本發(fā)明涉及一種能夠結(jié)合至IGF-1R的抗體-藥物-綴合物。一方面，本發(fā)明涉及一種抗體-藥物-綴合物，其包含能夠結(jié)合至IGF-1R的抗體，所述抗體與至少一種選自多拉司他汀10(dolastatin10)和奧瑞司他汀(auristatin)的衍生物的藥物綴合。本發(fā)明還包括治療的方法，和所述抗體-藥物-綴合物用于治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
：被稱為IGF-1R(或有時(shí)被稱為IGF1R或IGF-IR)的胰島素樣生長因子1受體是具有酪氨酸激酶活性的受體，其與胰島素受體IR具有70％同源性。IGF-1R為一種分子量約350,000的糖蛋白。其為一種異四聚體(hetero-tetrameric)受體，其中通過二硫橋連接的每一半由細(xì)胞外α-亞基和跨膜β-亞基組成。IGF-1R以非常高的親和力(Kd#1nM)結(jié)合IGF1和IGF2，但同樣能夠以低100至1000倍的親和力結(jié)合至胰島素。相反，IR以非常高的親和力結(jié)合胰島素，盡管IGF僅以低100倍的親和力結(jié)合至胰島素受體。IGF-1R和IR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有非常高的序列同源性，盡管同源性較弱的區(qū)段分別涉及處于α-亞基上的半胱氨酸富集區(qū)和β-亞基的C末端部分。在α-亞基中觀察到的序列差異處于配體的結(jié)合區(qū)段，因此其分別是IGF-1R和IR對(duì)IGF和胰島素的相對(duì)親和力的起源。β-亞基的C-末端部分中的差異導(dǎo)致兩個(gè)受體的信號(hào)通路中的分歧(divergence)；IGF-1R介導(dǎo)促有絲分裂、分化和抗凋亡作用，而IR的活化主要涉及代謝通路水平的作用。通過配體與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化胞質(zhì)酪氨酸激酶蛋白。激酶的活化依次涉及不同的細(xì)胞內(nèi)底物的刺激，所述底物包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb10。IGF-1R的兩種主要底物為IRS和Shc，其通過下游的許多效應(yīng)子的活化介導(dǎo)大部分生長和分化作用，所述作用與IGF和該受體的連接相關(guān)。因此，底物的可用性可以決定與IGF-1R的活化相關(guān)的最終生物學(xué)作用。當(dāng)IRS-1占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞傾向于增殖和轉(zhuǎn)化。當(dāng)Shc占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞傾向于分化。似乎主要涉及保護(hù)以對(duì)抗凋亡的作用的途徑為磷脂?；?肌醇3-激酶(PI3-激酶)途徑。IGF系統(tǒng)在癌發(fā)生(carcinogenesis)中的作用已經(jīng)成為近十年中深入研究的主題。這種興趣跟隨著事實(shí)的發(fā)現(xiàn)，即除了其促有絲分裂和抗凋亡性質(zhì)，IGF-1R似乎是轉(zhuǎn)化表型的建立和維持所必須的。事實(shí)上，已經(jīng)非常確定的是，在許多種細(xì)胞中，IGF-1R的過表達(dá)或組成性活化導(dǎo)致細(xì)胞的生長，所述生長不依賴于缺乏胎牛血清的介質(zhì)中的支持，并導(dǎo)致裸鼠中腫瘤的形成。這本身不是獨(dú)特的性質(zhì)，因?yàn)檫^表達(dá)基因的許多種產(chǎn)物可以使細(xì)胞轉(zhuǎn)化，包括大量的生長因子受體。然而，已經(jīng)清楚地證明IGF-1R在轉(zhuǎn)化中發(fā)揮的主要作用的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)已經(jīng)證明，IGR-1R-細(xì)胞(其中編碼IGF-1R的基因已經(jīng)失活)完全難以通過不同的試劑轉(zhuǎn)化，所述試劑為通常能夠使細(xì)胞轉(zhuǎn)化的試劑，如牛乳頭瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的過表達(dá)、SV40的T抗原、活化的ras或最后兩個(gè)因子的組合。IGF-1R在許多種腫瘤和腫瘤系中表達(dá)，并且IGF經(jīng)由它們與IGF-1R的連接擴(kuò)增腫瘤生長。支持IGF-1R在癌發(fā)生中的作用的其他爭論來自研究，所述研究使用針對(duì)受體的鼠單克隆抗體，或使用IGF-1R的顯性負(fù)突變體(negativedominant)。實(shí)際上，針對(duì)IGF-1R的鼠單克隆抗體在培養(yǎng)物中抑制多種細(xì)胞系的增殖，且在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。同樣地，已經(jīng)顯示IGF-1R的顯性負(fù)突變體能夠抑制腫瘤增殖。已經(jīng)開始大量項(xiàng)目開發(fā)用于治療癌癥的裸IGF-1R抗體。然而，到目前為止，這些項(xiàng)目都沒有成功，并且市場(chǎng)上沒有抗IGF-1R抗體。此外，一系列臨床試驗(yàn)已經(jīng)失敗，所述臨床試驗(yàn)涉及與抗EGFR抗體組合以靶向EGFR和IGF-1R的抗IGF-1R抗體，因?yàn)檫@些抗體均不能治療KRAS突變患者。因此，現(xiàn)在IGF-1R不被認(rèn)為是主要靶點(diǎn)，并且在潛在治療性抗體的研究中，IGF-1R不再被認(rèn)為是特別令人關(guān)注的。然而，還必須注意，產(chǎn)生IGF-1R抗體的努力集中于裸抗體，即通過其固有性質(zhì)而有用的抗體。在此意義上，IGF-1R被認(rèn)為是一個(gè)不適合于產(chǎn)生ADC如抗體-藥物-綴合物(被稱為“ADC”)的靶點(diǎn)，因?yàn)镮GF-1R被描述為一個(gè)也被正常細(xì)胞(包括血管)廣泛表達(dá)的靶點(diǎn)。在此意義上，可以注意到，最近的IGF-1R抗體(即AVE1642)被開發(fā)為一種未攜帶藥物的裸抗體。其與目前在開發(fā)中的其他IGF-1R抗體和與在臨床試驗(yàn)中失敗的所有那些抗體相同。在這種背景下，本發(fā)明涉及一種ADC或綴合物，和其用于治療癌癥，更特別地表達(dá)IGF-1R的癌癥的用途。ADC將抗體的結(jié)合特異性與藥物(例如細(xì)胞毒試劑)的效力相結(jié)合。近些年來，與單克隆抗體的開發(fā)、更有效的藥物的使用和將這些組分共價(jià)結(jié)合的化學(xué)接頭的設(shè)計(jì)相關(guān)的技術(shù)已經(jīng)迅速進(jìn)展。ADC的使用允許藥物的局部遞送，如果所述藥物作為未綴合的藥物施用，可能對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生不可接受水平的毒性。換言之，因此尋找具有最小毒性的最大功效。設(shè)計(jì)和改進(jìn)ADC的努力集中于抗體的選擇性以及藥物作用機(jī)制、藥物連接、藥物/抗體比例(加載或DAR)和藥物釋放性質(zhì)上。藥物部分可以通過機(jī)制發(fā)揮其細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用，所述機(jī)制包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白酶體、核糖體功能的損害、蛋白質(zhì)合成和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制。當(dāng)與大的抗體綴合時(shí)，一些細(xì)胞毒性藥物傾向于為無活性的或較低活性的。必須單獨(dú)表征每種抗體，設(shè)計(jì)合適的接頭，并確定合適的細(xì)胞毒試劑，所述試劑在遞送至腫瘤細(xì)胞后保持其效力。必須考慮癌靶點(diǎn)上的抗原密度，以及正常組織是否表達(dá)靶抗原。其他的考慮包括整個(gè)ADC是否在結(jié)合靶點(diǎn)后被內(nèi)化；當(dāng)考慮可能的正常組織暴露和/或所治療的癌癥的類型和階段時(shí)，細(xì)胞抑制性或細(xì)胞毒性藥物是否是優(yōu)選的；以及連接抗體與藥物有效負(fù)載的接頭是可裂解的還是不可裂解的連接。此外，對(duì)于化合物的未來開發(fā)過程，抗體與藥物部分的綴合比例必須是充分的，而不危及抗體的結(jié)合活性和/或藥物的效力，并且不改變ADC的物理化學(xué)性質(zhì)而導(dǎo)致聚集或有害性質(zhì)。ADC是復(fù)雜的生物學(xué)分子，開發(fā)有效的ADC的挑戰(zhàn)仍然是重要的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明概述本發(fā)明旨在解決該問題，并涉及下式(I)的ADC：Ab-(L-D)n(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Ab為能夠結(jié)合至人IGF-1R的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述Ab選自：i)包含序列SEQIDNo.1、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.4、5和6的三條輕鏈CDR的抗體；ii)與i)的抗體競(jìng)爭結(jié)合至IGF-1R的抗體；和iii)與i)的抗體結(jié)合至IGF-1R的相同表位的抗體；L為接頭；D為下式(II)的藥物部分：其中：R2為COOH、COOCH3或噻唑基；R3為H或(C1-C6)烷基；R9為H或(C1-C6)烷基；m為1至8之間的整數(shù)；波浪線表示與L連接的點(diǎn)；和n為1至12。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab選自：a)包含序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；b)包含序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.10、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；c)包含序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.9、5和12的三條輕鏈CDR的抗體；和d)包含序列SEQIDNo.8、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab選自：a)包含序列SEQIDNo.13的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；b)包含序列SEQIDNo.14的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.10、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；c)包含序列SEQIDNo.15的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和12的三條輕鏈CDR的抗體；d)包含序列SEQIDNo.16的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；和e)包含序列SEQIDNo.17的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和12的三條輕鏈CDR的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab選自：a)包含序列SEQIDNo.18的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；b)包含序列SEQIDNo.19的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；c)包含序列SEQIDNo.20的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；d)包含序列SEQIDNo.21的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.8、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和e)包含序列SEQIDNo.22的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種ADC，其中Ab選自：i)抗體208F2、212A11、214F8、219D6和213B10；ii)與i)的抗體競(jìng)爭結(jié)合至IGF-1R的抗體；和iii)與i)的抗體結(jié)合至IGF-1R的相同表位的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab為人源化抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab選自抗體，所述抗體包含：a)分別具有序列SEQIDNo.7、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重鏈，和源自人種系IGHV1-46*01(SEQIDNo.46)的FR1、FR2和FR3，和源自人種系IGHJ4*01(SEQIDNo.48)的FR4；和b)分別具有序列SEQIDNo.9、5和11的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，和源自人種系IGKV1-39*01(SEQIDNo.47)的FR1、FR2和FR3，和源自人種系IGKJ4*01(SEQIDNo.49)的FR4。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Ab選自：a)包含序列SEQIDNo.33或與SEQIDNo.33顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；和b)包含序列SEQIDNo.34或與SEQIDNo.34顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Ab選自：a)包含序列SEQIDNo.35或與SEQIDNo.35顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和b)包含序列SEQIDNo.36或與SEQIDNo.36顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Ab選自：a)包含或由序列SEQIDNo.37或與SEQIDNo.37顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.39或與SEQIDNo.39顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；和b)包含或由序列SEQIDNo.38或與SEQIDNo.38顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.40或與SEQIDNo.40顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Ab選自：a)包含選自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列或與SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80具有至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；b)包含選自SEQIDNo.57和60的序列或與SEQIDNo.57或60具有至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和c)包含選自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列或與SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80具有至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和選自SEQIDNo.57或60的序列或與SEQIDNo.57或60具有至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Ab選自：a)選自SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81的序列或與SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81具有至少80％同一性的任何序列的重鏈；和b)選自SEQIDNo.59和61的序列或與SEQIDNo.59或61具有至少80％同一性的任何序列的輕鏈。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中L為下式(III)的接頭：其中L2為(C4-C10)環(huán)烷基-羰基、(C2-C6)烷基或(C2-C6)烷基-羰基；W為氨基酸單元；w為0至5之間的整數(shù)；Y為PAB-羰基，其中PAB為y為0或1；星號(hào)表示與D連接的點(diǎn)；和波浪線表示與Ab連接的點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中L2為下式：其中星號(hào)表示與(W)w連接的點(diǎn)；和波浪線表示與下式的馬來酰亞胺部分的氮原子連接的點(diǎn)：在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，w＝0，或w＝2然后(W)w選自：其中星號(hào)表示與(Y)y連接的點(diǎn)；和波浪線表示與L2連接的點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中L選自：其中星號(hào)表示與D連接的點(diǎn)，并且波浪線表示與Ab連接的點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中(L-D)選自：其中波浪線表示與Ab連接的點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其具有選自以下的式：和其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Ab選自：i)抗體208F2、212A11、214F8、219D6和213B10；ii)與i)的抗體競(jìng)爭結(jié)合至IGF-1R的抗體；和iii)與i)的抗體結(jié)合至IGF-1R的相同表位的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中n為2。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中n為4。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其作為藥物的用途。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，其包含如上面所描述的ADC。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體(vehicle)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，其用于治療表達(dá)IGF-1R的癌癥或IGF-1R相關(guān)的癌癥的用途。表達(dá)IGF-1R的癌癥或IGF-1R相關(guān)的癌癥包括在其表面表達(dá)或過表達(dá)IGF-1R的全部或部分的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，其中所述表達(dá)IGF-1R的癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、腎癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、間皮瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌和任何耐藥的癌癥。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于在需要其的受試者中治療表達(dá)IGF-1R的癌癥的方法，其包括向受試者施用有效量的至少一種抗體-藥物-綴合物或根據(jù)本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種試劑盒，其至少包含i)抗體-藥物-綴合物和/或如上面所描述的組合物和ii)注射器或小瓶或安瓿，將所述抗體-藥物-綴合物和/或組合物置于其中。發(fā)明詳述I-抗體(Ab)術(shù)語“抗體(antibody)”、“抗體(antibodies)”、“ab”、“Ab”、“MAb”或“免疫球蛋白”在最廣泛的意義上可互換地使用，其包括單克隆抗體，分離的、工程化的或重組的抗體(例如全長的或完整的單克隆抗體)，多克隆抗體，多價(jià)抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和其抗體片段，只要它們顯示所期望的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體由重組抗體組成。術(shù)語“重組抗體”是指在活細(xì)胞中由重組DNA的表達(dá)所產(chǎn)生的抗體。通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因重組的實(shí)驗(yàn)室方法，產(chǎn)生不會(huì)在生物有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的DNA序列，以獲得本發(fā)明的ADC的重組抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體由化學(xué)合成的抗體組成。更特別地，該分子由糖蛋白組成，所述糖蛋白包含通過二硫鍵互相連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，即CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為被稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)(regionofhypervariability)，所述高變區(qū)中散布著被稱作框架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，從氨基末端至羧基末端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)。根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體的“抗原結(jié)合片段”或“IGF-1R結(jié)合片段”旨在表示任何肽、多肽或蛋白質(zhì)，其保留結(jié)合至抗體的靶點(diǎn)(通常也被稱作抗原)的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，該“抗原結(jié)合片段”選自Fv、scFv(sc表示單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或雙抗體、或已通過化學(xué)修飾或通過摻入脂質(zhì)體中延長半衰期的任何片段，所述化學(xué)修飾如加入聚(亞烷基)二醇(如聚乙二醇)(“PEG化”)(被稱作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”表示聚乙二醇)，所述片段具有至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的抗體的特有CDR。優(yōu)選地，所述“抗原結(jié)合片段”將包含或?qū)⒂伤鼈儊碓吹目贵w的重或輕可變鏈的部分序列構(gòu)成，所述部分序列足以保留與其所起源的抗體相同的結(jié)合特異性，和充足的對(duì)于靶點(diǎn)的親和力，優(yōu)選至少等于其所起源的抗體的親和力的1/100，更優(yōu)選至少1/10。更優(yōu)選地，所述“抗原結(jié)合片段”至少將包含或?qū)⒂伤鼈兯鶃碓吹目贵w的重可變鏈的三個(gè)CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和輕可變鏈的三個(gè)CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)構(gòu)成?！敖Y(jié)合(binding)”，“結(jié)合(bind)”等是指抗體或其任何抗原結(jié)合片段與抗原形成復(fù)合物，所述復(fù)合物在生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定。特異性結(jié)合的特征在于至少約1x10-6M的平衡解離常數(shù)。用于確定兩種分子是否結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，所述方法包括例如平衡透析、表面等離子體共振、放射性標(biāo)記分析等。為了避免疑問，這并不意味著所述抗體不能在低水平結(jié)合至或干擾另一種抗原。然而，作為一個(gè)實(shí)施方案，所述抗體僅結(jié)合至所述抗原。如在本說明書中所使用，表述“IGF-1R抗體”應(yīng)被解釋為與“抗IGF-1R抗體”類似，并且是指能夠結(jié)合至IGF-1R的抗體。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的表位優(yōu)選定位(localize)于人IGF-1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(也被稱作IGF-1RECD)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，抗體或其任何抗原結(jié)合片段能夠以10x10-10至1x10-10，更優(yōu)選8x10-10至2x10-10的EC50結(jié)合至IGF-1R。術(shù)語半最大有效濃度(EC50)對(duì)應(yīng)于藥物、抗體或毒物的濃度，所述濃度在一些特定的暴露時(shí)間后誘導(dǎo)在基線和最大值中間的應(yīng)答。其通常被用作藥物效力的量度。因此，分級(jí)劑量應(yīng)答曲線的EC50表示化合物的濃度，在所述濃度觀察到所述化合物的最大作用的50％。量化劑量應(yīng)答曲線的EC50表示化合物的濃度，在所述濃度在特定的暴露持續(xù)時(shí)間后50％的群體表現(xiàn)出應(yīng)答。濃度測(cè)量典型地遵循S形曲線，在相對(duì)小的濃度變化下快速增加。這可以通過最佳擬合線的推導(dǎo)從數(shù)學(xué)上確定。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在本發(fā)明中確定的EC50表征抗體結(jié)合至暴露于人腫瘤細(xì)胞上的IGF-1RECD的效力。使用FACS分析確定EC50參數(shù)。EC50參數(shù)反映了抗體濃度，在該濃度獲得在人腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的人IGF-1R上的最大結(jié)合的50％。使用四參數(shù)回歸曲線擬合程序(PrismSoftware)，以劑量應(yīng)答曲線的中點(diǎn)計(jì)算每個(gè)EC50值。已選擇該參數(shù)作為生理/病理情況的代表。術(shù)語“表位”是被抗體結(jié)合的抗原的區(qū)。表位可以被定義為結(jié)構(gòu)性的或功能性的。功能性表位通常為結(jié)構(gòu)性表位的子集，并且具有直接有利于相互作用的親和力的那些殘基。表位還可以為構(gòu)象性的，即由非直鏈氨基酸組成。在某些實(shí)施方案中，表位可以包括決定簇(determinant)，所述決定簇為分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性，和/或特定的電荷特性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或技術(shù)確定IGF-1R結(jié)合的競(jìng)爭，所述方法或技術(shù)如但不限于射線、表面胞質(zhì)共振(Biacore)、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等。“競(jìng)爭結(jié)合至IGF-1R”是指至少20％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少70％的競(jìng)爭?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或技術(shù)確定結(jié)合至相同表位的確定，所述方法或技術(shù)如但不限于射線、表面胞質(zhì)共振(Biacore)、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等?！敖Y(jié)合至IGF-1R的相同表位”是指至少20％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少70％的競(jìng)爭。如上面所提及，與一般知識(shí)相反，本發(fā)明集中于特定的IGF-1R抗體，所述抗體在IGF-1R結(jié)合后呈現(xiàn)高的內(nèi)化能力。如本文中所使用，“被內(nèi)化的”或“內(nèi)化的”(兩種表述是相似的)抗體為在與哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的IGF-1R結(jié)合后被細(xì)胞攝取(意為其“進(jìn)入”)的抗體。該抗體作為ADC的一部分是令人關(guān)注的，因此其將連接的細(xì)胞毒素定位或指向靶向的癌細(xì)胞。一旦被內(nèi)化，細(xì)胞毒素觸發(fā)癌細(xì)胞死亡。令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明的抗體對(duì)于CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2都顯示相同的序列，其他3個(gè)CDR是不同的。這種觀察似乎是條理清楚的(coherent)，因?yàn)槠錇殛P(guān)于抗體的結(jié)合特異性的公知常識(shí)的一部分，CDR-H3被描述為對(duì)于表位的識(shí)別是最重要的且最相關(guān)的。ADC治療成功的關(guān)鍵被認(rèn)為是靶抗原特異性和抗原-抗體復(fù)合物向癌細(xì)胞中的內(nèi)化。顯然，非內(nèi)化抗原遞送細(xì)胞毒試劑不如內(nèi)化抗原有效。在抗原間內(nèi)化過程是可變的，并且取決于多種參數(shù)，所述參數(shù)可以受到抗體影響。在ADC中，細(xì)胞毒劑賦予細(xì)胞毒活性，所使用的抗體負(fù)責(zé)針對(duì)癌細(xì)胞的特異性，以及載體(vector)負(fù)責(zé)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以恰當(dāng)?shù)匕l(fā)揮細(xì)胞毒劑。因此，為了改善ADC，抗體可以表現(xiàn)出高的內(nèi)化至靶向的癌細(xì)胞中的能力。抗體介導(dǎo)的內(nèi)化的效率根據(jù)靶向的表位而顯著不同。有效內(nèi)化IGF-1R抗體的選擇需要各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)不僅研究IGF-1R下調(diào)，而且還研究IGF-1R抗體向細(xì)胞中的內(nèi)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過具體用于內(nèi)化機(jī)制的免疫熒光或FACS(流式細(xì)胞術(shù))(如本申請(qǐng)下文中所示例)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或過程，評(píng)價(jià)根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體的內(nèi)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在結(jié)合至IGF-1R后，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體可以誘導(dǎo)至少30％，優(yōu)選50％，更優(yōu)選80％的內(nèi)化。在抗體與所述IGF-1R的ECD結(jié)合后，IGF-1R/抗體復(fù)合物被內(nèi)化，并誘導(dǎo)細(xì)胞表面的IGF-1R的量的減少?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，如非限制性示例的蛋白質(zhì)印跡(western-blot)、FACS和免疫熒光，將這種減少量化。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選可以通過FACS測(cè)量這種減少(由此反映內(nèi)化)，并將其表示為在4℃測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度(MFI)和與抗體孵育4小時(shí)后在37℃測(cè)量的MFI之間的差或Δ。作為非限制性示例，使用i)與本文所描述的抗體孵育4小時(shí)后的乳腺癌細(xì)胞MCF7，和ii)用Alexa488標(biāo)記的第二抗體，基于用未處理的細(xì)胞和用抗體處理的細(xì)胞獲得的MFI測(cè)定該Δ。此參數(shù)被定義為使用下式計(jì)算：Δ(MFI4℃–MFI37℃)。這種MFI之間差反映IGF-1R下調(diào)，因?yàn)镸FI與在細(xì)胞表面上表達(dá)的IGF-1R成比例。在一個(gè)有利的方面，抗體由在MCF-7中觸發(fā)至少280，優(yōu)選至少400的Δ(MFI4℃–MFI37℃)的抗體組成。更詳細(xì)地，可以根據(jù)以下方法測(cè)量上面提及的Δ，所述方法必須被認(rèn)為是說明性且非限制性的示例：a)在冷的(4℃)或溫的(37℃)完全培養(yǎng)介質(zhì)中，使用本發(fā)明的抗體處理并孵育感興趣的腫瘤細(xì)胞；b)使用第二抗體平行地處理步驟a)的經(jīng)處理的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞；c)測(cè)量用第二標(biāo)記抗體處理的和未處理的細(xì)胞的MFI(代表存在于表面的IGF-1R的量)，所述第二標(biāo)記抗體能夠結(jié)合本發(fā)明的抗體；和d)用經(jīng)處理的細(xì)胞獲得的MFI減去用未處理的細(xì)胞獲得的MFI以計(jì)算Δ。由該ΔMFI，內(nèi)化百分比可以被確定為：100x(MFI4℃-MFI37℃)/MFI4℃.在MCF7中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體優(yōu)選顯示50％至99％，70％至90％，優(yōu)選75％至87％的內(nèi)化百分比。本文所描述的抗體的特別優(yōu)點(diǎn)依賴于其內(nèi)化速率。通常已知對(duì)于ADC，期望所使用的抗體顯示快的內(nèi)化速率，優(yōu)選在施用抗體24小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在12小時(shí)內(nèi)，甚至更優(yōu)選在6小時(shí)內(nèi)。在本發(fā)明中，內(nèi)化速率(也被稱作細(xì)胞表面結(jié)合抗體減少或細(xì)胞表面抗體衰減)被表示為t1/2(半衰期)，并且對(duì)應(yīng)于獲得ΔMFI的50％的減少所需的時(shí)間(根據(jù)以下示例將清楚地理解該方面)。特別的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的ADC的抗體具有5至25分鐘，優(yōu)選10至20分鐘的t1/2。本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案涉及一種ADC，其中抗體Ab包含具有序列SEQIDNo.2的CDR-H2和序列SEQIDNo.3的CDR-H3的三條重鏈CDR，和具有序列SEQIDNo.5的CDR-L2的三條輕鏈CDR。本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案涉及一種ADC，其中抗體Ab包含序列SEQIDNos.1、2和3的三條重鏈CDR和序列SEQIDNo.4、5和6的三條輕鏈CDR。ADC的一個(gè)實(shí)施方案包含一種抗體，所述抗體包含三條重鏈CDR和三條輕鏈CDR，所述重鏈CDR包含或由序列SEQIDNo.1、2和3或與SEQIDNo.1、2或3顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列組成，所述輕鏈CDR包含或由序列SEQIDNo.4、5和6或與SEQIDNo.4、5或6顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其任何抗原結(jié)合片段包含三條重鏈CDR和三條輕鏈CDR，所述三條重鏈CDR包含序列SEQIDNo.1、2和3；三條輕鏈CDR包含序列SEQIDNo.4、5和6。已經(jīng)定義IMGT獨(dú)特編號(hào)以比較可變結(jié)構(gòu)域，而不管抗原受體、鏈類型或物種[LefrancM.-P.,ImmunologyToday18,509(1997)/LefrancM.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT獨(dú)特編號(hào)中，保守氨基酸總具有相同的位置，例如半胱氨酸23(第1個(gè)CYS)、色氨酸41(保守-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第2個(gè)CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨(dú)特編號(hào)提供了框架區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界(FR1-IMGT：位置1至26，F(xiàn)R2-IMGT：39至55，F(xiàn)R3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)，和互補(bǔ)決定區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界(CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117)。由于空位代表未占用的位置，CDR-IMGT長度(在括號(hào)中顯示，并由點(diǎn)分隔，例如[8.8.13])成為了關(guān)鍵信息。在被稱作IMGTColliersdePerles的2D圖示中[Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,CurrentBioinformatics,2,21-30(2007)]，和IMGT/3D結(jié)構(gòu)-DB的3D結(jié)構(gòu)中[Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,TcellreceptorandMHCstructuraldata.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]使用IMGT獨(dú)特編號(hào)。必須理解，在本說明書中沒有矛盾的說明情況下，互補(bǔ)決定區(qū)或CDR是指如根據(jù)IMGT編號(hào)系統(tǒng)所定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)。然而，還可以根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義CDR(Kabat等人,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH,1991,和后續(xù)的版本)。有三條重鏈CDR和三條輕鏈CDR。在此處，根據(jù)情況，使用術(shù)語“CDR”和“CDRs”以指示一個(gè)或多個(gè)或甚至所有區(qū)，所述區(qū)含有大部分氨基酸殘基，所述氨基酸殘基負(fù)責(zé)抗體對(duì)其識(shí)別的抗原或表位的結(jié)合親和力。為了簡化本申請(qǐng)的閱讀，沒有定義根據(jù)Kabat的CDR。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，使用根據(jù)IMGT的CDR的定義以根據(jù)Kabat定義CDR是顯而易見的。在本發(fā)明的意義上，兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的“同一性”或“同一性百分比”是指在最佳比對(duì)(optimalalignment)后獲得的、待比較的兩個(gè)序列之間的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比，該百分比是純統(tǒng)計(jì)學(xué)的，并且兩個(gè)序列之間的差異沿著它們的長度隨機(jī)分布。傳統(tǒng)上通過在已經(jīng)將兩個(gè)核酸或氨基酸序列最佳比對(duì)后比較序列，進(jìn)行所述兩個(gè)核酸或氨基酸序列的比較，能夠通過片段或通過使用“比對(duì)窗口”進(jìn)行所述比較。除了手動(dòng)比較，可以利用Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2:482]，利用Needleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48:443]，利用Pearson和Lipman的相似搜索方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]，或利用使用這些算法的計(jì)算機(jī)軟件(在WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI,或通過比較軟件BLASTNR或BLASTP)進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。