本發(fā)明涉及創(chuàng)傷修復(fù)和愈合，特別地涉及皮膚(dermal或cutaneous)創(chuàng)傷，其包括但不限于急性和慢性的創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍。

背景技術(shù)：

本說(shuō)明書(shū)中提及任何現(xiàn)有技術(shù)不是承認(rèn)或表明該現(xiàn)有技術(shù)形成在任何管轄范圍(jurisdiction)內(nèi)的公知常識(shí)的一部分，或者可合理地預(yù)期該現(xiàn)有技術(shù)被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解、視為相關(guān)和/或與其他現(xiàn)有技術(shù)組合。

在成人中，針對(duì)損傷的正常響應(yīng)通常是創(chuàng)傷修復(fù)。創(chuàng)傷修復(fù)已經(jīng)典地描述為以下三個(gè)不同階段，其由以下組成：其中形成纖維蛋白凝塊的初始階段，其中纖維蛋白凝塊裂解并且形成由蛋白聚糖、糖蛋白和III型膠原組成的臨時(shí)基質(zhì)的中間階段，以及其中臨時(shí)相被消化并且替換成富含I型膠原的基質(zhì)的最終階段。

局部因素(例如，創(chuàng)傷的類型、大小和位置，向創(chuàng)傷的血管供應(yīng)，感染的存在，局部運(yùn)動(dòng)(local movement)以及暴露于輻射和UV光)影響創(chuàng)傷修復(fù)，全身因素(包括心血管性能的狀況、感染、代謝狀態(tài)和激素)也是如此。

公認(rèn)的是，針對(duì)損傷的正常生理響應(yīng)是隨著從損傷開(kāi)始約3至4周時(shí)出現(xiàn)I型膠原沉積而完成的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。超過(guò)這一時(shí)間的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程拖延提高形成慢性創(chuàng)傷的可能性。

盡管炎癥在創(chuàng)傷愈合中的作用存在爭(zhēng)議，但是通常認(rèn)可的是：在創(chuàng)傷愈合期間根據(jù)炎癥的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間控制炎癥是重要的。特別地，已觀察到：炎癥在創(chuàng)傷愈合中的缺乏與再生相聯(lián)系，然而炎癥的存在導(dǎo)致一定程度的纖維化和瘢痕形成。此外，延長(zhǎng)的炎癥可導(dǎo)致慢性炎癥，并且當(dāng)涉及到皮膚創(chuàng)傷時(shí)，可導(dǎo)致創(chuàng)傷不能適當(dāng)閉合以及潰瘍。

已表明，表面(topical)施用活化蛋白C(activated protein C，APC)改善皮膚創(chuàng)傷，包括皮膚潰瘍、燒傷、口腔創(chuàng)傷、骨和軟骨損傷、眼部創(chuàng)傷以及華法林相關(guān)的皮膚壞死。根據(jù)WO2002/100445，APC的抗凝和抗炎功能強(qiáng)烈指示，APC可用于治療皮膚創(chuàng)傷，并且特別地可用于治療愈合緩慢的創(chuàng)傷。WO2002/100445還討論了APC介導(dǎo)的明膠酶A-活化功能對(duì)APC介導(dǎo)的創(chuàng)傷修復(fù)是重要的。

除抗凝和抗炎功能之外，還已知APC具有抗凋亡功能。已知抗凋亡功能不依賴于抗凝功能，并且特別地已知，APC之37-環(huán)(37-loop)上的至少3個(gè)賴氨酸殘基是APC介導(dǎo)的因子Va切割所必需的，然而由APC介導(dǎo)的PAR-1活化引起的抗凋亡、細(xì)胞保護(hù)活性不需要這些殘基Mosnier和Griffin 2006Frontiers in Bioscience 112381-2399。

盡管APC的抗炎功能被認(rèn)為是由APC介導(dǎo)的至少EPCR活化和可能PAR-1的活化引起，可能導(dǎo)致白細(xì)胞活化降低、炎性細(xì)胞因子的釋放受到抑制、炎性部位炎性細(xì)胞的外滲降低，但是APC介導(dǎo)之相互作用的機(jī)制(并且特別是抗炎功能所需的相關(guān)APC構(gòu)象位點(diǎn))尚不可知。Mosnier，如上。除APC受體介導(dǎo)的相互作用之外，還已經(jīng)認(rèn)為的是，可以以APC下調(diào)產(chǎn)生凝血途徑之蛋白酶的能力為理由來(lái)充分解釋APC的抗炎活性，從而潛在地將抗炎活性和抗凝活性聯(lián)系起來(lái)。

