發(fā)明背景納米顆粒已被研究作為藥物遞送系統(tǒng)，特別是作為用于將藥物靶向至患者內(nèi)的特定作用部位的可能持續(xù)釋放系統(tǒng)。術(shù)語“納米顆?！蓖ǔＳ糜谥付ň哂屑{米范圍內(nèi)的直徑的基于聚合物的顆粒。納米顆粒包括不同結(jié)構(gòu)的顆粒，諸如納米球和納米膠囊。在過去三十年中已經(jīng)研究了基于生物相容和生物可降解的聚合物諸如聚(氰基丙烯酸烷基酯)的納米顆粒，并且其對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用特別感興趣(參考Couvreur等人,JPharmPharmacol,1979,31:331-332;Vauthier等人,Adv.DrugDeliv.Rev.2003,55:519-548)。它們可以通過細(xì)乳液聚合制備(參考，例如，Reimold等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2008,70:627-632;Vauthier等人,Adv.DrugDeliv.Rev.2003,55:519-548)，并且它們的表面可以以允許納米顆粒累積于特定目標(biāo)器官或組織中的不同方式修飾(參考Vauthier等人,Adv.DrugDeliv.Rev.2003,55:519-548)。例如，已經(jīng)描述了抗體與納米顆粒表面的附接(參考，例如，Hasadsri等人,JBioChem,2009,284:6972-6981)。此外，已顯示用聚山梨醇酯80包被的納米顆粒將通常不能穿過血腦屏障的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通過該屏障(參考WO2007/088066;Kreuter等人,J.DrugTarget.2002,10(4):317-325;Reimold等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2008,70:627-632)。盡管納米顆粒領(lǐng)域中存在充分研究，但關(guān)于通過并入納米球的聚合物基質(zhì)而包封抗體知之甚少?？贵w是具有巨大治療潛力的相對大分子(對于IgG，~150kDa)。由于它們的尺寸，抗體通常不能穿過生物屏障，諸如血腦屏障。此外，蛋白諸如抗體可能對環(huán)境諸如人體中的蛋白水解降解敏感。因此，期望提供用于抗體和其他抗原結(jié)合分子的遞送系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明顯示如何將抗原結(jié)合分子諸如抗體并入納米球的聚合物基質(zhì)中，同時(shí)保持其抗原結(jié)合和生物活性。由此包封的抗原結(jié)合分子被保護(hù)免于酶促降解，并且納米球的表面保持游離用于進(jìn)一步修飾，諸如通過靶向分子或增加納米球在受試者體內(nèi)的半衰期的分子的進(jìn)一步修飾。因此，本發(fā)明提供納米球，其包含：a)由一種或多于一種聚合物形成的聚合物基質(zhì)，所述聚合物包含選自氰基丙烯酸C1-C10-烷基酯類和氰基丙烯酸C1-C6-烷氧基-C1-C10-烷基酯類中的一種或多于一種的主要單體組分；和b)一種或多于一種抗原結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合分子包含至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述一種或多于一種抗原結(jié)合分子被酯酶可釋放地并入所述聚合物基質(zhì)中。本發(fā)明進(jìn)一步提供多個(gè)如本文所述的納米球，所述納米球具有0.5或更小的多分散性和300nm或更小的平均直徑，如通過光子關(guān)聯(lián)光譜法所測定。本發(fā)明還提供制備納米球的方法，所述方法包括：i)提供疏水性液相，其包含一種或多于一種可聚合單體，所述可聚合單體選自氰基丙烯酸C1-C10-烷基酯類和氰基丙烯酸C1-C6-烷氧基-C1-C10-烷基酯類；ii)將所述疏水性液相精細(xì)地分散于親水性液相中以形成乳液，所述乳液的pH為4.0或更??；iii)將所述乳液的pH增加至4.0-6.0的范圍內(nèi)的值，以加速所述可聚合單體的聚合；iv)然后，添加一種或多于一種抗原結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合分子包含至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和v)最后，通過將pH進(jìn)一步增加至不超過pH8.0的值而允許繼續(xù)聚合；由此形成納米球的懸浮液，其中所述一種或多于一種抗原結(jié)合分子被并入通過所述可聚合單體的聚合形成的聚合物基質(zhì)中。本發(fā)明還提供包含多個(gè)如本文所述的納米球和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。附圖簡述圖1A顯示如實(shí)施例1中所述制備的PBCA和PECA納米球的懸浮液的平均粒徑(Z-平均直徑，柱)和多分散性(PDI，點(diǎn))。使用Zetasizer裝置進(jìn)行測量。懸浮液的透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示于圖1B中。