通過確定位置的數(shù)量，在所述位置氨基酸核苷酸或殘基在兩個(gè)序列之間，優(yōu)選在兩個(gè)完整序列之間是相同的，在比對(duì)窗口中將相同的位置的數(shù)目除以位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100計(jì)算同一性百分比，以獲得兩個(gè)序列之間的同一性百分比。例如，可以按缺省參數(shù)(尤其是對(duì)于參數(shù)“開放空位罰分”:5，和“延伸空位罰分”:2；所選擇的矩陣?yán)鐬橛沙绦蛱岢龅摹癇LOSUM62”矩陣)使用BLAST程序“BLAST2序列”(Tatusova等人,“Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences”,FEMSMicrobiol.,1999,Lett.174:247–250)，所述程序可在網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上獲得；直接由程序計(jì)算待比較的兩個(gè)序列之間的同一性百分比。對(duì)于與參考氨基酸序列顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，優(yōu)選的示例包括含有參考序列，某些修飾尤其是至少一個(gè)氨基酸的缺失、添加或替換，截短或延長的那些。在一個(gè)或多個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸取代的情況下，優(yōu)選取代，其中取代的氨基酸被“等價(jià)的”氨基酸替代。在此處，表述“等價(jià)氨基酸”是指可能取代一個(gè)結(jié)構(gòu)性氨基酸的任何氨基酸，而不改變相應(yīng)抗體和下面定義的那些具體示例的生物活性。等價(jià)氨基酸可以根據(jù)它們與被它們?nèi)〈陌被岬慕Y(jié)構(gòu)同源性或可能產(chǎn)生的各種抗體之間的生物活性的比較試驗(yàn)的結(jié)果來確定。作為非限制性示例，下表1總結(jié)了可能進(jìn)行的可能的取代，所述取代不導(dǎo)致相應(yīng)的修飾抗體的生物活性的顯著改變；在相同條件下逆向取代當(dāng)然是可能的。表1本發(fā)明的一個(gè)特別的方面在于ADC的抗體不結(jié)合至胰島素受體(IR)。該方面是令人關(guān)注的，因?yàn)楸疚乃枋龅目贵w將不會(huì)對(duì)IR具有任何負(fù)面影響，意味著胰島素代謝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體的另一個(gè)有利的方面在于其不僅能夠結(jié)合至人IGF-1R，而且能夠結(jié)合至猴IGF-1R，更特別地結(jié)合至食蟹猴(cynomolgus)IGF-1R。該方面也是令人關(guān)注的，因?yàn)槠鋵⒋龠M(jìn)臨床試驗(yàn)所需要的毒性評(píng)估。在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體由單克隆抗體組成。如本文中所使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“Mab”是指從基本上均質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即除了可能天然存在的突變(可以少量存在)之外，群體的單個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其針對(duì)單個(gè)表位?？梢酝ㄟ^B細(xì)胞或雜交瘤的單個(gè)克隆產(chǎn)生這種單克隆抗體。單克隆抗體還可以為重組的，即通過蛋白質(zhì)工程或化學(xué)合成產(chǎn)生。還可以從噬菌體抗體庫中分離單克隆抗體。此外，與多克隆抗體的制劑相反，所述多克隆抗體典型地包括針對(duì)各種決定簇或表位的各種抗體，每種單克隆抗體針對(duì)抗原的單個(gè)表位。本文的單克隆抗體包括鼠的，嵌合的和人源化的抗體，如以下所描述的。抗體優(yōu)選源自鼠源的雜交瘤，所述雜交瘤存放在法國國家微生物保藏中心(Frenchcollectionformicroorganismcultures)(CNCM，巴斯德研究所，紅色醫(yī)生街25號(hào)，巴黎15區(qū)75724，法國)，通過融合Balb/C免疫的小鼠脾細(xì)胞/淋巴細(xì)胞與骨髓瘤Sp2/O-Ag14細(xì)胞系的細(xì)胞獲得所述雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的IGF-1R抗體由鼠抗體組成，然后被稱作m[抗體的名稱]。在一個(gè)實(shí)施方案中，IGF-1R抗體由嵌合抗體組成，然后被稱作c[抗體的名稱]。在一個(gè)實(shí)施方案中，IGF-1R抗體由人源化抗體組成，然后被稱作hz[抗體的名稱]。為了避免疑問，在下面的說明書中，表述“IGF-1R抗體”和“[抗體的名稱]”是相似的，并且包括(無相反說明)所述IGF-1R抗體或所述“[抗體的名稱]”的鼠的、嵌合的和人源化的形式。當(dāng)必要時(shí)，使用前綴m-(鼠的)、c-(嵌合的)或hz-(人源化的)。為了更清楚，下表2闡明了用于優(yōu)選的抗體的根據(jù)IMGT定義的CDR序列。表2對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，如上面所描述的6個(gè)CDR的任何組合應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。從該表2可以觀察到，本文所描述的所有抗體對(duì)于CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2具有相同的序列，如上面所描述該性質(zhì)是特別令人關(guān)注的。一個(gè)具體的方面涉及一種ADC，其中抗體為鼠抗體，其特征在于所述抗體還包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)，所述恒定區(qū)源自與小鼠，尤其是與人異源的物種的抗體。另一個(gè)具體的方面涉及一種ADC，其中抗體為嵌合(c)抗體，其特征在于所述抗體還包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)，所述恒定區(qū)源自與小鼠，尤其是與人異源的物種的抗體。嵌合抗體為含有源自指定物種的抗體的天然可變區(qū)(輕鏈和重鏈)，以及與所述指定物種異源的物種的抗體的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)的抗體?？梢酝ㄟ^使用重組遺傳學(xué)的技術(shù)制備嵌合抗體。例如，可以通過克隆重組DNA生產(chǎn)嵌合抗體，所述重組DNA含有啟動(dòng)子，和編碼非人單克隆抗體(尤其是鼠)的可變區(qū)的序列，和編碼異源物種抗體恒定區(qū)(優(yōu)選人)的序列。由一種這樣的重組基因編碼的根據(jù)本發(fā)明的ADC的嵌合抗體可以為，例如小鼠-人嵌合體，該抗體的特異性由源自鼠DNA的可變區(qū)決定，其同種型由源自人DNA的恒定區(qū)決定。在一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體選自：a)包含序列SEQIDNo.13或與SEQIDNo.13顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；b)包含序列SEQIDNo.14或與SEQIDNo.14顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.10、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；c)包含序列SEQIDNo.15或與SEQIDNo.15顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和12的三條輕鏈CDR的抗體；d)包含序列SEQIDNo.16或與SEQIDNo.16顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；和e)包含序列SEQIDNo.17或與SEQIDNo.17顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和12的三條輕鏈CDR的抗體?！芭cSEQIDNo.13至17顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列”是指序列，所述序列顯示三條重鏈CDRSEQIDNO.1、2和3，此外在對(duì)應(yīng)于CDR的序列(即SEQIDNo.1、2和3)之外顯示與全序列SEQIDNo.13至17至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性。在另一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體選自：a)包含序列SEQIDNo.18或與SEQIDNo.18顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；b)包含序列SEQIDNo.19或與SEQIDNo.19顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；c)包含序列SEQIDNo.20或與SEQIDNo.20顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；d)包含序列SEQIDNo.21或與SEQIDNo.21顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.8、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和e)包含序列SEQIDNo.22或與SEQIDNo.22顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體?！芭cSEQIDNo.18至22顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列”分別是指序列，所述序列顯示三條輕鏈CDRSEQIDNO.4、5和6，此外在對(duì)應(yīng)于CDR的序列(即SEQIDNo.4、5和6)之外顯示與全序列SEQIDNo.18至22至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab為選自以下的抗體：a)包含序列SEQIDNo.13或與SEQIDNo.13顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.18或與SEQIDNo.18顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體；b)包含序列SEQIDNo.14或與SEQIDNo.14顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.19或與SEQIDNo.19顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體；c)包含序列SEQIDNo.15或與SEQIDNo.15顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.20或與SEQIDNo.20顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體；d)包含序列SEQIDNo.16或與SEQIDNo.16顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.21或與SEQIDNo.21顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體；和e)包含序列SEQIDNo.17或與SEQIDNo.17顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.22或與SEQIDNo.22顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。還可以以恒定結(jié)構(gòu)域表征本文所描述的嵌合抗體，更特別地，所述嵌合抗體可以選自或設(shè)計(jì)為，如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgD或IgE。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，所述嵌合抗體為IgG1或IgG4。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab為嵌合抗體，其包含如上面以IgG1形式描述的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL。更優(yōu)選地，所述嵌合抗體包含序列SEQIDNo.43的VH的恒定結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.45的VL的κ結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab為嵌合抗體，其包含如上面以IgG4形式描述的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL。更優(yōu)選地，所述嵌合抗體包含序列SEQIDNo.44的VH的恒定結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.45的VL的κ結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體選自：a)包含或由序列SEQIDNo.23或與SEQIDNo.23顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.28或與SEQIDNo.28顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；b)包含或由序列SEQIDNo.24或與SEQIDNo.24顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.29或與SEQIDNo.29顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；c)包含或由序列SEQIDNo.25或與SEQIDNo.25顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.30或與SEQIDNo.30顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；d)包含或由序列SEQIDNo.26或與SEQIDNo.26顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.31或與SEQIDNo.31顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；和e)包含或由序列SEQIDNo.27或與SEQIDNo.27顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.32或與SEQIDNo.32顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體。為了更清楚，下表3分別闡明了用于優(yōu)選的嵌合抗體的VH和VL的序列。表3本發(fā)明的另一個(gè)具體的方面涉及一種ADC，其中“Ab”為人源化抗體，其特征在于源自人抗體的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)分別為λ或κ區(qū)和γ-1、γ-2或γ-4區(qū)?！叭嗽椿贵w”是指含有源自非人源抗體的CDR區(qū)的抗體，抗體分子的其他部分源自一種(或幾種)人抗體。此外，可以修飾一些骨架片段殘基(稱為FR)以保留結(jié)合親和力。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備人源化抗體或其片段。這樣的人源化抗體優(yōu)選在涉及體外診斷或體內(nèi)預(yù)防性和/或治療性處理的方法中使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知其他的人源化技術(shù)，例如由PDL在專利EP0451216、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761中描述的“CDR嫁接”技術(shù)。還可以引用美國專利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。作為本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案，并且其將在下文的實(shí)施例中更詳細(xì)地被說明，本文描述了由hz208F2組成的抗體。這種人源化還可以被應(yīng)用于本發(fā)明的其他抗體部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有：i)分別地，序列SEQIDNo.7、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和ii)源自人種系IGHV1-46*01(SEQIDNo.46)的FR1、FR2和FR3，和iii)源自人種系IGHJ4*01(SEQIDNo.48)的FR4。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有：i)分別地，序列SEQIDNo.9、5和11的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和ii)源自人種系IGKV1-39*01(SEQIDNo.47)的FR1、FR2和FR3，和iii)源自人種系IGKJ4*01(SEQIDNo.49)的FR4。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，抗體包含：a)分別具有序列SEQIDNo.7、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重鏈，和源自人種系IGHV1-46*01(SEQIDNo.46)的FR1、FR2和FR3，和源自人種系IGHJ4*01(SEQIDNo.48)的FR4；和b)分別具有序列SEQIDNo.9、5和11的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，和源自人種系IGKV1-39*01(SEQIDNo.47)的FR1、FR2和FR3，和源自人種系IGKJ4*01(SEQIDNo.49)的FR4。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含序列SEQIDNo.33的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和序列SEQIDNo.35的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。所述人源化抗體在下文中將被稱作hz208F2(“變體1”或“Var.1”)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含序列SEQIDNo.33的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含至少1個(gè)選自殘基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的回復(fù)突變。表述“回復(fù)突變(back-mutation)”或“回復(fù)突變(backmutation)”是指存在于種系中的人殘基被替代為最初存在于鼠序列中的相應(yīng)殘基的突變或替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含序列SEQIDNo.33的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)選自殘基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的回復(fù)突變。為了更清楚，下表4闡明了優(yōu)選的回復(fù)突變。表4殘基序號(hào)2034353848505961鼠MIYKLWKN人VMHRMISA殘基序號(hào)627072747677798295鼠ELAKSNAFF人QMRTTSVEY在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含序列SEQIDNo.35的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含至少1個(gè)選自殘基22、53、55、65、71、72、77和87的回復(fù)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含序列SEQIDNo.35的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含2、3、4、5、6、7或8個(gè)選自殘基22、53、55、65、71、72、77或87的回復(fù)突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含：a)序列SEQIDNo.33的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含至少1個(gè)選自殘基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的回復(fù)突變；和b)序列SEQIDNo.35的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含至少1個(gè)選自殘基22、53、55、65、71、72、77和87的回復(fù)突變。為了更清楚，下表5闡明了優(yōu)選的回復(fù)突變。表5殘基序號(hào)2253556571727787鼠SRHRYSNF人TSQSFTSY在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體包含上面提及的所有回復(fù)突變，并且對(duì)應(yīng)于包含序列SEQIDNo.34的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和序列SEQIDNo.36的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體。所述人源化抗體在下文中將被稱作hz208F2(“變體3”或“Var.3”)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涵蓋變體1和變體3之間包含的所有人源化形式。換言之，根據(jù)本發(fā)明的抗體對(duì)應(yīng)于包含“共有”序列SEQIDNo.41的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和“共有”序列SEQIDNo.42的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體?？偟膩碚f，所述人源化抗體在下文中將被稱作hz208F2(“變體2”或“Var.2”)。在一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體選自：a)包含序列SEQIDNo.33或與SEQIDNo.33顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體；和b)包含序列SEQIDNo.34或與SEQIDNo.34顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.9、5和11的三條輕鏈CDR的抗體?！芭cSEQIDNo.33或34顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列”是指序列，所述序列顯示三條重鏈CDRSEQIDNO.1、2和3，此外在對(duì)應(yīng)于CDR的序列(即SEQIDNo.1、2和3)之外顯示與全序列SEQIDNo.33或34至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性。如果在本說明書的相關(guān)段落中未指出，通過任何序列或通過與特定序列顯示至少80％的序列，則必須理解，所述序列顯示與參考序列至少80％，優(yōu)選85％，90％、95％和98％同一性。無論這些序列是否含有CDR序列，其意指序列，所述序列顯示至少這些與參考序列CDR相同的CDR，與全序列具有80％，優(yōu)選85％，90％，95％和98％同一性，需要計(jì)算位于對(duì)應(yīng)于這些CDR的序列之外的剩余序列。在一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體選自：a)包含序列SEQIDNo.35或與SEQIDNo.35顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和b)包含序列SEQIDNo.36或與SEQIDNo.36顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體?！芭cSEQIDNo.35或36顯示至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列”是指序列，所述序列顯示三條輕鏈CDRSEQIDNO.4、5和6，此外在對(duì)應(yīng)于CDR的序列(即SEQIDNo.4、5和6)之外顯示與全序列SEQIDNo.35或36至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性。還可以以恒定結(jié)構(gòu)域表征本文所描述的人源化抗體，更特別地，所述人源化抗體可以選自或設(shè)計(jì)為，如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgD或IgE。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，所述人源化抗體為IgG1或IgG4。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中“Ab”為人源化抗體，其包含如上面以IgG1形式描述的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL。更優(yōu)選地，所述人源化抗體包含序列SEQIDNo.43的VH的恒定結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.45的VL的κ結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中“Ab”為人源化抗體，其包含如上面以IgG4形式描述的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL。更優(yōu)選地，所述人源化抗體包含序列SEQIDNo.44的VH的恒定結(jié)構(gòu)域和序列SEQIDNo.45的VL的κ結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的仍然另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中“Ab”為選自以下的抗體：a)包含或由序列SEQIDNo.37或與SEQIDNo.37顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.39或與SEQIDNo.39顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；和b)包含或由序列SEQIDNo.38或與SEQIDNo.38顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.40或與SEQIDNo.40顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體。為了更清楚，下表6a闡明了人源化抗體hz208F2的變體1(Var.1)和變體3(Var.3)的VH和VL的序列的非限制性示例。其還包含變體2(Var.2)的共有序列。表6a在另一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗體選自：a)包含選自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列或與SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80具有至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和序列SEQIDNo.9、5和1的三條輕鏈CDR的抗體；b)包含選自SEQIDNo.57或60的序列或與SEQIDNo.57或60具有至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，和序列SEQIDNo.7、2和3的三條重鏈CDR的抗體；和c)包含選自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列或與SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80具有至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和選自SEQIDNo.57或60的序列或與SEQIDNo.57或60具有至少80％，優(yōu)選85％、90％、95％和98％同一性的任何序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。本發(fā)明的仍然另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中“Ab”為選自以下的抗體：a)包含序列SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80或與SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈，和序列SEQIDNo.57或與SEQIDNo.57顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈的抗體；和b)包含序列SEQIDNo.56、64、68和78或與SEQIDNo.56、64、68或78顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.60或與SEQIDNo.60顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈的抗體。本發(fā)明的仍然另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種ADC，其中Ab為選自以下的抗體：a)包含或由序列SEQIDNo.58或與SEQIDNo.58顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；b)包含或由序列SEQIDNo.58或與SEQIDNo.58顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.61或與SEQIDNo.61顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；c)包含或由序列SEQIDNo.63或與SEQIDNo.63顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；d)包含或由序列SEQIDNo.65或與SEQIDNo.65顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；e)包含或由序列SEQIDNo.65或與SEQIDNo.65顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.61或與SEQIDNo.61顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；f)包含或由序列SEQIDNo.67或與SEQIDNo.67顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；g)包含或由序列SEQIDNo.69或與SEQIDNo.69顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；h)包含或由序列SEQIDNo.69或與SEQIDNo.69顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.61或與SEQIDNo.61顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；i)包含或由序列SEQIDNo.71或與SEQIDNo.71顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；j)包含或由序列SEQIDNo.73或與SEQIDNo.73顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；k)包含或由序列SEQIDNo.75或與SEQIDNo.75顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；l)包含或由序列SEQIDNo.77或與SEQIDNo.77顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；m)包含或由序列SEQIDNo.79或與SEQIDNo.79顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；n)包含或由序列SEQIDNo.79或與SEQIDNo.79顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.61或與SEQIDNo.61顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體；和o)包含或由序列SEQIDNo.81或與SEQIDNo.81顯示至少80％同一性的任何序列的重鏈和序列SEQIDNo.59或與SEQIDNo.59顯示至少80％同一性的任何序列的輕鏈組成的抗體。換言之，本發(fā)明涉及一種ADC，其中Ab為包含以下的抗體：a)選自SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81的序列或與SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81具有至少80％同一性的任何序列的重鏈；和b)選自SEQIDNo.59和61的序列或與SEQIDNo.59和61具有至少80％同一性的任何序列的輕鏈。為了更清楚，下表6b闡明了人源化抗體hz208F2的不同變體的VH和VL(可變結(jié)構(gòu)域和全長)的序列的非限制性示例。表6b本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種ADC，其中Ab為選自以下的抗體：i)由雜交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736或I-4774生產(chǎn)的抗體，所述雜交瘤分別在2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏于CNCM,法國巴斯德研究所；或ii)與i)的抗體競(jìng)爭結(jié)合至IGF-1R的抗體；或iii)與i)的抗體結(jié)合至IGF-1R的相同表位的抗體。事實(shí)上，在本文中描述了選自雜交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736和I-4774的鼠雜交瘤，所述雜交瘤分別在2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏于CNCM,法國巴斯德研究所。還描述了根據(jù)本發(fā)明的編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的離體的核酸。在本說明書中可互換使用的術(shù)語“核酸”、“核酸序列(nucleicsequence)”、“核酸序列(nucleicacidsequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”是指精確的核苷酸序列，其為修飾的或未修飾的，其定義核酸的片段或區(qū)域，其含有或不含有非天然核苷酸，并且其為雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這些序列已經(jīng)被分離和/或純化，即它們被直接或間接采樣，例如通過拷貝，其環(huán)境已經(jīng)被至少部分地修飾。在此處還應(yīng)該提及通過重組遺傳學(xué)，例如利用宿主細(xì)胞獲得的離體的核酸，或通過化學(xué)合成獲得的離體的核酸。還描述了載體，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸，還特別描述了含有這樣的核苷酸序列的克隆和/或表達(dá)載體。載體優(yōu)選含有元件，所述元件允許指定宿主細(xì)胞中的核苷酸序列的表達(dá)和/或分泌。因此，載體可以含有啟動(dòng)子，翻譯起始和終止信號(hào)，以及合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。其必須能夠以穩(wěn)定的方式保持在宿主細(xì)胞中，并且可以任選具有特異性信號(hào)，所述信號(hào)指定經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)的分泌。由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞選擇和優(yōu)化這些不同的元件。為了該目的，核苷酸序列可以被插入所選宿主內(nèi)的自我復(fù)制載體中，或者為所選宿主的整合載體。載體例如為質(zhì)粒或病毒來源的載體。它們用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以克隆或表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法制備這樣的載體，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法將所得的克隆導(dǎo)入至合適的宿主中，所述標(biāo)準(zhǔn)方法如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、綴合、熱休克或化學(xué)方法。通過如上面所描述的載體轉(zhuǎn)化這些離體的宿主細(xì)胞，或者這些離體的宿主細(xì)胞包含如上面所描述的載體。宿主細(xì)胞可以選自原核或真核系統(tǒng)，例如細(xì)菌細(xì)胞，但也可以選自酵母細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(除了人)。還可以使用昆蟲或植物細(xì)胞。還公開了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的ADC的抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其中所述方法包括以下步驟：a)在在介質(zhì)中于合適的培養(yǎng)條件培養(yǎng)如上面所公開的宿主細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)介質(zhì)或從所述培養(yǎng)的細(xì)胞中回收由此產(chǎn)生的抗體。在用于制備根據(jù)本發(fā)明的ADC的重組抗體的方法中使用經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本說明書中還包括用于使用如上面所公開的載體和/或由載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制備重組形式的抗體的方法。優(yōu)選地，在某種條件下培養(yǎng)如上面所描述的由載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述條件允許上述抗體的表達(dá)和所述抗體的回收。如已經(jīng)提及的，宿主細(xì)胞可以選自原核或真核系統(tǒng)。特別地，在這樣的原核或真核系統(tǒng)中能夠鑒定促進(jìn)分泌的核苷酸序列。因此，如上面所公開的攜帶這樣的序列的載體可以有利地用于待分泌的重組蛋白的生產(chǎn)。事實(shí)上，這些令人感興趣的重組蛋白存在于細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中而非在宿主細(xì)胞內(nèi)，這將促進(jìn)所述重組蛋白的純化。還可以通過化學(xué)合成制備本發(fā)明的ADC的抗體。一種這樣的制備方法也是本發(fā)明的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于化學(xué)合成的方法，如通過片段的縮合或通過溶液中的常規(guī)合成的固相技術(shù)或部分固相技術(shù)。還可以引用通過化學(xué)合成獲得并且能夠含有對(duì)應(yīng)的非天然氨基酸的多肽。本發(fā)明還包括通過上面所描述的方法可能獲得的抗體。