APC-3K3A是APC的類似物，其中已除去APC的37-環(huán)上與因子Va切割相關(guān)的3個(gè)賴氨酸殘基，使得該類似物能夠提供抗凋亡功能同時(shí)消除抗凝功能。制備該類似物的唯一目的是在涉及凋亡的條件下(包括卒中和神經(jīng)變性疾病(neurodegenerative disorder))提供完全細(xì)胞保護(hù)活性同時(shí)降低出血風(fēng)險(xiǎn)。Mosnier，如上。

仍需要改善皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，特別是需要改善創(chuàng)傷修復(fù)的時(shí)間，需要特別是通過(guò)加速創(chuàng)傷修復(fù)來(lái)提高創(chuàng)傷修復(fù)速率，或者需要改善由創(chuàng)傷修復(fù)產(chǎn)生的組織的質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明試圖解決上文中提及的一項(xiàng)或更多項(xiàng)需求，并且在一個(gè)實(shí)施方案中提供了用于治療皮膚創(chuàng)傷的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而治療皮膚創(chuàng)傷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了減小皮膚創(chuàng)傷的創(chuàng)傷面積或體積的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而減小皮膚創(chuàng)傷的創(chuàng)傷面積或體積。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了加快創(chuàng)傷愈合的速率或者縮短完成創(chuàng)傷愈合或創(chuàng)傷閉合的時(shí)間的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而加快創(chuàng)傷愈合的速率或者縮短完成創(chuàng)傷愈合或創(chuàng)傷閉合的時(shí)間。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在形成創(chuàng)傷之后的前3至7天，優(yōu)選地前3至5天，優(yōu)選地前3天期間加快創(chuàng)傷愈合速率的方法，其包括以下步驟：在創(chuàng)傷形成之后使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而加快創(chuàng)傷愈合的速率。可從形成創(chuàng)傷開(kāi)始在48小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選地在24小時(shí)內(nèi)或者在12小時(shí)內(nèi)使有效量的APC-3K3A與皮膚創(chuàng)傷接觸。通常來(lái)說(shuō)，相對(duì)于未經(jīng)治療的創(chuàng)傷或已經(jīng)用相當(dāng)量APC治療的創(chuàng)傷，創(chuàng)傷愈合的速率加快。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了誘導(dǎo)或促進(jìn)或引發(fā)皮膚創(chuàng)傷中的創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而誘導(dǎo)或促進(jìn)或引發(fā)皮膚創(chuàng)傷中的創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制。在該實(shí)施方案中，所述創(chuàng)傷可以是沒(méi)有或具有最低限度的主動(dòng)創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的慢性創(chuàng)傷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的炎癥最小化的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而使與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的炎癥最小化。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了APC-3K3A在制備用于治療皮膚創(chuàng)傷的藥物中的用途。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了APC-3K3A用于治療皮膚創(chuàng)傷的用途。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療皮膚創(chuàng)傷的APC-3K3A或包含所述APC-3K3A的制劑，其包含有效量的APC-3K3A。

在上述一些實(shí)施方案中，所述創(chuàng)傷通常與顯著的凋亡無(wú)關(guān)。通常來(lái)說(shuō)，所述皮膚創(chuàng)傷不以顯著凋亡為特征或者不由凋亡引起。

在上述一些實(shí)施方案中，通?？上騽?chuàng)傷施用有效量的APC-3K3A，從而使創(chuàng)傷與APC-3K3A接觸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療皮膚創(chuàng)傷的制劑，其中所述制劑包含APC-3K3A。在該實(shí)施方案中，所述制劑適用于表面施用于皮膚創(chuàng)傷。所述制劑可以是凝膠劑、軟膏劑、洗劑或噴霧劑的形式。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了被配制成或適合用于治療或控制皮膚創(chuàng)傷的裝置、個(gè)人護(hù)理物品(personal care article)或敷料(dressing)，其包含用于治療或控制皮膚創(chuàng)傷的有效量的APC-3K3A。在該實(shí)施方案中，APC-3K3A可以以紗布(gauze)、網(wǎng)狀物(mesh)、海綿或繃帶的形式提供。

在上述一些實(shí)施方案中，所述皮膚創(chuàng)傷可以是慢性創(chuàng)傷或急性創(chuàng)傷并且可由撕裂(laceration)、燒傷(burn)、切口(incision)、浸軟(maceration)、壓傷(crushing)、刺傷(puncture)、擦傷(abrasion)或類似損傷引起。

本發(fā)明的另一些方面及前述段落中所述的方面的另一些實(shí)施方案將由以下描述而變得顯而易見(jiàn)，所述描述通過(guò)舉例的方式并且參照附圖給出。