圖2顯示如實(shí)施例4中所述在未純化、抗RGMamab負(fù)載的酯酶處理的納米球(“游離+包封的”)，純化、抗RGMamab負(fù)載的酯酶處理的納米球(“包封的”)，無抗RGMamab的酯酶處理的納米球(“空NP”)和僅酯酶(“酯酶”)的不同稀釋液存在的情況下在熒光素酶報(bào)道基因測定中測量的以發(fā)光值表示的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)信號(hào)傳導(dǎo)。圖3顯示納米球樣品的平均發(fā)光值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其從圖2中描繪的稀釋液4-6的發(fā)光值計(jì)算。將對于“空NP”測量的平均發(fā)光均一化為100％。圖4顯示如實(shí)施例6中所述制備的PBCA-山羊IgG納米顆粒懸浮液的平均粒徑(測定為z-平均直徑)和多分散性值(PDI)。使用Zetasizer裝置測定尺寸和PDI值。發(fā)明詳述納米球是具有納米范圍內(nèi)(即，幾納米至幾百納米之間)的直徑的固體亞微米顆粒，其包含聚合物基質(zhì)，其中可以并入(例如溶解或分散)其他組分，諸如貨物分子(例如抗原結(jié)合分子)。本發(fā)明的納米球可以具有300nm或更小、特別是200nm或更小、諸如20-300nm的范圍內(nèi)或優(yōu)選50-200nm的范圍內(nèi)的尺寸。除非另有指明，否則術(shù)語“尺寸”和“直徑”當(dāng)指基本上圓形物體諸如納米顆粒(例如納米球或納米膠囊)或液微滴時(shí)，可互換使用。(例如)通過光子關(guān)聯(lián)光譜法(PCS)和累積分析根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射的國際標(biāo)準(zhǔn)ISO13321(1996)和ISO22412(2008)(其得到平均直徑(z-平均直徑)和分布寬度的估計(jì)值(PDI))，(例如)使用Zetasizer裝置(MalvernInstruments,Germany；軟件版本“NanoZS”)，可以測定納米顆粒制備物的尺寸和多分散指數(shù)(PDI)。術(shù)語“約”在本文使用的上下文中是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的。具體而言，“約”意指±20％、±10％、優(yōu)選±5％、更優(yōu)選±1％、仍更優(yōu)選±0.1％的變化。本發(fā)明的納米球的聚合物基質(zhì)由一種或多于一種聚合物形成。形成基質(zhì)的聚合物的主要單體組分選自氰基丙烯酸C1-C10-烷基酯類(諸如氰基丙烯酸C1-C8-烷基酯類)和氰基丙烯酸C1-C6-烷氧基-C1-C10-烷基酯類(諸如氰基丙烯酸C1-C3-烷氧基-C1-C3-烷基酯類)中的一種或多于一種。例如，成殼聚合物(shell-formingpolymers)的主要單體組分選自2-氰基丙烯酸甲酯、2-氰基丙烯酸2-甲氧基乙酯、2-氰基丙烯酸乙酯、2-氰基丙烯酸正丁酯、2-氰基丙烯酸2-辛酯和2-氰基丙烯酸異丁酯中的一種或多于一種，優(yōu)選選自2-氰基丙烯酸乙酯和2-氰基丙烯酸正丁酯。如本文所使用的術(shù)語“聚合物基質(zhì)”描述由一種或多于一種聚合物形成的三維固體。其他成分，諸如例如小分子藥物和大分子藥物，諸如多肽，例如，抗體和抗原結(jié)合片段，其二聚體和多聚體或綴合物，可以并入，諸如溶解或分散于此類聚合物基質(zhì)中。如本文中用于表征聚合物的術(shù)語“主要單體組分”是指構(gòu)成所述聚合物的至少80wt-%、至少90wt-%、至少95wt-%、至少98wt-%、優(yōu)選至少99wt-%和最多達(dá)100wt-%的單體組分。形成本發(fā)明納米球的基質(zhì)的合適的聚合物包括，但不限于，聚(2-氰基丙烯酸甲酯)、聚(2-氰基丙烯酸2-甲氧基乙酯)、聚(2-氰基丙烯酸乙酯)、聚(2-氰基丙烯酸正丁酯)、聚(2-氰基丙烯酸2-辛酯)、聚(2-氰基丙烯酸異丁酯)及其混合物，其中聚(2-氰基丙烯酸正丁酯)、聚(2-氰基丙烯酸乙酯)及其混合物是優(yōu)選的。形成基質(zhì)的聚合物的重均分子量通常在1,000至10,000,000g/mol、例如5,000至5,000,000g/mol或10,000至1,000,000g/mol的范圍內(nèi)。本發(fā)明的納米球適合于遞送抗原結(jié)合分子。本發(fā)明的納米球保護(hù)抗原結(jié)合分子在至目標(biāo)部位(例如，目標(biāo)細(xì)胞)的途中免于蛋白水解和其他酶的降解和/或修飾，并因此免于其生物(例如藥物)活性的喪失。因此，本發(fā)明也特別可用于包封對此類酶促降解和/或修飾敏感的抗原結(jié)合分子，特別是如果通過口服途徑施用。如本文所使用的術(shù)語“抗原結(jié)合分子”是指抗體、其抗原結(jié)合片段、包含抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的分子以及抗體模擬物?？乖Y(jié)合分子通常具有至少20kDa、特別是至少40kDa、例如20-350kDa或40-310kDa的分子量。