營養(yǎng)不良性疾病的高效全身治療的制作方法

文檔序號：11159354閱讀：982來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>醫(yī)藥醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn);醫(yī)療器械制造及應(yīng)用技術(shù)

發(fā)明背景

杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是最常見的漸進(jìn)性肌肉退行性疾病，影響大約每3500至5000出生男性中的一個。DMD是由位于X染色體上編碼肌營養(yǎng)不良蛋白的基因缺失或突變引起的。肌營養(yǎng)不良蛋白是肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白復(fù)合物的裝配所必需的，并為肌纖維的細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)之間提供機(jī)械和功能性連接。功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的缺乏引起纖維變性、炎癥、壞死和肌肉被疤痕和脂肪組織替代，導(dǎo)致進(jìn)行性肌無力和在生命的第二和第四個十年由于呼吸和心臟衰竭導(dǎo)致的過早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):第17-40頁)。

所謂Becker型肌營養(yǎng)不良(BMD)疾病的一個溫和形式與DMD的區(qū)別在于延遲發(fā)作，后來就是依賴于輪椅上的支持，以及較長的壽命跨度。BMD是由保持閱讀框和該基因的最關(guān)鍵的部分突變造成的，導(dǎo)致截短的但仍有功能的肌營養(yǎng)不良蛋白(Muntoni F等,Lancet Neurol,2003)。

目前沒有可用于DMD(Rodino-Klapac,L.R.等,Curr Neurol Neurosci Rep,2013.13(3):p.332)或BMD的治愈或有效治療方法。常規(guī)療法僅限于支持治療，部分地減輕癥狀和體征，但不直接靶向疾病機(jī)制也不反轉(zhuǎn)表型。

當(dāng)前正在開發(fā)用于DMD的多種治療策略，包括體內(nèi)基因治療、細(xì)胞移植治療、藥物救援DMD無義突變和外顯子跳躍策略以修復(fù)DNA基因閱讀框。所有這些策略都有需要克服的問題，包括靶向不同的肌肉群、遞送的優(yōu)化，轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)和潛在的免疫應(yīng)答(Jamin等,Expert Opin Biol Ther,2014)。

肌營養(yǎng)不良蛋白基因是人類基因組中最大的已知基因，并且由于太大以至于不能容納在已知的基因治療載體系統(tǒng)內(nèi)。因此，就今天而言，實(shí)質(zhì)有2種用病毒載體的DMD基因治療策略：i)反義寡核苷酸的組成性表達(dá)以促進(jìn)外顯子跳躍，這僅適合于某些突變，以及ii)編碼功能性、縮小尺寸的肌營養(yǎng)不良蛋白(“微肌營養(yǎng)不良蛋白”，也稱為”小型營養(yǎng)蛋白”)的cDNA的組成型表達(dá)。

這兩種策略，使用小型反義序列或使用微肌營養(yǎng)不良蛋白的，解決在DMD基因治療中使用AAV載體的主要障礙，即他們的包裝能力。AAV載體可容納約4.7kb，而野生型肌營養(yǎng)不良蛋白的cDNA的大小約為14kb。為了克服這個問題，許多研究已經(jīng)開發(fā)了部分缺失，但高度功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白基因，其可以成功包裝于AAV載體內(nèi)，并顯示出改善，盡管不能完全正?；瘎游锬Ｐ椭械募I養(yǎng)不良表型。

mdx小鼠模型通常用于測試編碼微肌營養(yǎng)不良蛋白新構(gòu)建體。然而，這種模型也有缺點(diǎn)，因?yàn)閙dx小鼠顯示所述疾病的一個較不嚴(yán)重的形式，沒有免疫反應(yīng)。其它動物模型是GRMD狗，這被認(rèn)為更可靠的預(yù)測基因治療產(chǎn)物在人體中的治療潛力(Kornegay等.,Mamm Genome,2012)。

在所有提出的微肌營養(yǎng)不良蛋白的序列中，F(xiàn)oster H.等(Mol Ther,2008.16(11):p.1825-32)在小鼠中，在重組AAV載體(rAAV2/8)中，在肌肉特異性啟動子(Spc5-12)的控制下，比較了微小肌營養(yǎng)不良蛋白(microdystrophin)基因的兩種不同配置ΔAB/R3-R18/ΔCT和ΔR4-R23/ΔCT。據(jù)報道，微小肌營養(yǎng)不良蛋白(microdystrophin)的密碼子人類優(yōu)化改善了在mdx小鼠模型中的基因轉(zhuǎn)移和肌肉功能。靜脈注射3.10¹¹vg總rAAV/8允許高效心臟基因轉(zhuǎn)移和在骨骼肌和隔膜內(nèi)顯著地肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)。

關(guān)于CXMDj狗，Ohshima S.等(Mol Ther,2009.17(1):第73-80頁)報道了通過肢體灌注，即在壓力下靜脈內(nèi)注射，將在CMV啟動子控制下的編碼M3微小肌營養(yǎng)不良蛋白(microdystrophin)的rAAV8施用到狗。

Zhang Y.等(Hum Mol Genet,2013.22(18):第3720-29頁)研究了在DMD小鼠中的全身(5.10¹²vg總)雙重AAV9基因治療。通過同源重組，通過尾靜脈注入的雙重AAV載體重構(gòu)含有肌營養(yǎng)不良蛋白重復(fù)R16和R17的nNOS結(jié)合微小肌營養(yǎng)不良蛋白。

同樣地，Odom G.等(Mol Ther,2011.19(1):第36-45頁)論證了在小鼠中，重構(gòu)編碼ΔH2-R19微小肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)盒，隨后血管內(nèi)共遞送兩種共享一個中央同源重組的區(qū)域的rAAV6載體(2.10¹²vg總)。