附圖說(shuō)明

圖1.經(jīng)APC、APC-3K3A處理的小鼠中作為原始創(chuàng)傷之百分比的創(chuàng)傷面積減小。

圖2.經(jīng)APC和APC-3K3A處理的小鼠中創(chuàng)傷修復(fù)的改善。

圖3.APC-3K3A具有比APC更大的減小創(chuàng)傷面積的效力。

圖4.與APC相比，APC-3K3A提高創(chuàng)傷愈合的速率。

圖5.與安慰劑相比，APC-3K3A和APC提高創(chuàng)傷愈合的速率。

圖6.APC-3K3A的氨基酸序列。

具體實(shí)施方式

應(yīng)了解，本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)且限定的發(fā)明延伸至所提及的或者由正文或附圖可見(jiàn)的單獨(dú)特征中兩項(xiàng)或更多項(xiàng)的所有替選組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明的多個(gè)替選方面。

如以上所討論的，APC-3K3A是APC的類似物，其中已除去APC之37-環(huán)上與因子Va切割相關(guān)的3個(gè)賴氨酸殘基，使得該類似物能夠提供抗凋亡功能同時(shí)消除抗凝功能。APC-3K3A的序列在圖6中示出。

制備APC-3K3A的唯一目的是在涉及凋亡的條件下(包括卒中和神經(jīng)變性疾病)提供完全細(xì)胞保護(hù)活性同時(shí)降低出血風(fēng)險(xiǎn)。Mosnier，如上。根據(jù)WO2005/007820，設(shè)計(jì)APC-3K3A是為了能夠?qū)⑵溆糜诜乐够驕p輕至少部分地與凋亡有關(guān)的損害，包括在處于至少部分地由凋亡引起的損害多種器官的血管或組織的風(fēng)險(xiǎn)之中的對(duì)象中。還參見(jiàn)WO2008/055145；WO2008/073603；Wang等2012 Stroke 43：2444-2449；和Guo等2009 Eur.J.Neurosci.29：1119-1130。

本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，APC-3K3A可用于改善皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。鑒于凋亡通常不被認(rèn)為是支持皮膚創(chuàng)傷修復(fù)或參與創(chuàng)傷病理學(xué)(包括慢性創(chuàng)傷形成)的細(xì)胞機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)是特別地出人意料的。

該發(fā)現(xiàn)是在以下情況下得到的：在本發(fā)明之前，至少APC的抗凝活性被認(rèn)為與皮膚創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)，并且關(guān)于抗凝功能的消除是否會(huì)影響明膠酶A(Gelatinase A)活性以及APC的抗炎功能是否是修復(fù)皮膚創(chuàng)傷所必需的知之甚少。

本發(fā)明的一個(gè)特別出人意料的發(fā)現(xiàn)是可以利用APC-3K3A來(lái)提供與用APC抗凝功能所觀察到的相比改善的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)響應(yīng)。特別地，如本文中的實(shí)施例中所示，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)切口模型中可使用APC-3K3A來(lái)加快創(chuàng)傷愈合的速率并且縮短創(chuàng)傷愈合的時(shí)間。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療皮膚創(chuàng)傷的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與有效量的APC-3K3A接觸，從而治療皮膚創(chuàng)傷。

在上述方法中，所述個(gè)體可以是處于創(chuàng)傷修復(fù)受損或創(chuàng)傷愈合受損的風(fēng)險(xiǎn)之中的個(gè)體。特別地，所述個(gè)體可以是具有創(chuàng)傷修復(fù)拖延的全身或局部風(fēng)險(xiǎn)因素的個(gè)體。全身風(fēng)險(xiǎn)因素包括全身性感染、代謝綜合征、糖尿病或葡萄糖耐受不良、心血管功能受損。局部風(fēng)險(xiǎn)因素包括與損傷有關(guān)的那些，包括損傷(例如，創(chuàng)傷或燒傷)本身的性質(zhì)；異常炎癥；由運(yùn)動(dòng)所致的反復(fù)物理應(yīng)力(physical stress)；或者對(duì)UV輻射的暴露。

本發(fā)明可包括以下步驟：對(duì)個(gè)體進(jìn)行評(píng)估以確定該個(gè)體或損傷部位是否具有上述創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程受損的一個(gè)或更多個(gè)全身或局部風(fēng)險(xiǎn)因素。通常來(lái)說(shuō)，針對(duì)適用于形成慢性創(chuàng)傷的一個(gè)或更多個(gè)全身或局部風(fēng)險(xiǎn)因素(例如本文中所述的那些)對(duì)個(gè)體進(jìn)行評(píng)估。

當(dāng)評(píng)估個(gè)體為具有創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程受損的一個(gè)或更多個(gè)局部或全身風(fēng)險(xiǎn)因素時(shí)，所述方法還可包括以下步驟：選擇該個(gè)體來(lái)用APC-3K3A進(jìn)行治療以使發(fā)生受損創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的可能性最小化。