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的納米球中的抗原結(jié)合分子包含至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或具有免疫球蛋白樣折疊的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的納米球包含的抗原結(jié)合分子可以是多克隆或單克隆抗體，其中單克隆抗體是優(yōu)選的。抗體可以是天然存在的抗體或其遺傳工程改造的變體?？贵w可以選自禽類(例如雞)抗體和哺乳動(dòng)物抗體(例如人、鼠、大鼠或食蟹猴抗體)，其中人抗體是優(yōu)選的。抗體可以是嵌合的，諸如例如通過用相應(yīng)的人抗體區(qū)域交換非抗原結(jié)合區(qū)域的部分或全部而衍生自鼠抗體的嵌合抗體。當(dāng)抗體是哺乳動(dòng)物抗體時(shí)，其可以屬于幾種主要類型之一，包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和重鏈抗體(如在駱駝科中所發(fā)現(xiàn))。如果是哺乳動(dòng)物抗體，則IgG(丙種球蛋白)是優(yōu)選的類型，因?yàn)樗鼈兪遣溉閯?dòng)物中最常見的抗體，被Fcγ受體特異性識(shí)別并且通?？梢匀菀椎卦隗w外制備。當(dāng)抗體是IgG時(shí)，其可以屬于幾種同種型之一，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4?？贵w可以(例如)經(jīng)由免疫動(dòng)物經(jīng)由雜交瘤技術(shù)或重組方法來制備。本發(fā)明的納米球包含的抗原結(jié)合分子可以是抗體的抗原結(jié)合片段，諸如，例如Fab、F(ab)2和Fv片段。本發(fā)明的納米球包含的抗原結(jié)合分子可以是具有抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的分子，其可以選自，但不限于，抗體的二聚體和多聚體；雙特異性抗體；單鏈Fv片段(scFv)和二硫鍵偶聯(lián)的Fv片段(dsFv)。本發(fā)明的納米球包含的抗原結(jié)合分子也可以是抗體模擬物。如本文所使用的術(shù)語“抗體模擬物”是指能夠特異性結(jié)合抗原、但在結(jié)構(gòu)上與抗體無關(guān)的人工多肽或蛋白。例如，此類多肽和蛋白可以基于支架，諸如蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域(即親和體(affibodies))，γ-B晶體(即affilins)，泛素(即affitins)，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipcalin)(即anticalins)，膜受體的結(jié)構(gòu)域(即親合體(avimers))，錨蛋白重復(fù)基序(即DARPins)，纖連蛋白(fibrection)的第10個(gè)III型結(jié)構(gòu)域(即單價(jià)抗體)。術(shù)語“抗體模擬物”還包括此類多肽或蛋白的二聚體和多聚體。術(shù)語“抗原結(jié)合分子”還包括抗體或包含抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的另一分子或抗體模擬物與(例如)至少一個(gè)可檢測部分(例如熒光團(tuán)或酶)或大分子諸如PEG或血清蛋白(例如BSA)的綴合物。本發(fā)明的納米球可以包含相對于納米球的形成基質(zhì)的聚合物和抗原結(jié)合分子的總重量的至少0.5wt-%、特別是至少5wt-%、優(yōu)選至少10wt-%、更優(yōu)選至少15wt-%的抗原結(jié)合分子。抗原結(jié)合分子的量相對于形成基質(zhì)的聚合物和抗原結(jié)合分子的總重量可以為高達(dá)10wt-%，高達(dá)15wt-%，高達(dá)20wt-%或更多?？乖Y(jié)合分子被酯酶可釋放地并入本發(fā)明的納米球的聚合物基質(zhì)中。術(shù)語“酯酶可釋放地”意味著抗原結(jié)合分子可以通過酯酶的催化活性從納米顆粒釋放。酯酶可以催化聚合物(諸如本文所述的形成基質(zhì)的聚合物)的烷基或烷氧基烷基側(cè)鏈的水解，其中釋放烷醇或烷氧基烷醇。據(jù)信聚合物通過酯酶的作用變?yōu)樗苄?，使得抗原結(jié)合分子可以通過含水液體諸如體液浸出。“并入聚合物基質(zhì)中”意味著抗原結(jié)合分子可以溶解或分散于聚合物基質(zhì)中。短語“并入納米球的聚合物基質(zhì)中”和“包封于納米球中”在本文中可互換使用。同樣，術(shù)語[將抗原結(jié)合分子]“包封”[于本發(fā)明的納米球中]是指將抗原結(jié)合分子并入納米球的聚合物基質(zhì)中。相比之下，僅附接至納米球的表面的分子(諸如抗體)不被納米球的聚合物基質(zhì)“包封”或“并入”納米球的聚合物基質(zhì)。有利地，包封于本發(fā)明的納米球中的抗原結(jié)合分子保留相當(dāng)大比例的其原始抗原結(jié)合和生物活性。包封于本發(fā)明的納米球中的抗原結(jié)合分子的至少20％、特別是至少30％、優(yōu)選至少40％和最多達(dá)45％或更多仍然能夠在從納米球釋放后與其抗原結(jié)合。