根據(jù)一個(gè)特別的方面，本發(fā)明涉及一種ADC，其中AB為如上面所描述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其用作尋址載體(addressingvehicle)用于在宿主靶位點(diǎn)遞送細(xì)胞毒試劑，所述宿主靶位點(diǎn)由表位組成，所述表位被定位于IGF-1R，優(yōu)選IGF-1R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選人IGF-1R(SEQIDNo.50)，還更優(yōu)選人IGF-1R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQIDNo.51)，還更優(yōu)選至人IGF-1R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N-末端(SEQIDNo.52)或其任何天然變體序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主靶位點(diǎn)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的靶位點(diǎn)，更優(yōu)選人細(xì)胞的靶位點(diǎn)，更優(yōu)選天然表達(dá)或通過基因重組表達(dá)IGF-1R的細(xì)胞的靶位點(diǎn)。在更多的實(shí)施方案中，所述宿主靶位點(diǎn)為患有癌癥的患者的細(xì)胞的靶位點(diǎn)，所述患者優(yōu)選為人，所述癌癥優(yōu)選為表達(dá)IGF-1R的癌癥或IGF-1R相關(guān)的癌癥。表達(dá)IGF-1R的癌癥或IGF-1R相關(guān)的癌癥特別地包括癌癥，其中腫瘤細(xì)胞在其表面表達(dá)或過表達(dá)全部或部分的IGF-1R。II-藥物(D)根據(jù)本發(fā)明的藥物部分具有下式(II)其中：-R2為COOH、COOCH3或噻唑基(如噻唑-2-基)，-R3為H或(C1-C6)烷基(如甲基)，特別是(C1-C6)烷基，-R9為H或(C1-C6)烷基(如甲基)，-m為1至8之間的整數(shù)，和-波浪線表示與L連接的點(diǎn)。本發(fā)明中的“烷基”是指直鏈或支鏈、飽和的烴鏈。例如，可以提及的是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。本發(fā)明中的“(Cx-Cy)烷基”是指包含x至y個(gè)碳原子的如上面所定義的烷基鏈。因此，(C1–C6)烷基為具有1至6個(gè)碳原子的烷基鏈。(C1–C6)烷基有利地為(C1–C4)烷基，優(yōu)選(C1–C2)烷基。在本發(fā)明的化合物中，一類特別推薦的藥物部分對(duì)應(yīng)于式(II)的藥物部分，其中R2表示COOH基團(tuán)。另一類特別推薦的部分對(duì)應(yīng)于式(II)的部分，其中R2為噻唑(特別是噻唑-2-基)。另一類特別推薦的部分對(duì)應(yīng)于式(II)的部分，其中R2為COOMe。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案，R2更特別地為COOH、COOMe或噻唑-2-基。根據(jù)第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，R2為COOH。根據(jù)第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，R2為COOMe。R3特別地表示(C1-C6)烷基，有利地為甲基。m為1至8之間，特別地1至6之間，有利地1至4之間的整數(shù)，優(yōu)選為1或2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2為COOH，R3為甲基，且m為1或2。在本發(fā)明的藥物部分中，一類特別推薦的藥物部分對(duì)應(yīng)于式(II)的藥物部分，其中R9為甲基或氫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中：-R2為COOH，R3為甲基，R9為甲基，且m為1或2，或-R2為COOH，R3為甲基，R9為氫，且m為1或2。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，NR9基團(tuán)位于苯環(huán)上相對(duì)于(CH2)m基團(tuán)的對(duì)位。有利地，藥物部分選自以下部分：(式DH的)藥物的制備：可以使用在下面合成方案中描述的一般方法制備藥物，所述一般方法當(dāng)需要時(shí)任選補(bǔ)充任何標(biāo)準(zhǔn)操作，所述操作描述于文獻(xiàn)中或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，或描述于本文實(shí)驗(yàn)部分的實(shí)施例中。方案1闡明第一種可用于制備藥物的一般方法。在上面通式中，R1＝H，R2和R3如前面式II中所定義，R4代表R4a代表任選為受保護(hù)形式的如前面所定義的R4基團(tuán)，且G為保護(hù)基。第一步由化合物(II)與化合物(III)的縮合組成，所述化合物(II)在其胺官能團(tuán)上受保護(hù)基G保護(hù)。X可以代表離去基如氯。在這種情況下，第一步由酰氯(acidchloride)與胺的反應(yīng)組成?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)進(jìn)行該反應(yīng)。在一個(gè)特別推薦的方法中，在有機(jī)或無機(jī)堿，例如Et3N、iPr2NEt、吡啶、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在溶劑如THF、二氯甲烷、DMF、DMSO中，尤其在-20℃至100℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。X還可以為羥基(OH)。在這種情況下，第一步為羧酸(II)和胺(III)的縮合反應(yīng)?？梢砸罁?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)進(jìn)行該反應(yīng)。在一個(gè)特別推薦的方法中，在偶聯(lián)劑如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺(EDC)、3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮、叔胺如二異丙基乙胺的存在下，在極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。在另一個(gè)特別推薦的方法中，在氰基磷酸二乙酯(DEPC)、叔胺如三乙胺的存在下，在極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷或DMF中，在-15℃至40℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。另一個(gè)特別推薦的方法由以下組成：在O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲六氟磷酸酯(HATU)、叔胺如二異丙基乙胺的存在下，在極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷或DMF中，在-15℃至100℃的溫度使這兩種實(shí)體反應(yīng)。在使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)(《ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis》,T.W.Greene,JohnWiley&Sons,2006和《ProtectingGroups》,P.J.Kocienski,ThiemeVerlag,1994)將中間體脫保護(hù)后，可以依據(jù)上面所描述的方法和技術(shù)將化合物(IV)與化合物(V)縮合，以在脫保護(hù)步驟后產(chǎn)生化合物(VI)。然后，在與中間體(VII)縮合并任選脫保護(hù)后，該化合物可以導(dǎo)致藥物的形成?；衔?VI)還可以與化合物(VII’)偶聯(lián)，其中R’3為R3的前體，特別是受保護(hù)基保護(hù)的R3基團(tuán)?；鶊F(tuán)R’3脫保護(hù)產(chǎn)生R3之后，可以依據(jù)如前面所描述的相同程序進(jìn)行偶聯(lián)。方案2闡明第二種可用于制備藥物的一般方法。在上面通式中，G為保護(hù)基，R1＝H，R2、R3和R4a如前面所定義，且R4b代表在第一步，將在其胺官能團(tuán)上受保護(hù)基G保護(hù)的化合物(IX)與化合物(VI)縮合。X可以代表離去基，例如氯。在這種情況下，第一步由酰氯與胺的反應(yīng)組成?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)進(jìn)行該反應(yīng)。在一個(gè)特別推薦的方法中，在有機(jī)或無機(jī)堿，如Et3N、iPr2NEt、吡啶、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在溶劑如THF、二氯甲烷、DMF、DMSO中，尤其在-20°至100℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。X還可以代表羥基。在這種情況下，第一步為羧酸(IX)與胺(VI)的縮合反應(yīng)。可以依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)進(jìn)行該反應(yīng)。在一個(gè)特別推薦的方法中，在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺(EDC)、3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮、叔胺如二異丙基乙胺的存在下，在極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。在另一個(gè)特別推薦的方法中，在氰基磷酸二乙酯(DEPC)、叔胺如三乙胺的存在下，在極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的溫度，使這兩種實(shí)體進(jìn)行反應(yīng)。在中間體脫保護(hù)后，使用技術(shù)人員熟知的技術(shù)，將所得的化合物(VIII)與R4Y反應(yīng)后可以產(chǎn)生藥物。在這種情況下，Y為離去基如Cl、Br、I、OSO2CH3、OSO2CF3或O-甲苯磺?；Ｔ谟袡C(jī)或無機(jī)堿，如Et3N、iPr2NEt、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在極性無水溶劑如二氯甲烷、THF、DMF、DMSO中，尤其在-20°至100℃的溫度進(jìn)行該反應(yīng)。在另一個(gè)特別推薦的方法中，使化合物(VIII)與式R4b-CHO的醛進(jìn)行反應(yīng)，其中R4b對(duì)應(yīng)于R4的前體。在這種情況下，該反應(yīng)為在還原劑如NaBH4、NaBH3CN、NaBH(OAc)3的存在下，在極性溶劑如1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、THF、DMF、MeOH中，任選在異丙醇鈦(IV)的存在下，在可以通過加入酸如乙酸控制的pH，尤其在-20℃至100℃的溫度的還原胺化反應(yīng)。在前述合成方案中，在附加的反應(yīng)步驟如皂化反應(yīng)(例如使用技術(shù)人員熟知的方法)之后一種藥物可以產(chǎn)生另一種藥物，由此將代表酯(COOMe)的R2基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)榇眙人?COOH)的R2基團(tuán)。如果期望在酸加成鹽的狀態(tài)下分離含有至少一個(gè)堿官能團(tuán)的藥物，則可以通過用合適的酸(優(yōu)選以等同的量)處理藥物的游離堿(含有至少一個(gè)堿官能團(tuán))。合適的酸可以特別地為三氟乙酸。III-接頭(L)在本發(fā)明中，“接頭”、“接頭單元”、“L”或“連接(link)”是指包含共價(jià)鍵或原子鏈的化學(xué)部分，其將至少一種藥物共價(jià)連接至抗體。可以使用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備接頭，所述偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞氨基四氫噻吩(iminothiolane，IT)、亞氨酸酯的雙官能團(tuán)衍生物(如二甲基己二酰亞胺鹽酸鹽(dimethyladipimidateHCl))、活性酯(如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種示例性螯合劑，用于將細(xì)胞毒試劑綴合至尋址系統(tǒng)。其他交聯(lián)劑可以為BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB和SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它們是市售可得的(例如，購自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,美國)。接頭可以為“不可裂解的”或“可裂解的”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其在于“可裂解的接頭”促進(jìn)藥物在細(xì)胞中的釋放。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭或含有二硫化物的接頭。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭在細(xì)胞內(nèi)條件下是可裂解的，使得在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中裂解接頭從抗體上釋放藥物。例如，在一些實(shí)施方案中，可以通過裂解劑裂解接頭，所述裂解劑存在于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中(例如，在溶酶體或核內(nèi)體(endosome)或胞膜窖內(nèi))。接頭可以為例如肽基接頭，其被細(xì)胞內(nèi)肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶體蛋白酶或核內(nèi)體蛋白酶)裂解。典型地，肽基接頭包含至少兩個(gè)連續(xù)的氨基酸或至少三個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者為至少兩個(gè)氨基酸長或至少三個(gè)氨基酸長。裂解劑可以包括組織蛋白酶B和D及纖溶酶，所有這些都已知水解二肽藥物衍生物，導(dǎo)致活性藥物在靶細(xì)胞內(nèi)的釋放。例如，可以使用可被硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B裂解的肽基接頭(例如，包含或?yàn)镻he-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly的接頭)，所述組織蛋白酶B在癌性組織中是高表達(dá)的。在具體的實(shí)施方案中，可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶裂解的肽基接頭包含或者為Val-Cit或Phe-Lys。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白水解藥物釋放的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，當(dāng)綴合時(shí)藥物常被減弱，并且綴合物的血清穩(wěn)定性通常是高的。在其他實(shí)施方案中，可裂解的接頭是pH敏感的，即在某些pH值時(shí)對(duì)水解敏感。典型地，pH敏感接頭在酸性條件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶體中可水解的酸不穩(wěn)定接頭(例如，腙、縮氨基脲、縮氨基硫脲、順烏頭酰胺、原酸酯、縮醛、縮酮等)。該接頭在中性pH條件下(例如在血液中的那些)是相對(duì)穩(wěn)定的，但在低于pH5.5或5.0(接近于溶酶體的pH)時(shí)是不穩(wěn)定的。在某些實(shí)施方案中，可水解接頭為硫醚接頭(例如，經(jīng)由酰腙鍵連接至藥物的硫醚)。在其他實(shí)施方案中，接頭在還原條件下是可裂解的(例如二硫化物接頭)。各種二硫化物接頭是本領(lǐng)域已知的，包括例如，使用SATA(N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?、SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMTP(N-琥珀酰亞胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)可以形成的那些。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭單元可以具有以下通式：-(T)a-(W)w-(Y)y-其中：T為拉伸子單元(stretcherunit)；a為0或1；W為氨基酸單元；w為0至12之間的整數(shù)；Y為間隔子單元(spacerunit)；y為0、1或2。拉伸子單元(T)(當(dāng)存在時(shí))將抗體連接至氨基酸單元(W)(當(dāng)存在時(shí))，或連接至間隔子單元(當(dāng)存在時(shí))，或直接連接至藥物。有用的官能團(tuán)包括巰基、氨基、羥基、碳水化合物的異頭(anomeric)羥基和羧基，所述官能團(tuán)可以天然地存在于抗體上，或經(jīng)由化學(xué)改造存在于抗體上。合適的官能團(tuán)為巰基和氨基?？梢酝ㄟ^抗體的分子內(nèi)二硫鍵的還原產(chǎn)生巰基(如果存在)?？商娲兀梢酝ㄟ^抗體賴氨酸部分的氨基與2-亞氨基四氫噻吩或其他巰基生成試劑的反應(yīng)產(chǎn)生巰基。在具體的實(shí)施方案中，將抗體工程化以攜帶一個(gè)或多個(gè)賴氨酸。更優(yōu)選地，可以將抗體工程化以攜帶一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸(參見ThioMab)。在某些具體的實(shí)施方案中，拉伸子單元與抗體的硫原子形成鍵。硫原子可以源自經(jīng)還原的抗體的巰基(-SH)。在某些其他的具體實(shí)施方案中，經(jīng)由抗體的硫原子與拉伸子單元的硫原子之間的二硫鍵將拉伸子單元連接至抗體。在其他的具體實(shí)施方案中，拉伸子的反應(yīng)性基團(tuán)含有反應(yīng)性位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與抗體的氨基可以反應(yīng)。氨基可以為精氨酸或賴氨酸的氨基。合適的胺反應(yīng)位點(diǎn)包括但不限于活化酯(例如琥珀酰亞胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯基酯)、酸酐、酰氯、磺酰氯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。在另一個(gè)方面，拉伸子的反應(yīng)性官能團(tuán)包含反應(yīng)性位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與可存在于抗體上的修飾的碳水化合物基團(tuán)反應(yīng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使抗體酶促糖基化以提供碳水化合物部分，或者使抗體天然糖基化?？梢杂迷噭┤绺叩馑徕c溫和地氧化碳水化合物，并且可以將經(jīng)氧化的碳水化合物的所得的羰基單元與拉伸子縮合，所述拉伸子含有官能團(tuán)如酰肼、肟、反應(yīng)性胺、肼、氨基硫脲、羧酸肼或芳基酰肼。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，拉伸子單元具有下式：其中L2為(C4-C10)環(huán)烷基-羰基、(C2-C6)烷基或(C2-C6)烷基-羰基(環(huán)烷基或烷基部分被連接至馬來酰亞胺部分的氮原子)，星號(hào)表示與氨基酸單元(如果存在)連接的點(diǎn)，與間隔子單元(如果存在)連接的點(diǎn)，或與藥物D連接的點(diǎn)，和波浪線表示與抗體Ab連接的點(diǎn)。本發(fā)明中的“(C4-C10)環(huán)烷基”是指具有4至10個(gè)碳原子的烴環(huán)，包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基等。L2可以有利地為(C2-C6)烷基-羰基，如下式的戊基-羰基：其中星號(hào)表示與氨基酸單元(如果存在)連接的點(diǎn)，與間隔子單元(如果存在)連接的點(diǎn)，或與藥物D連接的點(diǎn)；和波浪線表示與馬來酰亞胺部分的氮原子連接的點(diǎn)。氨基酸單元(W)(當(dāng)存在時(shí))將拉伸子單元(T)(如果存在)或要將抗體連接至間隔子單元(Y)(如果存在間隔子單元)，或連接至藥物(如果不存在間隔子單元)。如上面所提及，(W)w不存在(w＝0)或者可以為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元，其中形成肽的氨基酸可以彼此不同。因此，可以通過下式代表(W)w：(W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5，其中每個(gè)W1至W5彼此獨(dú)立地代表氨基酸單元，并且每個(gè)w1至w5為0或1。在一些實(shí)施方案中，氨基酸單元(W)w可以包含氨基酸殘基(如天然存在的那些)，以及次要(minor)氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，如瓜氨酸。氨基酸單元(W)w的氨基酸殘基包括但不限于丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、用乙?；蚣柞；Ｗo(hù)的或未保護(hù)的賴氨酸、精氨酸、用甲苯磺?；蛳趸Ｗo(hù)的或未保護(hù)的精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、用乙?；蚣柞；Ｗo(hù)的鳥氨酸、和瓜氨酸。示例性的氨基酸接頭組分優(yōu)選包括二肽、三肽、四肽或五肽，尤其是二肽或三肽。示例性的二肽包括：Val-Cit、Ala-Val、Ala-Ala、Val-Ala、Lys-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Phe、Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-硝基-Arg。示例性的三肽包括：Val-Ala-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Phe-Phe-Lys、Gly-Gly-Gly、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys。示例性的四肽包括：Gly-Phe-Leu-Gly(SEQIDNO.53)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQIDNO.54)。示例性的五肽包括：Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQIDNO.55)。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，(W)w可以為二肽(即w＝2)如Val-Cit，或者接頭缺少氨基酸單元(w＝0)。當(dāng)接頭缺少氨基酸單元時(shí)，其優(yōu)選也缺少間隔子單元。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，w＝0(即(W)w為單鍵)或w＝2(即(W)w為二肽)，因此(W)w可以選自：并且特別地為Val-Cit，其中星號(hào)表示與間隔子單元(如果存在)連接的點(diǎn)，或與藥物D連接的點(diǎn)；和波浪線表示與L2連接的點(diǎn)。氨基酸接頭組分可以在其對(duì)特定酶的酶切選擇性方面被設(shè)計(jì)和優(yōu)化，所述酶例如，與腫瘤相關(guān)的蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D或纖溶酶蛋白酶。接頭的氨基酸單元可以被酶(包括但不限于，與腫瘤相關(guān)的蛋白酶)酶裂解，以釋放藥物。氨基酸單元可以在其對(duì)特定的與腫瘤相關(guān)的蛋白酶的酶切選擇性方面被設(shè)計(jì)和優(yōu)化。合適的單元為那些單元，其裂解被蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D和纖溶酶催化。間隔子單元(Y)(當(dāng)存在時(shí))將氨基酸單元(如果存在)或拉伸子單元(如果存在)或抗體連接至藥物。間隔子單元有兩種一般類型：自分解的(self-immolative)和非自分解的。非自分解的間隔子單元為間隔子單元，其中在氨基酸單元從抗體-藥物綴合物中的酶裂解之后，部分或全部的間隔子單元依然結(jié)合在藥物上。非自分解的間隔子單元的示例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)間隔子單元和甘氨酸間隔子單元。為了釋放藥物，在靶細(xì)胞內(nèi)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行獨(dú)立的水解反應(yīng)，以裂解甘氨酸-藥物單元鍵。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，非自分解的間隔子單元(Y)為Gly?？商娲兀凶苑纸獾拈g隔子單元的抗體-藥物綴合物無需單獨(dú)的水解步驟即可釋放藥物。在這些實(shí)施方案中，(Y)為對(duì)氨基芐醇(PAB)單元的殘基，其經(jīng)由PAB基團(tuán)的氮原子連接至(W)w，并經(jīng)由酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基直接連接至藥物。自分解的間隔子的其他示例包括但不限于與PAB基團(tuán)在電性上(electronically)等價(jià)的芳香族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物的殘基和鄰或?qū)Π被S基縮醛的殘基?？梢允褂迷邗０锋I水解后易于經(jīng)歷環(huán)化的間隔子，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺、適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系統(tǒng)和2-氨基苯基丙酸酰胺。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，間隔子單元為支化的雙(羥甲基)苯乙烯(BHMS)單元，其可以用于并入額外的藥物。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，間隔子單元(Y)為PAB-羰基，其中PAB為(PAB單元的氧連接至羰基)，并且y＝1或接頭缺少間隔子單元(y＝0)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，接頭具有下式(III)：其中L2為(C4-C10)環(huán)烷基-羰基、(C2-C6)烷基或(C2-C6)烷基-羰基(這些部分的羰基(當(dāng)存在時(shí))連接至(W)w)，W表示氨基酸單元，其中w表示0至5之間的整數(shù)，Y為PAB-羰基，其中PAB為(PAB單元的氧連接至羰基)，并且y為0或1(優(yōu)選當(dāng)w為0時(shí)，y為0，且當(dāng)w為1至5時(shí)，y為0或1)，星號(hào)表示與藥物D連接的點(diǎn)，和波浪線表示與抗體Ab連接的點(diǎn)。有利地，L2為(C2-C6)烷基-羰基，如下式的戊基-羰基：其中星號(hào)表示與(W)w連接的點(diǎn)；和波浪線表示與馬來酰亞胺部分的氮原子連接的點(diǎn)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，接頭L選自：其中星號(hào)表示與藥物D連接的點(diǎn)，并且波浪線表示與抗體Ab連接的點(diǎn)。IV-抗體-藥物綴合物(ADC)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備本發(fā)明的抗體-藥物綴合物，所述方法如，但不限于，i)抗體的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，然后與藥物的親核基團(tuán)反應(yīng)，或ii)藥物的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，然后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)?？贵w上的親核基團(tuán)包括但不限于N-末端胺基、側(cè)鏈胺基(例如賴氨酸)、側(cè)鏈巰基和當(dāng)抗體糖基化時(shí)糖羥基或氨基。藥物上的親核基團(tuán)包括但不限于胺基、硫醇基和羥基，優(yōu)選胺基。胺基、硫醇基和羥基是親核性的，并且能夠反應(yīng)以與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)形成共價(jià)鍵，所述接頭部分和接頭試劑包括但不限于活性酯如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酰基鹵；烷基鹵化物和芐基鹵化物，如鹵代乙酰胺；醛；酮；羧基；和馬來酰亞胺基團(tuán)?？贵w可以具有可還原的鏈間二硫化物，即半胱氨酸橋。可以通過用還原劑如DTT(二硫蘇糖醇)處理，使抗體具有與接頭試劑綴合的反應(yīng)性。因此，每個(gè)半胱氨酸橋在理論上將形成兩個(gè)反應(yīng)性硫醇親核體(nucleophile)。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何反應(yīng)，將另外的親核基團(tuán)引入抗體中。作為非限制性示例，可以通過引入一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基將反應(yīng)性巰基引入抗體中。還可以通過修飾抗體引入親電部分以產(chǎn)生抗體-藥物綴合物，所述親電部分可以與接頭試劑上的親核取代基反應(yīng)。可以氧化糖基化抗體的糖，以形成可以與接頭試劑或藥物的胺基反應(yīng)的醛基或酮基。所得的亞胺希夫(Schiff)堿基團(tuán)可以形成穩(wěn)定的鍵，或者可以還原形成穩(wěn)定的胺鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可以在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生羰(醛和酮)基，其可以與藥物上合適的基團(tuán)反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可以與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生醛代替第一氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過制備藥物-接頭部分，然后將抗體的親核基團(tuán)(例如半胱氨酸部分的SH基團(tuán))與藥物-接頭部分的親電基團(tuán)(例如馬來酰亞胺)偶聯(lián)，制備本發(fā)明的抗體-藥物綴合物。1.藥物-接頭可以通過以下偶聯(lián)制備藥物-接頭部分：-將接頭與藥物偶聯(lián)，-在完成接頭的合成之前，將接頭的一部分與藥物偶聯(lián)，-在完成藥物的合成之前，將接頭與藥物的一部分或前體偶聯(lián)，或者-在完成接頭和藥物的合成之前，將接頭的一部分與藥物的一部分或前體偶聯(lián)。親核基團(tuán)與親電基團(tuán)之間的偶聯(lián)反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的反應(yīng)。親核基團(tuán)可以特別地為胺基、硫醇基或羥基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為伯或仲胺基團(tuán)。親電基團(tuán)可以為任選處于活化形式的羧酸基團(tuán)(COOH)或活化的碳酸酯部分。羧酸的“活化形式”是指羧酸，其中COOH官能團(tuán)的OH部分已被活化的離去基(LG)替代，所述離去基(LG)能夠?qū)⒒罨聂人峄鶊F(tuán)與氨基偶聯(lián)，以形成酰胺鍵并釋放化合物L(fēng)G-H。活化形式可以為活化酯、活化酰胺、酸酐或酰基鹵，如酰氯(acylchloride)?；罨グㄓ婶人峄鶊F(tuán)與N-羥基苯并三唑或N-羥基琥珀酰亞胺的反應(yīng)形成的衍生物?！盎罨奶妓狨ァ笔侵赴?OC(O)OR部分的碳酸酯，其中OR代表好的離去基，所述離去基能夠?qū)⒒罨奶妓狨ヅc氨基偶聯(lián)，以形成氨基甲酸酯部分并釋放化合物ROH。活化的碳酸酯的R基包括但不限于對(duì)硝基苯基、五氟苯基、2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基和芐基，優(yōu)選對(duì)硝基苯基和五氟苯基。當(dāng)接頭具有下式(III)時(shí)：藥物-接頭部分具有下式(IV)：并且藥物-接頭部分的合成的最后步驟通常為下式(V)的化合物與下式(VI)的化合物的偶聯(lián)：其中L2如前面所定義，并且LG代表離去基，尤其是鹵化物如氯化物，或衍生自N-羥基琥珀酰亞胺的基團(tuán)，H-(W)w-(Y)y-D(VI)。當(dāng)y＝1且Y＝PAB-羰基時(shí)，可以通過將藥物(DH)與下式(VII)的化合物(優(yōu)選其受保護(hù)的形式)偶聯(lián)，制備式(VI)的化合物：G-(W)w-PAB-CO-OR(VII)其中W和w如前面所定義，R如在“活化的碳酸酯”的定義中所定義，并且G為H或保護(hù)基。當(dāng)式(VII)的化合物為受保護(hù)的形式時(shí)，最后的脫保護(hù)步驟是必要的。當(dāng)y＝0時(shí)，化合物(VI)具有式H-(W)w-D，其中(W)w和優(yōu)選地D由氨基酸單元組成。因此在這種情況下，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)的肽合成方法制備化合物(VI)。2.Ab-接頭-藥物根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案由存在于抗體上的半胱氨酸與藥物-接頭部分的親電基團(tuán)的偶聯(lián)組成，優(yōu)選由存在于抗體上的半胱氨酸與存在于藥物-接頭部分上的馬來酰亞胺部分的偶聯(lián)組成?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行馬來酰亞胺-半胱氨酸偶聯(lián)。通常，抗體不含有許多(如果有的話)游離的和反應(yīng)性的半胱氨酸硫醇基團(tuán)，所述基團(tuán)可以連接至藥物部分?？贵w中的大部分半胱氨酸硫醇?xì)埢鳛槎驑虼嬖冢⑶冶仨氂眠€原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或TCEP，在部分或全部還原條件下還原?？梢酝ㄟ^多種不同的方式控制ADC的負(fù)載(loading)(藥物/抗體比例)，包括：(i)限制藥物-接頭中間體(D-L)或接頭試劑相對(duì)于抗體的摩爾過量，(ii)限制綴合反應(yīng)時(shí)間或溫度，和(iii)用于半胱氨酸巰基修飾的部分或有限還原條件。人IgG的二硫鍵結(jié)構(gòu)現(xiàn)在已被很好地確定(綜述于Liu和May,mAbs4(2012):17-23)。事實(shí)上，對(duì)于4種人IgG亞類(即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的二硫鍵結(jié)構(gòu)，存在許多相似性和一些差異。所有IgG亞類總是含有12個(gè)鏈內(nèi)二硫橋，并且差異存在于它們?cè)谥劓満洼p鏈之間形成的鏈間二硫鍵中。每個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵與單個(gè)IgG結(jié)構(gòu)域，即可變(VL和VH)和恒定(CL、CH1、CH2和CH3)結(jié)構(gòu)域相關(guān)。2個(gè)重鏈在其鉸鏈區(qū)通過可變數(shù)目的二硫橋相連：IgG1和IgG4有2個(gè)，IgG2有4個(gè)，IgG3有11個(gè)。IgG1的重鏈和輕鏈通過輕鏈的最后的半胱氨酸殘基和重鏈的第五個(gè)殘基之間的二硫鍵相連，而對(duì)于其他亞類IgG2、IgG3和IgG4，輕鏈通過輕鏈的最后的半胱氨酸殘基和重鏈的第三個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接至重鏈，所述第三個(gè)半胱氨酸殘基位于VH和CH1結(jié)構(gòu)域的界面。已經(jīng)描述了IgG2和IgG4的除了這些經(jīng)典結(jié)構(gòu)以外的二硫鍵結(jié)構(gòu)(綜述于Liu和May,mAbs4(2012):17-23)。鏈間二硫鍵是高度溶劑暴露的，因此其比鏈內(nèi)二硫鍵更加活潑，所述鏈內(nèi)二硫鍵被埋在每個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的反平行β-折疊結(jié)構(gòu)中，并且其不是溶劑暴露的。由于這些原因，無論抗體同種型，在溫和還原后，將在鏈間暴露的半胱氨酸殘基上發(fā)生偶聯(lián)。因此，每個(gè)鏈間二硫橋理論上可以形成兩個(gè)綴合位點(diǎn)。通過賴氨酸與2-亞氨基四氫噻吩(特勞特(Traut's)試劑)的反應(yīng)，使胺轉(zhuǎn)化為硫醇，可以將額外的親核基團(tuán)引入抗體中。還可以通過將一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基工程化(例如，制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變抗體)，將反應(yīng)性巰基引入抗體(或其片段)中。US7521541教導(dǎo)了通過反應(yīng)性半胱氨酸氨基酸的引入將抗體工程化。半胱氨酸氨基酸可以在抗體的反應(yīng)位點(diǎn)被工程化，并且其不形成鏈內(nèi)或分子間二硫鍵(Junutula,等人,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249)。工程化的半胱氨酸硫醇可以與本發(fā)明的接頭試劑或藥物-接頭試劑反應(yīng)，以形成具有半胱氨酸工程化的抗體和藥物部分的ADC，所述接頭試劑或藥物-接頭試劑具有巰基反應(yīng)性親電基團(tuán)，如馬來酰亞胺或α-鹵代酰胺。因此，藥物部分的位置可以被設(shè)計(jì)、控制和知曉。藥物負(fù)載可以被控制，因?yàn)楣こ袒陌腚装彼崃虼蓟鶊F(tuán)通常以高產(chǎn)率與巰基反應(yīng)性接頭試劑或藥物-接頭試劑反應(yīng)。通過在重鏈或輕鏈上的單個(gè)位點(diǎn)的取代將IgG抗體工程化，以引入半胱氨酸氨基酸，在對(duì)稱的抗體上產(chǎn)生了兩個(gè)新的半胱氨酸?？梢杂镁Y合產(chǎn)品ADC的接近同質(zhì)性(homogeneity)實(shí)現(xiàn)接近2的藥物負(fù)載。當(dāng)抗體的大于一個(gè)親核基團(tuán)或親電基團(tuán)與藥物-接頭中間體反應(yīng)，或者與接頭試劑反應(yīng)然后與藥物部分試劑反應(yīng)時(shí)，則所得的產(chǎn)物為ADC化合物的混合物，其具有連接至抗體的藥物部分的分布，例如1、2、3等。液相色譜法(如聚合反相(PLRP)和疏水相互作用(HIC))可以按藥物負(fù)載值分離混合物中的化合物?？梢苑蛛x具有單一藥物負(fù)載值(p)的ADC的制劑，然而，這些單一負(fù)載值的ADC仍然可能為異質(zhì)混合物，因?yàn)樗幬锊糠挚梢越?jīng)由接頭連接至抗體的不同位點(diǎn)。對(duì)于一些抗體-藥物綴合物，藥物比例可能受到抗體上連接位點(diǎn)的數(shù)量的限制。高的藥物負(fù)載(例如藥物比例>5)可以導(dǎo)致某些抗體-藥物綴合物的聚集、不溶解、毒性或細(xì)胞通透性的喪失。典型地，在綴合反應(yīng)期間，將比理論最大值小的藥物部分綴合至抗體。藥物負(fù)載(也被稱作藥物-抗體比例(DAR))為每個(gè)細(xì)胞結(jié)合試劑的平均藥物數(shù)量。對(duì)于抗體IgG1和IgG4同種型，其中藥物在部分抗體還原后結(jié)合至半胱氨酸，藥物負(fù)載可以為每個(gè)抗體1至8個(gè)藥物(D)，即，其中1、2、3、4、5、6、7和8個(gè)藥物部分共價(jià)連接至抗體。對(duì)于抗體IgG2同種型，其中藥物在部分抗體還原后結(jié)合至半胱氨酸，藥物負(fù)載可以為每個(gè)抗體1至12個(gè)藥物(D)，即，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12個(gè)藥物部分共價(jià)連接至抗體。ADC的組合物包括細(xì)胞結(jié)合試劑(例如抗體)的集合，所述細(xì)胞結(jié)合試劑與1至8個(gè)或1至12個(gè)藥物綴合?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段如UV、反相HPLC、HIC、質(zhì)譜、ELISA分析和電泳，表征來自綴合反應(yīng)的ADC的制劑中每個(gè)抗體的藥物的平均數(shù)量。作為非限制性實(shí)施方案，本文提供了與抗體c208F2的綴合。在這種情況下，將藥物偶聯(lián)至至少一個(gè)半胱氨酸，所述半胱氨酸選自i)序列SEQIDNo.28的輕鏈的214位的殘基Cys，和ii)序列SEQIDNo.23的重鏈的223、229和232位的殘基Cys。作為非限制性實(shí)施方案，本文提供了與抗體c208F2的綴合。在這種情況下，將藥物偶聯(lián)至二、三或四個(gè)半胱氨酸，所述半胱氨酸選自i)序列SEQIDNo.28的輕鏈的214位的殘基Cys，和ii)序列SEQIDNo.23的重鏈的223、229和232位的殘基Cys。作為非限制性實(shí)施方案，本文提供了與抗體hz208F2(ar.1)的綴合。在這種情況下，將藥物偶聯(lián)至至少一個(gè)半胱氨酸，所述半胱氨酸選自i)序列SEQIDNo.39的輕鏈的214位的殘基Cys，和ii)序列SEQIDNo.37的重鏈的223、229和232位的殘基Cys。作為非限制性實(shí)施方案，本文提供了與抗體hz208F2(var.3)的綴合。