通常來(lái)說(shuō)，所述損傷為由對(duì)皮膚(dermal、cutaneous或skin)組織的損害(insult)引起的損傷。所述損害可影響所有的皮膚組織層，例如影響基底層(stratum basale)(生發(fā)層(stratum germinativum))、棘層(stratum spinosum)、顆粒層(stratum granulosum)、透明層(stratum lucidum)。具體損傷的實(shí)例包括撕裂、擦傷、破裂(rupture)、燒傷、挫傷(contusion)、壓迫。

所述損傷可以是燒傷，包括1度、2度或3度燒傷。

通常來(lái)說(shuō)，所述損傷是急性損傷。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷可與慢性炎癥不相關(guān)。

通常來(lái)說(shuō)，所述損傷與纖維化不相關(guān)。

通常來(lái)說(shuō)，損傷不是炎性病癥、變應(yīng)性病癥或者特發(fā)性病癥或疾病。

可在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程已形成纖維蛋白凝塊之前將APC-3K3A施用于組織損傷部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程已形成臨時(shí)基質(zhì)之前將APC-3K3A施用于組織損傷部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程已形成最終基質(zhì)之前將APC-3K3A施用于組織損傷部位。通常來(lái)說(shuō)，在大約形成臨時(shí)基質(zhì)時(shí)或者之后不久施用APC-3K3A。

通常來(lái)說(shuō)，用APC-3K3A治療個(gè)體以提供在組織損傷的約3至4周內(nèi)完成創(chuàng)傷修復(fù)。

盡管有前述內(nèi)容，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，APC-3K3A的劑量可因以下而不同：待治療的疾病或病癥；疾病或病癥的嚴(yán)重程度；局部施用的類型；化合物的排泄速率；治療的持續(xù)時(shí)間；施用于動(dòng)物的任何其他藥物的特性(identify)；動(dòng)物的年齡、大小和物種，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已知的類似因素。一般來(lái)說(shuō)，化合物或化合物組合的合適日劑量是有效地產(chǎn)生治療效果的最低劑量的量。施用的劑量、劑型和方式可由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)確定。用于多種化合物及化合物組合的施用有效劑量、劑型和方式可憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，并且作出這樣的決定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，重要的是提供APC-3K3A以使得APC-3K3A能夠如本文中所述與組織損傷部位的皮膚細(xì)胞接觸；盡管不希望受假設(shè)的限制，但是認(rèn)為：通過(guò)這一接觸，APC-3K3A提供創(chuàng)傷愈合的改善。一般來(lái)說(shuō)，已與APC-3K3A接觸的那些細(xì)胞可通過(guò)具有以下特征來(lái)識(shí)別：增殖提高且凋亡降低；胱天蛋白酶-3降低；蛋白酶活化受體1、2或3活化；NF-kB活化降低；信號(hào)傳導(dǎo)分子p38的活化降低；TNF分泌降低；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2蛋白和活化提高；MMP-9降低；鞘氨醇-1-磷酸提高；血管生成素(angiopoietin，Ang)1提高且Ang 2降低；Tie2活化提高；信號(hào)傳導(dǎo)分子Akt活化。因此，細(xì)胞與APC或APC-3K3A的接觸以及因此治療的治療效果可通過(guò)評(píng)估這些細(xì)胞表型來(lái)確定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的APC-3K3A可在個(gè)體中防止或抑制病理性瘢痕的形成。這一結(jié)果可通過(guò)下文中所討論的定性或定量測(cè)量來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

在某些實(shí)施方案中，APC-3K3A的治療有效量為：每cm²施用APC-3K3A的皮膚區(qū)域0.1μg至5000μg APC-3K3A，或者每cm²施用APC-3K3A的皮膚區(qū)域1μg至2000μg APC-3K3A，或者每cm²施用APC-3K3A的皮膚區(qū)域10μg至1000μg APC-3K3A，或者每cm²施用APC-3K3A的皮膚區(qū)域10μg至200μg、或10μg至400μg、或10μg至800μg APC-3K3A。

基于組織損傷的性質(zhì)，APC-3K3A可每周一次地高至每日兩次地施用。一般提供持續(xù)不超過(guò)20周的連續(xù)日或者不超過(guò)6周的連續(xù)日。

當(dāng)相關(guān)皮膚區(qū)域?yàn)榘屏哑つw表面的皮膚區(qū)域時(shí)，例如使用糊劑(paste)、凝膠劑、乳膏劑、油劑(oil)、洗劑、泡沫劑、軟膏劑或類似物質(zhì)的表面治療方法特別有用，因?yàn)檫@允許APC-3K3A滲透至成纖維細(xì)胞所駐留的相關(guān)皮膚組織層。

在一個(gè)實(shí)施方案中，APC-3K3A的治療有效量可以是每cm²皮膚區(qū)域0.1μg至2000μg，優(yōu)選20μg至200μg APC-3K3A。當(dāng)皮膚受到較為嚴(yán)重的影響時(shí)，或者當(dāng)個(gè)體由于存在上述創(chuàng)傷修復(fù)受損的局部或全身因素而特別處于風(fēng)險(xiǎn)之中時(shí)，一般優(yōu)選較高的量。當(dāng)皮膚未受到嚴(yán)重影響時(shí)，可優(yōu)選較低的量。