Wang B.等(J Orthop Res.2009；27(4):第421-6頁)在新生小鼠(dKO和mdx)中腹膜內(nèi)(i.p.)注射3.10¹¹vg總rAAV1載體。這些AAV載體編碼微小肌營養(yǎng)不良蛋白(microdystrophin)Δ3990，其置于MCK或CMV啟動子控制之下。

Koppanati等(Gene therapy.2010；17(11):第1355-62頁)報道了在mdx小鼠子宮內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，通過腹膜內(nèi)注射(i.p.)6.4.10¹¹vg總rAAV8載體，其編碼置于CMV啟動子控制之下的犬微小肌營養(yǎng)不良蛋白。

Schinkel等(Human Gene therapy.2012；23(6):第566-75頁)報道了在mdx小鼠中心臟基因治療，通過靜脈內(nèi)(IV)注射10¹²vg總rAAV9載體，其編碼置于CMV啟動子或心臟特異性MLC0.26啟動子控制下的微小肌營養(yǎng)不良蛋白。

Gregorevic等(Mol.Therapy 2008；16(4):第657-64頁)報道了在mdx小鼠中肌肉基因治療，通過靜脈內(nèi)(IV)注射10¹³vg總rAAV6載體，其編碼置于CMV啟動子控制下的ΔR4-R23/ΔCT微小肌營養(yǎng)不良蛋白。

Shin等(Gene Therapy 2011；18(9):第910-19頁)報道了在mdx小鼠中心臟基因治療，通過靜脈內(nèi)(IV)注射3.10¹²vg總rAAV9載體，其編碼置于CMV啟動子控制下的hΔCS2微小肌營養(yǎng)不良蛋白。

Shin等(J.of Gene Medicine 2008；10(4):第449頁)在小鼠中比較了通過皮下注射或靜脈內(nèi)注射對于編碼置于CMV啟動子控制下的ΔCS2微小肌營養(yǎng)不良蛋白rAAV8的遞送效率。

Colgan等(Mol.Therapy 2014；22(S1):第S197頁)報道了在dKO小鼠中，微小肌營養(yǎng)不良蛋白和卵泡抑素(follistatin)通過靜脈注射rAAV6載體的組合基因遞送。

在DMD的情況下，有價值的治療的解決方案是具有以下特征的基因治療產(chǎn)品：

-可以合理的劑量(即，在靶組織中適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移)并可能通過獨(dú)特的注射全身施用的產(chǎn)品；

-在所述劑量下具有可接受的毒性，并且特別是不會誘導(dǎo)針對肌營養(yǎng)不良蛋白的不良免疫應(yīng)答的產(chǎn)品；

-具有滿意的向性，即在骨骼肌、而且還包括隔膜和心肌的大區(qū)域內(nèi)具有廣泛的基因轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品；

-能夠改善人類的營養(yǎng)不良疾病的產(chǎn)品。

在實(shí)踐中，以前的報道表明，這是一個非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，并且和若干嘗試已經(jīng)失?。?/p>

使用CMV啟動子下編碼人類特異性，但不是密碼子優(yōu)化的微小肌營養(yǎng)不良蛋白(AR4-R23/ACT)的AAV2/6載體的研究導(dǎo)致注射的CXMDj狗肌肉纖維的有限表達(dá)，并且在停止免疫抑制后6周，初始肌內(nèi)注射后22周通過免疫系統(tǒng)被最終破壞(Wang,Z.等,Mol Ther,2007.15:第1160-66頁)。

基于CMV啟動子下編碼人類特異性，但不是密碼子優(yōu)化的微小肌營養(yǎng)不良蛋白(ΔR3-R21/ΔCT)的肌肉內(nèi)注射臨床試驗(yàn)導(dǎo)致非常有限的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答(Mendell,JR等,N Engl J Med,2010.363(15):第1429-37頁；Bowles,DE.等,Mol Ther,2012.20(2):第443-55頁)。

因此，在生存期、總體臨床評分、消化系統(tǒng)、心臟和/或呼吸功能方面，本領(lǐng)域需要人類營養(yǎng)不良疾病的有效治療方法。

發(fā)明簡述

本發(fā)明的目的在于通過表達(dá)較短但功能性的稱為微小肌營養(yǎng)不良蛋白的肌營養(yǎng)不良蛋白多肽來減輕或治愈破壞性杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)。

本發(fā)明首次提供一種有前途的基因治療產(chǎn)品，在AAV8衣殼中殼體化的序列優(yōu)化的微小肌營養(yǎng)不良蛋白，用于治療營養(yǎng)不良性疾病。單次劑量的全身性靜脈內(nèi)給藥后，不僅是在多個肌肉中高度表達(dá)微小肌營養(yǎng)不良蛋白，而且導(dǎo)致肌肉病理的改善和改善的臨床結(jié)果測量。

事實(shí)上，在狗的模型獲得這么好的效果，在以下方面：肌肉、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心臟搶救、在良好的條件下與延長的壽命相關(guān)，關(guān)于這種病理目前從未報道。

定義

冠詞“一”和“一個”在本文中用于指一個或多于一個(即，至少一個)所述冠詞的語法對象。通過舉例的方式，“一個元件”意指一個元件或多于一個元件。

“關(guān)于”或“近似”在本文中用于涉及可測量值，例如數(shù)量、時間期限等時，是指包括從指定的值變化±20％或±10％，更優(yōu)選的±5％，甚至更優(yōu)選的±1％，并且還更優(yōu)選的±0.1％，因?yàn)檫@些變化適于執(zhí)行所公開的方法。

范圍：貫穿本發(fā)明，本發(fā)明的各個方面可以以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解的是，范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，不應(yīng)該被解釋為對本發(fā)明的范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為具有該范圍內(nèi)具體公開的所有可能的子范圍以及單獨(dú)的數(shù)值。例如，范圍的描述，例如從1到6應(yīng)被認(rèn)為具有具體公開的子范圍如從1到3，從1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等，以及在該范圍內(nèi)的單獨(dú)的數(shù)值，例如，1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。這適用而不考慮范圍的寬度。