在這種情況下，將藥物偶聯(lián)至二、三或四個(gè)半胱氨酸，所述半胱氨酸選自i)序列SEQIDNo.40的輕鏈的214位的殘基Cys，和ii)序列SEQIDNo.38的重鏈的223、229和232位的殘基Cys。一個(gè)替代方案由賴氨酸偶聯(lián)組成。抗體可以含有例如許多賴氨酸殘基，所述殘基不與藥物-接頭中間體(D-L)或接頭試劑反應(yīng)。只有最具反應(yīng)性的賴氨酸基團(tuán)可以與胺反應(yīng)性接頭試劑反應(yīng)。此外，只有最具反應(yīng)性的半胱氨酸硫醇基團(tuán)可以與硫醇反應(yīng)性接頭試劑反應(yīng)。當(dāng)本發(fā)明的化合物與賴氨酸結(jié)合時(shí)，藥物負(fù)載可以為每個(gè)細(xì)胞抗體1至80個(gè)藥物(D)，但是優(yōu)選的上限為40、20、10或8。ADC的組合物包括細(xì)胞結(jié)合試劑(例如抗體)的集合，所述細(xì)胞結(jié)合試劑與1至80個(gè)、1至40個(gè)、1至20個(gè)、1至10個(gè)或1至8個(gè)藥物綴合。根據(jù)本發(fā)明的式(I)的ADC可以為藥學(xué)上可接受的鹽的形式。在本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”是指可以在藥物組合物的制劑中使用，通常是安全無毒的，既不是生物學(xué)上也不是其他不期望的，并且對(duì)于獸醫(yī)用途以及人制藥用途是可接受的?；衔锏摹八帉W(xué)上可接受的鹽”是指如本文所定義的藥學(xué)上可接受的鹽，并且其具有母體化合物的期望的藥理活性。藥學(xué)上可接受的鹽尤其包含：(1)與藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸形成的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，所述無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和類似的酸；與藥學(xué)上可接受的有機(jī)酸形成的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，所述有機(jī)酸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硬脂酸、乳酸和類似的酸；和(2)當(dāng)母體化合物中存在的酸質(zhì)子被金屬離子替代時(shí)形成的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，所述金屬離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子；或與藥學(xué)上可接受的有機(jī)堿配位時(shí)形成的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，所述有機(jī)堿如賴氨酸、精氨酸等；或與藥學(xué)上可接受的無機(jī)堿配位時(shí)形成的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，所述無機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀(potash)、氫氧化鈣和類似物?？梢允褂贸Ｒ?guī)的化學(xué)方法，由含有堿或酸官能團(tuán)的本發(fā)明的化合物與相應(yīng)的酸或堿制備這些鹽。V-治療最后，本發(fā)明涉及一種如上面所描述的ADC，其作為藥物，特別是用于治療癌癥的用途。本發(fā)明的另一個(gè)主題為一種如上面所定義的式(I)的化合物，其作為藥物產(chǎn)品，特別是用于治療癌癥的用途。本發(fā)明還涉及如上面所定義的式(I)的化合物用于生產(chǎn)藥物產(chǎn)品，特別是旨在用于治療癌癥的藥物產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明還涉及一種用于治療癌癥的方法，其包括向需要其的人施用有效量的如上面所定義的式(I)的化合物。癌癥可以優(yōu)選選自IGF-1R相關(guān)的癌癥，所述癌癥包括腫瘤細(xì)胞在其表面表達(dá)或過表達(dá)全部或部分的蛋白質(zhì)IGF-1R。更特別地，所述癌癥為乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、腎癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、間皮瘤、平滑肌肉瘤和任何耐藥的癥候或癌癥。為了避免疑問，必須理解耐藥的表達(dá)IGF-1R的癌癥不僅指最初表達(dá)IGF-1R的耐藥的癌癥，而且還指最初不表達(dá)或不過表達(dá)IGF-1R，但當(dāng)對(duì)前面的治療已經(jīng)變得耐受后即表達(dá)IGF-1R的癌癥。本發(fā)明的另一個(gè)目的為一種藥物組合物，其包含如說明書中所描述的ADC。更特別地，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的ADC和至少一種賦形劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。在本說明書中，表述“藥學(xué)上可接受的載體”或“賦形劑”旨在表示化合物或化合物的組合，其進(jìn)入藥物組合物中而不引起次級(jí)反應(yīng)，并且其允許例如活性化合物的施用的簡化、活性化合物的壽命和/或在體內(nèi)的功效的增加、活性化合物在溶液中的溶解度的增加或活性化合物的保存的改善。這些藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)所選擇的活性化合物的性質(zhì)和施用模式改變所述載體和賦形劑?；钚猿煞挚梢砸詥挝皇┯眯问?，與常規(guī)藥物載體混合施用至動(dòng)物或人類。合適的單位施用形式包括經(jīng)由口服途徑的形式，和經(jīng)由胃腸外途徑(皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))施用的形式。作為用于口服施用的固體組合物，可以使用片劑、丸劑、粉末(硬的或軟的明膠膠囊)或顆粒劑。在這些組合物中，在氬氣流中，將本發(fā)明的活性成分與一種或多種惰性稀釋劑如淀粉、纖維素、蔗糖、乳糖或二氧化硅混合。這些組合物還可以包含除稀釋劑以外的物質(zhì)，例如一種或多種潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石，著色劑，包衣(包衣片)或清漆(varnish)。用于胃腸外施用的無菌組合物可以優(yōu)選為水性或非水性溶液、混懸劑或乳劑。作為溶劑或載體，可以使用水、丙二醇、聚乙二醇、植物油特別是橄欖油、可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯或其他合適的有機(jī)溶劑。這些組合物還可以含有佐劑，特別是潤濕劑、等滲劑、乳化劑、分散劑和穩(wěn)定劑?？梢砸远喾N方式進(jìn)行滅菌，例如通過消毒過濾，通過向組合物中加入滅菌劑，通過輻射或通過加熱。它們還可以被制備成固體無菌組合物的形式，可以在使用時(shí)將所述組合物溶解于無菌水或任何其它可注射的無菌介質(zhì)中。優(yōu)選地，將通過全身途徑，特別是通過靜脈內(nèi)途徑、通過肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑或通過口服途徑施用這些ADC。在一個(gè)更優(yōu)選的方式中，將以連續(xù)的方式多次施用包含根據(jù)本發(fā)明的ADC的組合物。因此，本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其至少包含i)根據(jù)本發(fā)明的抗體-藥物-綴合物和/或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，和ii)注射器或小瓶或安瓿，其中裝有所述抗體-藥物-綴合物和/或藥物組合物。可以根據(jù)在確立適合于患者的治療時(shí)通?？紤]的標(biāo)準(zhǔn)，確定它們的施用方式、劑量和最佳藥物形式，所述標(biāo)準(zhǔn)例如患者的年齡或體重、他/她的整體病癥的嚴(yán)重性、對(duì)治療的耐受性和注意到的副作用。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)隨著實(shí)施例和附圖出現(xiàn)在本說明書的連續(xù)部分中，所述附圖的說明表示如下。附圖說明圖1A-1C：通過FACS分析的抗體與人天然IGF-1R的結(jié)合。圖1A表示在MCF-7細(xì)胞系中的滴定曲線。MFI表示熒光強(qiáng)度的平均值。圖1B表示在MCF-7細(xì)胞系中鼠抗IGF-1R抗體和嵌合抗IGF-1R抗體的EC50。圖1C表示在MCF-7細(xì)胞系中嵌合抗IGF-1R抗體的Bmax。圖2A-2B：使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)比于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行的hIGF-1R識(shí)別的評(píng)價(jià)。圖2A表示在IGF-1R+細(xì)胞系中一種嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲線。MFI表示熒光強(qiáng)度的平均值。圖2B表示在人IGF-1R-細(xì)胞系中嵌合抗IGF-1RAb的結(jié)合。圖3A-3B：使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行的Ab對(duì)IGF-1R對(duì)hIR的特異性的評(píng)價(jià)。圖3A表示在hIR+轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中鼠抗IGF-1RAb的結(jié)合。圖3B表示在IR+細(xì)胞系中嵌合抗IGF-1RAb的結(jié)合。MFI表示熒光強(qiáng)度的平均值。引入GRO5抗hIRMab(Calbiochem)作為陽性對(duì)照。圖4：在IM-9細(xì)胞系中鼠抗IGF-1RAb的結(jié)合。MFI表示熒光強(qiáng)度的平均值。引入GRO5抗hIRMab作為陽性對(duì)照。圖5A-5C：猴IGF-1R的識(shí)別的評(píng)價(jià)。圖5A表示在COS-7細(xì)胞系中嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲線。MFI表示熒光強(qiáng)度的平均值。圖5B表示在COS-7細(xì)胞系中鼠抗IGF-1R抗體和嵌合抗IGF-1R抗體的EC50。圖5C表示在NIH3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞hIGF-1R+和COS-7細(xì)胞系中嵌合抗IGF-1R抗體的EC50。圖6：使用CM5傳感芯片(sensorchip)在基于SPR技術(shù)的BiacoreX100上獲得的傳感圖(sensorgram)，所述CM5傳感芯片用更多的11000RU的小鼠抗-TagHis抗體活化，所述抗體被化學(xué)接枝到羧甲基葡聚糖基質(zhì)上。使用HBS-EP+作為運(yùn)行和樣品稀釋緩沖液，在25℃以30μl/min的流速運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。該圖顯示了4張獨(dú)立的傳感圖在分析物的第一次注射開始時(shí)，在x軸上對(duì)準(zhǔn)的疊加，以及通過在該第一次注射之前剛定義的基線在y軸上對(duì)準(zhǔn)的疊加。用菱形標(biāo)記通過捕獲基于人的重組可溶性IGF1R的序列獲得的傳感圖。用三角形標(biāo)記通過捕獲基于食蟹猴的重組可溶性IGF-1R的序列獲得的傳感圖。白色符號(hào)對(duì)應(yīng)于空白循環(huán)(運(yùn)行緩沖液的5次注射)，黑色符號(hào)對(duì)應(yīng)于增加的濃度范圍的c208F2(5、10、20、40和80nM)的注射。圖7：與IGF1相比，抗hIGF-1R抗體對(duì)受體磷酸化的固有作用的評(píng)價(jià)。圖8：通過鼠抗hIGF-1R的對(duì)IGF-1相應(yīng)的IGF-1R磷酸化的抑制。圖9：在37℃孵育細(xì)胞后，抗IGF-1R抗體的細(xì)胞表面信號(hào)強(qiáng)度被下調(diào)。將MCF-7細(xì)胞與10μg/ml的Ab在4℃或37℃孵育4h。該圖表示ΔMFI。圖10A-10B：抗體表面衰減(decay)。在37℃，在10、20、30、60和120分鐘后評(píng)估細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。圖10A表示與在4℃測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度相比剩余IGF-1R的％。圖10B表示使用Prism軟件和使用指數(shù)衰減擬合的半衰期計(jì)算。圖11：抗hIGF-1RAb被內(nèi)化。將細(xì)胞與10μg/ml鼠Ab在37℃孵育0、30或60min。將細(xì)胞通透化(permeabilize)或不將細(xì)胞通透化，并與第二抗小鼠IgG-Alexa488孵育。膜對(duì)應(yīng)于信號(hào)強(qiáng)度w/o通透化作用(permeabilization)。總計(jì)對(duì)應(yīng)于細(xì)胞通透化后的信號(hào)強(qiáng)度，并且細(xì)胞質(zhì)對(duì)應(yīng)于內(nèi)化的Ab。每個(gè)評(píng)價(jià)的抗體的名稱標(biāo)注于每張圖的頂部。圖12A-12B：Ab內(nèi)化的成像。圖12A：MCF-7細(xì)胞，其在4℃與m208F2孵育20分鐘，并在孵育前(W)、在37℃孵育15min(X)、30min(Y)和60min(Z)時(shí)洗滌。將細(xì)胞固定并通透化。使用抗小鼠IgGAlexa488和Lamp-1，使用兔抗Lamp-1抗體和第二抗兔IgGAlexa555顯示m208F2Ab。圖12B：將MCF-7細(xì)胞與抗hIGF-1R鼠抗體在37℃孵育30分鐘，并如上所述進(jìn)行染色。使用ImageJ軟件的共定位高亮(highliter)插件確定共定位。圖13：溶酶體通路在抗體降解中的參與。圖14：酸性pH降低五種鼠抗IGF-1R抗體的結(jié)合能力。圖15A-15D：c208F2Mab的第一人源化形式的結(jié)合特征。在人細(xì)胞系MCF-7(A)、猴細(xì)胞系COS-7(B)和表達(dá)人胰島素受體的轉(zhuǎn)染的鼠細(xì)胞系(C)中，評(píng)價(jià)hz208F2VH3/VL3mAb的結(jié)合性質(zhì)。平行地評(píng)價(jià)鼠208F2mAb和嵌合208F2mAb的結(jié)合。使用抗hIR抗體克隆GRO5以驗(yàn)證hIR在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(D)中的表達(dá)。圖16：hz208F2VH3/VL3抗體表面衰變。圖17：用CM5傳感器芯片在25℃的溫度用基于SPR的BiacoreX100裝置獲得的傳感圖的疊加，所述CM5傳感器芯片在兩個(gè)流動(dòng)池(flowcell)中用約12.000RU的小鼠抗TagHis單克隆抗體活化，所述抗體被化學(xué)接枝到羧甲基葡聚糖基質(zhì)上，使用HBS-EP+作為運(yùn)行緩沖液，流速為30μl/min。每張傳感圖(第一個(gè)用三角形標(biāo)記，第二個(gè)用菱形標(biāo)記)對(duì)應(yīng)于一個(gè)完整的周期：1-在一分鐘期間，在第二流動(dòng)池中重組h-IGF-1R的溶液(10μg/ml)的注射。2-對(duì)于第一張傳感圖：運(yùn)行緩沖液的5次注射，每次90s對(duì)于第二張傳感圖：增加的濃度范圍的抗IGF-1Rc208F2抗體溶液的五次注射，每次90s。3-300s的延遲，用于確定解離動(dòng)力學(xué)速率。4-通過10mM甘氨酸，HClpH1.5緩沖液的45s的注射的表面的再生。圖18：以灰色顯示傳感圖，所述傳感圖對(duì)應(yīng)于用增加的濃度范圍的抗IGF-1Rc208F2溶液獲得的傳感圖減去空白傳感圖(HBS-EP+的5次注射)。以細(xì)黑線顯示對(duì)應(yīng)于1:1模型的理論傳感圖，所述理論傳感圖具有以下參數(shù)：kon＝(1.206±0.036)x106M-1.s-1，koff＝(7.81±0.18)x10-5s-1，Rmax＝307.6±0.3RU。在圖上報(bào)告了c208F2的計(jì)算的濃度：僅最高濃度(24nM)被認(rèn)為是常數(shù))。圖19：解離常數(shù)對(duì)應(yīng)于每種抗體運(yùn)行的四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值，并且對(duì)應(yīng)于以pM單位表達(dá)的比例：koff/konx1012。誤差條對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝4)。圖20：半衰期對(duì)應(yīng)于每種抗體運(yùn)行的四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值，并且對(duì)應(yīng)于以h單位表達(dá)的比例：Ln(2)/koff/3600。誤差條對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝4)。圖21：與三種不同的化合物偶聯(lián)的抗IGF-1R的細(xì)胞毒性。將五種嵌合抗體抗IGF-1R與E-13、G-13或F-63偶聯(lián)。還將不相關(guān)的抗體c9G4與相同的化合物偶聯(lián)。圖22A-22C：在MCF-7異種移植模型中，c208F2-E-13(圖22A)、c208F2-G-13(圖22B)和c208F2-F-63(圖22C)的體內(nèi)評(píng)價(jià)。圖23A-23B：在MCF-7異種移植模型中，c208F2-E-13(圖23A)和c208F2-G-13(圖23B)相比于ADC對(duì)照(c9G4-E13和c9G4-G-13)的體內(nèi)評(píng)價(jià)。圖24A和B：酸性pH降低人源化IGF-1R抗體hz208F2H076/L024(A)和hz208F2(H077/L018(B))的結(jié)合能力。圖25：c208F2-G-13對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)。圖26：與G-13偶聯(lián)的hz208F2的人源化變體的細(xì)胞毒性。還將不相關(guān)的抗體c9G4與相同的化合物偶聯(lián)。圖27：在MCF-7異種移植模型中，208F2-G-13的人源化形式對(duì)比于c208F2-G-13的人源化形式的體內(nèi)評(píng)價(jià)。圖28A和28B：在MCF-7異種移植模型中，c208F2-G-13(28A)或hz208F2-4-G-13(28B)注射4次相比于注射一次的體內(nèi)評(píng)價(jià)。圖29A和29B：在CaOV-3異種移植模型中，c208F2-E-13(29A)和c208F2-G-13(29B)的體內(nèi)評(píng)價(jià)。具體實(shí)施方式實(shí)施例實(shí)施例1：針對(duì)IGF-1RECD的鼠抗體的產(chǎn)生為了產(chǎn)生針對(duì)人IGF-1受體(hIGF-1R)的人細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的鼠單克隆抗體(Mab)，將5只BALB/c小鼠用10μg的rhIGF-1R蛋白(R&DSystems，目錄號(hào)391-GR)皮下免疫3次。作為替代方案，在一些動(dòng)物中用10μgIGF-1R的鼠細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(R&DSystems，目錄號(hào)6630-GR/Fc)進(jìn)行三次額外的免疫。在完全弗氏(Freund)佐劑(Sigma,StLouis,MD,美國)的存在下進(jìn)行第一次免疫。加入不完全弗氏佐劑(Sigma)用于隨后的免疫。在融合前三天，用10μg的rhIGF-1R蛋白增強(qiáng)被免疫的小鼠。然后，分別通過灌注脾臟，和通過切碎(mince)近端淋巴結(jié)節(jié)制備脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，所述細(xì)胞從5只被免疫小鼠中的1只(在所有小鼠的血清滴定后選擇)中收獲，并將其與SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞(ATCC,Rockville,MD,美國)融合。Kohler和Milstein描述了融合方案(Nature,256:495-497,1975)。然后，使融合的細(xì)胞經(jīng)受HAT選擇。通常，為了制備單克隆抗體或其功能片段(尤其是鼠源的)，能夠特別地參考在手冊(cè)“Antibodies”(Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborNY,第726頁,1988)中描述的技術(shù)。在融合后約10天，篩選雜交細(xì)胞的群落。對(duì)于初次篩選，使用人乳腺M(fèi)CF7腫瘤細(xì)胞(ATCC)和/或猴COS7細(xì)胞(非洲綠猴腎-SV40轉(zhuǎn)化的)，通過FACS分析，評(píng)價(jià)雜交瘤上清液中針對(duì)IGF-1RECD蛋白的Mab的分泌，所述猴COS7細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)猴IGF-1R。更精確地，對(duì)于通過流式細(xì)胞術(shù)的選擇，在4℃將105個(gè)細(xì)胞(MCF7或COS7)接種至96孔板的每個(gè)孔的PBS中，所述PBS含有1％BSA和0.01％疊氮化鈉(FACS緩沖液)。在以2000rpm離心2min后，去除緩沖液，并加入待測(cè)的雜交瘤上清液。在4℃孵育20min后，將細(xì)胞洗滌兩次，加入在FACS緩沖液中稀釋的Alexa488-綴合的山羊抗小鼠抗體1/500°(#A11017,MolecularProbesInc.,Eugene,美國)，并在4℃孵育20分鐘。在用FACS緩沖液的最終洗滌后，在以40μg/ml的終濃度向每個(gè)試管中加入碘化丙啶后，通過FACS(Facscalibur，Becton-Dickinson)分析細(xì)胞。含有單獨(dú)的細(xì)胞的孔和含有與二級(jí)Alexa488-綴合的抗體孵育的細(xì)胞的孔被包含作為陰性對(duì)照。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用同種型對(duì)照(Sigma,參考號(hào)M90351MG)。評(píng)估至少5000個(gè)細(xì)胞，以計(jì)算熒光強(qiáng)度的平均值(MFI)。此外，進(jìn)行內(nèi)化分析，以僅選擇內(nèi)化抗體。對(duì)于該分析，在實(shí)驗(yàn)前，將MCF7腫瘤細(xì)胞系在不含酚紅的RMPI1640中培養(yǎng)3天，所述RMPI1640具有1％L-谷氨酰胺和10％FACS。然后，使用胰蛋白酶使細(xì)胞分散，并將100μl4.105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液接種至96孔板的不含酚紅的RPMI1640中，所述RPMI1640具有1％L-谷氨酰胺和5％FBS。在以2000rpm離心2min后，將細(xì)胞重新懸浮于50μl的雜交瘤上清液或?qū)φ湛贵w溶液(1μg/ml的陽性和同種型對(duì)照)中。在4℃孵育20min后，將細(xì)胞以2000rpm離心2min，并重新懸浮于冷的(4℃)或溫的(37℃)完全培養(yǎng)介質(zhì)中。然后，將細(xì)胞在37℃或在4℃孵育2小時(shí)。然后，用FACS緩沖液將細(xì)胞洗滌三次。將Alexa488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體孵育20分鐘，并將細(xì)胞洗滌三次，然后在碘化丙錠陰性細(xì)胞群體中進(jìn)行FACS分析。在FACS分析后，確定兩個(gè)參數(shù)：(i)在4℃與一種雜交瘤上清液孵育的細(xì)胞的表面上檢測(cè)到的熒光信號(hào)，與在37℃與一種雜交瘤上清液孵育的細(xì)胞獲得的熒光信號(hào)的差異，和(ii)細(xì)胞表面上剩余的IGF-1R的百分比。剩余的hIGF1R的百分比計(jì)算如下：剩余的IGF-1R％＝(MFIAb37℃/MFIAb4℃)x100。此外，進(jìn)行三次ELISA(在克隆之前或之后)，以研究抗體對(duì)重組人(hIGF-1R)蛋白和重組鼠(mIGF-1R)蛋白的結(jié)合，以及對(duì)重組人胰島素受體(hIR)蛋白的結(jié)合。分泌抗體的雜交瘤被保留，所述抗體顯示結(jié)合至rh-和/或rm-IGF-1R且不結(jié)合至rhIR。簡言之，用在PBS中的0.6μg/ml的rhIGF-1R蛋白(R&DSystems，目錄號(hào)391-GR)，或1μg/ml的rmIGF-1R蛋白(R&DSystems，目錄號(hào)6630-GR/Fc)，或1μg/ml的rhIR蛋白(R&DSystems，目錄號(hào)1544-IR/CF)，將96孔ELISA板(Costar3690,Corning,NY,美國)以100μl/孔在4℃包被過夜。然后，用含有0.5％明膠的PBS(#22151,ServaElectrophoresisGmbH,Heidelberg,德國)將板在37℃封閉2小時(shí)。當(dāng)通過搖動(dòng)板棄去飽和緩沖液后，將100μl的每種上清液稀釋液加入至每個(gè)孔(未稀釋的雜交瘤上清液或上清液系列稀釋液)中，并在37℃孵育1h。在洗滌三次后，在37℃，加入在含有0.1％明膠和0.05％吐溫20(w:w)的PBS中以1/5000稀釋的100μl辣根過氧化物酶綴合的多克隆山羊抗小鼠IgG(#115-035-164,JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA,美國)，持續(xù)1小時(shí)。然后，將ELISA板洗滌3次，并加入TMB((#UP664782,Uptima,Interchim,法國)底物。在室溫孵育10min后，使用1M硫酸終止反應(yīng)，并測(cè)量450nm處的光密度。通過有限的稀釋擴(kuò)增和克隆分泌感興趣的抗體的雜交瘤。一旦被同種型化，擴(kuò)增和冷凍每個(gè)編碼的一種克隆。在被稱作CellLine(IntegraBiosciences)的體外生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)每種感興趣的抗體，用于進(jìn)一步的表征。在IM9細(xì)胞(表達(dá)人IR的B淋巴母細(xì)胞)中，以及在hIGF-1R轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相比于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，進(jìn)行處理(address)結(jié)合特異性FACS分析的額外的分析。將對(duì)應(yīng)于選擇的抗體的所有數(shù)據(jù)總結(jié)于表7中，并且證明了五種選擇的抗體強(qiáng)烈地識(shí)別在MCF-7乳腺癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表達(dá)的天然人IGF-1R。它們還識(shí)別COS-7細(xì)胞上的猴IGF-1R。這些抗體不與在IM9細(xì)胞上高表達(dá)的人胰島素受體交叉反應(yīng)。必須注意，當(dāng)直接被包被在ELISA板上時(shí)，這些抗體很差地識(shí)別rhIGF-1RECD蛋白。實(shí)施例2：通過FACS分析的對(duì)人天然IGF-1R的抗體結(jié)合將5種鼠IGF-1R抗體嵌合。使用增加的抗體濃度，通過在人MCF-7乳腺癌細(xì)胞系(ATCC#HTB-22)中進(jìn)行的FACS分析，評(píng)價(jià)鼠IGF-1R抗體和嵌合IGF-1R抗體的結(jié)合性質(zhì)。為了這個(gè)目的，在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/ml)與IGF-1R抗體在4℃孵育20min。然后將它們洗滌3次，并在暗處與偶聯(lián)有Alexa488的合適的第二抗體在4℃孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R抗體的結(jié)合。由每種抗體獲得的信號(hào)強(qiáng)度的最大值被設(shè)計(jì)為Bmax，并以熒光強(qiáng)度的平均值(MFI)表示。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。每種鼠Ab或嵌合Ab的滴定曲線證明，產(chǎn)生的全部抗體都能夠以典型的飽和模式(profile)識(shí)別天然的IGF-1R形式(圖1A)。為了把抗體分等級(jí)并比較鼠Ab和嵌合Ab的結(jié)合性質(zhì)，使用非線性回歸分析確定每種化合物的結(jié)合EC50。每種鼠Ab和其相應(yīng)的嵌合形式的EC50的比較顯示，2種形式顯示相同的結(jié)合性質(zhì)，表明Ab嵌合不影響IGF-1R識(shí)別(圖1B-C)。嵌合抗體的EC50和Bmax值總結(jié)于表8中。表8ACBmaxEC50c208F29816.7E-10c212A119916.7E-10c214F810695.0E-10c219D69934.7E-10c213B1011034.4E-10實(shí)施例3：通過使用IGF-1R或IR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或IM9細(xì)胞的抗體特異性的確認(rèn)，所述IM9細(xì)胞表達(dá)顯著水平的IR為了確認(rèn)所產(chǎn)生的抗體對(duì)IGF-1R相比于IR的特異性，通過FACS分析評(píng)價(jià)表達(dá)hIGF-1R或hIR的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。簡言之，在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將增加濃度的嵌合mAb與細(xì)胞在4℃孵育20min。然后將細(xì)胞洗滌3次，并與偶聯(lián)有Alexa488的合適的第二抗體孵育，然后在暗處在4℃孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。在hIGH-1R轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(圖2A)中相比于在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖2B)中獲得的滴定曲線證實(shí)了嵌合Ab對(duì)人IGF-1R的結(jié)合特異性。EC50和Bmax值總結(jié)于表9中。表9AcBmaxEC50(M)c208F220083.2E-10c212A1125134.4E-10c214F820942.7E-10c219D625215.5E-10c213B1020293.3E-10為了證實(shí)不存在鼠抗體和嵌合抗體對(duì)hIR的結(jié)合，使用了表達(dá)人IR(hIR)的穩(wěn)定的細(xì)胞系。通過FACS分析進(jìn)行鼠Ab和嵌合Ab對(duì)人細(xì)胞表面hIR的識(shí)別。在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將增加濃度的鼠mAb或嵌合mAb在hIR+轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中在4℃孵育20分鐘。然后將細(xì)胞洗滌3次，并與偶聯(lián)有Alexa488的合適的第二抗體孵育，然后在暗處在4℃孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。使用抗hIR抗體克隆GRO5作為陽性對(duì)照。引入鼠9G4抗體和嵌合9G4抗體作為不相關(guān)的抗體。使用市售的抗hIR抗體GRO5確認(rèn)hIR在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞表面上的高水平表達(dá)(圖3A和3B)。即使使用高濃度的鼠hIGF-1RAb(圖3A)或嵌合hIGF-1RAb(圖3B)，也沒有觀察到在hIR+轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞表面上的結(jié)合。這些結(jié)果證明，鼠抗hIGF-1RAb和嵌合抗hIGF-1RAb都不識(shí)別hIR。通過FACS分析，使用IM9細(xì)胞(表達(dá)hIR的B淋巴瘤細(xì)胞系)，還證明了這種hIGF-1R相比于IR的識(shí)別的特異性(圖4)。對(duì)于該FACS分析，方案與上面所描述的方案相同，并且使用鼠抗體，以防止第二抗人Ab的交叉反應(yīng)性(IM9細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)人Ig)。圖4中呈現(xiàn)的結(jié)果再次證明，使用GRO5抗hIR抗體觀察到預(yù)期的信號(hào)，而所評(píng)估的鼠抗體沒有一個(gè)在該細(xì)胞系中顯示任何顯著的結(jié)合信號(hào)。實(shí)施例4：通過FACS和Biacore分析的對(duì)猴天然IGF-1R的抗體結(jié)合管理毒理學(xué)(regulatorytoxicology)研究的第一個(gè)先決條件之一是找到相關(guān)的動(dòng)物種類，以評(píng)價(jià)所選擇的化合物。由于本文所描述的一系列抗體不能識(shí)別鼠IGF-1R，因此用于毒理學(xué)評(píng)價(jià)的最可能的物種是非人靈長目動(dòng)物(NHP)。為了評(píng)價(jià)抗IGF-1R抗體對(duì)猴IGF-1R的結(jié)合，使用增加的抗體濃度，在COS-7細(xì)胞系中通過FACS分析首先評(píng)價(jià)鼠抗hIGF-1R抗體和嵌合抗hIGF-1R抗體的結(jié)合。在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/ml)與抗IGF-1R抗體在4℃孵育20min。然后將細(xì)胞洗滌3次，并與偶聯(lián)有Alexa488的合適的第二抗體孵育，然后在暗處在4℃孵育另外20分鐘，最后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中評(píng)價(jià)抗IGF-1R抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。在COS-7猴細(xì)胞系中獲得的滴定曲線顯示，所有抗hIGF-1RAb特異性地識(shí)別在猴細(xì)胞系的表面上表達(dá)的IGF-1R(圖5A)。每種鼠Ab和嵌合Ab的EC50的測(cè)定顯示，該2種形式在它們對(duì)猴IGF-1R的結(jié)合性質(zhì)方面較為符合(圖5B)。這些結(jié)果表明，所有產(chǎn)生的抗hIGF-1R都識(shí)別猴IGF-1R。進(jìn)行對(duì)COS-7細(xì)胞相比于對(duì)轉(zhuǎn)染的IGF-1R細(xì)胞的結(jié)合EC50的比較，以驗(yàn)證對(duì)人IGF-1R相比于對(duì)猴IGF-1R的嵌合抗體識(shí)別的量級(jí)。圖5C中顯示的結(jié)果證明了所有抗體對(duì)人IGF-1R和猴IGF-1R的類似的識(shí)別。為了確認(rèn)對(duì)另一種類型的猴的識(shí)別，用IGF-1R形式食蟹猴轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以產(chǎn)生可溶性猴IGF-1RECD，并用嵌合抗體(c208F2)之一進(jìn)行Biacore實(shí)驗(yàn)，以比較其對(duì)hIGF-1R或食蟹猴IGF-1R的結(jié)合性質(zhì)。使用由抗TagHis抗體活化的CM5傳感器芯片(His捕獲試劑盒GEHealthcare目錄號(hào)28-9950-56)，在BiacoreX100裝置上運(yùn)行識(shí)別實(shí)驗(yàn)。使用胺試劑盒化學(xué)，將超過11000RU的抗體化學(xué)接枝到羧甲基葡聚糖基質(zhì)上。使用HBS-EP緩沖液(GEHealthcare)作為運(yùn)行和樣品稀釋緩沖液，以30μl/min的流速在25℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用單循環(huán)動(dòng)力學(xué)方案，定義208F2抗體的嵌合形式(c208F2)對(duì)hIGF-1R相比于對(duì)獼猴(Macaca)IGF-1R的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在限定為捕獲約160RU抗原的稀釋度，將IGF-1R異四聚體的可溶性重組形式的溶液在第二流動(dòng)池中注射1分鐘，所述IGF-1R異四聚體由2α鏈和2β鏈的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成，表達(dá)額外的C-末端10-His標(biāo)簽，基于人的序列(R&DSystems目錄號(hào)305-GR-50)或食蟹猴之一的序列(自制(producedinhouse))。在捕獲階段后，在兩個(gè)流動(dòng)池中，注射運(yùn)行緩沖液5次(每次注射90秒)，或注射增加的5個(gè)濃度范圍的c208F2(每次注射90秒)。在第五次注射結(jié)束時(shí)，使運(yùn)行緩沖液經(jīng)過(pass)以定義解離速率。然后，在30s期間注射10mM甘氨酸，HClpH1.5緩沖液使表面再生。計(jì)算的信號(hào)對(duì)應(yīng)于流動(dòng)池2的響應(yīng)(具有捕獲的IGF-1R)與流動(dòng)池1的響應(yīng)(沒有任何IGF-1R分子)之間的差值(圖6)。對(duì)于每種IGF-1R分子(人或食蟹猴)，通過減去緩沖液的5次注射獲得的信號(hào)(雙參比)，校正由于增加的濃度范圍的c208F2的注射而產(chǎn)生的信號(hào)。使用具有1:1模型的Biaevaluation軟件分析所得的傳感圖。獨(dú)立地(c208F2對(duì)每種IGF-1R的結(jié)合的2個(gè)動(dòng)力學(xué)速率)或共同地(c208F2對(duì)人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R的結(jié)合的相同動(dòng)力學(xué)速率)評(píng)價(jià)動(dòng)力學(xué)速率。通過低于0.05RU的Chi2/Rmax比例評(píng)估擬合的質(zhì)量。分別為每種IGF-1R定義的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率(參見表10)是接近的，并且具有相同動(dòng)力學(xué)速率的兩張傳感圖的擬合具有良好的質(zhì)量。c208F2抗體同樣地識(shí)別重組人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R，解離常數(shù)(KD)為約0.2nM。在本研究中定義的親和力對(duì)應(yīng)于約160RU的捕獲的人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R的水平的抗體的功能親和力(親合力(avidity))。表10IGF1Rkon[1/M.s]koff[1/s]Kd[nM]Chi2/Rmax人1.52E+063.40E-040.230.045食蟹猴1.85E+063.10E-040.170.032人和食蟹猴1.52E+063.33E-040.220.039實(shí)施例5：產(chǎn)生的抗體對(duì)IGF-1R磷酸化的固有作用眾所周知，當(dāng)抗體結(jié)合至酪氨酸激酶受體時(shí)，所述抗體可以誘導(dǎo)激動(dòng)(agonistic)作用。由于我們不希望選擇這樣的激動(dòng)劑抗體，因此使用嵌合抗體研究hIGF-1R磷酸化的評(píng)價(jià)。為了這個(gè)目的，將MCF-7細(xì)胞在無血清介質(zhì)中孵育過夜。然后，在37℃將IGF-1(100nM)或待測(cè)試的Ab加入(10μg/ml)持續(xù)10分鐘。棄去介質(zhì)，在裂解緩沖液(pH7.5)中在4℃將細(xì)胞刮擦(scrape)90分鐘，所述裂解緩沖液含有10mMTrisHCl緩沖液(pH7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污劑混合物(10mMTris-HCl，10％Igepal裂解緩沖液)(SigmaChemicalCo.)、5％脫氧膽酸鈉(SigmaChemicalCo.)、1蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)完全TM片(Roche)、1％磷酸酶抑制劑混合物II套(Calbiochem)。通過在4℃離心使裂解物澄清，在100℃加熱5min，并保持在-20℃，或直接裝載在4-12％SDS-PAGE凝膠上。在室溫將第一抗體孵育2hr，然后在室溫與連接HRP的第二抗體孵育1hr。在用ECL使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)之前，在TBST中洗滌膜。使用ImageJ軟件將印跡定量。用GAPDH將含磷-(phospho-)蛋白質(zhì)值歸一化。響應(yīng)IGF-1的hIGF-1R的磷酸化被認(rèn)為是100％的刺激。抗hIGF-1RAb對(duì)hIGF-1R的磷酸化的作用被確定為由IGF-1誘導(dǎo)的磷酸化的％。圖7中描述的結(jié)果表示相比于IGF-1，響應(yīng)嵌合抗IGF-1RAb的pIGF-1R的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的％的平均值+/-S.D.。如圖所示，當(dāng)MCF-7細(xì)胞與10μg抗IGF-1RAb孵育時(shí)，沒有檢測(cè)到顯著或微小(<10％)的hIGF-1R的磷酸化。