同樣，包封于本發(fā)明的納米球中的抗原結(jié)合分子可以保留其原始生物(例如藥物)活性的至少20％、特別是至少30％、優(yōu)選至少40％和最多達(dá)45％或更多。術(shù)語“生物活性”是指化合物(諸如抗原結(jié)合分子)對生物系統(tǒng)(諸如細(xì)胞、組織或生物體)的作用。生物活性可以通過檢查受生物活性化合物影響的過程(諸如，例如，特定(報(bào)道)基因的表達(dá)、作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一部分的蛋白的磷酸化、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖)來測定。用于測量化合物的生物活性及其與特定抗原的結(jié)合的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。此類方法的實(shí)例包括，但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和流式細(xì)胞術(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供如本文所述的就尺寸而言具有相對高均一性的多個(gè)納米球。具體而言，用本發(fā)明的方法獲得的納米球制備物可具有如通過光子關(guān)聯(lián)光譜法(PCS)測定的0.5或更小、0.3或更小、優(yōu)選0.2或更小或甚至0.1或更小(例如0.05至0.5的范圍內(nèi))的PDI(多分散指數(shù))值。納米球的平均直徑可以為300nm或更小、特別是200nm或更小、諸如20-300nm的范圍內(nèi)或優(yōu)選50-200nm的范圍內(nèi)。術(shù)語“多個(gè)納米膠囊”是指2個(gè)或更多個(gè)納米膠囊，例如至少10、至少100、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000或至少1,000,000或更多個(gè)納米膠囊。任選地，本發(fā)明的納米球可以進(jìn)一步包含一種或多于一種如本文所述的穩(wěn)定劑。本發(fā)明的納米球的組分，特別是形成基質(zhì)的聚合物，以及根據(jù)本發(fā)明的組合物的成分，特別是載體，便利地是藥學(xué)上可接受的。如本文所使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)本發(fā)明的納米球或其組合物以醫(yī)療治療或預(yù)防所需的量施用時(shí)不引起急性毒性的化合物或材料。本發(fā)明的納米球可以通過修改的細(xì)乳液聚合方法、特別是通過包括以下步驟的方法來制備：i)提供疏水性液相，其包含一種或多于一種可聚合單體，所述可聚合單體選自氰基丙烯酸C1-C10-烷基酯類和氰基丙烯酸C1-C6-烷氧基-C1-C10-烷基酯類；ii)將所述疏水性液相精細(xì)地分散于親水性液相中以形成乳液，所述乳液的pH為4.0或更小，例如pH1.0至3.0的范圍內(nèi)；iii)將所述乳液的pH增加至4.0-6.0的范圍內(nèi)的值，特別是4.8-5.5的范圍內(nèi)的pH，且優(yōu)選4.9-5.2的范圍內(nèi)的pH，以便加速所述可聚合單體的聚合；iv)然后，添加一種或多于一種抗原結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合分子包含至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和v)最后，通過進(jìn)一步將pH增加至不超過pH8.0的值、特別是6.8-7.5的范圍內(nèi)的pH、優(yōu)選6.9-7.2的范圍內(nèi)的pH而允許繼續(xù)聚合；由此形成納米球的懸浮液，其中所述一種或多于一種抗原結(jié)合分子被并入通過可聚合單體的聚合形成的聚合物基質(zhì)中。不希望受理論束縛，假定步驟(i)的疏水性液相包含的可聚合單體的聚合由羥基離子引發(fā)，并且根據(jù)陰離子聚合機(jī)制發(fā)生(參考，例如，Vauthier等人,Adv.DrugDeliv.Rev.2003,55:519-548)。所述可聚合單體選自氰基丙烯酸C1-C10-烷基酯類(諸如氰基丙烯酸C1-C8-烷基酯類)和氰基丙烯酸C1-C6-烷氧基-C1-C10-烷基酯類(諸如氰基丙烯酸C1-C3-烷氧基-C1-C3-烷基酯類)中的一種或多于一種。合適的可聚合單體的實(shí)例包括，但不限于，2-氰基丙烯酸甲酯、2-氰基丙烯酸2-甲氧基乙酯、2-氰基丙烯酸乙酯、2-氰基丙烯酸正丁酯、2-氰基丙烯酸2-辛酯、2-氰基丙烯酸異丁酯及其混合物，其中2-氰基丙烯酸乙酯、2-氰基丙烯酸正丁酯及其混合物是優(yōu)選的。任選地，步驟(i)的疏水性液相可以進(jìn)一步包含一種或多于一種油。如本文所使用的術(shù)語“油”是指具有低于水的密度的密度、與如本文所述的可聚合單體和與其他油性物質(zhì)(親脂性)可混溶、與水不可混溶(疏水性)且在室溫(25℃)下為液體的中性、非極性物質(zhì)。在本發(fā)明的方法的步驟(i)中使用的油可以是石油化學(xué)、動(dòng)物或植物來源的。