“分離的”是指改變或從自然狀態(tài)中移除。例如，核酸或肽天然存在于活的動物內(nèi)不是“分離的”，但同樣的核酸或肽部分或完全分離自其天然狀態(tài)的共存材料是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或者可以在非天然環(huán)境，例如宿主細(xì)胞中存在。

在本發(fā)明的上下文中，使用通常存在的核酸堿基的下述縮寫?！癆”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鳥苷，“T”是指胸苷，和“U”是指尿苷。

除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為簡并形式并編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白或RNA或cDNA的短語核苷酸序列也可包括內(nèi)含子，其包括程度為編碼所述蛋白的核苷酸序列可以在一些版本含有一個(多個)內(nèi)含子。

“編碼”指的是在多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA的核苷酸的特定序列的固有的屬性，以作為在生物過程中合成具有限定的核苷酸序列(即rRNA,tRNA和mRNA)或者限定的氨基酸序列、并由此產(chǎn)生的生物學(xué)特性的其它聚合物或大分子的模板。因此，基因編碼蛋白質(zhì)，如果對應(yīng)于該基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞內(nèi)或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白的話。編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同且通常在序列表中提供)，和用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈都可稱為編碼該蛋白或基因或cDNA的其它產(chǎn)品。

如本文所用的術(shù)語“多核苷酸”被定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，核酸和本文所用的多核苷酸是可互換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是多核苷酸，其可水解成單體“核苷酸”的一般知識。單體核苷酸可以水解成核苷。本文所用的多核苷酸包括，但不限于，通過本領(lǐng)域任何可用的手段獲得的所有核酸序列，包括，但不限于，重組方法，即，使用普通的克隆技術(shù)和PCR等，以及通過合成方法，從重組文庫或細(xì)胞基因組中克隆核酸序列。

如本文所用，術(shù)語“肽”，“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指由通過肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須包含至少兩個氨基酸，并且對于可以組成蛋白質(zhì)或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)量沒有限制。多肽包括包含兩個或多個氨基酸通過肽鍵彼此連接的任何肽或蛋白。如本文所用，該術(shù)語指短鏈，這在本領(lǐng)域也通常指肽，例如寡肽和寡聚體，和長鏈，其通常在本領(lǐng)域中是指為蛋白質(zhì)，其中有許多類型?！岸嚯摹卑ǎ?，生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，二聚體，異二聚體，多肽的變體，修飾的多肽，衍生物，類似物，融合蛋白，等等。所述多肽包括天然的肽，重組肽，合成肽，或其組合。

“相同”是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列相同性。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的位置由相同堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)，例如在每兩個DNA分子的一個位置由腺嘌呤占據(jù)，則分子在該位置同源或相同。兩個序列之間的同源性/相同性的百分比是兩個序列共享匹配位置的數(shù)目除以位置數(shù)相比×100的函數(shù)。例如，如果兩個序列中10個位置中的6個匹配，則兩個序列60％相同。通常，當(dāng)兩個序列進(jìn)行比對時進(jìn)行對比以得到最大同源性/相同性。

“載體”是物質(zhì)的組合物，其包含分離的核酸和可用于將所述分離的核酸遞送到細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)。許多載體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，線性多核苷酸，與離子的或兩親性化合物相關(guān)的多核苷酸，質(zhì)粒，和病毒。因此，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。該術(shù)語也應(yīng)被理解為包括促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的非質(zhì)粒和非病毒化合物，如，例如，聚賴氨酸化合物，脂質(zhì)體，和類似物。病毒載體的實(shí)例包括，但不限于，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，和類似物。

“表達(dá)載體”指包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接于待表達(dá)核苷酸序列的控制序列。表達(dá)載體包含足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其它元件可由宿主細(xì)胞或在體外表達(dá)系統(tǒng)中提供。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域中已知的那些，如粘粒，質(zhì)粒(例如，裸的或包含在脂質(zhì)體中的)和病毒(例如，慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，和腺相關(guān)病毒)，其納入所述重組多核苷酸。

如本文所用，術(shù)語“啟動子”定義為細(xì)胞的合成機(jī)制或引進(jìn)的合成機(jī)制識別，啟動多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄所需要的DNA序列。

如本文所用，術(shù)語“啟動子/調(diào)控序列”是指一核酸序列，這是可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列的基因產(chǎn)物的表達(dá)所需要的。在一些情況下，該序列可以是核心啟動子序列和在其他情況下，該序列還可包括增強(qiáng)子序列和其他調(diào)控元件，它們所述基因產(chǎn)物的表達(dá)必需的。所述啟動子/調(diào)控序列可以是，例如，是這樣一種，其以組織特異性方式表達(dá)所述基因產(chǎn)物。

“組成型”啟動子是一核苷酸序列，當(dāng)它可操作地連接于編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸時，導(dǎo)致所述基因產(chǎn)物在細(xì)胞的大多數(shù)或所有生理?xiàng)l件下在細(xì)胞中產(chǎn)生。

“誘導(dǎo)型”啟動子是一核苷酸序列，當(dāng)它可操作地連接于編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸時，導(dǎo)致所述基因產(chǎn)物基本上只在所述細(xì)胞中存在對應(yīng)于所述啟動子的誘導(dǎo)物時在細(xì)胞中產(chǎn)生。

“組織特異性”啟動子是一核苷酸序列，當(dāng)它可操作地連接于編碼或指定基因的多核苷酸時，導(dǎo)致所述基因產(chǎn)物優(yōu)先在如果所述細(xì)胞是對應(yīng)于所述啟動子的組織類型的細(xì)胞時在細(xì)胞中產(chǎn)生。