制劑中APC-3K3A的濃度可以是約10g/ml至1mg/ml，并且施用于皮膚區(qū)域的組合物體積為約100l至10ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于創(chuàng)傷愈合或修復(fù)之包含APC-3K3A作為活性組分的制劑包含約200至600μg APC-3K3A，優(yōu)選地約200至250μg APC-3K3A，更優(yōu)選地250μg APC-3K3A或500μg APC-3K3A。認(rèn)為該量的APC-3K3A提供一般與用單獨(dú)APC所觀察到的相比更大的創(chuàng)傷愈合加速，特別是當(dāng)創(chuàng)傷面積小于20cm²時(shí)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療皮膚創(chuàng)傷的這樣的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與約200至600μg APC-3K3A，優(yōu)選地約200至250μg APC-3K3A，更優(yōu)選地250μg APC-3K3A或500μg APC-3K3A接觸，從而治療皮膚創(chuàng)傷。當(dāng)創(chuàng)傷面積大于20cm²時(shí)，需要更大量的APC-3K3A，特別地約600至1000μg APC-3K3A，優(yōu)選地約800至1000μg APC-3K3A。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于治療皮膚創(chuàng)傷的這樣的方法，其包括以下步驟：使皮膚創(chuàng)傷與約600至1000μg APC-3K3A，優(yōu)選地約800至1000μg APC-3K3A接觸。在這些實(shí)施方案中，制劑可以以適于表面或腸胃外施用的形式提供。

組合物可一般用無(wú)菌表面(例如手指或抹刀(spatula))以不超過(guò)約10mm厚，優(yōu)選約3mm厚的層提供至皮膚。然后，可將組合物摩擦或按摩到皮膚區(qū)域和周?chē)鷧^(qū)域中。所述施用一般為每天一次至每周一次，并且一般不長(zhǎng)于20周或者不長(zhǎng)于12周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可將包含APC-3K3A的組合物施加至固體基質(zhì)，即繃帶、敷料等，然后將基質(zhì)固定至相關(guān)皮膚區(qū)域。

在某些實(shí)施方案中，上述結(jié)果通過(guò)建立至少2倍高于APC基線的局部濃度的APC-3K3A來(lái)獲得。APC-3K3A和APC的這一量可如上所述通過(guò)使用ELISA和顯色底物Spectrozyme PCa測(cè)定測(cè)量皮膚活檢的APC-3K3A和APC活性來(lái)測(cè)量。當(dāng)角質(zhì)層完整并且具有APC-3K3A穿過(guò)皮膚層的滲透受到限制這樣的性質(zhì)時(shí)，一般優(yōu)選皮內(nèi)或皮下注射作為施用途徑。一般來(lái)說(shuō)，可使用0.3至1ml注射器上針頭(約28至34G)中的細(xì)小規(guī)格針頭。可以以每cm²約1次注射來(lái)給予多次注射以覆蓋皮膚的表面積。每次注射的量可以是10μl至1ml不等，通常量為50μl。一般來(lái)說(shuō)，施用以每天一次至每周一次，并且一般不長(zhǎng)于20周來(lái)給予。皮內(nèi)或皮下注射可與APC-3K3A的表面施用同時(shí)使用。

用于本文中所述的方法或產(chǎn)品的APC-3K3A可通過(guò)如WO2005/007820所述的方法來(lái)產(chǎn)生。此外，APC-3K3A可從ZZ Biotech獲得。APC-3K3A的氨基酸序列在圖6中示出。

在某些實(shí)施方案中，APC-3K3A可引入修飾(例如，氨基酸替換、缺失和異源氨基酸序列的添加)，從而形成可例如增強(qiáng)相應(yīng)蛋白質(zhì)的生物活性或表達(dá)的APC-3K3A類似物。例如，APC-AK3A類似物可包含對(duì)應(yīng)于APC之鈣環(huán)的RR229/230AA突變、對(duì)應(yīng)于APC之自溶環(huán)(autolysis loop)的RR306/312AA突變或者對(duì)應(yīng)于APC之自溶環(huán)的RKRR306/314AAAA。與天然APC的活性相比，APC類似物的這些實(shí)例均具有降低的抗凝活性。然而，就與EPCR和PAR-1或PAR-3結(jié)合而言，其均具有相關(guān)的APC功能。