合適的油的實(shí)例包括，但不限于，菜籽油、玉米油、向日葵油、花生油，特別是大豆油。步驟(ii)中使用的親水性液相通常是酸性水溶液，例如無機(jī)酸諸如磷酸或鹽酸的水溶液。疏水性和親水性液相優(yōu)選在室溫下制備，然后在約0℃的溫度下保持在冰上，直至使用。疏水性液相的量相對于親水性和疏水性液相的總重量通常在1-40wt-%的范圍內(nèi)，諸如2-25wt-%的范圍內(nèi)。親水性液相或疏水性液相或兩者，優(yōu)選親水性相，可以含有一種或多于一種如本文所述的穩(wěn)定劑。如本文所使用的術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指能夠穩(wěn)定如本發(fā)明方法的步驟(ii)中制備的乳液的化合物。所述穩(wěn)定劑使分散于親水性液相中的疏水性液相的各個(gè)微滴保持彼此分離并基本上防止其團(tuán)聚。合適的穩(wěn)定劑的實(shí)例包括，但不限于，泊洛沙姆類，例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407；正C12-C16烷基硫酸鈉，例如十二烷基硫酸鈉，肉豆蔻基硫酸鈉和十六烷基硫酸鈉；脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，例如單不飽和或飽和C11-C18-脂肪酸諸如月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸的脫水山梨糖醇單酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，例如單不飽和或飽和C11-C18-脂肪酸諸如月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單酯和三酯類；泊洛沙胺類、聚(氧乙烯)醚類、聚(氧乙烯)酯類、聚乙二醇類及其混合物。包含至少一種泊洛沙姆、特別是泊洛沙姆188和至少一種正C12-C16烷基硫酸鈉、特別是十二烷基硫酸鈉的穩(wěn)定劑的混合物是特別優(yōu)選的。最優(yōu)選的穩(wěn)定劑具有6至16的范圍內(nèi)的HLB。穩(wěn)定劑的總量通常為相對于可聚合單體的總重量的5-25wt-%的范圍內(nèi)。例如，5-25wt-%的量的穩(wěn)定劑可以由以下構(gòu)成：泊洛沙姆，諸如泊洛沙姆188，和正C12-C16烷基硫酸鈉，諸如十二烷基硫酸鈉，重量比為1份正C12-C16烷基硫酸鈉對2-3份泊洛沙姆。在本發(fā)明方法的步驟(ii)中，將疏水性液相精細(xì)地分散于親水性液相中以形成在整個(gè)親水性液體中分布的疏水性液體的細(xì)小微滴的乳液。該乳液可以通過如下獲得：通過應(yīng)用剪切力，例如通過使用靜態(tài)混合器充分混合，通過超聲波，通過在壓力下(例如，在至少5,000kPa、諸如20,000-200,000kPa、優(yōu)選50,000-100,000kPa的壓力下)均質(zhì)化，或通過組合任何這些均質(zhì)化方法。親水性液體中的疏水性液體的乳液可以兩步法制備，其中首先將兩相混合，例如，用靜態(tài)混合器(轉(zhuǎn)子/定子型混合器)，以獲得前乳液(pre-emulsion)，所述前乳液在第二步驟中進(jìn)一步超聲均質(zhì)化，和/或使用高壓均質(zhì)化器，以減小疏水性液體微滴的尺寸。剪切力可以應(yīng)用1-10分鐘、特別是2-5分鐘的時(shí)間。例如，超聲波可以以50-100%的范圍內(nèi)的振幅應(yīng)用1-10分鐘、特別是2-5分鐘。步驟(ii)可以在約25℃(室溫)或優(yōu)選在約0℃的溫度(諸如在冰上)下實(shí)施?？删酆蠁误w的聚合在與親水性液相接觸后起始，但進(jìn)行非常緩慢，除非在堿性環(huán)境中。在本發(fā)明方法的步驟(iii)中，乳液中的聚合因此通過將乳液的pH增加至4.0-6.0的范圍內(nèi)的值而加速。這可以通過添加堿或其水溶液來實(shí)現(xiàn)。合適的堿的實(shí)例包括，但不限于，氫氧化鈉、碳酸鉀、氨和Tris(堿)。在將乳液的pH增加至4.0-6.0之后，將一種或多于一種如本文所述的抗原結(jié)合分子(例如，以水溶液的形式)添加至乳液中。因此，所述抗原結(jié)合分子可以被并入形成納米球的聚合物基質(zhì)中。所述方法的步驟(iv)中添加的抗原結(jié)合分子的量通常為相對于形成基質(zhì)的聚合物和抗原結(jié)合分子的總重量的0.05wt-%至20wt-%、特別是0.5wt-%至15wt-%的范圍內(nèi)。任選地，將抗原結(jié)合分子和乳液的混合物在約25℃(室溫)下孵育5-20分鐘。繼續(xù)聚合，同時(shí)將步驟(v)中的pH增加至不超過pH8.0的pH。這允許殘余單體聚合。聚合通常在約10-14小時(shí)(例如過夜孵育)之后完成，其可在約4℃的溫度下實(shí)施。任選地，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括純化步驟諸如過濾步驟，和/或部分或完全交換獲得的納米球的懸浮介質(zhì)，例如，通過透析。本發(fā)明的方法可以得到如本文所述的納米球的制備物。