實(shí)施例6：通過鼠IGF-1R抗體的響應(yīng)IGF-1的IGF-1R磷酸化的抑制為了表征所選擇的抗體，研究了它們抑制IGF1誘導(dǎo)的磷酸化的能力。為了這個(gè)目的，將MCF-7細(xì)胞在無血清介質(zhì)中孵育過夜。然后，將細(xì)胞與鼠抗hIGF-1RAb孵育5分鐘，然后在37℃加入IGF-1持續(xù)2分鐘。棄去介質(zhì)，在裂解緩沖液(pH7.5)中在4℃將細(xì)胞刮擦90分鐘，所述裂解緩沖液含有10mMTrisHCl緩沖液(pH7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污劑混合物(10mMTris-HCl，10％Igepal裂解緩沖液)(SigmaChemicalCo.)、5％脫氧膽酸鈉(SigmaChemicalCo.)、1蛋白酶抑制劑混合物完全TM片(Roche)、1％磷酸酶抑制劑混合物II套(Calbiochem)。通過在4℃離心使裂解物澄清，在100℃加熱5min，并保持在-20℃，或直接裝載在4-12％SDS-PAGE凝膠上。在室溫將第一抗體孵育2h，然后在室溫與連接HRP的第二抗體孵育1hr。在用ECL使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)之前，在TBST中洗滌膜。使用ImageJ軟件將印跡定量。用GAPDH將含磷-蛋白質(zhì)值歸一化。響應(yīng)IGF-1的hIGF-1R的磷酸化被認(rèn)為是100％的刺激?？筯IGF-1RAb對(duì)hIGF-1R的磷酸化的作用被確定為由IGF-1誘導(dǎo)的磷酸化的％。所有抗IGF-1RAb強(qiáng)烈抑制響應(yīng)IGF-1的hIGF-1R磷酸化(降低>80％)(圖8)。hIGF-1R的IGF1誘導(dǎo)的磷酸化的最佳抑制劑為m208F2、m212A11和m214F8Mab。實(shí)施例7：通過FACS分析，在結(jié)合所產(chǎn)生的IGF-1R抗體后IGF-1R內(nèi)化的研究將MCF-7細(xì)胞與10μg/ml嵌合抗體在4℃孵育20min。然后，將細(xì)胞洗滌，并在4℃或37℃孵育4h。使用第二抗體確定細(xì)胞表面結(jié)合的抗體的量。ΔMFI對(duì)應(yīng)于內(nèi)化的Ab的量，所述ΔMFI被定義為4小時(shí)孵育時(shí)間后在4℃測(cè)量的MFI和在37℃測(cè)量的MFI之間的差值。ΔMFI呈現(xiàn)于圖9和表11中。10μg/mlAb的內(nèi)化的百分比計(jì)算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，并呈現(xiàn)于表11中。表11Ab內(nèi)化％ΔMFIΔMFI_EC50c208F2832881.8E-10c212A11803222.7E-10c214F8874032.2E-10c219D6803534.4E-10c231B10853692.3E-10為了確定抗體(其也識(shí)別猴IGF-1R)是否能夠內(nèi)化該受體，進(jìn)行相同的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)。表12中總結(jié)的結(jié)果證明，所有經(jīng)測(cè)試的抗體都能夠介導(dǎo)猴IGF-1R內(nèi)化。表12進(jìn)一步評(píng)價(jià)細(xì)胞表面結(jié)合抗體減少的動(dòng)力學(xué)。為了這個(gè)目的，將MCF-7細(xì)胞接種在96孔板中，并與10μg/ml鼠在4℃孵育20min。然后，洗滌細(xì)胞以去除未結(jié)合的抗體，并在37℃在介質(zhì)中持續(xù)10、20、30、60或120min。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞離心，然后用第二抗小鼠IgG-Alexa488在冰上進(jìn)行表面標(biāo)記，以確定細(xì)胞表面上剩余的抗體的量。通過4℃的信號(hào)(剩余的IGF-1R的％)將每種鼠Ab和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度歸一化，并擬合為指數(shù)式衰減以確定半衰期(t1/2)。t1/2被認(rèn)為是獲得50％信號(hào)減少所需的時(shí)間。如圖10所闡明，在前30min中所有鼠Ab的表面水平迅速下降，并且在孵育60min后降低幾乎是最大的(圖10A)。根據(jù)鼠Ab的計(jì)算的半衰期為10至18min之間(圖10B)。為了驗(yàn)證細(xì)胞表面信號(hào)的降低是由于Ab內(nèi)化而不是由于受體脫落，將細(xì)胞與鼠Ab在37℃孵育0、30和60min(圖11)。然后，將細(xì)胞固定，并通透化或不通透化，以確定對(duì)應(yīng)于細(xì)胞表面結(jié)合+內(nèi)化Ab(通透化的)的細(xì)胞表面結(jié)合抗體(w/o通透化)和總抗體信號(hào)。內(nèi)化的Ab的量(細(xì)胞質(zhì))如下確定：通透化后的MFI-w/o通透化的MFI。該實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞表面結(jié)合的Ab的降低是由于細(xì)胞質(zhì)Ab的增加，證明Ab被內(nèi)化(圖11)。此外，如通透化后信號(hào)的降低(總計(jì))所示，Ab的降解在孵育1h后開始。實(shí)施例8：通過共聚焦分析，在結(jié)合所產(chǎn)生的IGF-1R抗體后IGF-1R內(nèi)化的研究為了進(jìn)一步確認(rèn)抗體內(nèi)化，進(jìn)行共聚焦顯微鏡，以評(píng)估細(xì)胞運(yùn)輸(cellulartrafficking)后抗體的亞細(xì)胞分布。將細(xì)胞與抗hIGF-1RAb在37℃孵育，固定并通透化。因此，使用第二抗體Alexa-488和兔抗Lamp-1抗體將細(xì)胞染色，使用第二抗兔IgGAlexa555顯示所述兔抗Lamp-1抗體。在37℃孵育之前，鼠208F2Ab被定位于MCF-7細(xì)胞的膜上(圖12A)。使用ImageJ軟件的共定位高亮插件，沒有注意到與溶酶體標(biāo)記物lamp-1的共定位。在37℃孵育15min后，細(xì)胞表面結(jié)合的抗體顯著降低。伴隨細(xì)胞表面結(jié)合的抗體的降低，在囊泡中檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)抗體?？梢杂^察到與lamp-1的少見的共定位。在孵育30min后，幾乎檢測(cè)不到細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。然而，Ab向溶酶體中的共定位增加。在孵育1h后，細(xì)胞內(nèi)Ab染色降低，并且與lamp-1共定位的數(shù)量也降低。這種細(xì)胞表面結(jié)合的抗體的動(dòng)力學(xué)及其細(xì)胞內(nèi)累積與通過FACS的抗體表面衰變測(cè)量的動(dòng)力學(xué)相關(guān)。此外，如已經(jīng)用FACS研究所描述，通過共聚焦顯微鏡，鼠Ab的降解在孵育1h后開始。還評(píng)估了所有其它hIGF-1R鼠抗體的內(nèi)化和它們與Lamp-1的共定位(圖12B)。在37℃孵育30min后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗體，并且可以觀察到與lamp-1的共定位，表明所有選擇的抗IGF-1R抗體都被有效地內(nèi)化至溶酶體中。實(shí)施例9：使用溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1(BafilomycinA1)的Ab降解的抑制為了確認(rèn)抗體到達(dá)溶酶體(在其中它們被降解)，用巴佛洛霉素A1(一種溶酶體功能的有效抑制劑)處理細(xì)胞或不處理細(xì)胞。然后，將細(xì)胞與10μg/ml待測(cè)試的Ab在4℃孵育，洗滌并在37℃孵育2h。在細(xì)胞通透化后，使用第二抗小鼠IgG-Alexa488Ab檢測(cè)內(nèi)化的Ab。巴佛洛霉素A1的加入阻止了細(xì)胞內(nèi)Ab的降解(圖13)，表明Ab被有效地內(nèi)化并在溶酶體中降解。實(shí)施例10：pH對(duì)抗體-IGF-1R結(jié)合的作用由于抗體基于其內(nèi)化潛力被選擇，并且上面顯示在進(jìn)入溶酶體區(qū)室之前其與早期核內(nèi)體共定位，所以有趣的方法在于選擇抗體，其中根據(jù)pH環(huán)境調(diào)節(jié)所述抗體的Ab/hIGF-1R結(jié)合的穩(wěn)定性，并且優(yōu)選當(dāng)pH環(huán)境變?yōu)樗嵝詴r(shí)優(yōu)先與IGF-1R解離的抗體。事實(shí)上，早期核內(nèi)體與溶酶體之間的主要區(qū)別為它們的腔內(nèi)pH：在核內(nèi)體區(qū)室中pH約為6，而在溶酶體區(qū)室中pH約為4.5。眾所周知，一旦在配體結(jié)合(IGF1)后被內(nèi)化，hIGF-1R通過回收通路返回至細(xì)胞表面。不通過理論連接，本文所描述的假設(shè)為，抗體將可能有利于靶回收至膜，所述抗體更傾向于在酸性pH下提前從它們的靶釋放，因此其可以被認(rèn)為是ADC方法的更好的候選物。為了研究我們的抗體中的一些是否顯示這樣的性質(zhì)，并將該性質(zhì)與細(xì)胞毒活性相關(guān)聯(lián)，在不同pH的緩沖液中進(jìn)行在MCF-7細(xì)胞系中鼠抗hIGF-1RMab的結(jié)合。在從5至8變動(dòng)的不同pH下，將增加濃度的鼠mAb在MCF-7細(xì)胞系中在4℃孵育20min。然后，將細(xì)胞洗滌3次，并在FACS緩沖液中與合適的第二抗體孵育，所述第二抗體與Alexa488偶聯(lián)。將細(xì)胞在4℃在黑暗中孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗hIGF-1R抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。如在圖14中所闡明，所選擇的所有鼠抗IGF-1R抗體在酸性pH下顯示較低的結(jié)合能力。在不同pH的緩沖液中進(jìn)行人源化抗IGF-1RMab在MCF-7細(xì)胞系中的結(jié)合。在從5至8變動(dòng)的不同pH下，將增加濃度的人源化mAb在MCF-7細(xì)胞系中在4℃孵育20min。然后，將細(xì)胞洗滌3次，并在FACS緩沖液中與合適的第二抗體孵育，所述第二抗體與Alexa488偶聯(lián)。將細(xì)胞在4℃在黑暗中孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R人源化抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。如在圖24中所闡明，人源化抗IGFR抗體在酸性pH下顯示較低的結(jié)合能力。實(shí)施例12：208F2Mab的人源化形式的評(píng)價(jià)12.1第一人源化形式hz208F2VH3/VL3(也被稱作hz208F2H026/L024)的結(jié)合和內(nèi)化的評(píng)價(jià)在MCF-7、COS-7和NIH3T3IR+細(xì)胞系中評(píng)價(jià)c208F2mAb的第一人源化形式的結(jié)合。在4℃，在每個(gè)細(xì)胞系中加入增加濃度的m208F2、c208F2或hz208F2VH3VL3持續(xù)20min。然后，洗滌細(xì)胞，并使用相應(yīng)的第二抗體顯示經(jīng)測(cè)試的mAb的結(jié)合。為了驗(yàn)證人IR在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)，使用市售抗hIR抗體克隆GRO5，其識(shí)別模式在(圖15D)中示例。在MCF-7(圖15A)細(xì)胞或猴COS-7(圖15B)細(xì)胞中，人源化形式與鼠形式或嵌合形式的比較顯示了經(jīng)測(cè)試的3種形式的緊密模式。人源化過程不改變抗體識(shí)別的特異性，就在人胰島素受體上不存在交叉反應(yīng)性而論，其完全與鼠形式和嵌合形式可相比(圖15C)。在人細(xì)胞系MCF-7和猴細(xì)胞系COS-7中208F2的第一人源化形式的計(jì)算的EC50與用mAb208F2的鼠形式或嵌合形式測(cè)定的EC50相似。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估待內(nèi)化的mAbhz208F2VH3/VL3的能力。將MCF-7細(xì)胞與10μg/ml抗體在4℃孵育20min。然后，將細(xì)胞洗滌，并在4℃或37℃孵育4h。使用第二抗體確定細(xì)胞表面結(jié)合的抗體的量。ΔMFI對(duì)應(yīng)于內(nèi)化的Ab的量，所述ΔMFI被定義為4小時(shí)孵育時(shí)間后在4℃測(cè)量的MFI和在37℃測(cè)量的MFI之間的差值。ΔMFI呈現(xiàn)于圖16和表13中。10μg/mlAb的內(nèi)化的百分比計(jì)算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，并呈現(xiàn)于表13中。因此，人源化的hz208F2VH3/VL3具有結(jié)合和內(nèi)化性質(zhì)，所述結(jié)合和內(nèi)化性質(zhì)與用相應(yīng)的鼠208F2抗體和嵌合208F2抗體測(cè)量的結(jié)合和內(nèi)化性質(zhì)是相似的。表13a12.2隨后的hz208F2人源化形式的結(jié)合的評(píng)價(jià)mAb208F2被人源化，并評(píng)價(jià)十六種人源化變體(包括在12.1中所描述的第一形式)的結(jié)合性質(zhì)。使用增加的抗體濃度，在人MCF-7乳腺癌細(xì)胞系和猴細(xì)胞系Cos-7中，通過FACS分析評(píng)價(jià)人源化變體的結(jié)合性質(zhì)。為了這個(gè)目的，在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/ml)與抗IGF-1R抗體在4℃孵育20min。然后將它們洗滌3次，并在暗處與偶聯(lián)有Alexa488的合適的二級(jí)抗體在4℃孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R抗體的結(jié)合。使用非線性回歸分析(GraphPadPrims4.0)計(jì)算結(jié)合的EC50，其以摩爾濃度(M)表示。人源化變體的EC50顯示，所有的人源化變體在人細(xì)胞系和猴細(xì)胞系中顯示等同的結(jié)合性質(zhì)。人源化抗體的EC50總結(jié)于表13b中。表13b12.3另一種hz208F2人源化形式的內(nèi)化的評(píng)價(jià)將MCF-7細(xì)胞與10μg/ml人源化抗體在4℃孵育20min。然后，將細(xì)胞洗滌，并在4℃或37℃孵育4h。在FacsCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)上，使用第二抗體確定細(xì)胞表面結(jié)合的抗體的量。ΔMFI對(duì)應(yīng)于內(nèi)化的Ab的量，所述ΔMFI被定義為4小時(shí)孵育時(shí)間后在4℃測(cè)量的MFI和在37℃測(cè)量的MFI之間的差值。ΔMFI呈現(xiàn)于表13c中。10μg/mlAb的內(nèi)化的百分比計(jì)算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI。人源化抗體hz208F2H077/L018能夠誘導(dǎo)IGF-1R的顯著的內(nèi)化。表13cΔMFI內(nèi)化％hz208F2H077/L01846888實(shí)施例13：五種嵌合抗IGF-1R抗體(c208F2、c213B10、c212A11、c214F8和c219D6)和208F2抗體的人源化形式(VH3/VL3)在可溶性重組人IGF-1R中的結(jié)合的解離常數(shù)(KD)的定義通過解離速率(koff)和結(jié)合速率(kon)之間的比例定義抗體在重組可溶性人-IGF-1R中的結(jié)合的解離常數(shù)(KD)。使用CM5傳感器芯片，在BiacoreX100裝置中運(yùn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過小鼠抗TagHis單克隆抗體活化所述CM5傳感器芯片。使用胺試劑盒化學(xué)，將約12000RU的抗體化學(xué)接枝到羧甲基葡聚糖基質(zhì)上。使用HBS-EP+緩沖液(GEHealthcare)作為運(yùn)行和樣品稀釋緩沖液，以30μl/min的流速在25℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用單循環(huán)動(dòng)力學(xué)方案，以定義由其兩個(gè)C端10組氨酸標(biāo)簽捕獲的抗IGF-1R抗體在可溶性重組人IGF-1R中的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。1-人IGF-1R異四聚體的可溶性重組形式的溶液：以10μg/ml的濃度，在一分鐘期間，在第二流動(dòng)池中注射表達(dá)額外的C-末端10-His標(biāo)簽的2α鏈和2β鏈的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(R&DSystems目錄號(hào)305-GR-50)。在本研究實(shí)現(xiàn)的24個(gè)周期的每個(gè)周期中，捕獲平均587RU(具有標(biāo)準(zhǔn)差24RU)的可溶性受體。2-在捕獲階段后，在兩個(gè)流動(dòng)池中，注射運(yùn)行緩沖液5次(每次注射90秒)，或注射增加的5個(gè)濃度范圍的六種抗體之一(每次注射90秒)。在第五次注射結(jié)束時(shí)，在5分鐘期間使運(yùn)行緩沖液經(jīng)過以定義解離速率。3-然后，在45s期間注射10mM甘氨酸，HClpH1.5緩沖液使表面生成。計(jì)算的信號(hào)對(duì)應(yīng)于流動(dòng)池2的響應(yīng)(具有捕獲的IGF-1R)與流動(dòng)池1的響應(yīng)(沒有任何IGF-1R分子)之間的差值。對(duì)于每種IGF-1R，通過減去緩沖液的5次注射獲得的信號(hào)(雙參比)，校正由于增加的濃度范圍的一種抗體的注射而產(chǎn)生的信號(hào)，參見圖17。通過具有1:1模型的Biaevaluation軟件分析所得的傳感圖。對(duì)于每種抗體，使用兩種不同的濃度范圍運(yùn)行四次實(shí)驗(yàn)：對(duì)于每個(gè)抗體運(yùn)行，前兩個(gè)實(shí)驗(yàn)為40、20、10、5和2.5nM，后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)為24、12、6、3和1.5nM。對(duì)于在該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的6種抗體，當(dāng)較高的濃度被定義為常數(shù)且計(jì)算其他四個(gè)濃度時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與具有顯著的koff值的1:1模型擬合良好(參見圖18)。作為比例koff/kon計(jì)算的解離常數(shù)(KD)，和作為比例Ln(2)/koff計(jì)算的復(fù)合物的半衰期呈現(xiàn)在圖19和20中。它們對(duì)應(yīng)于對(duì)每種抗體運(yùn)行的四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條對(duì)應(yīng)于數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝4)。解離常數(shù)在10至100pM的范圍內(nèi)。c208F2抗體呈現(xiàn)對(duì)h-IGF-1R的較弱的親和力(較高的解離常數(shù)值)(具有約75pM的KD)，并且其人源化形式至少與嵌合形式一樣好(具有約60pM的KD)。其他四種抗IGF-1R嵌合抗體表現(xiàn)出對(duì)hIGF1-R的非常相似的親和力(KD約為30pM)。親和力的差異主要與復(fù)合物的解離速率或結(jié)果(resultant)半衰期相關(guān)。對(duì)于208F2，對(duì)于嵌合和人源化(VH3/VL3)形式，復(fù)合物的半衰期為2至3小時(shí)。對(duì)于其他四種嵌合抗體，平均半衰期為7.0至9.4h。這些非常慢的解離動(dòng)力學(xué)與抗體的二價(jià)結(jié)構(gòu)明顯相關(guān)，所述二價(jià)結(jié)構(gòu)能夠通過它們的兩個(gè)Fab臂同時(shí)結(jié)合至兩個(gè)相鄰的h-IGF-1R分子。在這種情況下，捕獲的IGF-1R分子的水平可能對(duì)解離速率產(chǎn)生影響。本研究中定義的親和力對(duì)應(yīng)于約600RU的捕獲的h-IGF-1R的水平的抗體的功能親和力(或親合力)。在上面所示的數(shù)據(jù)(表10)和實(shí)施例13中呈現(xiàn)的數(shù)值之間觀察到的KD的3倍差異與hIGF-1R的捕獲水平的變化相關(guān)(600RU相比于實(shí)施例4中的160RU)。實(shí)施例14：本發(fā)明的藥物的合成在以下實(shí)施例中使用以下縮寫：aq.水溶液ee對(duì)映體過量equiv當(dāng)量ESI電噴霧電離LC/MS液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用HPLC高效液相色譜NMR核磁共振sat.飽和的UV紫外線參考化合物1(S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺雙三氟乙酸化合物1A：(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙?；?1,3-噁唑烷-2-酮在惰性氣氛中，將(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-1,3-噁唑烷-2-酮(5.8g,32.7mmol,1.00equiv)溶解于四氫呋喃(THF,120mL)中。將混合物冷卻至-78℃，滴加入正丁基鋰(14.4mL)。在-78℃攪拌30分鐘之后，加入丙酰氯(5.7mL)。在-78℃持續(xù)攪拌30分鐘，然后于環(huán)境溫度攪拌過夜。將反應(yīng)混合物濃縮，然后重新溶解于200mL水中。用碳酸氫鈉飽和水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至7。用100mL乙酸乙酯(EtOAc)萃取該水相3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮以獲得6.8g(89％)黃色油形式的化合物1A。化合物1B：(2S)-2-[(1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-[(4R,5S)-4-甲基-2-氧代-5-苯基-1,3-噁唑烷-3-基]-3-氧代丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在惰性氣氛中，將化合物1A(17.6g,75.45mmol,1.00equiv)溶解于二氯甲烷(DCM,286mL)中。用冰浴冷卻該溶液。滴加入三乙胺(TEA,12.1mL,1.15equiv)和Bu2BOTf(78.3mL,1.04equiv)，同時(shí)保持反應(yīng)混合物的溫度在2℃以下。在0℃繼續(xù)攪拌45分鐘，之后將反應(yīng)冷卻至-78℃。滴加入(2S)-2-甲?；量┩?1-羧酸叔丁酯(8.5g,42.66mmol,0.57equiv)在DCM(42mL)中的溶液。在-78℃繼續(xù)攪拌2小時(shí)，然后在0℃攪拌1小時(shí)，最后在環(huán)境溫度攪拌1小時(shí)。用72mL磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2-7.4)和214mL甲醇中和反應(yīng)，并冷卻至0℃。滴加入30％過氧化氫在甲醇(257mL)中的溶液，同時(shí)保持溫度在10℃以下。在0℃繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用142mL水中和反應(yīng)，然后減壓濃縮。用200mLEtOAc萃取所得的水溶液3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和石油醚的混合物(EtOAc:PE＝1:8)純化以獲得13.16g(40％)無色油形式的化合物1B?；衔?C：(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(叔丁氧基)羰基]吡咯烷-2-基]-3-羥基-2-甲基丙酸在過氧化氫(水中30％,15.7mL)的存在下，將化合物1B(13.16g,30.43mmol,1.00equiv)溶解于THF(460mL)中，然后用冰浴冷卻。滴加入氫氧化鋰(0.4mol/L,152.1mL)的水溶液，同時(shí)保持反應(yīng)溫度在4℃以下。在0℃攪拌反應(yīng)混合物2.5小時(shí)。滴加入Na2SO3(1mol/L,167.3mL)的水溶液，同時(shí)保持溫度在0℃。在環(huán)境溫度攪拌反應(yīng)混合物14小時(shí)，然后用150mL冷的碳酸氫鈉飽和溶液中和并用50mLDCM洗滌3次。用1MKHSO4的水溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH至2-3。用100mLEtOAc萃取該水溶液3次。將有機(jī)相合并，用飽和NaCl溶液洗滌一次，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮以獲得7.31g(88％)無色油形式的化合物1C?；衔?D：(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(叔丁氧基)羰基]吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸在惰性氣氛中在碘甲烷(25.3mL)的存在下將化合物1C(7.31g,26.74mmol,1.00equiv)溶解于THF(135mL)中。用冰浴冷卻反應(yīng)介質(zhì)，之后分批加入NaH(油中60％,4.28g)。在攪拌下在0℃放置反應(yīng)3天，然后用100mL碳酸氫鈉飽和水溶液中和，并用50mL乙醚洗滌3次。用1MKHSO4的水溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH至3。用100mLEtOAc萃取該水溶液3次。將有機(jī)相合并，用100mLNa2S2O3(水中5％)洗滌一次，用NaCl飽和溶液洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮以獲得5.5g(72％)無色油形式的化合物1D?；衔?E：N-甲氧基-N-甲基-2-苯基乙酰胺將2–苯乙酸(16.2g,118.99mmol,1.00equiv)溶解于二甲基甲酰胺(DMF,130mL)中，然后冷卻至-10℃。加入氰基磷酸二乙酯(DEPC,19.2mL)、甲氧基(甲基)胺鹽酸鹽(12.92g,133.20mmol,1.12equiv)和三乙胺(33.6mL)。在-10℃攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后在環(huán)境溫度攪拌2.5小時(shí)。然后，用1升EtOAc萃取兩次。將有機(jī)相合并，用500mLNaHCO3(sat.)洗滌兩次，用400mL水洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:3)純化，以獲得20.2g(95％)黃色油形式的化合物1E?；衔?F：2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-酮在惰性氣氛中，將四甲基乙二胺(TMEDA,27.2mL)溶解于THF(300mL)中，然后在滴加入n-BuLi(67.6mL,2.5M)之前冷卻至-78℃。滴加入2–溴–1,3–噻唑(15.2mL)并在-78℃繼續(xù)攪拌30分鐘。滴加入溶解于THF(100mL)中的化合物1E(25g,139.50mmol,1.00equiv)。在-78℃繼續(xù)攪拌30分鐘，然后在-10℃攪拌2小時(shí)。用500mLKHSO4(sat.)中和反應(yīng)，然后用1升EtOAc萃取3次。將有機(jī)相合并，用400mL水洗滌兩次，用700mLNaCl(sat.)洗滌兩次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:10)純化以獲得25g(88％)黃色油形式的化合物1F?；衔?G：(1R)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-醇在惰性氣氛中，將化合物1F(15g,73.8mmol,1.00equiv.)在乙醚(300mL)中的溶液滴加入(+)-B-二異松蒎基氯硼烷((+)–Ipc2BCl,110.8mL)中。在0℃攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)，然后用300mLNaOH(水中10％)和H2O2(水中30％)的混合物(1:1)中和，最后用500mLEtOAc萃取三次。將有機(jī)相合并，用300mLK2CO3(sat.)洗滌兩次，用500mLNaCl(sat.)洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:20至1:2)純化以獲得6.3g(42％)白色固體形式的化合物1G?；衔?H：2-[(1S)-1-疊氮-2-苯基乙基]-1,3-噻唑在惰性氣氛中，在三苯基膦(13g,49.56mmol,1.70equiv.)的存在下，將化合物1G(6g,29.23mmol,1.00equiv.)溶解于THF(150mL)中，然后冷卻至0℃。滴加入偶氮二羧酸二乙酯(DEAD,7.6mL)，接著滴加入疊氮磷酸二苯酯(DPPA,11mL)，然后移走冷浴，攪拌下在環(huán)境溫度放置溶液48小時(shí)。在減壓下濃縮介質(zhì)。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:30)純化，以獲得8g黃色油形式的部分純化的化合物1H?；衔?H就這樣用于以下步驟?；衔?I：N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯在惰性氣氛中，在三苯基膦(6.5g,33.9mmol,1.20equiv)的存在下，將化合物1H(6.5g,28.2mmol,1.00equiv)溶解于THF(100mL)中，并加熱至50℃持續(xù)2小時(shí)。然后加入氨水(70mL)并繼續(xù)加熱3小時(shí)。將反應(yīng)冷卻，用500mL水中和，然后用500mLEtOAc萃取3次。將有機(jī)相合并，用500mL1NHCl萃取兩次。將水相合并，通過加入氫氧化鈉溶液(水中10％)調(diào)節(jié)至pH8-9，然后用500mLDCM萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮以獲得4.8g(83％)黃色油形式的(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-胺。然后用Boc基團(tuán)((叔丁氧基)羰基)保護(hù)該化合物，以便能夠?qū)⑵浼兓?。在惰性氣氛中，將其溶解?,4-二氧六環(huán)(40mL)中，然后冷卻至0℃。滴加入稀釋于20mL1,4-二氧六環(huán)中的(Boc)2O(10.26g,47.01mmol,2.00equiv)。移走冷浴，攪拌下在環(huán)境溫度放置溶液過夜，然后用300mL水中和，并用500mLEtOAc萃取兩次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:20，ee＝93％)純化。然后，將其在己烷/丙酮混合物(～5-10/1,1g/10mL)中重結(jié)晶，以獲得6g(84％)白色固體形式的化合物1I(ee>99％)?；衔?J：(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲?；鵠乙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在惰性氣氛中，將化合物1I(3g,9.86mmol,1.00equiv)溶解于10mLDCM中。加入三氟乙酸(TFA,10mL)，攪拌下在環(huán)境溫度放置溶液過夜，然后在減壓下濃縮，以獲得2.0g(64％)黃色油形式的(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-胺三氟乙酸鹽。將該中間體重新溶解于20mLDCM中，然后加入化合物1D(1.8g,6.26mmol,1.05equiv)、DEPC(1.1g,6.75mmol,1.13equiv)和二異丙基乙胺(DIEA,1.64g,12.71mmol,2.13equiv)。在攪拌下在環(huán)境溫度放置反應(yīng)混合物過夜，然后減壓下濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:3)純化，以獲得2.3g(81％)淡黃色固體形式的化合物1J?；衔?K：(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸鹽在惰性氣氛中，將化合物1J(2.25g,4.75mmol,1.00equiv)溶解于10mLDCM中。加入TFA(10mL)，并在攪拌下在環(huán)境溫度將溶液放置過夜，然后減壓下濃縮，以獲得2.18g(94％)黃色油形式的化合物1K?；衔?L：(2S,3S)-2-(芐基氨基)-3-甲基戊酸在環(huán)境溫度，將(2S,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸(98.4g,750mmol,1.00equiv)分批加入至2N氫氧化鈉溶液(375mL)中?？焖偌尤氡郊兹?79.7g,751.02mmol,1.00equiv)，將所得溶液攪拌30分鐘。分小份加入硼氫化鈉(10.9g,288.17mmol,0.38equiv)，同時(shí)保持溫度在5至15℃。在環(huán)境溫度繼續(xù)攪拌4小時(shí)。用200mL水稀釋反應(yīng)混合物，然后用200mLEtOAc洗滌兩次。用2N鹽酸溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH至7。通過過濾收集形成的沉淀，得到149.2g(90％)白色固體形式的化合物1L。化合物1M：(2S,3S)-2-[芐基(甲基)氨基]-3-甲基戊酸在惰性氣氛中，在甲醛(水中36.5％22.3g)的存在下，將化合物1L(25g112.97mmol,1.00equiv)溶解于甲酸(31.2g)中。在90℃攪拌溶液3小時(shí)，然后減壓下濃縮。將殘余物在250mL丙酮中研磨，然后濃縮。用500mL丙酮重復(fù)研磨/蒸發(fā)操作兩次，以獲得21.6g(81％)白色固體形式的化合物1M。化合物1N：(2S,3S)-2-[芐基(甲基)氨基]-3-甲基戊-1-醇在惰性氣氛中，在0℃，將LiAlH4(0.36g)懸浮于10mLTHF中。分小份加入化合物1M(1.5g,6.37mmol,1.00equiv)，同時(shí)保持溫度在0至10℃。在65℃攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，然后再次冷卻至0℃，之后依次加入360μL水、1mL15％氫氧化鈉和360μL水中和反應(yīng)混合物。通過過濾去除沉淀出的鋁鹽。濾液經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:50)純化，以獲得820mg(58％)淡黃色油形式的化合物1N。化合物1O：(2S,3S)-2-[芐基(甲基)氨基]-3-甲基戊醛在惰性氣氛中，將草酰氯(0.4mL)溶解于DCM(15mL)中。將溶液冷卻至-70℃，經(jīng)15分鐘滴加入二甲基亞砜(DMSO(0.5mL))在DCM(10mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，之后經(jīng)15分鐘滴加入化合物1N(820mg,3.70mmol,1.00equiv)在DCM(10mL)中的溶液。在低溫將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌30分鐘，然后緩慢加入三乙胺(2.5mL)。在-50℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后移走冷浴，用25mL水中和反應(yīng)，同時(shí)使溫度返回到正常。用30mLNaCl飽和水溶液洗滌溶液一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:200)純化，以獲得0.42g(52％)黃色油形式的化合物1O。化合物1P：(2S,3S)-N-芐基-1,1-二甲氧基-N,3-二甲基戊-2-胺在0℃，將化合物1O(4.7g,21.43mmol,1.00equiv)溶解于20mL甲醇中。滴加入濃硫酸(4.3mL)，在0℃繼續(xù)攪拌30分鐘。加入原甲酸三甲酯(21.4mL)，移走冷浴，在攪拌下在環(huán)境溫度放置反應(yīng)介質(zhì)3小時(shí)。用200mLEtOAc稀釋反應(yīng)介質(zhì)，依次用100mL10％Na2CO3和200mL飽和NaCl洗滌，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得3.4g(60％)淡黃色油形式的化合物1P。化合物1Q：[[1-(叔丁氧基)乙烯基]氧基](叔丁基)二甲基硅烷在惰性氣氛中，將二異丙基胺(20g,186.71mmol,1.08equiv)溶解于170mLTHF中，并冷卻至-78℃。滴加入nBuLi(2.4M,78.8mL)，在低溫?cái)嚢枞芤?0分鐘(以獲得LDA-二異丙基氨基鋰)，然后加入乙酸叔丁酯(20g,172.18mmol,1.00equiv)。在-78℃攪拌反應(yīng)混合物20分鐘，然后加入六甲基磷酰胺(HMPA,25.8mL)，和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl,28g,185.80mmol,1.08equiv)在35mLTHF中的溶液。在低溫繼續(xù)攪拌另外20分鐘，然后移走冷浴。減壓下濃縮溶液。將殘余物重新溶解于100mL水中，并用100mLPE萃取3次。將有機(jī)相合并，用500mLNaCl飽和水溶液洗滌一次，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物通過蒸餾純化，以獲得16.6g(83％)無色油形式的化合物1Q。化合物1R：(3R,4S,5S)-4-[芐基(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯在惰性氣氛中，將化合物1P(2.0g,7.54mmol,1.00equiv)和化合物1Q(2.6g,11.28mmol,1.50equiv)溶解于33mLDCM中。將溶液冷卻至0℃。滴加入DMF(1.2g)以及BF3·Et2O(2.1g)在7.5mLDCM中的溶液。在0℃繼續(xù)攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)用30mL碳酸鈉(10％)洗滌一次，用50mLNaCl飽和水溶液洗滌兩次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100)純化，以獲得1.82g(91％)黃色油形式的化合物1R。化合物1S：(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸酯鹽酸鹽在惰性氣氛中，在Pd/C(0.12g)和濃鹽酸(0.63mL)的存在下，將化合物1R(2.4g,6.87mmol,1.00equiv)溶解于35mL乙醇中。將氮?dú)夥仗鎿Q為氫氣氛，攪拌下在環(huán)境溫度放置反應(yīng)介質(zhì)18小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾和減壓濃縮。將殘余物在50mL己烷中研磨，移走上清液，之后將上清液減壓下干燥，獲得1.66g(82％)白色固體形式的化合物1S?；衔?T：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(芐氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯在DIEA(38.3mL)和三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸鹽(PyBrOP,32.3g)的存在下，將(2S)-2-[[(芐氧基)羰基]氨基]-3-甲基丁酸(15g,0.40mmol,1.00equiv)溶解于300mLDCM中。在環(huán)境溫度攪拌溶液30分鐘，然后加入化合物1S(15.99g,0.42mmol,1.07equiv)。將反應(yīng)介質(zhì)攪拌2小時(shí)，然后濃縮。將殘余物經(jīng)反相(C18)用乙腈(ACN)和水的混合物(40分鐘內(nèi)30:70至100:0)純化，以獲得17g(58％)無色油形式的化合物1T?；衔?U：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯在惰性氣氛中，在Pd/C(0.05g)的存在下，將化合物1T(76mg,0.15mmol,1.00equiv)溶解于10mL乙醇中。將氮?dú)夥仗鎿Q為氫氣氛，在環(huán)境溫度攪拌反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得64mg無色油形式的化合物1U?；衔?V：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸酯在碳酸氫鈉(12.78g,152mmol,3.00equiv)和9H-芴-9-基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl,19.69g,76mmol,1.50equiv)的存在下，將化合物1U(18.19g,50.74mmol,1.00equiv)溶解于400mL1,4-二氧六環(huán)/水混合物(1:1)中，然后在環(huán)境溫度攪拌2小時(shí)。然后，將反應(yīng)介質(zhì)用500mL水稀釋，并用200mLEtOAc萃取3次。