APC-3K3A類似物一般具有與人蛋白C序列同源的序列。序列對(duì)之間的同一性百分比可通過(guò)在BESTFIT計(jì)算機(jī)程序中執(zhí)行的算法來(lái)計(jì)算(Smith&Waterman.J.Mol.Biol.147：195-197，1981；Pearson，Genomics11：635-650，1991)。計(jì)算序列趨異度的另一種算法已適應(yīng)于快速數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并且在BLAST計(jì)算機(jī)程序中執(zhí)行(Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389-3402，1997)。與人序列相比，蛋白C多核苷酸或多肽在氨基酸水平上可具有僅約60％同一性、70％或更高同一性、80％或更高同一性、90％或更高同一性、95％或更高同一性、97％或更高同一性或者大于99％同一性。

在進(jìn)行比對(duì)時(shí)，還可將保守氨基酸替換(例如，Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/Lys、Gln/Asn)考慮在內(nèi)，因?yàn)轭A(yù)期這些氨基酸殘基對(duì)的化學(xué)相似性在很多情況下產(chǎn)生功能等同性。預(yù)期保留多肽的生物功能的氨基酸替換可保留所替換氨基酸殘基的化學(xué)屬性，例如疏水性、親水性、側(cè)鏈電荷或大小。與人序列相比，蛋白C多肽可具有僅約80％或更高相似性、90％或更高相似性、95％或更高相似性、97％或更高相似性、99％或更高相似性或者約100％相似性。功能等同性或生物功能保留可通過(guò)用于結(jié)構(gòu)確定和生物測(cè)定的方法來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

還可通過(guò)采納宿主的密碼子偏愛(ài)性來(lái)改變所使用的密碼子以適用于在異源宿主中翻譯。這無(wú)需顯著改變多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)即可適應(yīng)異源宿主的翻譯機(jī)構(gòu)(translational machinery)。

還可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法對(duì)APC-3K3A進(jìn)行糖基化，并且所述方法可包括酶促和非酶促方式。

在不存在二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息下，可基于肽序列使用本領(lǐng)域中用于設(shè)計(jì)肽模擬物的公知方法來(lái)設(shè)計(jì)合適的APC-3K3A模擬化合物(即，模擬APC-3K3A的功能的化合物)。例如，可如下產(chǎn)生肽模擬化合物：對(duì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾以提高肽的限定區(qū)域的疏水性(例如，用甲基取代肽的芳族殘基上的氫)、用非氨基酸側(cè)鏈取代氨基酸側(cè)鏈(例如，用其他芳基取代肽的芳族殘基)和用多種取代基取代氨基和/或羧基末端(例如，用脂族基團(tuán)取代以提高疏水性)。

或者，模擬化合物可以是所謂的類肽(peptoid)(即，非肽)，其包含對(duì)肽骨架的修飾(即，通過(guò)例如用碳原子取代骨架中的氮原子來(lái)引入酰胺鍵替代物)，或者包含N-取代的甘氨酸殘基、一個(gè)或更多個(gè)D-氨基酸(替代L氨基酸)和/或一個(gè)或更多個(gè)α-氨基酸(替代β-氨基酸或γ-氨基酸)。另一些模擬化合物替代物包括“反向倒置肽(retro-inverso peptide)”，其中將肽鍵倒置并且在其所基于的肽序列中將D-氨基酸以相對(duì)于L-氨基酸順序的相反順序組裝；以及其他非肽構(gòu)架，例如甾族化合物(steroid)、糖類、苯并氮雜基(benzazepinel)、3，4-三取代的吡咯烷酮、吡啶酮和吡啶并吡嗪。合適的模擬化合物還可通過(guò)結(jié)構(gòu)建模/確定、通過(guò)篩選天然產(chǎn)物、產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)、最少化蛋白質(zhì)、SELEX(適配體)選擇、組合文庫(kù)和集中組合文庫(kù)、虛擬篩選/數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及本領(lǐng)域中公知的合理藥物設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)/鑒定。

APC-3K3A的合適藥物組合物包含APC-3K3A和可藥用載體。包含APC-3K3A的組合物一般可以是這樣的組合物，其為包含填充劑(bulking agent)(例如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖和棉子糖)、鹽(例如，氯化鈉和氯化鉀)、緩沖劑(例如，檸檬酸鈉、Tris-乙酸鹽和磷酸鈉)和APC-3K3A的高純度的穩(wěn)定凍干產(chǎn)品。例如，穩(wěn)定的凍干組合物可包含重量比為約1份APC-3K3A、約7至8份鹽和約5至7份填充劑。這樣的穩(wěn)定凍干組合物的一個(gè)實(shí)例是每小瓶5.0mg APC、30mg蔗糖、38mg NaCl和7.56mg檸檬酸鹽，pH 6.0。