具體而言，該方法適合于制備包含抗原結(jié)合分子的納米球，所述抗原結(jié)合分子在從納米球釋放之后分別保留其抗原結(jié)合和初始生物活性的至少20％、特別是至少30％、優(yōu)選至少40％和最高達(dá)45％或更多。本發(fā)明的方法允許抗原結(jié)合分子的高包封效率。術(shù)語“包封效率”是指相對于用于制備納米球的抗原結(jié)合分子的總量的納米球中包封的抗原結(jié)合分子的量。具體地，本發(fā)明的方法允許至少50％、特別是至少70％、至少80％、優(yōu)選至少90wt-%、至少95％或甚至99％或更高的包封效率。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含多個(gè)如本文所述的納米球和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。選擇所述載體以適合于預(yù)期的施用方式，所述施用方式可以是，例如，口服或腸胃外施用，血管內(nèi)、皮下或最常見地，靜脈內(nèi)注射，經(jīng)皮應(yīng)用或局部應(yīng)用，諸如至皮膚、鼻或頰粘膜或結(jié)膜上。本發(fā)明的納米球可以通過保護(hù)包封的活性劑免于在胃腸道和血液中過早降解并允許其持續(xù)釋放而增加所述試劑的生物利用度和效力?？诜┯弥?，本發(fā)明的納米球可以穿過腸壁，甚至屏障，諸如血腦屏障。本發(fā)明的液體藥物組合物通常包含載體，所述載體選自可包含一種或多于一種水溶性鹽和/或一種或多于一種水溶性聚合物的水溶液。如果通過注射施用組合物，則所述載體通常是等滲水溶液(例如含有150mMNaCl、5wt-%葡萄糖或兩者的溶液)。此類載體通常還具有約7.3-7.4的范圍內(nèi)的適當(dāng)(生理)pH。固體或半固體載體，例如對于待口服或作為儲(chǔ)庫植入物施用的組合物，可以選自藥學(xué)上可接受的聚合物，包括，但不限于，N-乙烯基內(nèi)酰胺類的均聚物和共聚物(特別是N-乙烯吡咯烷酮的均聚物和共聚物，例如聚乙烯吡咯烷酮，N-乙烯吡咯烷酮和乙酸乙烯酯或丙酸乙烯酯的共聚物)，纖維素酯類和纖維素醚類(特別是甲基纖維素和乙基纖維素，羥基烷基纖維素類，特別是羥丙基纖維素，羥基烷基烷基纖維素類，特別是羥丙基甲基纖維素，纖維素鄰苯二甲酸酯類或琥珀酸酯類，特別是纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯和羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯或羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯)，高分子量聚氧化烯類(諸如聚氧乙烯和聚氧丙烯以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物)，聚乙烯醇-聚乙二醇-接枝共聚物類，聚丙烯酸酯類和聚甲基丙烯酸酯類(諸如甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物，甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物，甲基丙烯酸丁酯/甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯共聚物，聚(丙烯酸羥基烷基酯類)，聚(甲基丙烯酸羥基烷基酯類))，聚丙烯酰胺類，乙酸乙烯酯聚合物類(諸如乙酸乙烯酯和巴豆酸的共聚物，部分水解的聚乙酸乙烯酯)，聚乙烯醇，寡糖和多糖類，諸如角叉藻聚糖類、半乳甘露聚糖類和黃原膠，或其一種或多種的混合物。固體載體成分可以溶解或懸浮于本發(fā)明的納米球的液體懸浮液中，并且可以至少部分地去除液體懸浮介質(zhì)。實(shí)施例粒徑和多分散指數(shù)的測定在本文描述的實(shí)施例中，通過動(dòng)態(tài)光散射的國際標(biāo)準(zhǔn)ISO13321(1996)和ISO22412(2008)中所定義的累積分析使用Zetasizer裝置(MalvernInstruments,Germany)(其得到平均粒徑(z-平均直徑)和分布寬度的估計(jì)值(PDI))測定制備的納米顆粒的尺寸和多分散指數(shù)(PDI)。如實(shí)施例中所示的PDI是尺寸分布的寬度的無量綱量度，其在Zetasizer軟件中范圍為0至1。<0.05的PDI值表明單分散性樣品(即，具有非常均勻的粒徑分布的樣品)，而較高PDI值表明更高分散性的樣品。實(shí)施例1負(fù)載抗生物素山羊IgG的聚合物納米顆粒的制備負(fù)載IgG的聚(2-氰基丙烯酸正丁酯)(PBCA)納米球如下制備：將250μl2-氰基丙烯酸正丁酯(單體)與21.5μl大豆油混合，以獲得油相。將16.25mg泊洛沙姆188和6.5mg十二烷基硫酸鈉(SDS)與1.3ml0.1M磷酸混合，以獲得水相。將兩相保持在冰上。將各相混合，并且使用探頭超聲波儀(HielscherUltrasonicsGmbH,Germany，70％振幅，1個(gè)循環(huán))將混合物均質(zhì)化兩分鐘，同時(shí)仍然在冰上冷卻。將0.1N氫氧化鈉(NaOH)逐滴添加至獲得的乳液，同時(shí)攪拌(700rpm)。乳液的pH一達(dá)到5.0就緩慢添加1mg抗生物素山羊IgG，同時(shí)繼續(xù)攪拌。添加IgG之后，在室溫下繼續(xù)攪拌乳液約10分鐘。