將有機(jī)相合并，用200mLNaCl飽和水溶液洗滌一次,經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得40g淡黃色油形式的部分純化的化合物1V?；衔?W：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸在中性氣氛中，將化合物1V(40g,68.88mmol,1.00equiv)溶解于600mLDCM中。加入TFA(300mL)。在環(huán)境溫度攪拌溶液2小時(shí)，然后減壓濃縮。將殘余物在硅膠柱上用甲醇和DCM的混合物(1:10)純化，以獲得23.6g(65％)無色油形式的化合物1W?；衔?X：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲?；鵠乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基]-2-甲基丙基]氨基甲酸酯在化合物1K(2.18g,4.47mmol,1.00equiv)、DEPC(875mg,5.37mmol,1.20equiv)和DIEA(1.25g,9.67mmol,2.16equiv)的存在下，將化合物1W(2.53g,4.82mmol,1.08equiv)溶解于20mLDCM中。在攪拌下在環(huán)境溫度放置反應(yīng)混合物過夜，然后依次用50mL飽和KHSO4和100mL水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用甲醇和DCM的混合物(1:200至1:40)純化，以獲得2.8g(71％)淡黃色固體形式的化合物1X?；衔?Y：(2S)-2-氨基-N-[(3R,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲?；鵠乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N,3-二甲基丁酰胺在哌啶(3mL)的存在下，將化合物1X(2.8g,3.18mmol,1.00equiv)溶解于乙腈(ACN,12mL)中，并在攪拌下在環(huán)境溫度放置18小時(shí)。將反應(yīng)用50mL水中和，然后用100mLDCM萃取兩次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用甲醇和DCM的混合物(1:100至1:40)純化，以獲得1.2g(57％)黃色固體形式的化合物1Y。化合物1ZA：(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸在惰性氣氛中，在碘甲烷(181mL)的存在下，將(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-甲基丁酸(63g,289.97mmol,1.00equiv)溶解于THF(1000mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后分小份加入氫化鈉(116g,4.83mol,16.67equiv)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物1.5小時(shí)，然后移走冷浴并繼續(xù)攪拌18小時(shí)。用200mL水中和反應(yīng)，然后減壓濃縮。用4升水稀釋殘余的水相，用200mLEtOAc洗滌一次，用1N鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH至3到4。用1.2LEtOAc萃取所得的混合物3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得60g(89％)黃色油形式的化合物1ZA?；衔?ZB：(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸芐酯在Li2CO3(15.8g,213.83mmol,1.05equiv)的存在下，將化合物1ZA(47g,203.21mmol,1.00equiv)溶解于DMF(600mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后滴加入溴芐(BnBr57.9g,338.53mmol,1.67equiv)。將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后用400mL水中和并過濾。用500mLEtOAc萃取所得的溶液兩次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:20)純化，以獲得22.5g(34％)黃色油形式的化合物1ZB?；衔?ZC：(2S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酸芐酯鹽酸鹽將化合物1ZB(22.5g,70.00mmol,1.00equiv)溶解于150mLDCM中。氣態(tài)鹽酸鼓泡。在環(huán)境溫度攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后減壓濃縮，以獲得17g(94％)黃色固體形式的化合物1ZC?；衔?ZD：N-(3,3-二乙氧基丙基)氨基甲酸叔丁酯在TEA(4.45g,43.98mmol,1.08equiv)的存在下，將3,3-二乙氧基戊-1-胺(6g,40.76mmol,1.00equiv)溶解于1,4-二氧六環(huán)(30mL)中，然后冷卻至0℃。滴加入稀釋于20mL1,4-二氧六環(huán)中的(Boc)2O(9.6g,43.99mmol,1.08equiv)。將溶液在0℃攪拌2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌過夜，然后用10mL水中和。用HCl(1％)調(diào)節(jié)pH至5。用50mLEtOAc萃取溶液3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得8.21g(81％)淡黃色油形式的化合物1ZD?；衔?ZE：N-(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯將化合物1ZD(8.20g,33.15mmol,1.00equiv)溶解于18.75mL乙酸中，在攪拌下在環(huán)境溫度放置過夜。然后，用30mLEtOAc萃取反應(yīng)介質(zhì)3次。將有機(jī)相合并，用30mL飽和NaCl溶液洗滌3次，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得5g(87％)暗紅色油形式的化合物1ZE?；衔?ZF：(2S)-2-[(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙基)(甲基)氨基]-3-甲基丁酸在化合物1ZC(3.56g,13.81mmol,1.00equiv)和DIEA(9.16mL,4.00equiv)的存在下，將化合物1ZE(2.4g,13.86mmol,1.00equiv)溶解于50mLTHF中。在環(huán)境溫度攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后加入三乙酰氧基硼氫化鈉(5.87g,27.70mmol,2.00equiv)。繼續(xù)攪拌過夜，然后用100mL水中和反應(yīng)，并用50mLEtOAc萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:4)部分地純化。在Pd/C(1.2g)的存在下，將所得的粗產(chǎn)品重新溶解于20mL甲醇中，并在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下氫化20分鐘。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得200mg(5％)白色固體形式的化合物1ZF?；衔?ZG：N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲?；鵠乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4基](甲基)氨基甲?；鵠-2-甲基丙基]氨基甲?；鵠-2-甲基丙基](甲基)氨基]丙基)氨基甲酸叔丁酯在化合物1ZF(26.2mg,0.09mmol,1.20equiv)、DIEA(37.7mL)和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,43.3mg,0.11mmol,1.50equiv)的存在下，將化合物1Y(50mg,0.08mmol,1.00equiv)溶解于2mLDMF中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)在攪拌下放置過夜，然后用10mL水稀釋，并用5mLEtOAc萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得100mg部分純化的無色油形式的化合物1ZG。在中性氣氛中，將化合物1ZG(90mg,0.10mmol,1.00equiv)溶解于2mLDCM中，并用冰浴冷卻溶液。加入TFA(1mL)，在環(huán)境溫度攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后減壓濃縮。將殘余物通過制備型HPLC(Pre-HPLC-001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)7分鐘18％至31％ACN，然后經(jīng)2分鐘31％至100％ACN；Waters2489UV檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物1，產(chǎn)率25％(23mg)。LC/MS/UV(AtlantisT3柱,3μm,4.6×100mm；35℃；1mL/min,水中30％至60％ACN(經(jīng)6分鐘20mM乙酸銨)；ESI(C44H73N7O6S,精確質(zhì)量827.53)m/z：829(MH+),5.84min(93.7％,254nm)。1HNMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.85-7.80(m,1H)；7.69-7.66(m,1H),7.40-7.10(m,5H),5.80-5.63(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.22-4.00(m,1H),3.89-0.74(m,58H)。參考化合物2(S)-2-((S)-2-(((2-氨基吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺三氟乙酸鹽化合物2A：(S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在惰性氣氛中，將化合物1D(2.5g,8.70mmol,1.00equiv)和(1S,2R)-2-氨基-1-苯基丙-1-醇(1.315g,8.70mmol,1.00equiv)溶解于DMF(35mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后滴加入DEPC(1.39mL)和TEA(1.82mL)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌4小時(shí)。用200mL水稀釋反應(yīng)混合物，然后用50mLEtOAc萃取三次。將有機(jī)相合并，用50mLKHSO4(1mol/L)洗滌一次，用50mLNaHCO3(sat.)洗滌一次，用50mLNaCl(sat.)洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得3.6g(98％)黃色固體形式的化合物2A?；衔?B：(2R,3R)-N-((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺2,2,2-三氟乙酸鹽在惰性氣氛中，將化合物2A(2.7g,6.42mmol,1.00equiv)溶解于DCM(40mL)中，然后冷卻至0℃。加入TFA(25mL)，在0℃攪拌溶液2小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，以獲得4.4g黃色油形式的化合物2B?；衔?C：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯在惰性氣氛中，將化合物2B(4.4g,10.13mmol,1.00equiv)和1W(5.31g,10.12mmol,1.00equiv)溶解于DCM(45mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后滴加入DEPC(1.62mL)和DIEA(8.4mL)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌過夜。用100mL水稀釋反應(yīng)混合物，并用50mLDCM萃取三次。將有機(jī)相合并，用50mLKHSO4(1mol/L)洗滌一次，用50mLNaHCO3(sat.)洗滌一次，用50mLNaCl(sat.)洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得3.3g(39％)黃色固體形式的化合物2C?；衔?D：(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺在惰性氣氛中，將化合物2C(300mg,0.36mmol,1.00eq.)溶解于ACN(2mL)和哌啶(0.5mL)中。在環(huán)境溫度將溶液攪拌下放置過夜，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘余物在硅膠柱上用DCM和MeOH的混合物(1:100)純化，以獲得150mg(68％)白色固體形式的化合物2D?；衔?E：2-((叔丁氧基羰基)氨基)異煙酸甲酯將2-氨基吡啶-4-羧酸甲酯(2g,13.14mmol,1.00equiv)溶解于叔丁醇(20mL)中，然后加入二碳酸二叔丁酯(4.02g,18.42mmol,1.40equiv)。在60℃將反應(yīng)混合物攪拌過夜，然后通過加入1MNaHCO3水溶液(50mL)使反應(yīng)終止。通過過濾回收固體，用50mLEtOH洗滌，然后經(jīng)真空干燥，以獲得2.5g(75％)白色固體形式的化合物2E?；衔?F：(4-(羥甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯將化合物2E(2.5g,9.91mmol,1.00equiv)和CaCl2(1.65g)溶解于EtOH(30mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后逐漸加入NaBH4(1.13g,29.87mmol,3.01equiv)。在環(huán)境溫度將溶液在攪拌下放置過夜，然后加入水(50mL)使反應(yīng)終止。用20mLEtOAc萃取混合物三次。將有機(jī)相合并，用20mLNaCl(sat.)洗滌兩次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得2.0g(90％)無色固體形式的化合物2F?；衔?G：(4-甲?；拎?2-基)氨基甲酸叔丁酯將化合物2F(2.5g,11.15mmol,1.00equiv)溶解于DCE(25mL)中，然后加入19.4gMnO2(223.14mmol,20.02equiv)。在70℃將混合物在攪拌下放置過夜，然后通過過濾去除固體。將濾液蒸發(fā)至干，以獲得1.4g(57％)白色固體形式的化合物2G。化合物2H：(S)-2-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸芐酯在化合物1ZC(2.93g,11.37mmol,1.10equiv)、DIEA(5.39g,41.71mmol,4.03equiv)和NaBH(OAc)3(4.39g,20.71mmol,2.00equiv)的存在下，將化合物2G(2.3g,10.35mmol,1.00equiv)溶解于25mLTHF中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用60mLNaHCO3(sat.)中和，并用20mLAcOEt萃取3次。將有機(jī)相合并，用20mLNaCl(sat.)洗滌兩次，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:15)純化，以獲得2.7g(61％)白色固體形式的化合物2H?；衔?I：(S)-2-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸在Pd/C(250mg)的存在下，將化合物2H(500mg,1.17mmol,1.00equiv)溶解于10mLAcOEt和2mL甲醇中，在環(huán)境溫度和大氣壓力下氫化3小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得254mg(64％)無色固體形式的化合物2I。化合物2J：(4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-仲丁基)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-3,6-二異丙基-2,8-二甲基-4,7-二氧代-11-氧雜-2,5,8-三氮雜十二烷基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯以相似于化合物1ZG的方式，在DMF(3mL)中，由胺2D(85.2mg,0.14mmol,1.50equiv)、酸2I(31.7mg,0.09mmol,1.00equiv)、HATU(42.9mg,0.11mmol,1.20equiv)和DIEA(36.7mg,0.28mmol,3.02equiv)制備化合物2J。蒸發(fā)至干之后，獲得100mg白色固體形式的粗產(chǎn)物。將化合物2J(100mg,0.11mmol,1.00equiv)溶解于2mLDCM和1mLTFA中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)攪拌1小時(shí)，然后減壓濃縮。將殘余物(80mg)通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相；0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物2，產(chǎn)率6％(6.3mg)。LC/MS/UV(AscentisExpressC18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.8mL/min,經(jīng)6分鐘從10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C45H73N7O7,精確質(zhì)量823.56)m/z：824.5(MH+)和412.9(M.2H+/2,100％),3.21min(99.2％,210nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.81-7.79(m,1H)；7.39-7.29(m,5H)；6.61-6.59(m,2H)；4.84-4.52(m,1H)；4.32-4.02(m,1H)；3.90-2.98(m,10H)；2.90-2.78(m,1H)；2.55-0.81(m,39H)。參考化合物3((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸鹽化合物3A：(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在惰性氣氛中，將化合物1D(3g,10.44mmol,1.00equiv)和(S)-2-氨基-3-苯基丙酸甲酯(2.25g,12.55mmol,1.20equiv)溶解于DMF(40mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后滴加入DEPC(1.67mL,1.05equiv)和TEA(3.64mL,2.50equiv)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌過夜。用100mL水稀釋反應(yīng)混合物，然后用50mLEtOAc萃取三次。將有機(jī)相合并，用100mLKHSO4(1mol/L)洗滌一次，用100mLNaHCO3(sat.)洗滌一次，用100mLNaCl(sat.)洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得4g(85％)無色油形式的化合物3A?；衔?B：(S)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯的2,2,2-三氟乙酸鹽在惰性氣氛中，將化合物3A(5g,11.15mmol,1.00equiv)溶解于DCM(40mL)中。加入TFA(25mL)，并將溶液攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，以獲得8g黃色油形式的化合物3B?；衔?C：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯在惰性氣氛中，將化合物3B(8.03g,17.36mmol,1.00equiv)和1W(9.1g,17.34mmol,1.00equiv)溶解于DCM(80mL)中。將溶液冷卻至0℃，然后滴加入DEPC(2.8mL)和DIEA(12mL)。在0℃將反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌過夜。用200mL水稀釋反應(yīng)混合物，并用50mLDCM萃取三次。將有機(jī)相合并，用50mLKHSO4(1mol/L)洗滌一次，用50mLNaHCO3(sat.)洗滌一次，用50mLNaCl(sat.)洗滌一次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得5g(34％)黃色固體形式的化合物3C?；衔?D：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯在惰性氣氛中，將化合物3C(5.5g,6.43mmol,1.00equiv)溶解于四丁基氟化銨(TBAF,2.61g,9.98mmol,1.55equiv)的DMF(100mL)溶液中。在環(huán)境溫度將溶液攪拌2小時(shí)，然后用100mL水稀釋，并用50mLEtOAc萃取三次。將有機(jī)相合并，然后經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得3.3g(81％)黃色固體形式的化合物3D?；衔?E：(S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酸芐酯在化合物1ZC(2.9g,11.25mmol,1.21equiv)和異丙醇鈦(IV)(4.19mL,1.40equiv)的存在下，將吡啶-4-甲醛(1g,9.34mmol,1.00equiv)溶解于10mL1,2-二氯乙烷(DCE)中。在環(huán)境溫度將混合物攪拌30分鐘，然后加入2.77gNaBH(OAc)3(13.07mmol,1.40equiv)。將反應(yīng)介質(zhì)在攪拌下放置過夜，然后用100mL水中和，并用50mLAcOEt將混合物萃取3次。將有機(jī)相合并，并蒸發(fā)至干。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:20)純化，以獲得1.3g(45％)無色油形式的化合物3E。化合物3F：(S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酸在Pd/C(300mg)的存在下，將化合物3E(800mg,2.56mmol,1.00equiv)溶解于30mLAcOEt中，并在環(huán)境溫度和大氣壓力下氫化3小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮。將殘余物在硅膠柱上用DCM和MeOH的混合物(100:1至5:1)純化，以獲得100mg(18％)白色固體形式的化合物3F。將化合物3D(50mg,0.08mmol,1.00equiv)和3F(26.34mg,0.12mmol,1.50equiv)溶解于3mLDCM中。將溶液冷卻至0℃，然后加入0.018mLDEPC和0.0392mLDIEA。在0℃將反應(yīng)攪拌2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度攪拌過夜。將反應(yīng)介質(zhì)減壓濃縮，并將殘余物(70mg)通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2545紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物3，產(chǎn)率27％(20mg)。LC/MS/UV(AscentisExpressC18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,經(jīng)8分鐘10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C46H72N6O8,精確質(zhì)量836.5)m/z：837.5(MH+)和419.4(M.2H+/2(100％)),7.04min(90.0％,210nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.76-8.74(m,2H)；8.53-8.48(m,0.4H,NHCO不完全的交換)；8.29-8.15(m,0.8H,NHCO不完全的交換)；8.01(s,2H),7.31-7.22(m,5H),4.88-4.68(m,3H)；4.31-4.07(m,2H)；3.94-2.90(m,18H)；2.55-0.86(m,38H)。參考化合物4(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸三氟乙酸鹽將化合物3(100mg,0.11mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(5mL)和哌啶(2.5mL)的混合物中。將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后減壓濃縮。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2545紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化，以獲得20mg(20％)白色固體形式的化合物4。LC/MS/UV(AscentisExpressC18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,經(jīng)8分鐘10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C45H70N6O8,精確質(zhì)量822.5)m/z：823.5(MH+)和412.4(M.2H+/2,100％),6.84min(89.1％,210nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.79-8.78(m,2H)；8.09(m,2H)；7.30-7.21(m,5H)；4.80-4.80(m,1H),4.36-0.87(m,58H)。參考化合物6(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯雙三氟乙酸鹽化合物6A：(2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙基)(甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚?；鵠吡咯烷-2-基](甲氧基)甲基]丙酰胺基]-3-苯基丙酸甲酯在0℃，在惰性氣氛中，在羧酸1ZF(78.7mg,0.27mmol,1.10equiv)、DEPC(46μl)和DIEA(124μl)的存在下，將化合物3D(157.5mg,0.25mmol,1.00equiv)溶解于3mLDCM中。在低溫將反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)，然后移走冷浴，并繼續(xù)攪拌4小時(shí)。然后減壓濃縮，以獲得200mg粗黃色油形式的化合物6A。其就這樣用于以下步驟。在惰性氣氛中，在0℃將化合物6A(200mg,0.22mmol,1.00equiv)溶解于2mLDCM中。滴加入TFA(1mL)，移走冷浴。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，然后減壓濃縮。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化，以獲得60mg(26％，2個(gè)步驟的產(chǎn)率)白色固體形式的化合物6。LC/MS/UV(ZorbaxEclipsePlusC8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,經(jīng)18分鐘30至80％甲醇在水中(0.1％H3PO4))；ESI(C43H74N6O8,精確質(zhì)量802.56)m/z：804(MH+)；11.50min(91.5％,210nm)。1HNMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.52(d,0.3H,NHCO不完全的交換)；8.25(d,0.5H,NHCO不完全的交換)；7.30–7.22(m,5H)；4.9–4.6(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；4.0–0.86(m,61H)。參考化合物7(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸雙三氟乙酸鹽將化合物6(70mg,0.08mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(2.5mL)和哌啶(5mL)的混合物中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后減壓濃縮。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；UVWaters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化，以獲得14.6mg(21％)白色固體形式的化合物7。LC/MS/UV(AscentisExpressC18,2.7μm,4.6×100mm；1.5mL/min,40℃,經(jīng)8分鐘0至80％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C42H72N6O8,精確質(zhì)量788.54)m/z：790(MH+),5.71min(96.83％,210nm)。1HNMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.42(d,0.3H,NHCO不完全的交換)；8.15(d,0.2H,NHCO不完全的交換)；7.31–7.21(m,5H)；4.9–4.6(m,3H)；4.25–4.0(m,1H)；4.0–0.86(m,59H)。化合物11(S)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺三氟乙酸鹽化合物11A：N-[4-(2-羥乙基)苯基]氨基甲酸叔丁酯將二碳酸二叔丁酯(16.7g,77mmol,1.05eq.)加入至2-(4-氨基苯基)乙醇(10g,72.9mmol,1eq.)的THF(200mL)溶液中，并將反應(yīng)在環(huán)境溫度攪拌過夜。將混合物用EtOAc(200mL)稀釋，用水(200mL)洗滌，然后用1MHCl(100mL)洗滌，然后用飽和NaHCO3水溶液(100mL)洗滌，然后用鹽水(100mL)洗滌。將有機(jī)相用MgSO4干燥，然后減壓蒸發(fā)至干。將粗產(chǎn)物用庚烷(150mL)研磨兩次，并在真空中干燥，以得到為白色固體的化合物11A(14.7g，84％)?；衔?1B：N-[4-(2-氧代乙基)苯基]氨基甲酸叔丁酯將化合物11A(2.5g,10.5mmol,1.00equiv)溶解于25mLDCM中，然后冷卻至-78℃。滴加入DCM(10mL)中的戴斯-馬丁高碘烷溶液(DMP,6.71g,15.8mmol,1.5equiv)。移走冷浴，在環(huán)境溫度繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用60mL碳酸氫鈉飽和水溶液和Na2S2O3飽和水溶液的50/50混合物中和反應(yīng)。用30mLEtOAc萃取所得溶液3次。將有機(jī)相合并，用NaCl飽和水溶液洗滌兩次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮。殘余物經(jīng)硅膠純化(EtOAc/PE1/15)，以獲得1.0g(40％)淡黃色固體形式的化合物11B?；衔?1C：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸芐酯在DIEA(6.4g,49.7mmol,4.0equiv)、醛11B(2.9g,12.3mmol,1.0equiv)和三乙酰氧基硼氫化鈉(5.23g,49.7mmol,2.0equiv)的存在下，將化合物1ZC(3.5g,13.6mmol,1.1equiv)溶解于THF(30mL)中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后用60mL碳酸氫鈉飽和溶液中和。用30mLEtOAc將所得的溶液萃取3次。將有機(jī)相合并，用NaCl飽和水溶液洗滌兩次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮。殘余物經(jīng)硅膠純化(EtOAc/PE1:20)，以獲得3.7g(68％)黃色油形式的化合物11C。化合物11D：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸在Pd/C(2g)的存在下，將化合物11C(2g,4.5mmol,1equiv)溶解于10mL甲醇中，并在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下氫化2小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得1.2g(75％)黃色油形式的化合物11D?；衔?1E：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸在惰性氣氛中，將化合物11D(1.2g,3.4mmol,1.00equiv)溶解于THF(20mL)中。用冰浴冷卻反應(yīng)介質(zhì)，然后分批加入NaH(在油中的60％,549mg,13.7mmol,4.0equiv)，接著加入碘甲烷(4.9g,34mmol,10equiv)。在環(huán)境溫度將反應(yīng)在攪拌下放置過夜，然后用水中和，并用100mLEtOAc洗滌。用1NHCl調(diào)節(jié)水溶液的pH至6-7。用100mLEtOAc將該水溶液萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，以獲得800mg(64％)黃色固體形式的化合物11E?；衔?1F：N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲?；鵠乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4基](甲基)氨基甲?；鵠-2-甲基丙基]氨基甲?；鵠-2-甲基丙基](甲基)氨基]乙基)苯基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯以相似于化合物6A的方式，由胺1Y(150mg,0.22mmol,1.2equiv)和酸11E(70mg,0.19mmol,1.0equiv)制備化合物11F。經(jīng)硅膠(EtOAc/PE1:1)純化之后，獲得100mg(52％)淡黃色固體形式的期望的產(chǎn)物。以相同于化合物1的方式，由中間體11F(100mg,0.1mmol)制備化合物11。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物11，產(chǎn)率39％(39.7mg)。LC/MS/UV(EclipsePlusC8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,經(jīng)18分鐘50至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C50H77N7O6S,精確質(zhì)量903.57)m/z：904.5(MH+),7.53min(93.68％,254nm)。1HNMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.84(d,0.5H,NHCO不完全的交換)；8.7–8.5(m,0.9H,NHCO不完全的交換)；7.76–7.73(m,1H)；7.55-7.4(m,1H)；7.28–7.22(m,7H)；7.08–7.05(m,2H)；5.51–5.72(m,1H)；4.9–4.80(m,2H)；4.3–0.7(m,60H)。化合物12(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸鹽以合成化合物1最后階段的相同方式，由胺3D(118mg,0.19mmol)和酸11E(82mg,0.22mmol)經(jīng)兩步驟制備化合物12。將最終殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物12，產(chǎn)率7％(13.7mg)。LC/MS/UV(EclipsePlusC8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,經(jīng)18分鐘40至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C49H78N6O8,精確質(zhì)量878.59)m/z：879.7(MH+),10.07min(90.6％,254nm)。1H:NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.40(se,2H)；7.38–7.22(m,7H)；4.95–4.7(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；3.9–0.86(m,62H)?；衔?3(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸三氟乙酸鹽以相同于化合物7的方式，由化合物12(100mg,0.10mmol)制備化合物13。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物13，產(chǎn)率20％(20mg)。LC/MS/UV(AscentisExpressC18,2.7μm,4.6×100mm；1.5mL/min,40℃,經(jīng)8分鐘10至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C48H76N6O8,精確質(zhì)量864.57)m/z：865.6(MH+),6.05min(90.9％,210nm)。1HNMR:(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.32–7.19(m,9H)；4.9–4.65(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；3.9–0.86(m,59H)?；衔?4(S)-2-((S)-2-((3-氨基芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺三氟乙酸鹽化合物14A：(3-(羥甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯將(3-氨基苯基)甲醇(3g,24.36mmol,1.00equiv)溶解于THF(60mL)中，然后加入二碳酸二叔丁酯(6.38g,29.23mmol,1.20equiv)。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后加入200mL水稀釋反應(yīng)。用100mLAcOEt將產(chǎn)物萃取3次，然后將有機(jī)相重新合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得黃色油形式的粗產(chǎn)物(13.85g化合物14A)?；衔?4B：(3-甲?；交?氨基甲酸叔丁酯將化合物14A(13.8g,61.81mmol,1.00equiv)溶解于DCE(400mL)中，然后加入MnO2(54g,621.14mmol,10.05equiv)。在環(huán)境溫度將混合物在攪拌下放置3天，然后通過過濾去除固體。將濾液蒸發(fā)至干，將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:30)純化，以獲得3g(22％)白色固體形式的化合物14B。化合物14C：(S)-2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸芐酯在化合物1ZC(1.16g,4.50mmol,1.00equiv)、DIEA(3mL)和NaBH(OAc)3(1.92g,9.06mmol,2.01equiv)的存在下，將化合物14B(1g,4.52mmol,1.00equiv)溶解于20mLTHF中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后用100mL水中和，并用50mLAcOEt萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將殘余物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:50)純化，以獲得1.9g(99％)白色固體形式的化合物14C?；衔?4D：(S)-2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸在Pd/C(400mg)的存在下，將化合物14C(1g,2.34mmol,1.00equiv)溶解于30mLAcOEt和4mL甲醇中，在環(huán)境溫度和大氣壓力下氫化1小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得680mg(86％)白色固體形式的化合物14D?