劇烈攪拌2分鐘。

(2)菟絲子種子提取物(CINThera-2)

將5.2kg購(gòu)自位于首爾的慶東市場(chǎng)的干燥菟絲子種子(Backjangsaeng Pharmacy)洗滌、粉碎并添加至5L的95％乙醇中，用超聲提取90分鐘進(jìn)行2次提取。用濾紙對(duì)殘余物進(jìn)行過(guò)濾，得到提取物，并將過(guò)濾的提取物在真空下濃縮。用冷凍干燥器(ScanVac，Labogene)對(duì)濃縮的提取物進(jìn)行干燥，得到264.3g(產(chǎn)率：4.36％)菟絲子種子提取物粉末，在4℃下儲(chǔ)存。

在用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)之前，將干燥提取物溶于生理鹽水溶液中并在室溫下劇烈攪拌2分鐘。

(3)洋蔥鱗莖提取物(CINThera-3)

將1,000g購(gòu)自位于慶尚南道(韓國(guó))的昌寧市場(chǎng)的洋蔥鱗莖(Backjangsaeng Pharmacy)洗滌、干燥并添加至5L的70％乙醇中，在70℃下通過(guò)回流提取2小時(shí)進(jìn)行提取。用濾紙對(duì)殘余物進(jìn)行過(guò)濾，得到提取物，并將過(guò)濾的提取物在真空下濃縮。用冷凍干燥器(ScanVac，Labogene)對(duì)濃縮的提取物進(jìn)行干燥，得到13.8g(產(chǎn)率：1.38％)洋蔥鱗莖提取物粉末，在4℃下儲(chǔ)存。

在用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)之前，將干燥提取物溶于生理鹽水溶液中并在室溫下劇烈攪拌2分鐘。

實(shí)施例2混合草藥提取物的制備(CINThera-1:CINThera-2:CINThera-3＝10:1:10)

分別稱量實(shí)施例1中制備的干燥巴戟天根提取物(CINThera-1)10mg、菟絲子種子提取物(CINThera-2)1mg和洋蔥鱗莖提取物(CINThera-3)10mg，使用混合器(Vortex genie-2，scientific industries，USA)充分混合，獲得混合草藥提取物21mg，并在以下實(shí)驗(yàn)中用作測(cè)試樣品。同樣制備5:1:5和1:1:1的測(cè)試樣品。

(以下稱為“CINTM1”)

試驗(yàn)例1.體外精子活力促進(jìn)效果評(píng)價(jià)

為了對(duì)上述實(shí)施例中獲得的本發(fā)明提取物對(duì)人精子的精子計(jì)數(shù)和精子活力的影響進(jìn)行研究，根據(jù)文獻(xiàn)公開的體外精子活力促進(jìn)效果評(píng)價(jià)方法(Martin Blomberg Jensen,Poul J.Bjerrum,Torben E.Jessen,John E.Nielsen,Ulla N.Joensen等(2011)Vitamin D is positively associated with sperm motility and increases intracellular calcium in human spermatozoa.Human Reproduction,Vol.26,No.6pp.1307-1317)進(jìn)行了以下體外實(shí)驗(yàn)。

1-1.實(shí)驗(yàn)程序

對(duì)來(lái)自患有不育癥的就診志愿患者(韓國(guó)全北國(guó)立大學(xué)醫(yī)院泌尿科分部，20至50歲，約85名患者)的人精液的精子計(jì)數(shù)和精子活力進(jìn)行測(cè)定后，將精液倒入保持在37℃的培養(yǎng)箱中。精液充分液化后，向200μL精液中添加20μL測(cè)試樣品提取物，直至終濃度為2mg/ml。加入3小時(shí)后，使用計(jì)數(shù)室(MAKLER計(jì)數(shù)室，self-Medical Instruments、Haifa、Israel)和顯微鏡(Axiovert25，ZEISS，USA)對(duì)精子活力進(jìn)行測(cè)定。

作為對(duì)照組，使用3H緩沖液{Hams F-10(N6635，Sigma chemical Co.，USA)+0.4％HAS(A1635，Sigma Chemical Co.，USA)+12mM HEPES(H4034，Sigma Chemical Co.，USA)[3H，pH 7.4]。將測(cè)試樣品溶解在與上述相同的3H緩沖液中，調(diào)節(jié)至pH 7.4，并通過(guò)離心裝置(A32010(1)，LABOGENE，13,000rpm，2分鐘，4℃)離心，得到上清液用于測(cè)定。