術(shù)語“不正常”，當(dāng)在生物體，組織，細(xì)胞或其組分的上下文中使用時，是指那些生物體，組織，細(xì)胞或其組分，其在至少一種可觀察或可檢測的特征方面(例如，年齡，治療，時間等)不同于那些顯示“正?！?預(yù)期)相應(yīng)特性的生物體，組織，細(xì)胞或其組分。對于一種細(xì)胞或組織類型，正常或預(yù)期的特征對于不同的細(xì)胞或組織類型可能是異常的。

術(shù)語“患者”，“受試者”，“個體”等在本文中可互換使用，并且指可適用于本文所述方法的任何動物或其細(xì)胞，無論是體外還是原位。在某些非限制性實(shí)施方案中，患者，受試者或個體是人。

“疾病”是動物的健康狀態(tài)，其中動物不能維持體內(nèi)平衡，并且其中如果所述疾病沒有改善，則動物的健康繼續(xù)惡化。相比之下，動物中的“病癥”是健康狀態(tài)，其中所述動物能夠維持體內(nèi)平衡，但是其中動物的健康狀況比不存在所述病癥時更差。未經(jīng)治療，病癥不一定引起動物健康狀態(tài)的進(jìn)一步降低。

如果疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重程度，患者經(jīng)歷的這種癥狀的頻率，或兩者都減輕，則疾病或病癥被“減輕”或“改善”。這還包括阻止所述疾病或病癥的進(jìn)展。如果疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重程度，患者經(jīng)歷這種癥狀的頻率，或兩者都消除，則疾病或病癥被“治愈”。

“治療性”治療是對表現(xiàn)出病理學(xué)體征的受試者施用的治療，目的是減少或消除這些體征。

如本文所用，“治療疾病或病癥”是指降低受試者經(jīng)歷的疾病或病癥的至少一種體征或癥狀的頻率或嚴(yán)重程度。疾病和病癥在本文中在治療的上下文中可互換使用。

化合物的“有效量”是足以對施用該化合物的受試者提供有益效果的化合物的量。本文所用的短語“治療有效量”是指足以或有效預(yù)防或治療(延遲或防止發(fā)作，阻止其進(jìn)展，抑制，減少或逆轉(zhuǎn))疾病或病癥的量，包括減輕這些疾病的癥狀。遞送載體的“有效量”是足以有效結(jié)合或遞送化合物的量。

具體實(shí)施方式/發(fā)明詳述

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含用于治療受試者的營養(yǎng)不良性疾病的基因治療產(chǎn)品的組合物，其中：

-所述基因治療產(chǎn)物包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列；

-所述組合物全身施用。

換言之，本發(fā)明提供了用于治療受試者的營養(yǎng)不良性疾病的方法，包括向受試者全身施用包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列的組合物。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療受試者的營養(yǎng)不良性疾病的方法，包括向受試者全身施用包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列的基因治療產(chǎn)品。本發(fā)明涉及包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列的基因治療產(chǎn)品用于制備為治療營養(yǎng)不良性疾病的藥物的用途，其中所述藥物是全身性施用的。

根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及用于治療受試者的營養(yǎng)不良性疾病的基因治療產(chǎn)品。

通常，基因治療產(chǎn)品由2種組分制成：

-殼體化的重組核酸序列，其限定一旦在靶細(xì)胞/組織中表達(dá)就提供治療益處的表達(dá)盒；和

-病毒衣殼，其允許適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移和一定程度的組織嗜性。

根據(jù)一個方面，所述基因治療產(chǎn)品包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列。

在本發(fā)明的框架中，微肌營養(yǎng)不良蛋白是指比天然或野生型肌營養(yǎng)不良蛋白更短的肽或蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“微肌營養(yǎng)不良蛋白”和“小型肌營養(yǎng)不良蛋白”具有相同的含義。在本申請的其余部分中，將使用術(shù)語“微肌營養(yǎng)不良蛋白”，以及縮寫“MD”或“μDys”。

“功能性”微肌營養(yǎng)不良蛋白是指相應(yīng)的肽或蛋白質(zhì)能夠執(zhí)行野生型肌營養(yǎng)不良蛋白的至少一些功能，并且能夠至少部分減輕與缺少天然肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)的一種或多種癥狀，特別是纖維變性，炎癥，壞死，肌肉被瘢痕和脂肪組織替代，肌肉無力，消化系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)和心臟衰竭，以及過早死亡。

肌營養(yǎng)不良蛋白的結(jié)構(gòu)已被充分證明(參見圖1)，并且已經(jīng)公開了其活性片段(Athanasopoulos等,Gene Ther 2004 Suppl 1:S109-21)。如本領(lǐng)域所理解的，活性片段是全長序列的一部分或多個部分，其保留全長序列的生物學(xué)功能。

全長肌營養(yǎng)不良蛋白的特征在于不同的結(jié)構(gòu)域：

-結(jié)合肌動蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域；

-4個鉸鏈結(jié)構(gòu)域(H1至H4)；

-24個血小板樣重復(fù)或棒結(jié)構(gòu)域(1至24)；

-富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；

-C末端結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)一個實(shí)施方案，微肌營養(yǎng)不良蛋白具有至少一個缺失的結(jié)構(gòu)域，有利地至少一個血小板樣重復(fù)序列。

根據(jù)一個具體實(shí)施方案，微肌營養(yǎng)不良蛋白具有ΔR4-R23/ΔCT的構(gòu)型，其包含4個血小板樣重復(fù)序列，即如圖1所示的血小板樣重復(fù)序列1,2,3和24。更精確地，這一序列包含肌營養(yǎng)不良蛋白的棒結(jié)構(gòu)域4-23和CT結(jié)構(gòu)域的外顯子71-78的缺失，并且包含肌營養(yǎng)不良蛋白的外顯子79的最后三個氨基酸，其后是三個終止密碼子。

這種稱為ΔR4-R23/ΔCT或MD1的微肌營養(yǎng)不良蛋白具有例如SEQ ID NO：3,4或7所示的氨基酸序列。

在一個實(shí)施方案中，編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列(也稱為“開放閱讀框”，ORF)是cDNA。然而，可以使用例如單鏈或雙鏈DNA或RNA。