；衔?4E：(3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-仲丁基)-3,6-二異丙基-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-2,8-二甲基-4,7-二氧代-11-氧雜-2,5,8-三氮雜十二烷基)苯基)氨基甲酸叔丁酯以相同于化合物3的方式，在DCM(3mL)中，由胺1Y(100mg,0.15mmol,1.00equiv)、酸14D(102.27mg,0.30mmol,2.00equiv)、DEPC(0.053mL)和DIEA(0.046mL)合成化合物14E。將粗產(chǎn)物(80mg)在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:1)純化，以獲得100mg(67％)淡黃色固體形式的化合物14E。以相同于化合物2的方式，由中間體14E(100mg,0.10mmol,1.00equiv)制備化合物14。將粗產(chǎn)物(80mg)通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2545紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物14，產(chǎn)率10％(10mg)。LC/MS/UV(EclipseplusC8柱,3.5μm,4.6×150mm；40℃；1.0mL/min,經(jīng)18分鐘40％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C48H73N7O6S,精確質(zhì)量875.5)m/z：876.5(MH+)和438.9(M.2H+/2,100％),11.35min(95.6％,210nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)8.92-8.86(m,0.4H,NH不完全的交換)；8.70-8.54(m,0.6H,NH不完全的交換)；7.88-7.78(m,1H)；7.60-7.50(m,1H)；7.45-6.97(m,9H)；5.80-5.65(m,1H)；4.85-4.70(m,1H)；4.40-0.80(m,56H)?；衔?5(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸鹽化合物15A：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((叔丁氧羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯以相同于化合物3的方式，在DCM(5mL)中，由胺3D(200mg,0.32mmol,1.00equiv)、酸14D(212.6mg,0.63mmol,2.00equiv)、DEPC(0.1103mL)和DIEA(0.157mL,3.00equiv)合成化合物15A。將粗產(chǎn)物在硅膠柱上用EtOAc和PE的混合物(1:1)純化，以獲得200mg(67％)黃色固體形式的化合物15A?；衔?5：以相同于化合物2的方式，由中間體15A(200mg,0.21mmol,1.00equiv)合成化合物15。將粗產(chǎn)物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2545紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化。獲得白色固體形式的化合物15，產(chǎn)率19％(38.6mg)。LC/MS/UV(AscentisExpressC18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,經(jīng)8分鐘10％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C47H74N6O8,精確質(zhì)量850.5)m/z：851.5(MH+)和426.4(M.2H+/2,100％),6.61min(91.1％,210nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.53-7.42(m,1H)；7.35-7.18(m,8H)；4.88-4.79(m,2H)；4.42-4.00(m,3H)；3.93-2.71(m,22H)；2.61-0.81(m,33H)。化合物20(S)-2-((S)-2-((4-氨基芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺三氟乙酸鹽以相同于化合物1的方式，由胺1ZC和相應(yīng)的醛制備化合物20。在化合物20的制備中涉及的4-硝基苯甲醛是市售的。通過還原硝基完成化合物20的合成。該合成如下進(jìn)行：將(2S)-N-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-[[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲?；鵠-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N,3-二甲基-2-[(2S)-3-甲基-2-[甲基[(4–硝基苯基)甲基]氨基]丁酰胺基]丁酰胺(40mg,0.05mmol,1.0equiv)溶解于15mL乙醇中。加入二水合的氯化錫(II)(317mg,1.4mmol,30equiv)，在環(huán)境溫度將溶液在攪拌下放置3天。將反應(yīng)用50mL水中和，然后用50mLEtOAc萃取三次。將有機(jī)相合并，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾和減壓濃縮，以獲得粗品狀態(tài)的化合物20(純度：93.2％；量：21.6mg)。將化合物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2489紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化，以獲得白色固體形式的對(duì)應(yīng)的TFA鹽。1HNMR:(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.85–7.80(m,1H)；7.6–7.5(m,1H)；7.4–7.15(m,5H)；7.1–7.05(m,2H)；6.73–6.70(m,2H)；5.8–5.55(m,1H)；5.0–4.7(m,2H)；4.25–4.05(m,1H)；4.0–0.8(m,54H)。LC/MS/UVESI:(C48H73N7O7S,精確質(zhì)量875.53)m/z876(MH+),439[75％,(M.2H+)/2]；UV:RT＝4.83min(96.8％,254nm)。1HNMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.85–7.80(m,1H)；7.6–7.5(m,1H)；7.4–7.1(m,7H)；6.76–6.72(m,2H)；5.8–5.55(m,1H)；4.9–4.65(m,2H)；4.25–4.05(m,1H)；4.0–0.8(m,54H)?；衔?9(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸三氟乙酸鹽將化合物15(100mg,0.10mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(5mL)和哌啶(2.5mL)的混合物中。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物在攪拌下放置過夜，然后減壓濃縮。將殘余物通過制備型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脫相：0.05％TFA緩沖的水/ACN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％ACN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％ACN；Waters2545紫外檢測(cè)器在254nm和220nm處)純化，以獲得20mg(20％)白色固體形式的化合物29。LC/MS/UV(EclipsePlusC8柱,3.5μm,4.6×150mm；40℃；1.0mL/min,經(jīng)18分鐘40％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C46H72N6O8,精確質(zhì)量836.54)m/z:837.5(MH+)和419.4(M.2H+/2,100％),10.61min(92.5％,210nm)。1HNMR:(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)7.38-7.15(m,6H)；7.00-6.99(m,3H)；4.85-4.68(m,2H)；4.37-3.38(m,11H)；3.31-2.70(m,8H)；2.60-0.82(m,35H)?；衔?1(S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺化合物61A：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸二鹽酸鹽將化合物11D(962mg,2.75mmol)溶解于10mL市售可得的HCl在丙-2-醇中的溶液(5-6M)中，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC分析表明起始原料被消耗完全。將溶劑減壓蒸發(fā)，并用Et2O(2×10ml)研磨所得的黃色固體。將產(chǎn)物真空干燥，以得到為黃色固體的化合物61A(322mg,47％)?；衔?1：將羧酸61A(73mg,0.23mmol,1eq.)和胺1Y(150mg,0.23mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(2ml)中。加入DIEA(158μl,0.90mmol,4eq.)和DECP(51μl,0.34mmol,1.5eq.)，并在室溫將反應(yīng)攪拌4小時(shí)。LC-MS分析表明起始原料被消耗完全。將溶劑減壓蒸發(fā)，并將殘余物在硅膠上通過閃式色譜法(DCM/MeOH)純化，以得到為淡黃色固體的化合物61(83mg,40％)。1HNMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體),8.86(d,0.5H,NHCO)；8.65(d,0.5H,NHCO),8.11-8.05(m,1H,NHCO),7.80(d,0.5H,噻唑),7.78(d,0.5H,噻唑),7.65(d,0.5H,噻唑),7.63(d,0.5H,噻唑),7.32–7.12(m,5H),6.83(d,J＝8.3Hz,2H),6.45(d,J＝8.3Hz,2H),5.56–5.49(m,0.5H),5.42–5.35(m,0.5H),4.78(s,2H,NH2),4.74–4.46(m,2H),4.01–0.66(m,57H)。HPLC(XbridgeShieldC18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,經(jīng)2.25分鐘0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持續(xù)0.5分鐘,Tr＝1.31min(96.5％,220nm)。m/z(Q-TOFESI+)890.5558(2％,MH+,C49H76N7O6S要求890.5572),445.7834(100％,(MH2)2+,C49H77N7O6S要求445.7823)?；衔?2((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯以相同于化合物61的方式，使用羧酸61A(69mg,0.21mmol,1eq.)、胺3D(135mg,0.21mmol,1eq.)、DIEA(75μl,0.43mmol,2eq.)和DECP(49μl,0.32mmol,1.5eq.)制備化合物62。將粗產(chǎn)物在硅膠上通過閃式色譜法(DCM/MeOH)純化，以得到為黃色固體的化合物62(82mg,45％)。1HNMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體),8.50(d,J＝8.3,0.5H,NHCO)；8.27(d,J＝8.0,0.5H,NHCO),8.15-8.04(m,1H,NHCO),7.27–7.13(m,5H),6.86–6.79(m,2H),6.48–6.42(m,2H),4.78(s,2H,NH2),4.74–4.44(m,3H),4.01–3.72(m,1.5H),3.66(s,1.5H,CO2Me),3.63(s,1.5H,CO2Me),3.57-0.65(m,55.5H)。HPLC(XbridgeShieldC18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,經(jīng)2.25分鐘0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持續(xù)0.5分鐘,Tr＝1.29min(95.3％,220nm)。m/z(Q-TOFESI+)865.5800(2％,MH+,C48H77N6O8要求865.5797),433.2937(100％,(MH2)2+,C48H78N6O8要求433.2935)。化合物63((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯基丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽將化合物62(23mg,0.03mmol)溶解于水(1ml)和乙腈(1ml)的混合物中。加入哌啶(0.75ml)，并在室溫將混合物攪拌5小時(shí)。TLC分析表明起始原料被完全消耗。將溶劑減壓蒸發(fā)，并將殘余物通過制備型HPLC(SunFirePrep柱C18OBD,5μm,19×150mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)10分鐘20％至40％MeCN，然后經(jīng)2分鐘40％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2545在254nm和220nm處)純化。獲得為白色固體的化合物63(14mg,66％)。1HNMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體),12.7(s(br),1H,CO2H),9.58(m(br),1H)；9.04–8.89(m,1H),8.41(d,0.6H,NHCO),8.15(d,0.4H,NHCO),7.27–7.13(m,5H),7.13–6.99(m(br),2H),6.90–6.64(s(br),2H),4.77–3.40(m,10H),3.34–2.75(m,20H),2.34–1.94(m,4H),1.90–0.7(m,25H)。HPLC(XbridgeShieldC18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,經(jīng)2.25分鐘0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持續(xù)0.5分鐘,Tr＝1.24min(100％,220nm)。m/z(Q-TOFESI+)851.5641(6％,MH+,C47H75N6O8要求851.5641),426.2854(100％,(MH2)2+,C47H76N6O8要求426.2857)。實(shí)施例15：藥物的抗增殖活性方法：細(xì)胞培養(yǎng)。將A549(非小細(xì)胞肺癌-ATCCCCL-185)和MDA-MB-231(乳腺癌–ATCCHTB-26)細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有5％胎牛血清(FCS)的最低必需介質(zhì)Eagle(MEM)和含有10％FCS的Dulbecco改良的Eagle介質(zhì)(DMEM)中。將MCF7(乳腺導(dǎo)管癌–ATCCHTB-22)和SN-12C(腎癌–ATCC)細(xì)胞維持在含有10％FCS的RPMI1640介質(zhì)中(對(duì)于MCF7細(xì)胞沒有酚紅)。所有的介質(zhì)均補(bǔ)充有兩性霉素(1.25μg/mL)和青霉素-鏈霉素(100U/100μg/mL)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下在孵育器中在37℃、5％CO2和95％大氣濕度下培養(yǎng)細(xì)胞。在4種腫瘤細(xì)胞系中的抗增殖活性。使用ATPlite增殖試驗(yàn)(PerkinElmer，VillebonsurYvette，法國)在4種細(xì)胞系的綜合板上考察所選擇的藥物的抗增殖活性。在第0天將細(xì)胞接種于96孔板上(對(duì)于A549為103細(xì)胞/孔，對(duì)于MCF7、MDA-MB-231和SN12C為2.103)，其濃度能夠保證細(xì)胞在72h藥物處理期處于對(duì)數(shù)細(xì)胞生長期。在24h孵育期之后，將所有細(xì)胞用系列稀釋的受試化合物處理(11μL10X在1％DMSO中的溶液-6孔/條件)。為了避免細(xì)胞粘附到槍頭(tip)上，在兩個(gè)連續(xù)稀釋之間更換槍頭。然后，將細(xì)胞放置在37℃、5％CO2孵育器中。在第4天，通過計(jì)量(dose)活細(xì)胞釋放的ATP評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。與溶劑處理的細(xì)胞的數(shù)量相比，分析活細(xì)胞的數(shù)量。使用曲線擬合分析(具有S形劑量響應(yīng)的非線性回歸模型，可變坡面系數(shù))確定EC50值，使用由GraphPadSoftware(GraphPadSoftwareInc.,CA,美國)提供的算法進(jìn)行所述曲線擬合分析。結(jié)果：各種藥物：依據(jù)上述的方法，測(cè)試各種藥物，以確定它們?cè)贛DA–MB–231細(xì)胞系中的抗增殖活性。測(cè)量的活性給出EC50<0.1μM的值。選自上面示例藥物的數(shù)個(gè)以下的示例闡明了它們完全顯著的抗增殖性質(zhì)：實(shí)施例12：EC50＝5.80×10-10M；實(shí)施例13：EC50＝7.95×10-8M；實(shí)施例15：EC50＝1.70×10-10M；實(shí)施例27：EC50＝1.20×10-10M。各種細(xì)胞系：依據(jù)上面所描述的方法，在不同的細(xì)胞系(A549、MDA–MB–231、MCF-7、SN12C)中測(cè)試化合物15。測(cè)量的活性在所有經(jīng)測(cè)試的細(xì)胞系中給出了EC50<0.1μM的值。EC50(M)A549MDA-MB-231MCF-7SN12C化合物151.45x10-101.70x10-107.15x10-102.18x10-10對(duì)比實(shí)施例：在下面對(duì)比實(shí)施例中研究了苯環(huán)上的取代(氨基相比于羧基)，顯示包含氨基取代基的根據(jù)本發(fā)明的藥物的改善的抗增殖活性。實(shí)施例16：藥物-接頭部分的合成化合物E-114-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二異丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)苯基)(甲基)氨基甲酸酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物E-11-1：(S)-2-氨基-5-脲基戊酸甲酯鹽酸鹽在0℃，在攪拌下將乙酰氯(10mL)滴加至MeOH(120mL)中。在20分鐘后，加入L-瓜氨酸(10g，57mmol，1.00eq.)，并將混合物加熱回流過夜。減壓蒸發(fā)溶劑，以獲得15g(116％)為白色固體的化合物E-11-1。產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步干燥用于下一個(gè)步驟?；衔顴-11-2：(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸甲酯在惰性氣氛中，在0℃，將化合物E-11-1(13g,57.6mmol,1.1eq.)溶解于DMF(140mL)中。加入DIEA(30mL,173mmol,3.0eq.)、羥基苯并三唑(HOBt-10.59g,69.1mmol,1.2eq.)和Boc-L-纈氨酸羥基琥珀酰亞胺酯(Boc-Val-OSu-18.1g,57.6mmol,1.0eq.)。將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度攪拌過夜，然后減壓蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶解于水(100mL)中，并用DCM(150mL)萃取兩次。合并有機(jī)相，用Na2SO4干燥，并減壓濃縮。將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得18.8g(84％)為白色固體的化合物E-11-2?；衔顴-11-3：(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺)-5-脲基戊酸在0℃，將化合物E-11-2(18.8g,48.4mmol,1eq.)溶解于MeOH(200mL)中。加入1MNaOH溶液(72mL,72mmol,1.5eq.)，并將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓除去MeOH，并使用1MHCl將殘余的水溶液酸化。將水相蒸發(fā)至干，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得18g(99％)為白色固體的化合物E-11-3?；衔顴-11-4：((S)-1-(((S)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯將化合物E-11-3(5g,13.4mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(65ml)和干燥MeOH(35ml)的混合物中。加入(4-氨基苯基)甲醇(1.81g,14.7mmol,1.1eq.)和N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ-6.60g,26.7mmol,2eq.)，并將混合物在暗處攪拌過夜。減壓蒸發(fā)溶劑，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得5.2g(73％)為灰白色固體的化合物E-11-4?；衔顴-11-5：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯在惰性氣氛中，在環(huán)境溫度，將化合物E-11-4(1.1g,2.29mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(5mL)中。加入雙(4-硝基苯基)碳酸酯(1.40g,4.59mmol,2eq.)，然后加入DIEA(600μl,3.44mmol,1.5eq.)，并將所得的黃色溶液攪拌過夜。減壓蒸發(fā)DMF，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得1.27g(84％)為灰白色固體的化合物E-11-5?；衔顴-11-6：4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二異丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)苯基)(甲基)氨基甲酸酯2,2,2-三氟乙酸鹽將碳酸酯E-11-5(114mg,0.177mmol,1.2eq.)和苯胺11F(150mg,0.147mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(4mL)中。加入HOBt(38mg,0.295mmol,2eq.)和DIEA(54μL,0.295mmol,2eq.)，并將混合物在室溫?cái)嚢柽^周末。減壓蒸發(fā)DMF，并將殘余物通過閃式色譜法在硅膠上純化，用DCM洗脫。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將產(chǎn)物重新純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物E-11-6(89mg，39％)?；衔顴-11：將化合物E-11-6(21mg,0.014mmol,1.0eq.)溶解于DCM(0.25mL)中，并加入TFA(40μL)。將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后，LC-MS分析表明起始材料完全消耗。將混合物短暫冷卻(液氮浴)，同時(shí)加入DMF(0.5mL)，然后加入DIEA(100μL)以中和TFA。然后移除冷卻浴，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(4mg,0.012mmol,1eq.)。將混合物在室溫?cái)嚢?8小時(shí)，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將產(chǎn)物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物E-11(11mg,54％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1524.8282(2％,MNa+,C79H115N13NaO14S要求1524.8299),751.9283(100％,(MH2)2+,C79H117N13O14S要求751.9276)?；衔顴-12((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物E-12-1：((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-((((全氟苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-5-脲基戊烷-2-基)氨基)丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯在惰性氣氛中，在0℃，將化合物E-11-4(670mg,1.26mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(6mL)中。加入雙(全氟苯基)碳酸酯(991mg,2.51mmol,2eq.)，然后加入DIEA(329μl,1.89mmol,1.5eq.)，并將所得的無色溶液在室溫?cái)嚢?0分鐘。減壓蒸發(fā)DMF，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得836mg(96％)為灰白色固體的化合物E-12-1?；衔顴-12-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽在惰性氣氛中，在0℃，將苯胺12(165mg,0.189mmol,1.0eq.)溶解于DMF(5mL)中。加入碳酸酯E-12-1(194mg,0.282mmol,1.5eq.)、HOBt(51mg,0.375mmol,2eq.)和DIEA(66μL,0.375mmol,2eq.)，并將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將殘余物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物E12-7(247mg,77％)?；衔顴-12-3：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯雙(2,2,2-三氟乙酸鹽)將化合物E-12-2(5.6mg,4.04μmol,1.0eq.)溶解于TFA(100μL)中。在5分鐘之后，加入2ml水，并將混合物凍干過夜，以獲得為灰白色固體的化合物E-12-3(5.6mg,98％)?；衔顴-12：將化合物E-12-3(5.6mg,4μmol,1.0eq.)溶解于乙腈(0.5mL)中，并加入DIEA(5μL,7eq.)，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2.5mg,8μmol,2eq.)。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。在通過LC-MS控制反應(yīng)后，加入200μL水，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將所得的溶液純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物E-12(4.6mg,70％)。m/z(Q-TOFMSESI+)739.4389(100％,(MH2)2+,C78H118N12O16要求739.4389)。化合物E-13((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽化合物E-13-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸在室溫，將化合物E-12-2(185mg,0.123mmol,1.0eq.)溶解于水(5mL)和乙腈(5mL)的混合物中。加入哌啶(3.67mL,300eq.)，并將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶劑減壓蒸發(fā)至干，并將殘余物用Et2O(60mL)研磨。將固體用Et2O(20ml)沖洗兩次，并真空干燥，以獲得為灰白色固體的化合物E-13-1(175mg,95％)。化合物E-13-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸雙(2,2,2-三氟乙酸鹽)將化合物E-13-1(175mg,0.128mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分鐘之后，加入水(1ml)和乙腈(1ml)，并將溶液凍干過夜，以獲得為灰白色固體的化合物E-13-2(180mg,87％)?；衔顴-13：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽將化合物E-13-2(80mg,0.058mmol,1.0eq.)溶解于乙腈(1.5mL)和DMF(0.4mL)的混合物中。加入DIEA(50μL,0.289mmol,5eq.)，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(36mg,0.116mmol,2eq.)。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。在通過LC-MS控制反應(yīng)之后，減壓蒸發(fā)溶劑，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將殘余物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物E-13(32mg,35％)。m/z(Q-TOFMSESI-)1461.8336(100％,(M-H)-,C77H113N12O16要求1461.8403)。m/z(Q-TOFMSESI+)1463.8565(2％,MH+,C77H115N12O16要求1463.8549),732.4317(100％,(MH2)2+,C77H116N12O16要求732.4311)?；衔顴-15((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物E-15-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽根據(jù)與化合物E-11-6相同的方法，在DMF(2mL)中使用碳酸酯E-11-5(28mg,0.044mmol,1eq.)、苯胺15(42mg,0.044mmol,1eq.)、HOBt(3mg,0.022mmol,0.5eq.)和DIEA(15μL,0.087mmol,2eq.)制備化合物E-15-1。分離到為白色固體的化合物E-15-1(8.2mg,13％)?；衔顴-15-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)芐基)氧基)羰基)氨基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯雙(2,2,2-三氟乙酸鹽)將化合物E-15-1(8.2mg,5.58μmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分鐘之后，加入水(1ml)，并將溶液凍干過夜，以獲得為白色固體的化合物E-15-8(7.6mg,99％)?；衔顴-15：根據(jù)與化合物E-12相同的方法，在乙腈(0.5mL)中使用胺E-15-2(7.6mg,5.55μmol,1eq.)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2mg,6.65μmol,1.2eq.)和DIEA(5μL,0.028mmol,5eq.)制備化合物E-15。分離到為白色固體的化合物E-15(4.2mg,48％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1471.8169(2％,MNa+,C76H112N12NaO16要求1471.8211),725.4223(100％,(MH2)2+,C76H114N12O16要求725.4232),483.9482(10％,(MH3)3+,C76H115N12O16要求483.9513)。化合物F-13((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽化合物F-13-1：N-(4-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸芐酯將化合物11C(250mg,0.567mmol,1eq.)溶解于THF(10ml)中，然后加入NaH(在礦物油中的60％混懸液，68mg，1.702mmol，3eq.)。將混合物攪拌5分鐘，然后加入碘甲烷(106μL,1.702mmol,3eq.)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用水淬滅，并在EtOAc(100mL)和水(50mL)之間分離。將有機(jī)相用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干，以獲得黃色油狀物化合物F-13-1(250mg，97％)，其不作進(jìn)一步純化而使用?；衔颋-13-2：N-甲基-N-(4-(甲基氨基)苯乙基)-L-纈氨酸芐酯將Boc-保護(hù)的苯胺F-13-1(250mg,0.550mmol,1eq)溶解于MeOH(5mL)中，然后加入1mL市售可得的HCl在iPrOH中的溶液(5-6M)。將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)至干。將所得的黃色油狀物用Et2O研磨，以獲得為黃色固體的化合物F-13-2(202mg，94％)。化合物F-13-3：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸芐酯將酸E-11-3(190mg,0.508mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(1ml)中，然后加入DIEA(118μL,0.677mmol,2eq.)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP-264mg,0.508mmol,1.5eq.)和苯胺F-13-2(120mg,0.339mmol,1eq.)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜，并減壓蒸發(fā)溶劑。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將殘余物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物F-13-3(140mg,45％)。化合物F-13-4：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸在Pd/C10％(30mg)的存在下，將化合物F-13-3(116mg,0.163mmol,1eq.)溶解于MeOH(5ml)中，并在環(huán)境溫度和大氣壓下氫化2小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，以獲得110mg(99％)為米色固體的化合物F-13-4。化合物F-13-5：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽將胺3D(89mg,0.140mmol,1eq.)和酸F-13-4(145mg,0.210mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(4mL)中，并加入PyBOP(109mg,0.210mmol,1.5eq.)和DIEA(73μL,0.420mmol,3eq.)。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并蒸發(fā)溶劑。在EtOAc和水之間分離殘余物，并將有機(jī)相用MgSO4干燥，過濾并減壓蒸發(fā)。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將粗產(chǎn)物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物F-13-5(140mg,73％)。化合物F-13-6：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽將化合物F-13-5(140mg,0.104mmol,1eq.)溶解于水(4mL)、乙腈(4mL)和哌啶(2mL)的混合物中，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將殘余物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物F-13-6(115mg,83％)?；衔颋-13：根據(jù)與化合物E-11相同的方法制備化合物F-13，在DCM(0.5mL)和TFA(100μL,30eq.)中使用Boc-保護(hù)的胺F-13-6(55mg,0.041mmol,1.0eq.)，然后用DMF(1mL)稀釋，用DIEA(320μL,45eq)淬滅，然后與2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(15mg,0.049mmol,1.2eq.)反應(yīng)。在通過制備型HPLC純化并凍干后，獲得為白色固體的化合物F-13(14mg,24％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1314.8067(2％,MH+,C69H108N11O14要求1314.8072),657.9067(100％,(MH2)2+,C69H109N11O14要求657.9072)。化合物F-61N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二異丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺2,2,2-三氟乙酸鹽化合物F-61-1：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸芐酯二鹽酸鹽將化合物11C(1.0g,2.27mmol,1eq.)溶解于8mL市售可得的HCl在iPrOH中的溶液(5-6M)中。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘余物用Et2O(30ml)研磨兩次，并真空干燥，以獲得為白色固體的化合物F-61-1(916mg,98％)。化合物F-61-2：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸芐酯將酸E-11-3(769mg,2.05mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(2.5ml)中，然后加入DIEA(957μL,5.48mmol,4eq.)和PyBOP(1.07g,2.05mmol,1.5eq.)。加入苯胺F-61-1(566mg,1.369mmol,1eq.)，并將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。減壓蒸發(fā)溶劑，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH)，以獲得969mg(102％)為白色固體的化合物F-61-2?；衔颋-61-3：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸在Pd/C10％(270mg)的存在下，將化合物F-61-2(969mg,1.28mmol,1eq.)溶解于MeOH(20ml)中，并在環(huán)境溫度和大氣壓下氫化3小時(shí)。將反應(yīng)介質(zhì)過濾，并減壓濃縮，并將殘余物在硅膠上純化(DCM/MeOH/AcOH)，以獲得520mg(67％)為白色固體的化合物F-61-3?；衔颋-61-4：((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二異丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯2,2,2-三氟乙酸鹽將酸F-61-3(67.5mg,0.111mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(2mL)中，并加入DECP(17μL,0.111mmol,1.5eq.)和DIEA(39μL,0.223mmol,3eq.)。在室溫?cái)嚢?5分鐘后，加入胺1Y(50mg,0.074mmol,1eq.)，并將溶液攪拌過夜。