然后，通過逐滴添加0.1NNaOH將pH增加至7.0，并將樣品在4℃下孵育過夜，以允許殘余單體聚合。使用2-氰基丙烯酸乙酯代替2-氰基丙烯酸正丁酯重復(fù)相同的程序，以獲得負(fù)載IgG的聚(2-氰基丙烯酸乙酯)(PECA)納米球。過夜孵育之后，使用如上所述的Zetasizer裝置和軟件分析獲得的納米球懸浮液，將其過濾通過200nm膜并再次分析。這些分析的結(jié)果，即負(fù)載IgG的PBCA納米球(PBCANP)和負(fù)載IgG的PECA納米球(PECANP)的尺寸(測定為z-平均直徑)和PDI，包括標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，概述于圖1A中。此外，通過透射電子顯微鏡(TEM，參見圖1B)檢查納米球。實(shí)施例2包封效率(EE)使用尺寸排阻高效液相色譜(SE-HPLC)測定實(shí)施例1的PBCA納米球懸浮液中的游離(未包封)抗生物素山羊IgG的量。發(fā)現(xiàn)僅5.6％IgG是游離的(即溶解于懸浮介質(zhì)中，而不是包封于納米球中)。以[(添加的IgG的總量)-(未包封的IgG)]/[添加的IgG的總量]的商計(jì)算的包封效率為94.4％。實(shí)施例3包封的IgG的抗原結(jié)合活性將250μl2-氰基丙烯酸正丁酯(單體)與21.5μl大豆油混合，以獲得油相。將16.25mg泊洛沙姆188和6.5mg十二烷基硫酸鈉(SDS)與1.3ml0.1M磷酸混合，以獲得水相。將兩相保持在冰上。將各相混合，并且使用探頭超聲波儀(HielscherUltrasonicsGmbH,Germany，100％振幅，1個(gè)循環(huán))將混合物均質(zhì)化五分鐘，同時(shí)仍然在冰上冷卻，以獲得乳液。用800μl具有如上所示的組成的水相稀釋500μl乳液。逐滴添加0.1N氫氧化鈉(NaOH)，同時(shí)攪拌(300-500rpm)。乳液的pH一達(dá)到5就緩慢添加1mg非特異性山羊IgG(對生物素?zé)o特異性結(jié)合活性)或1mg抗生物素山羊IgG(與生物素特異性結(jié)合)，同時(shí)繼續(xù)攪拌。添加IgG之后，通過逐滴添加0.1NNaOH將pH增加至7，并將樣品在4℃下孵育過夜，以允許殘余單體聚合。將各樣品的一部分(最終濃度：1.08mg/mlPBCA)用豬肝酯酶(SigmaAldrichCo.,Germany，目錄號(hào)E2884，≥150U/ml，最終濃度：0.5mg/ml)在37℃下處理4小時(shí)，同時(shí)搖動(dòng)。在生物素包被的微量滴定板上以ELISA測定樣品的生物素結(jié)合活性。對各樣品測量6種不同的稀釋液(系列1:2稀釋液)。計(jì)算抗生物素抗體的理論濃度，如同所有抗生物素IgG都保留抗原結(jié)合活性?；诟采w3.9-1,000ng/ml抗生物素IgG的范圍的抗生物素IgG校準(zhǔn)曲線經(jīng)由ELISA(用抗山羊抗體辣根過氧化物酶綴合物和四甲基聯(lián)苯胺檢測)測定抗原結(jié)合抗生物素IgG的實(shí)際濃度。計(jì)算ELISA可檢測的抗原結(jié)合抗生物素IgG相對于理論濃度的百分比。結(jié)果概述于表1中。表1：功能性抗生物素抗體的濃度考慮未包封的5.6％抗生物素IgG(參見實(shí)施例2)以及非生物素特異性山羊IgG(對照)的背景信號(hào)。因此，納米球中酯酶可釋放包封的抗原結(jié)合IgG的量為約40-45％。實(shí)施例4包封的IgG的生物活性如下在負(fù)載針對排斥性指導(dǎo)分子A(RGMa)的單克隆抗體(mab)的PBCA納米球中測定包封的IgG的生物活性：負(fù)載抗RGMamab的PBCA納米球的懸浮液使用實(shí)施例1中所述的方法(添加2.26mgmab，而不是1mg山羊IgG)制備，并且含有游離和包封的mab(酯酶處理之后的樣品名稱：“游離+包封的”)。通過超濾(AmiconCell和Biomax500kDa過濾膜)將懸浮液的一部分的納米球與游離mab分離，由此獲得僅含有包封的mab的樣品(酯酶處理之后的樣品名稱：“包封的”)。將各樣品的一部分(9.55mg/mlPBCA，1:10稀釋度)用豬肝酯酶(SigmaAldrichCo.,Germany，目錄號(hào)E2884，≥150U/ml，最終濃度：0.22mg/ml)在37℃下處理4小時(shí)，同時(shí)搖動(dòng)，以從納米球釋放包封的mab。作為對照，如針對樣品“游離+包封的”和“包封的”所述制備未負(fù)載任何抗體的PBCA納米顆粒且用酯酶處理(樣品名稱：“空NP”)。使用One-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega,Germany)經(jīng)由熒光素酶報(bào)道基因測定法測定各樣品中的生物學(xué)抗RGMamab活性。所述測定法基于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)與位于c-293HEK細(xì)胞的細(xì)胞膜中的BMP受體BMPRI/II的結(jié)合，所述c-293HEK細(xì)胞表達(dá)人RGMa且包含響應(yīng)于BMPRI/II的BMP誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的熒光素酶報(bào)道分子。