在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含比野生型肌營養(yǎng)不良蛋白cDNA短的核酸序列的組合物。

當(dāng)用于可容納約4.7kb的AAV載體的情況下，編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列以及其正確表達(dá)所需的所有序列不應(yīng)超過該包裝能力。在一個實(shí)施方案中，編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列不超過4500、4000bp，優(yōu)選3900、3800、3700、3600或甚至3500bp。

編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列有利地是人來源的，但也可以是非人靈長類動物，犬，大鼠或鼠序列。在一個實(shí)施方案中，所述核酸序列源自其將被施用的生物體(例如人類中的人序列)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，編碼所述微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列被優(yōu)化用于給定受試者，有利地用于人。優(yōu)選地，該優(yōu)化的序列如下修改：

-修改序列以在mRNA內(nèi)AUG起始密碼子之前包括共有Kozak序列，以改善翻譯的起始。

-基于人中轉(zhuǎn)移RNA頻率的優(yōu)化序列，并且增加GC含量以促進(jìn)RNA穩(wěn)定性。因此并且在特定情況下，人類的密碼子優(yōu)化有利地導(dǎo)致63％的密碼子被修改，并且GC含量增加到超過60％。這當(dāng)然取決于原始(優(yōu)化前)微肌營養(yǎng)不良蛋白序列和靶向宿主。

根據(jù)一個實(shí)施方案，所述編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列對應(yīng)于：

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸586至4185，如SEQ ID NO：5所示；或

-序列SEQ ID NO：2的核苷酸586至4188，如SEQ ID NO：6所示。

根據(jù)一個實(shí)施方案，所述序列可以是編碼微肌營養(yǎng)不良蛋白的分離的核酸，所述微肌營養(yǎng)不良蛋白與本文公開的肽，尤其是序列SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或甚至SEQ ID NO：7，具有基本同源性或相同性(60％，70％，80％，90％，95％或甚至99％)。

優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的肽的分離的核酸的核苷酸序列與編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白，特別是序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或甚至SEQ ID NO：8的分離的核酸的核苷酸序列“基本同源/相同”，即約60％同源，更優(yōu)選地約70％同源，甚至更優(yōu)選地約80％同源，更優(yōu)選地約90％同源，甚至更優(yōu)選地約95％同源，以及甚至更優(yōu)選地約97％，98％或甚至99％同源。

根據(jù)另一方面，由本發(fā)明的表達(dá)載體攜帶的核苷酸序列與序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2是“基本上同源的/相同的”，即約60％同源，更優(yōu)選地約70％同源，甚至更優(yōu)選地約80％同源，甚至更優(yōu)選地約90％同源，甚至更優(yōu)選地約95％同源，以及甚至更優(yōu)選地約97％，98％或甚至99％同源。

在另一個實(shí)施方案中，所述組合物包含質(zhì)?；蜉d體。根據(jù)一個具體實(shí)施方案，將分離的核酸插入載體中。簡言之，天然或合成核酸的表達(dá)通常通過將核酸或其部分可操作地連接至啟動子，并將該構(gòu)建物并入表達(dá)載體中來實(shí)現(xiàn)。待使用的載體適合于復(fù)制和，任選地，整合入真核細(xì)胞中。典型的載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子，起始序列和用于調(diào)控所需核酸序列表達(dá)的啟動子。

在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含表達(dá)載體，有利地是病毒載體。特別感興趣的是包裝能力不允許負(fù)載(野生型)肌營養(yǎng)不良蛋白基因，包括(野生型)肌營養(yǎng)不良蛋白cDNA的表達(dá)載體。

在一個實(shí)施方案中，所述病毒載體選自下組：桿狀病毒載體，皰疹病毒載體，慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，含有表達(dá)構(gòu)建物的病毒載體是腺相關(guān)病毒(AAV)載體。

腺相關(guān)病毒(AAV)載體已經(jīng)成為用于治療各種病癥的強(qiáng)有力的基因遞送工具。AAV載體具有使它們理想地適合于基因治療的許多特征，包括缺乏致病性，中等免疫原性和以穩(wěn)定和有效的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后細(xì)胞和組織的能力。通過選擇AAV血清型，啟動子和遞送方法的適當(dāng)組合，可以將包含在AAV載體內(nèi)的特定基因的表達(dá)特異性靶向一種或多種類型的細(xì)胞。

在一個實(shí)施方案中，編碼序列包含在AAV載體內(nèi)。已知超過100種天然存在的AAV血清型。AAV衣殼中存在許多天然變體，允許鑒定和使用具有特別適合營養(yǎng)不良病理的性質(zhì)的AAV。AAV病毒可以使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)工程改造，使得可以優(yōu)化這些顆粒以用于核酸序列的細(xì)胞特異性遞送，最大程度降低免疫原性，調(diào)節(jié)穩(wěn)定性和顆粒壽命，有效降解，精確遞送至細(xì)胞核。

如上所述，AAV載體的使用是DNA的外源遞送的共同模式，因?yàn)槠湎鄬o毒，提供有效的基因轉(zhuǎn)移，并且可以容易地為特定目的優(yōu)化。在從人或非人靈長類動物(NHP)分離并且充分表征的AAV的血清型中，人血清型2是作為基因轉(zhuǎn)移載體開發(fā)的第一個AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11和AAV12。此外，非天然工程改造的變體和嵌合AAV也可以是有用的。

用于裝配到載體中的理想的AAV片段包括帽蛋白，包括vp1，vp2，vp3和高可變區(qū)，rep蛋白，包括rep78，rep68，rep52和rep40，以及編碼這些蛋白的序列。這些片段可以容易地用于多種載體系統(tǒng)和宿主細(xì)胞中。