可通過(guò)篩選在已建立動(dòng)物模型中的相關(guān)效力來(lái)測(cè)試APC-3K3A及APC-3K3A類似物的多種重組形式和合成形式在治療病理性瘢痕(pathologic scar)中的用途，所述動(dòng)物模型的實(shí)例在下文中進(jìn)行描述。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本文中所述的方法，以適于表面施用于相關(guān)組織損傷部位的組合物或制劑的形式提供APC-3K3A。這樣的制劑的實(shí)例包括可直接施用至相關(guān)表面使得能夠?qū)PC-3K3A局部施用于相關(guān)部位的那些制劑。這些制劑包括凝膠劑、油劑、噴霧劑、走珠型制劑(roll on formulation)、軟膏劑、洗劑、泡沫劑等。在一個(gè)實(shí)施方案中，APC-3K3A以甲基纖維素凝膠劑的形式提供，并且可包含穩(wěn)定劑，例如碳水化合物和鹽。

皮膚軟膏劑可以是有機(jī)成分、保健成分、美容成分或藥物成分通常在石油油料基質(zhì)(petroleum oil base)中的組合。這提供了皮膚軟膏劑在身體表面上保留較長(zhǎng)時(shí)間使得成分可更有效地起作用以治療廣泛多種問(wèn)題的較稠的、水溶性較低的配方。有很多天然和有機(jī)皮膚乳膏劑可從公司(例如Therapex)訂購(gòu)。

還可使用丙酸氯倍他索(clobetasol propionate，CP)泡沫劑(0.05％)。這是乳劑型氣霧泡沫劑，其已在美國(guó)用于治療皮質(zhì)類固醇響應(yīng)性皮膚病的炎性和瘙癢表現(xiàn)，并且已在加拿大用于治療中度到重度特應(yīng)性皮炎的炎性和瘙癢表現(xiàn)(Olux-E(丙酸氯倍他索)泡沫劑，0.05％Stiefel Laboratories Inc，Research Triangle Park，NC(2011))。

當(dāng)所述制劑是凝膠劑時(shí)，其可包含10至5000μg/g凝膠劑的量的APC-3K3A。

可提供APC-3K3A的可注射制劑作為用于靜脈內(nèi)輸注的無(wú)菌凍干粉末，所述可注射制劑包含APC-3K3A、蔗糖、NaCl和檸檬酸鈉?？蓪⑿∑?vial)用注射用無(wú)菌水(USP)重構(gòu)以得到濃度為約2mg/ml的APC-3K3A，然后，向該經(jīng)稀釋的APC-3K3A添加約0.9％氯化鈉注射劑得到濃度為約100至約500μg/ml的APC-3K3A以用于向患者施用。這是通過(guò)皮下注射來(lái)施用APC-3K3A特別優(yōu)選的制劑。

實(shí)施例

實(shí)施例1APC-3K3A促進(jìn)體內(nèi)切口模型中的創(chuàng)傷修復(fù)

材料和方法

當(dāng)開(kāi)始致傷方案(wounding protocol)時(shí)C57BL/6J小鼠的年齡為7至8周。小鼠從Kearns Facility，Kolling Medical Research Institute獲得并且在22℃下以12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)飼養(yǎng)于此。

在小鼠的背部上，使用虹膜剪制備全層皮膚創(chuàng)傷(full-thickness skin wound)并使用無(wú)菌的6-mm穿孔活檢工具來(lái)顯示樣式(pattern)。

在連續(xù)前3天，每天一次地將重組(r)3K3A-APC、rAPC或磷酸緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)對(duì)照注射到皮膚創(chuàng)傷內(nèi)外周周?chē)?個(gè)點(diǎn)(每點(diǎn)接受10μl)并向創(chuàng)傷表面添加10μl。

然后，使動(dòng)物在麻醉下保持15分鐘以允許溶液被吸收。使創(chuàng)傷保持敞開(kāi)并將動(dòng)物飼養(yǎng)在單獨(dú)的籠中。

如下監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷愈合：拍攝數(shù)碼照片并通過(guò)用細(xì)尖頭記號(hào)筆(thin tipped marker)在無(wú)菌的Visitrak Grid 6上追蹤創(chuàng)傷的周界(perimeter)來(lái)盲態(tài)地測(cè)量創(chuàng)傷面積。然后，掃描描記圖以獲得創(chuàng)傷面積的數(shù)字讀數(shù)。

所有的操作均是按照地方動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)(local animal care and ethics committee)的指南進(jìn)行的。

結(jié)果和討論

圖1和圖2：結(jié)果作為平均值±SE示出。對(duì)于PBS、10μg r3K3A-APC和10μg rAPC：創(chuàng)傷數(shù)量＝12、小鼠數(shù)量＝6。對(duì)于其他濃度：創(chuàng)傷數(shù)量＝6、小鼠數(shù)量＝3。P＜0.01，PBS相對(duì)于r3K3A-APC 10μg。P＜0.01，r3K3A-APC10μg相對(duì)于rAPC 10μg(重復(fù)測(cè)量ANOVA)?？偠灾谠撗芯恐衦3K3A-APC的最佳劑量為10μg。數(shù)據(jù)表明：與PBS對(duì)照相比，r3K3A-APC增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合。而且，與rAPC相比，r3K3A-APC增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合。