根據(jù)以下經(jīng)驗(yàn)公式1計(jì)算精子活力。

[經(jīng)驗(yàn)公式1]

1-2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了確定巴戟天根、菟絲子種子以及洋蔥鱗莖的混合天然提取物的比例，對(duì)于由上述患有不育癥的就診志愿者獲得的精液進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，在分別使用三種本發(fā)明組合(CINTM1(10:1:10)、CINTM1(5:1:5)和CINTM1(1:1:1))處理的組中，分別在組CINTM1(10:1:10)：濃度為0.05mg/ml時(shí)為70％；組CINTM1(5:1:5)：濃度為0.5mg/ml時(shí)為62％；組CINTM1(1:1:1)：濃度為0.005mg/ml時(shí)為63％的情況下顯示出最高的精子活力增加值。在測(cè)試樣品組中，與不同混合比的其它組相比，組CINTM1(10:1:10)顯示出最高的精子活力增加效力(參見圖1)。

對(duì)于由上述患有不育癥的就診志愿者獲得的精液進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，在分別使用CINThera-1、CINThera-2、CINThera-3和CINTM1(10:1:10)處理的試驗(yàn)組中，在0.05mg/ml的同一濃度下分別顯示出55％、53.5％、48.0％以及59.5％的最高的精子活力增加值。在測(cè)試樣品組中，與其它單獨(dú)的天然提取物組相比，混合天然提取物組CINTM1(10:1:10)顯示出最高的精子活力增加效力(參見圖2)。

試驗(yàn)例2.使用體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型對(duì)混合草藥提取物的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)

為了對(duì)上述實(shí)施例中獲得的本發(fā)明提取物在體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中對(duì)人精子的精子計(jì)數(shù)和精子活力的影響進(jìn)行研究，根據(jù)文獻(xiàn)中記載的體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法(Zhang LT,Kim HK,Choi BR,Zhao C,Lee SW,Jang KY等(2014)Analysis of testicular-internal spermatic vein variation and the recreation of varicocoele in a Sprague-Dawley rat model.Andrology.2,466-73)進(jìn)行了以下體內(nèi)試驗(yàn)。

2-1.體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型的建立

為了建立體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型，獲取購(gòu)自KOATECH.Ltd(位于韓國(guó)平澤市)的重量為300至350g的9周齡Sprague-Dawley大鼠，經(jīng)一周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境后，飼養(yǎng)于塑料籠中，每籠四只大鼠。在飼養(yǎng)場(chǎng)所中，將人工照明調(diào)節(jié)為在早7時(shí)至晚7時(shí)的12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)溫度維持在18至23℃，相對(duì)濕度維持在40至60％。供給標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料并允許自由飲水。使用氯胺酮+賽拉嗪(50mg/kg+25mg/kg)的混合物對(duì)每只大鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)麻醉，沿中線切開腹部，并經(jīng)切口接近左腎后暴露出與腔靜脈相連的左腎靜脈。以具有平行金屬探針(外徑：0.85mm)的5.0尼龍縫合線結(jié)扎左腎靜脈，隨后取出金屬探針，使得左腎靜脈在結(jié)扎點(diǎn)處直徑減小50％，并且血管持續(xù)收縮。結(jié)扎ISV(精索內(nèi)靜脈)枝以誘導(dǎo)精索靜脈曲張，用作誘導(dǎo)精索靜脈曲張的動(dòng)物組，并且在結(jié)扎后四周，口服給予溶解于生理鹽水溶液中的測(cè)試樣品。

2-2.體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中的混合天然提取物的效力評(píng)價(jià)

對(duì)于將左腎靜脈部分結(jié)扎以誘導(dǎo)精索靜脈曲張的精索靜脈曲張手術(shù)組以及正常對(duì)照組，在手術(shù)后28日(對(duì)照組為在安定后28日)內(nèi)，每日口服給予測(cè)試樣品(CINTM1(10:1:10))或生理鹽水溶液2ml(正常對(duì)照組：生理鹽水2ml/天、混合草藥提取物100mg/kg/2ml/天、混合草藥提取物200mg/kg/2ml/天；精索靜脈曲張手術(shù)組：生理鹽水2ml/天、混合草藥提取物100mg/kg/2ml/天、混合草藥提取物200mg/kg/2ml/天)，然后稱量大鼠體重。在全身麻醉下切除大鼠的輸精管，對(duì)其中的精子計(jì)數(shù)和活力進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)雙側(cè)睪丸和附睪的重量進(jìn)行稱重以進(jìn)行比較。