這樣的片段可以單獨(dú)使用，與其他AAV血清型序列或片段組合使用，或與來自其他AAV或非AAV病毒序列的元件組合使用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣殼蛋白的AAV。這樣的人工衣殼可以通過任何合適的技術(shù)，使用選擇的AAV序列(例如，vp1衣殼蛋白的片段)與可以從不同的選擇的AAV血清型、同一AAV血清型的非連續(xù)部分、非AAV病毒來源或非病毒來源獲得的異源序列組合產(chǎn)生。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣殼，重組AAV衣殼或“人源化”AAV衣殼。因此，示例性AAV或人工AAV包括AAV2/8(US 7,282,199)，AAV2/5(可從國立衛(wèi)生研究院獲得)，AAV2/9(WO2005/033321)，AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8WO2003/042397)。在一個實(shí)施方案中，用于本文所述的組合物和方法的載體至少含有編碼所選AAV血清型衣殼，例如AAV8衣殼或其片段的序列。在另一個實(shí)施方案中，有用的載體至少含有編碼所選AAV血清型rep蛋白(例如AAV8rep蛋白)或其片段的序列。任選地，這樣的載體可以含有AAV cap和rep蛋白。在其中提供AAV rep和cap兩者的載體中，AAV rep和AAV帽序列都可以是一種血清型來源，例如都是AAV8來源?；蛘撸梢允褂玫妮d體中rep序列來自的AAV血清型不同于提供cap序列的血清型。在一個實(shí)施方案中，rep和cap序列從不同的來源(例如，分開的載體，或宿主細(xì)胞和載體)表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，這些rep序列在框架中與不同AAV血清型的cap序列融合以形成嵌合AAV載體，如AAV2/8(US 7,282,199)。

根據(jù)一個實(shí)施方案，組合物包含血清型2,5,8或9的AAV。有利地，要求保護(hù)的載體是AAV8或AAV9載體，特別是AAV2/8或AAV2/9載體。更有利地，要求保護(hù)的載體是AAV8載體或AAV2/8載體。

在用于本發(fā)明的AAV載體中，AAV基因組可以是單鏈(ss)核酸或雙鏈(ds)/自身互補(bǔ)(sc)核酸分子。

有利地，將編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列插入AAV載體的ITR(《反向末端重復(fù)》)序列之間。典型的ITR序列對應(yīng)于：

-序列SEQ ID NO：1或序列SEQ ID NO：2的核苷酸1至128(5'ITR序列)；

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸4511至4640或序列SEQ ID NO：2的核苷酸4514至4643(3'ITR序列)。

重組病毒顆粒可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得，例如通過共轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞，通過單純皰疹病毒系統(tǒng)和通過桿狀病毒系統(tǒng)。載體滴度通常表示為每mL病毒基因組(vg/mL)。

在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含調(diào)控序列，特別是啟動子序列。這樣的啟動子可以是天然或合成的(人工)啟動子，誘導(dǎo)型或組成型。

在一個實(shí)施方案中，啟動子是普遍存在的啟動子或具有低組織特異性。作為實(shí)例，表達(dá)載體可以攜帶磷酸甘油酸激酶1(PGK)，EF1，β-肌動蛋白，CMV啟動子。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇啟動子序列以便在表達(dá)水平方面，但也在組織特異性方面充分控制位于其控制下的核酸序列的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含肌肉特異性啟動子。這樣的啟動子允許在骨骼肌，并且可能在心肌以及在隔膜中的強(qiáng)力表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適啟動子的示例是例如，結(jié)蛋白啟動子，肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子，CK6啟動子和Syn啟動子。另一個啟動子是如序列SEQ ID NO：1或2(核苷酸215至537)所示的合成啟動子C5-12(spC5-12)，其允許在骨骼和心肌中的強(qiáng)力表達(dá)。

其他可能的調(diào)控序列的非窮盡列表是：

-聚腺苷酸化信號，例如，感興趣的基因的多聚A，SV40或β血紅蛋白(HBB2)的多聚A，有利地位于編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的序列的3'端；SV40的多聚A在序列SEQ ID NO：1(核苷酸4223至4353)和SEQ ID NO：2(核苷酸4226至4356)中公開；

-用于轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定化的序列，例如血紅蛋白(HBB2)的內(nèi)含子1；

-增強(qiáng)子序列；

-miRNA靶序列，其可以抑制編碼功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的序列在非靶組織中的表達(dá)，其中所述表達(dá)是不需要的，例如其可以是毒性的。優(yōu)選地，相應(yīng)的miRNA不存在于骨骼肌中，并且可能不存在于隔膜中或心臟中。

根據(jù)一個實(shí)施方案，所述基因治療產(chǎn)品包含表達(dá)載體，有利地為攜帶序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，有利地為SEQ ID NO：1的AAV載體。如上所述，本發(fā)明還涵蓋與序列SEQ ID NO：1或2“基本上同源”的序列，即顯示約60％的同源性，更優(yōu)選地約70％同源性，甚至更優(yōu)選地約80％同源性，更優(yōu)選地約90％同源性，甚至更優(yōu)選地約95％同源性，以及甚至更優(yōu)選地約97％、98％或甚至99％的同源性。

根據(jù)本發(fā)明，組合物至少包含所述基因治療產(chǎn)品和可能的其它活性分子(其它基因治療產(chǎn)品，化學(xué)分子，肽，蛋白質(zhì)等)，專用于治療相同疾病或另一種疾病。

根據(jù)具體實(shí)施方案，所述組合物不包含任何免疫抑制劑。

本發(fā)明然后提供包含本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的載體的藥物組合物。此類組合物包含治療有效量的治療劑(本發(fā)明的核酸或載體)和藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國或歐洲藥典或其他公認(rèn)的藥典中列出的用于動物和人的。

術(shù)語“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或媒介。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油，動物，植物或合成來源的那些，例如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