在早期的時(shí)間點(diǎn)，10μg3K3A和PBS之間存在顯著的差異，在第2天、第3天和第4天，P＜0.01。在10μg APC和10μg3K3A之間觀察到類似的差異。10μg3K3A相對(duì)于PBS的提高％在第2天、第3天和第4天分別為28％、23％和30％。10μg3K3A相對(duì)于10μg APC的提高％在第2天、第3天和第4天分別為24％、29％和36％。特別是在早期階段創(chuàng)傷愈合得越快，發(fā)生組織再生(而不是僅修復(fù))的可能性越大。再生通常是指與原始組織相同的新組織，而修復(fù)與瘢痕形成有關(guān)(Min，Su；Wang，SongW.；Orr，William(2006)."Graphic general pathology：2.2completeregeneration：".Pathology.pathol.med.stu.edu.cn.Retrieved 2012-12-07)。在創(chuàng)傷愈合期間，前幾天是再生的關(guān)鍵時(shí)期一愈合得越慢，發(fā)生瘢痕形成的可能性越高(Ferguson MW1，O′Kane S；Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2004May 29；359(1445)：839-50.Scar-free healing：from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention)。(Profyris C，Tziotzios C and Do Vale I.Cutaneous scarring：Pathophysiology，molecular mechanisms，and scar reduction therapeutics Part I.The molecular basis of scar formation.J Am Acad Dermatol 2012；66：1-10)。因此，與用10μg APC或PBS進(jìn)行處理相比，由10μg3K3A在早期時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的顯著改善更可能導(dǎo)致期望的無(wú)瘢痕愈合。該早期推力提供了加速血管發(fā)生、肉芽組織形成、上皮形成和基質(zhì)重組(matrix reorganisation)的動(dòng)力。相對(duì)于正常愈合(對(duì)照)和用10μg APC進(jìn)行處理，這提供了切實(shí)的優(yōu)勢(shì)。

與10μg3K3A相比，用30μg3K3A進(jìn)行處理顯示出較慢的愈合。該類型的響應(yīng)在生物藥物研究中并非不常見(jiàn)。一種解釋是3K3A受體變得飽和并且發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)反饋機(jī)制，其中細(xì)胞內(nèi)信使發(fā)送生化信號(hào)以可能通過(guò)影響3K3A受體來(lái)阻止3K3A的作用。該效應(yīng)的先例可見(jiàn)于APC對(duì)在體外的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和創(chuàng)傷閉合的作用(Xue M，Thompson P，Kelso I，Jackson C.Exp Cell Res.2004年9月10日；299(1)：119-27.Activated protein C stimulates proliferation，migration and wound closure，inhibits apoptosis and upregulates MMP-2activity in cultured human keratinocytes)。對(duì)APC沒(méi)有觀察到這樣的反饋機(jī)制，因?yàn)?0μg APC具有比10μg APC更強(qiáng)的效果(p＜0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，10μg的APC尚未達(dá)到其峰值，而10μg3K3A已經(jīng)達(dá)峰，表明作為用于創(chuàng)傷愈合的治療性藥物3K3A比APC更有效。總之，以上數(shù)據(jù)表明3K3A與APC不同并且與APC相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖3：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，當(dāng)與對(duì)照(ANOVA，Bnferonni’s)相比時(shí)。在第8天和第9天，10μg和30μg的r3K3A-APC二者均增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合，然而對(duì)于rAPC，僅較高的濃度(30μg)是有效的。在第9天，10μgr3K3A-APC和10μg rAPC之間存在顯著差異。

圖4：P＜0.01，3K3A-APC(n＝12)10μg相對(duì)于PBS(n＝12)；P＜0.05，3K3A-APC 10μg(n＝12)相對(duì)于rAPC 10μg(n＝12)。在rAPC 10μg與PBS之間不存在差異(p＝0.064)(使用Kaplan-Meier和對(duì)數(shù)秩分析(log rank analysis))?？偠灾?0μg的3K3A-APC比安慰劑或rAPC(10μg)更快地完全愈合創(chuàng)傷。

圖5：P＜0.05，rAPC 30μg(n＝6)相對(duì)于PBS(n＝12)。P＜0.05，3k3A-APC 30μg(n＝6)相對(duì)于PBS(n＝12)。在rAPC 30μg和3k3A APC30μg之間不存在差異(使用Kaplan-Meier和對(duì)數(shù)秩分析)?？偠灾?，在30μg時(shí)，3K3A-APC和rAPC二者都比安慰劑更快地完全愈合創(chuàng)傷。