RGMa結(jié)合BMP-2、BMP-4或BMP-6且充當(dāng)共受體，導(dǎo)致增強(qiáng)的BMP信號(hào)傳導(dǎo)。生物活性抗RGMamab防止RGMa與BMP結(jié)合，因此減少BMP信號(hào)傳導(dǎo)。每孔用50,000個(gè)c-293HEK細(xì)胞(在50μl培養(yǎng)基中)接種96孔板(Corning，白色測定板)。添加每孔25μl樣品稀釋液。稀釋液的組成概述于表2中。表2：熒光素酶測定中使用的樣品稀釋液的組成1在對照“空NP”和“酯酶”的稀釋液中不存在2計(jì)算為PBCA當(dāng)量，如同不通過酯酶處理水解，在對照“酯酶”中不存在。將96孔板在37℃和5%CO2下孵育24小時(shí)。然后，添加75μl/孔One-Glo底物。在室溫下再孵育7分鐘、同時(shí)在黑暗中以750rpm振蕩之后，測量各孔中的發(fā)光。結(jié)果顯示于圖2中。酯酶本身(樣品名稱：“酯酶”)在所有測試濃度下都不具有對信號(hào)性能的大幅影響。然而，無mab的PBCA納米顆粒(“空NP”)及其由酯酶處理導(dǎo)致的降解產(chǎn)物在稀釋液1-3中減少細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。因此，計(jì)算基于對稀釋液4-6測量的發(fā)光值。將“空NP”樣品的平均信號(hào)值均一化為100％(參見圖3)。來自負(fù)載純化mab的納米球的抗RGMamab(“包封的”)導(dǎo)致BMP信號(hào)傳導(dǎo)減少25％。在樣品“游離+包封的”中觀察到的BMP信號(hào)傳導(dǎo)減少49.5％表明24.5％的抗RGMamab是游離的(未包封于納米球中)。這些結(jié)果表明包封于納米球中的至少25％的mab保留其原始的生物活性。實(shí)施例5負(fù)載人IgG-FITC綴合物的PBCA納米顆粒的制備使用實(shí)施例1中描述的方法制備負(fù)載人IgG-FITC綴合物的PBCA納米球的懸浮液，除了將乳液的pH調(diào)節(jié)至7.0之后，在室溫下孵育約4.5小時(shí)(而不是在4℃下孵育過夜)。在過濾前，納米球的z-平均直徑為173nm，且PDI為0.186。過濾(200nm膜)之后，納米球的z-平均直徑為144nm，且PDI為0.157。如實(shí)施例2中所述測定的包封效率為97.6％(即，2.4％游離抗體綴合物)。實(shí)施例6負(fù)載山羊IgG的PBCA納米顆粒的制備對于各樣品，將21.5μl大豆油與表3中所示的量的2-氰基丙烯酸正丁酯(單體)小心混合，以獲得油相。將16.25mg泊洛沙姆188和6.5mg十二烷基硫酸鈉(SDS)與1.3ml0.1M磷酸混合，以獲得水相。將兩相保持在冰上。將各相混合，并且在表3中所示的時(shí)間和條件下使用探頭超聲波儀(HielscherUltrasonicsGmbH,Germany，1個(gè)循環(huán))將混合物均質(zhì)化。將0.1N氫氧化鈉(NaOH)逐滴添加至獲得的乳液，同時(shí)攪拌(300-500rpm)。乳液的pH一達(dá)到表3中所示的值就緩慢添加1mg抗生物素山羊IgG，同時(shí)繼續(xù)攪拌。添加IgG之后，在室溫下繼續(xù)攪拌乳液約10分鐘。然后，通過逐滴添加0.1NNaOH將pH增加至約6.0-7.0，并將樣品在4℃下孵育過夜，以允許殘余單體聚合。表3：細(xì)乳液聚合-條件樣品2-氰基丙烯酸正丁酯[mg]超聲處理時(shí)間[min]超聲處理振幅[％]超聲處理溫度當(dāng)添加IgG時(shí)的pHDoE11002100RT*7DoE2100250冰冷卻5DoE3105100冰冷卻3DoE4105100RT*5DoE510550RT*3DoE71005100RT*3DoE810550冰冷卻5DoE9100550RT*5DoE10102100冰冷卻5DoE1110250RT*5DoE12100250RT*3DoE13100550冰冷卻3DoE14102100RT*3DoE151005100冰冷卻5DoE161002100冰冷卻3*RT=室溫。過夜孵育之后，使用如上所述的Zetasizer裝置和軟件分析獲得的納米球懸浮液，將其過濾通過200nm膜并再次分析。這些分析的結(jié)果，即納米球的尺寸(測定為z-平均直徑)和PDI，包括標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，概述于圖4中。此外，通過透射電子顯微鏡(TEM)檢查納米球。如實(shí)施例2中所述測定各樣品的包封效率(EE)。結(jié)果示于表4中。表4：包封效率(EE)樣品游離IgG[%]EE[%]樣品游離IgG[%]EE[%]DoE123.2976.71DoE101.4798.53DoE29.2290.78DoE1121.8778.13DoE30.2999.71DoE120.2999.71DoE47.6292.38DoE130.2999.71DoE50.2999.71DoE140.2999.71DoE70.6199.39DoE150.2999.71DoE80.5699.44DoE160.2999.71DoE90.2999.71當(dāng)前第1頁1 2 3