如果需要，組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液，懸浮液，乳液，緩釋制劑等形式。合適的藥物載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的“《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences)”。這樣的組合物將含有治療有效量的治療劑，優(yōu)選以純化形式，與合適量的載體一起，以提供用于向受試者適當(dāng)施用的形式。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)程序?qū)⒔M合物配制為適合于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，以在注射部位緩解疼痛。

在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物適合于在人中施用。組合物優(yōu)選為液體形式，有利地為鹽水組合物，更有利地為磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)組合物或林格氏乳酸鹽溶液。

可有效治療營養(yǎng)不良性疾病的本發(fā)明治療劑(即核酸或載體)的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。此外，可以任選地使用體內(nèi)和/或體外測定來幫助預(yù)測最佳劑量范圍。在制劑中使用的精確劑量還將取決于施用途徑、重量和疾病的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個患者的情況來決定。

合適的施用應(yīng)該允許將治療有效量的基因治療產(chǎn)品遞送到靶組織，特別是骨骼肌和可能的平滑肌(例如食管)，隔膜和心臟。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)基因治療產(chǎn)品是包含編碼功能性微肌營養(yǎng)不良蛋白的核酸序列的病毒載體時，治療劑量定義為施用于受試者每千克(kg)體重的含有微營養(yǎng)不良蛋白序列的病毒顆粒的量(病毒基因組的vg)。

可用的給藥途徑是局部(局部)，腸內(nèi)(全系統(tǒng)效應(yīng)，但通過胃腸道(GI)道遞送)或胃腸外(全身作用，但通過GI道以外的途徑遞送)。本文公開的組合物的優(yōu)選給藥途徑是胃腸外給藥，其包括肌內(nèi)給藥(即進(jìn)入肌肉)和全身給藥(即進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng))。在本文中，術(shù)語“注射”(或“灌注”或“輸注”)包括血管內(nèi)的，特別是靜脈內(nèi)(IV)和肌內(nèi)(IM)給藥。注射通常使用注射器或?qū)Ч苓M(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，組合物的全身遞送包括在局部治療部位附近，即在弱化肌肉附近的靜脈或動脈中施用組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括組合物的局部遞送，其產(chǎn)生全身效應(yīng)。這種給藥途徑，通常稱為“局部(局部)輸注”，“通過孤立肢體灌注給藥”或“高壓經(jīng)靜脈肢體灌注”已經(jīng)成功地用作肌營養(yǎng)不良癥中的基因遞送方法(Zheng Fan等.(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

根據(jù)一個方面，通過輸注或灌注將組合物施用于分離的肢體(局部-區(qū)域)。換言之，本發(fā)明包括在腿和/或手臂中通過血管內(nèi)施用途徑，即靜脈(經(jīng)血管)或動脈在壓力下局部遞送組合物。這通常通過使用止血帶暫時阻止血液循環(huán)，同時允許灌注產(chǎn)品的區(qū)域擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)，例如，公開于Toromanoff等(2008,Molecular Therapy 16(7):1291-99),Arruda等(2010,Blood 115(23):4678-88)和Fan等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

在一個實(shí)施方案中，將組合物注射到受試者的肢體中。在一個實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，優(yōu)選人，狗或非人靈長類動物。當(dāng)受試者是人時，所述肢體可以是手臂或腿。根據(jù)一個實(shí)施方案，組合物在受試者身體的下部施用，例如，在膝蓋下方，或在受試者的身體的上部，例如在肘下方。

在一個實(shí)施方案中，將組合物施用于外周靜脈，例如，頭靜脈。待輸注的組合物的體積可以在肢體體積的約5％至40％之間變化的范圍內(nèi)。典型的劑量可以在5和30ml/kg體重之間變化。在一個實(shí)施方案中，待施加的壓力(止血帶壓力或最大管線壓力)低于100 000Pa，有利地低于50 000Pa。在優(yōu)選實(shí)施方案中，施加的壓力為約300托(40 000Pa)。

在一個實(shí)施方案中，使用止血帶停止肢體的血液循環(huán)，止血帶收緊幾分鐘至多于一小時，通常在約1至80分鐘之間，例如約30分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用之前，期間和之后應(yīng)用止血帶，例如在輸注之前約10分鐘，在輸注期間約20分鐘和輸注之后約15分鐘。更一般地，施加壓力幾分鐘，通常在約1至80分鐘之間，例如約30分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用之前，期間和之后施加壓力，例如在輸注之前約10分鐘，在輸注期間約20分鐘和在輸注之后約15分鐘。

在一個實(shí)施方案中，平均流速為5至150ml/min，有利地為5至80ml/min，例如10ml/min。當(dāng)然，流速還決定血液循環(huán)停止的時間段和施加的壓力。

在局部-區(qū)域施用的情況下，注射的劑量可以在10¹²和10¹⁴vg/kg患者體重之間變化，優(yōu)選在10¹²和10¹³vg/kg之間。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的施用方法是全身施用。系統(tǒng)性注射打開了全身注射的方式，以便到達(dá)包括心臟和膈肌的受試者身體的整個肌肉，然后是實(shí)際治療這些全身性和仍然不可治愈的疾病。在某些實(shí)施方案中，全身遞送包括將組合物遞送至受試者，使得組合物在受試者的整個身體中可及。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，全身給藥通過在血管中注射組合物進(jìn)行，即血管內(nèi)(靜脈內(nèi)或動脈內(nèi))給藥。根據(jù)一個實(shí)施方案，通過外周靜脈作靜脈內(nèi)注射施用組合物。