減壓蒸發(fā)溶劑，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將殘余物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物F61-4(28mg,28％)?；衔颋-61-5：(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二異丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)苯基)-5-脲基戊酰胺雙(2,2,2-三氟乙酸鹽)將化合物F-61-4(28mg,0.021mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分鐘之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并將溶液凍干過夜，以獲得為無色油的化合物F-61-5(38mg,134％)?；衔颋-61：將化合物F-61-5(28.3mg,0.020mmol,1eq.)溶解于乙腈(0.5mL)中，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(9mg,0.029μmol,1.4eq.)和DIEA(25μL,0.143mmol,7eq.)。將混合物攪拌4.5小時(shí)，然后HPLC分析顯示存在起始材料，但琥珀酰亞胺被完全消耗。因此，加入補(bǔ)充的2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(3mg,0.01μmol,0.5eq.)，并將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)。HPLC分析顯示起始材料被完全消耗。將溶劑蒸發(fā)至干，并將殘余物用EtOAc/Et2O(80/20)的混合物研磨兩次，以獲得為灰白色固體的化合物F-61(19.4mg,70％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1361.7725(2％,MNa+,C70H106N12NaO12S要求1361.7666),670.3961(100％,(MH2)2+,C70H108N12O12S要求670.3960)?；衔颋-62：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物F-62-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽以類似于化合物F-61-4的方式，在DMF(2mL)中，由胺3D(100mg,0.158mmol,0.9eq.)、酸F-61-3(108mg,0.178mmol,1eq.)、DECP(41μL,0.267mmol,1.5eq.)和DIEA(93μL,0.534mmol,3eq.)制備化合物F-62-1。在通過制備型HPLC純化后，獲得為白色固體的化合物F-62-1(93mg,39％)?；衔颋-62-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯雙(2,2,2-三氟乙酸鹽)將化合物F-62-1(35mg,0.026mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在10分鐘之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并將溶液凍干過夜，以獲得為白色固體的化合物F-62-2(34mg,105％)?；衔颋-62：將胺F-62-2(34mg,5.55μmol,1eq.)溶解于乙腈(3mL)中。加入DIEA(5μL,0.028mmol,5eq.)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2mg,6.65μmol,1.2eq.)。HPLC分析顯示起始材料被完全消耗。將溶劑蒸發(fā)至干，并將殘余物用EtOAc/Et2O(80/20)的混合物研磨。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將粗產(chǎn)物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物F-62(5.5mg,13％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1336.7859(2％,MNa+,C69H107N11NaO14要求1336.7891),657.9073(100％,(MH2)2+,C69H109N11O14要求657.9072)?；衔颋-63：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽化合物F-63-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸將化合物F-62-1(157mg,0.118mmol,1eq.)溶解于水(4.5mL)、乙腈(4.5mL)和哌啶(3.5mL)的混合物中，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶劑減壓蒸發(fā)，并將殘余物用Et2O(60mL)研磨。通過過濾收集固體，并將其用Et2O(10ml)沖洗兩次，以獲得為灰白色固體的化合物F-63-1(153mg,100％)?；衔颋-63-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸雙2,2,2-三氟乙酸鹽將化合物F-63-1(153mg,0.127mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在10分鐘之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并將溶液凍干過夜，以獲得為白色固體的化合物F-63-2(34mg,105％)。化合物F-63：將胺F-63-2(100mg,0.082mmol,1eq.)溶解于乙腈(2mL)和DMF(0.5mL)的混合物中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(45mg,0.147mmol,1.8eq.)和DIEA(71μL,0.409mmol,5eq.)。在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)后，減壓蒸發(fā)溶劑。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將粗產(chǎn)物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，然后以得到為白色固體的化合物F-63(42mg,36％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1300.7901(2％,MH+,C68H106N11O14要求1300.7915),650.8990(100％,(MH2)2+,C68H107N11O14要求650.8994)?；衔颎-12((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物G-12-1：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-纈氨酸芐酯二鹽酸鹽將6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(200mg,0.947mmol,1eq.)溶解于草酰氯(3mL)中。將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)至干。獲得為米色固體的化合物G-12-1(217mg,100％)，并且其不經(jīng)純化而用于下一個(gè)步驟。化合物G-12：在0℃，將苯胺12(40mg,0.045mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(1mL)中，并加入DIEA(8μL,0.045mmol,1eq.)。在攪拌30分鐘后，引入化合物G-12-1(10mg,0.45mmol,1eq.)在干燥DCM(1mL)中的溶液，并將反應(yīng)在0℃攪拌1小時(shí)。將混合物用DCM(25ml)稀釋，并用水(20mL)洗滌兩次，用鹽水(10mL)洗滌一次。將有機(jī)相用Na2SO4干燥，過濾并減壓蒸發(fā)，以獲得為淺棕色固體的粗產(chǎn)物(54mg)。將其通過閃式色譜法在硅膠上純化(DCM/MeOH)，然后通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)純化。將分離的產(chǎn)物凍干，以獲得白色固體(23mg)，將其通過制備型HPLC重新純化，并將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物G-12(9mg,16％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1094.6543(20％,MNa+,C59H89N7NaO11要求1094.6512),1072.6722(16％,MH+,C59H90N7O11要求1072.6693),536.8358(100％,(MH2)2+,C59H91N7O11要求536.8383)?；衔颎-13((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸鹽化合物G-13：在0℃，將苯胺13(15mg,0.015mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(1.5mL)中，并加入DIEA(8μL,0.046mmol,3eq.)。引入化合物G-12-1(3.5mg,0.046mmol,1eq.)在干燥DCM(0.5mL)中的溶液，并將反應(yīng)在0℃攪拌1.5小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑，并通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將粗產(chǎn)物純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物G-13(11.4mg,62％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1058.6510(30％,MH+,C58H88N7O11要求1058.6536),529.8285(100％,(MH2)2+,C58H89N7O11要求529.8305)?；衔颎-15((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)芐基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙?；?-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽化合物G-15：在0℃，將苯胺15(40mg,0.047mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(2mL)中，并加入DIEA(10μL,0.056mmol,1.2eq.)。引入化合物G-12-1(108mg,0.47mmol,10eq.)在干燥DCM(1mL)中的溶液，并將反應(yīng)在0℃攪拌1.5小時(shí)。將混合物用DCM(10ml)稀釋，并用水(5mL)洗滌兩次。將有機(jī)相用MgSO4干燥，過濾并減壓蒸發(fā)，以獲得為米色固體的粗產(chǎn)物。通過制備型HPLC(Waters600E,SunFirePrepC18OBD柱,5μm,19×100mm；流動(dòng)相：0.1％TFA緩沖的水/MeCN；梯度經(jīng)15分鐘5％至100％MeCN；紫外檢測(cè)器Waters2487在220nm處)將其純化。將選擇的級(jí)分合并和凍干，以得到為白色固體的化合物G15(27mg,50％)。m/z(Q-TOFMSESI+)1066.6517(2％,MNa+,C57H85N7NaO11要求1066.6199),522.8224(100％,(MH2)2+,C57H87N7O11要求522.8226)。實(shí)施例17：ADC的合成、純化和表征以下所描述的程序適用于嵌合IgG1形式和人源化IgG1形式。必須理解，對(duì)于任何其他形式，例如IgG2、IgG4等，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用一般知識(shí)以改變?cè)摮绦?。?7℃，用10mM硼酸鹽緩沖液(pH8.4)中的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)將抗體(1-5mg/ml)部分地還原2h，所述硼酸鹽緩沖液含有150mMNaCl和2mMEDTA。典型地，使用2.5-3摩爾當(dāng)量的TCEP，以分別靶向約4的藥物-抗體比例(DAR)。在非還原條件下，通過SDS-PAGE分析確認(rèn)部分抗體還原。在將接頭-藥物偶聯(lián)至釋放的鏈間半胱氨酸殘基之前，允許將還原混合物冷卻至室溫。然后，用10mM硼酸鹽緩沖液(pH8.4)將抗體濃度調(diào)節(jié)至1mg/ml，所述硼酸鹽緩沖液含有150mMNaCl和2mMEDTA，并從10mM二甲基亞砜(DMSO)溶液中加入相比于抗體5摩爾過量的藥物。將最終的DMSO濃度調(diào)節(jié)至10％，以在偶聯(lián)期間維持藥物在水性介質(zhì)中的溶解度。將反應(yīng)在室溫進(jìn)行1h。通過加入1.5摩爾N-乙酰半胱氨酸每摩爾藥物，并在室溫孵育1小時(shí)，以淬滅藥物過量。在4℃對(duì)含有150mMNaCl的25mMHis緩沖液(pH6.5)透析過夜后，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法純化抗體-藥物-綴合物，所述方法基于市售的色譜柱和超濾單元。首先，通過在S200(GELifeSciences)或TSKG3000SW(Tosoh)柱上的尺寸排阻色譜法(SEC)，除去未偶聯(lián)的藥物和ADC聚集體。然后，通過在30或50kDaMWCO過濾單元上的超濾，或通過在蛋白A上的親和層析，將純化的ADC單體濃縮至2-3mg/ml。在0.2μm過濾器上無菌過濾后，將純化的ADC儲(chǔ)存于4℃。在還原條件和非還原條件下，通過SDS-PAGE進(jìn)一步分析它們，以確認(rèn)藥物綴合，并通過在分析型S200或TSKG3000SWXL柱上的SEC進(jìn)一步分析它們，以確定單體和聚集形式的含量。通過使用以IgG作為標(biāo)準(zhǔn)的二喹啉甲酸(BCA)分析，確定蛋白質(zhì)濃度。通過HIC和LC-MS估計(jì)每種純化的ADC的DAR。典型地，聚集形式的含量低于5％，并且DAR為3.5至5。實(shí)施例18：與不同藥物偶聯(lián)的IGF-1R抗體的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)18.1嵌合抗體在MCF-7細(xì)胞中的評(píng)價(jià)已顯示五種IGF-1R抗體被快速內(nèi)化至溶酶體中，并且在酸性環(huán)境中具有較低的結(jié)合能力。在這方面，那些Ab具有用作ADC的所有性質(zhì)。因此，將五種嵌合抗IGF-1R抗體與三種不同的化合物(G-13；E-13和F-63)偶聯(lián)。這些ADC的藥物抗體比例約為4。為了評(píng)價(jià)非特異性細(xì)胞毒性，還將不相關(guān)的嵌合抗體c9G4與那些化合物以相同的DAR偶聯(lián)。在完全培養(yǎng)介質(zhì)中，將MCF-7細(xì)胞與增加濃度的每種ADC在37℃孵育6天。使用熒光細(xì)胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)評(píng)估細(xì)胞活力。使用Mithras讀板器(BertholdTechnologies)讀取熒光信號(hào)。與E-13、G-13或F-63偶聯(lián)的不相關(guān)的嵌合抗體c9G4在MCF-7細(xì)胞中不顯示細(xì)胞毒活性，或顯示溫和的細(xì)胞毒活性(圖21)。相反，在將抗IGF-1R抗體與E-13、G-13或F-63偶聯(lián)后獲得的所有其他的ADC的加入顯著降低MCF-7細(xì)胞活力。18.2嵌合抗體在正常細(xì)胞中的評(píng)價(jià)使用c208F2mAb，在原代正常細(xì)胞(PromoCellGmbH)中評(píng)價(jià)IGF-1R的表達(dá)水平。為了這個(gè)目的，在FACS緩沖液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，將細(xì)胞(0.5x106個(gè)細(xì)胞/ml)與10μg/mlc208F2抗體在4℃孵育20min。然后將它們洗滌3次，并在暗處與偶聯(lián)有Alexa488的合適的二級(jí)抗體在4℃孵育另外20分鐘，然后在FACS緩沖液中洗滌3次。使用碘化丙啶(其將死細(xì)胞染色)鑒定存活的細(xì)胞，立即在所述存活的細(xì)胞中進(jìn)行抗IGF-1R抗體的結(jié)合。相比于在MCF-7細(xì)胞中的IGF-1R表達(dá)(參見實(shí)施例2，表8)，在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平(Bmax)是低的(表14)。表14正常細(xì)胞Bmax人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAoEC)21人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)33人支氣管平滑肌細(xì)胞(HBSMC)26人腎上皮細(xì)胞(HREpC)110人尿路上皮細(xì)胞(HUG)181在正常細(xì)胞中評(píng)價(jià)ADCc208F2-G-13的細(xì)胞毒性。在完全培養(yǎng)介質(zhì)中，將細(xì)胞與增加濃度的c208F2-G-13在37℃孵育6天。使用熒光細(xì)胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)評(píng)估細(xì)胞活力。使用Mithras讀板器(BertholdTechnologies)讀取熒光信號(hào)。在HBSMC、HPMEC、HAoEC和HREpC中，沒有觀察到較大的細(xì)胞毒性(圖25)。在HUC中，僅在高濃度的c208F2-G-13處測(cè)量到較小的細(xì)胞毒性。18.3hz208F2的人源化變體的評(píng)價(jià)將208F2的十六種人源化變體與化合物G-13偶聯(lián)。這些ADC的藥物抗體比例約為4。為了評(píng)價(jià)非特異性細(xì)胞毒性，還將不相關(guān)的嵌合抗體c9G4與那些化合物以相同的DAR偶聯(lián)。還將嵌合抗體c208F2與G-13偶聯(lián)。在完全培養(yǎng)介質(zhì)中，將MCF-7細(xì)胞與增加濃度的每種ADC在37℃孵育6天。使用熒光細(xì)胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)評(píng)估細(xì)胞活力。使用Mithras讀板器(BertholdTechnologies)讀取熒光信號(hào)。與G-13偶聯(lián)的不相關(guān)的嵌合抗體c9G4在MCF-7細(xì)胞中不顯示細(xì)胞毒活性，或顯示溫和的細(xì)胞毒活性(圖26)。相反，在將抗IGF-1R抗體與G-13偶聯(lián)后獲得的所有其他的ADC的加入顯著降低MCF-7細(xì)胞活力。十六種人源化變體誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的能力至少等于甚至優(yōu)于用嵌合形式c208F2-G-13測(cè)量的能力，如表15所示，并且如在圖26中用一種人源化變體所闡明。表15實(shí)施例19：在MCF-7異種移植模型中，與E-13、G-13或F-63化合物綴合的c208F2抗體的體內(nèi)活性。為了確認(rèn)與G-13、E-13或F-63化合物偶聯(lián)的c208F2的體外功效可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化(translate)，已經(jīng)在MCF-7異種移植模型中測(cè)試了它們。根據(jù)2010/63/UE指令(Directive)關(guān)于保護(hù)用于科學(xué)目的的動(dòng)物的指南，進(jìn)行所有動(dòng)物程序。該方案由PierreFabreInstitute的動(dòng)物倫理委員會(huì)(AnimalEthicalCommittee)批準(zhǔn)。將五百萬個(gè)MCF-7細(xì)胞皮下注射至7周齡的Swiss/Nude小鼠中。在細(xì)胞注射之前，將雌激素顆粒(pellet)(InnovativeResearchofAmerica)植入小鼠的左側(cè)腹，以釋放MCF-7腫瘤的體內(nèi)生長所必需的雌激素。在MCF-7細(xì)胞植入后二十天，當(dāng)腫瘤達(dá)到120-150mm3的平均尺寸時(shí)，根據(jù)腫瘤大小和外觀將動(dòng)物分組，每組5只小鼠。通過腹膜內(nèi)注射接種不同的處理。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的健康狀況。每周兩次用電子卡尺測(cè)量腫瘤體積，直至研究結(jié)束。腫瘤體積用下式計(jì)算：π/6×長度×寬度×高度。每周三次稱量動(dòng)物的重量后，評(píng)價(jià)毒性。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，在每次測(cè)量時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有化合物均為腹膜內(nèi)(i.p.)注射。在該實(shí)施例中，在D20和D272次注射7mg/kg劑量后，評(píng)價(jià)約DAR4的與E-13、F-13或F-63偶聯(lián)的c208F2mAb的抗腫瘤活性(圖22A、22B和22C)。平行地，以對(duì)應(yīng)于7mg/kg的DAR約4的c208F2-E-13、c208F2-F-13和c208F2-F-63的劑量的等效劑量，注射加帽的(capped)藥物部分E-13、F-13和F-63。c208-E-13(圖22A)、c208F2-G-13(圖22B)或c208F2-F-63(圖22C)的注射顯著抑制甚至誘導(dǎo)完全的腫瘤生長消退(p<0.05對(duì)比于相應(yīng)的加帽的藥物)。沒有注意到c208-E-13、c208F2-G-13和c208F2-F-63之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)活性差異。加帽的藥物對(duì)MCF-7腫瘤生長沒有作用(p>0.05對(duì)比于對(duì)照組)。如前面所描述，在MCF-7異種移植模型中，使用與E-13或G-13偶聯(lián)的c208F2和與E-13或G-13偶聯(lián)的不相關(guān)的抗體c9G4進(jìn)行第二組實(shí)驗(yàn)。在D20和D27，將小鼠i.p.注射7mg/kg的每種ADC(圖23A和23B)。c9G4-E-13和c9G4-F-13的注射溫和地且短暫地影響MCF-7異種移植腫瘤的生長。然而，該第二實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，c208-E-13或c208F2-G-13的注射誘導(dǎo)完全的腫瘤消退，因?yàn)镈43顯示這些ADC的高的抗腫瘤活性。實(shí)施例20：在3+MCF-7異種移植模型中，與G-13化合物綴合的hz208F2抗體的體內(nèi)活性。在MCF-7異種移植模型中，已經(jīng)體內(nèi)評(píng)價(jià)了與G-13化合物偶聯(lián)的208F2的人源化形式。根據(jù)2010/63/UE指令(Directive)關(guān)于保護(hù)用于科學(xué)目的的動(dòng)物的指南，進(jìn)行所有動(dòng)物程序。該方案由PierreFabreInstitute的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將五百萬個(gè)MCF-7細(xì)胞皮下注射至7周齡的Swiss/Nude小鼠中。在細(xì)胞注射之前，將雌激素顆粒(InnovativeResearchofAmerica)植入小鼠的左側(cè)腹，以釋放MCF-7腫瘤的體內(nèi)生長所必需的雌激素。在MCF-7細(xì)胞植入后二十天，當(dāng)腫瘤達(dá)到120-150mm3的平均尺寸時(shí)，根據(jù)腫瘤大小和外觀將動(dòng)物分組，每組6只小鼠。通過作為4次注射方案的腹膜內(nèi)注射接種不同的處理；每四天一次注射(Q4d4)。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的健康狀況。每周兩次用電子卡尺測(cè)量腫瘤體積，直至研究結(jié)束。腫瘤體積用下式計(jì)算：π/6×長度×寬度×高度。每周三次稱量動(dòng)物的重量后，評(píng)價(jià)毒性。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，在每次測(cè)量時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有化合物均為腹膜內(nèi)(i.p.)注射。在該實(shí)施例中，將偶聯(lián)至G-13化合物的c208F2mAb的抗腫瘤活性，與也偶聯(lián)至G-13的不同的人源化形式作比較(圖27)。在下表16中描述了經(jīng)測(cè)試的人源化形式：表16c208-G-13或208F2人源化形式的注射顯著抑制，甚至誘導(dǎo)完全的腫瘤生長消退(p<0.05對(duì)比于相應(yīng)的對(duì)照)。沒有觀察到c208F2-G-13與經(jīng)測(cè)試的人源化形式之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)活性差異。如前面所描述，在MCF-7異種移植模型中，使用與G-13偶聯(lián)的c208F2或hz208F2-4進(jìn)行第二組實(shí)驗(yàn)(分別地，圖28A和28B)。每四天4次注射(Q4d4)或僅一次，將小鼠i.p.注射3mg/kg的每種ADC。在MCF異種移植模型中，當(dāng)ADC被注射四次或僅一次時(shí)，觀察到相同的強(qiáng)抗腫瘤活性。實(shí)施例21：在2+CaOV-3異種移植模型中，與G-13或E-13化合物綴合的208F2抗體的體內(nèi)活性。還在2+表達(dá)性腫瘤，CaOV-3異種移植模型中研究抗腫瘤活性，所述異種移植模型為卵巢癌細(xì)胞系。對(duì)于該計(jì)劃，在D0，將小鼠皮下注射7×106個(gè)細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到約120mm3(腫瘤細(xì)胞注射后19天)時(shí)，將動(dòng)物分成具有可比較的腫瘤大小的5組，每組5只小鼠，并用與E-13或G-13偶聯(lián)的c208F2和與E-13或G-13偶聯(lián)的不相關(guān)的抗體c9G4腹膜內(nèi)處理。將小鼠i.p.注射3mg/kg的每種ADC持續(xù)6個(gè)注射循環(huán)；每四天一次注射。跟蹤觀察小鼠的異種移植物生長速率。腫瘤體積通過下式計(jì)算：π/6×長度×寬度×高度。相比于溫和地且短暫地誘導(dǎo)生長減緩的c9G4-E-13，c9G4-G-13的注射不影響CaOV-3異種移植腫瘤的生長。同時(shí)，在第50天，c208F2-E-13或c208F2-G-13的注射分別誘導(dǎo)95％和77％的腫瘤生長抑制(圖29A和29B)。序列表<110>皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司<120>IGF-1R抗體-藥物-綴合物和其用于治療癌癥的用途<130>D33593<150>EP14305620.8<151>2014-04-25<160>81<170>PatentInversion3.5<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-H1<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Thr可以被Ser代替<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Tyr可以被Phe代替<400>1GlyTyrThrPheThrSerTyrTyr15<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-H2<400>2IleTrpProGlyAspGlySerThr15<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-H3<400>3AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyr1510<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-L1<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Ser可以被Asn代替<400>4GlnAspIleSerLysTyr15<210>5<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-L2<400>5TyrThrSer1<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有CDR-L3<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Thr可以被Ala代替<400>6GlnGlnGlySerThrLeuProTyrThr15<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-H1<400>7GlyTyrThrPheThrSerTyrTyr15<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-H1<400>8GlyTyrSerPheThrSerTyrPhe15<210>9<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L1<400>9GlnAspIleSerLysTyr15<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L1<400>10GlnAspIleAsnLysTyr15<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L3<400>11GlnGlnGlySerThrLeuProTyrThr15<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L3<400>12GlnGlnGlySerAlaLeuProTyrThr15<210>13<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,重鏈,VH<400>13GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleTyrTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpLeu354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysAspLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>14<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c212A11,重鏈,VH<400>14GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>15<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c214F8,重鏈,VH<400>15GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlySerGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluArgPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>16<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c219D6,重鏈,VH<400>16GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAsp151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerTyr202530PheIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuAsnSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>17<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c213B10,重鏈,VH<400>17GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlySerGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluArgPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>18<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,輕鏈,VL<400>18AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnValGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>19<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c212A11,輕鏈,VL<400>19AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleAsnLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrValLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>20<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c214F8,輕鏈,VL<400>20AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrPheSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleThrAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerAlaLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>21<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c219D6,輕鏈,VL<400>21AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrValLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>22<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c213B10,輕鏈,VL<400>22AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleThrAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerAlaLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>23<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,重鏈,全長<400>23GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleTyrTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpLeu354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysAspLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175LeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro180185190SerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLysSerCysAsp210215220LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly225230235240ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle245250255SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu260265270AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis275280285AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg290295300ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys305310315320GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGlu325330335LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr340345350ThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeu355360365ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp370375380GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal385390395400LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp405410415LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis420425430GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro435440445Gly<210>24<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>c212A11,重鏈,全長<400>24GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175LeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro180185190SerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLysSerCysAsp210215220LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly225230235240ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle245250255SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu260265270AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis275280285AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg290295300ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys305310315320GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGlu325330335LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr340345350ThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeu355360365ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp370375380GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal385390395400LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp405410415LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis420425430GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro435440445Gly<210>25<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>c214F8,重鏈,全長<400>25GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlySerGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerG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