2-3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

作為給藥后28日時(shí)精子計(jì)數(shù)的測(cè)定結(jié)果，觀察到誘導(dǎo)精索靜脈曲張的組中，給予混合天然提取物的組獲得的精液中精子計(jì)數(shù)有所增加。在誘導(dǎo)精索靜脈曲張的組中，給予生理鹽水的組中，獲得的精液中的精子計(jì)數(shù)僅為18.25±9.53×10⁶/ml，而100mg/kg/2ml/天以及200mg/kg/2ml/天的混合天然提取物的組中，觀察到精子計(jì)數(shù)分別為20.91±12.25×10⁶/ml和28.63±8.90×10⁶/ml，產(chǎn)生了大幅增加(參見圖3)。

作為給藥后28日時(shí)精子活力的測(cè)定結(jié)果，觀察到誘導(dǎo)精索靜脈曲張的組中，給予混合天然提取物的組獲得的精液中精子活力有所增加。在誘導(dǎo)精索靜脈曲張的組中，給予生理鹽水的組中，獲得的精液中的精子活力僅為31.3±18.8％，而100mg/kg/2ml/天以及200mg/kg/2ml/天的混合天然提取物的組中，確認(rèn)精子活力分別為53.8±20.7％和53.3±12.1％，精子活力強(qiáng)化效果優(yōu)異(參見圖4)。

在下文中，將對(duì)包含本發(fā)明的提取物和多種賦形劑的組合物的制劑例進(jìn)行描述，然而以下內(nèi)容僅為進(jìn)行具體描述，并非旨在限制本發(fā)明。

制劑例1.散劑的制備

混合草藥提取物(CINTM1) 20mg

乳糖 100mg

滑石 10mg

將上述組分混合后，通過(guò)填充密封包裝制備散劑。

制劑例2.片劑的制備

將上述組分混合后，通過(guò)常規(guī)片劑制造方法制備片劑。

制劑例3.膠囊劑的制備

將上述組分混合后，通過(guò)常規(guī)膠囊劑制備方法填充明膠膠囊制備膠囊劑。

制劑例4.注射劑的制備

通過(guò)常規(guī)注射劑制備方法，溶解上述成分并以每安瓿(2ml)中填入如上所述含量的全部組分來(lái)制備注射劑。

制劑例5.液體劑的制備

通過(guò)常規(guī)液體劑制備方法，向蒸餾水中添加各活性組分并溶解，加入適量檸檬香料后，將上述成分混合后添加蒸餾水，然后將所有組分添加蒸餾水調(diào)節(jié)至100ml后，填充至棕色瓶中并滅菌，從而制備液體劑。

制劑例6.保健食品的制備

盡管上述維生素和礦物質(zhì)的混合物的組成比是按照比較適合于保健食品的成分的優(yōu)選實(shí)施例混合組成的，然而也可任意改變其配合比例來(lái)實(shí)施。根據(jù)常規(guī)的保健食品的制備方法，可將上述成分混合后，制造顆粒，并依照常規(guī)方法將其用于制備保健食品組合物。

制劑例7.保健飲料的制備

通過(guò)常規(guī)保健飲料的制備方法，通過(guò)將上述成分混合后，在85℃下攪拌加熱1小時(shí)，隨后將所得溶液過(guò)濾并滅菌，填充于2L容器中，密封滅菌后冷藏保管，從而制備本發(fā)明的保健飲料組合物。

盡管上述組成比是按照比較適合于嗜好飲料的成分的優(yōu)選實(shí)施例混合組成的，然而也可根據(jù)所需水平、所需國(guó)家、所需用途等地域、民族偏好而任意改變其配合比例來(lái)實(shí)施。

工業(yè)實(shí)用性

如本發(fā)明所述，本發(fā)明的巴戟天根、菟絲子種子和洋蔥鱗莖的混合草藥組合物對(duì)人類不育癥顯示出有效的治療效果，這通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，例如體外精子質(zhì)量促進(jìn)效果評(píng)價(jià)以及體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法，該方法用于對(duì)草藥提取物對(duì)體內(nèi)精索靜脈曲張動(dòng)物模型中精子計(jì)數(shù)和活力變化的影響進(jìn)行研究，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的混合提取物對(duì)精子計(jì)數(shù)和精子活力顯示出更有效的提升作用。因此，本發(fā)明的草藥提取物可以有效地用于預(yù)防和治療男性不育癥的藥物組合物、保健功能性食品和保健補(bǔ)充食品中。