全身給藥通常在以下條件下進(jìn)行：

-1至10mL/min，有利地1至5mL/min的流速，例如3mL/min；

-總注射體積可以在1至20mL之間變化，優(yōu)選5mL載體制劑/kg受試者體重。注射體積不應(yīng)超過總血量的10％，優(yōu)選地約6％。

當(dāng)全身遞送時，組合物優(yōu)選以小于或等于10¹⁵vg/kg或甚至10¹⁴vg/kg的劑量施用，有利地為10¹²vg/kg至10¹⁴vg/kg，更有利地為5.10¹²vg/kg至10¹⁴vg/kg/kg，例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.10¹³vg/kg。也可考慮較低劑量例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.10¹²vg/kg，以避免潛在的毒性和/或免疫反應(yīng)。如技術(shù)人員已知的，優(yōu)選在效率方面給出令人滿意的結(jié)果的盡可能低的劑量。

在具體實(shí)施方案中，治療包括單次施用組合物。

如將在下面的實(shí)施例中說明的，本發(fā)明的基因治療產(chǎn)品的施用不認(rèn)為與不良免疫反應(yīng)相關(guān)。因此，根據(jù)一個實(shí)施方案，所述施用不與任何進(jìn)一步或額外的免疫抑制治療(免疫抑制)組合。

在一個實(shí)施方案中，觀察基因治療產(chǎn)品的存在和/或功能性微營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)以及相關(guān)的治療益處，持續(xù)長達(dá)1個月，或3個月或6個月，或甚至1年，2年，5年，10年，甚至受試者的整個生命。

根據(jù)本發(fā)明，受試者是哺乳動物，優(yōu)選人或狗，但也可以是小鼠，大鼠或非人靈長類動物。

“營養(yǎng)不良疾病”是指與肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺陷相關(guān)的疾病。該缺陷可以是導(dǎo)致低水平的表達(dá)或缺失表達(dá)的缺失或突變，在開放閱讀框中引入提前終止密碼子或產(chǎn)生無活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的營養(yǎng)不良性疾病是由肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變引起的杜氏和貝克肌營養(yǎng)不良(DMD/BMD)。所述突變可導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)的缺失或低水平，或者產(chǎn)生部分或完全失活的，可能截短的蛋白質(zhì)。

可受益于本發(fā)明的組合物的受試者包括所有診斷為肌營養(yǎng)不良或有發(fā)展為這類肌肉營養(yǎng)不良的風(fēng)險的患者。然后可以基于肌營養(yǎng)不良蛋白基因中的突變或缺失的鑒定，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來選擇待治療的受試者，包括例如肌營養(yǎng)不良蛋白基因的測序，和/或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法評價肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)或活性水平。因此，所述受試者包括已經(jīng)表現(xiàn)出營養(yǎng)不良疾病癥狀的受試者和具有發(fā)展所述疾病風(fēng)險的受試者。在一個實(shí)施方案中，所述受試者包括已經(jīng)表現(xiàn)出營養(yǎng)不良性疾病癥狀的受試者。在另一個實(shí)施方案中，所述受試者是流動患者和早期非流動患者。

這種組合物特別意在用于基因治療，特別是用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)或貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)，有利地是DMD。

本發(fā)明的第一個目的是提供安全(無毒)治療。另一個目的是提供有效的治療，其允許推遲，減緩或防止疾病的發(fā)展，并且可能改善可以在臨床水平上容易監(jiān)測的患者的表型。

在受試者中，可以使用本發(fā)明的組合物：

-用于改善肌肉功能。特別感興趣的是骨骼肌，以及心肌和膈肌；

-用于改善步態(tài)；

-用于改善心臟功能；

-用于改善呼吸功能；

-用于改善消化功能；和/或

-用于延長生存期，更一般地改善生活的質(zhì)量和期望。

根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及用于改善肌肉功能，步態(tài)，消化功能，心臟功能和/或呼吸功能，和/或用于延長生存期，有利地?zé)o副作用(細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答)的方法，包括向有需要的受試者施用治療量的如上所公開的基因治療產(chǎn)品。

有利地，所述改善在給藥后長達(dá)1個月，或3個月或6個月或9個月，更有利地在給藥后長達(dá)1年，2年，5年，10年或甚至在受試者整個生命中觀察到。

在一個實(shí)施方案中，所述改善導(dǎo)致癥狀嚴(yán)重程度和/或頻率的減輕，和/或延遲出現(xiàn)，其中所述癥狀選自下組：頻繁跌倒，不能行走，吞咽困難，心肌病，涎分泌過多(ptyalism)，運(yùn)動技能降低(跑，蹦，跳)，呼吸異常，假性肥大，腰椎突起和肌肉僵硬。

所述功能的改善可以基于本領(lǐng)域已知的方法評估，例如：

-評估表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白的肌纖維的百分比；

-步行測試；

-通過測力計(jì)測量的強(qiáng)度評估；

-通過運(yùn)動功能測量評估精確肢體的運(yùn)動功能；

-使用運(yùn)動監(jiān)測器評估全身活動；

-通過3軸加速度記錄評估步態(tài)；

-通過超聲心動圖，多普勒分析和斑點(diǎn)跟蹤分析評估心臟功能；

-通過評估隔膜動力學(xué)評估呼吸功能；

-通過臨床隨訪評估重要功能，特別是心臟，呼吸和消化功能；

-通過臨床評分評估生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。

如實(shí)施例中所示，與未治療的受試者相比，所要求保護(hù)的治療方法允許改善臨床狀態(tài)和上文公開的各種參數(shù)。

根據(jù)一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及治療營養(yǎng)不良性疾病的方法，包括向受試者施用如上公開的基因治療產(chǎn)品，其中：

-至少30％的肌纖維，有利地40％，更有利地至少50％的肌纖維表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白；和/或

-臨床得分維持在對應(yīng)于健康受試者的得分的至少50％，有利地至少60％或甚至70％的水平。

有利地，所述效果在給藥后長達(dá)1個月，或3個月或6個月或9個月，更有利地在給藥后長達(dá)1年，2年，5年，10年，或甚至受試者整個生命中更長。

如本領(lǐng)域已知的，肌肉中肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)的水平易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，有利地通過免疫組織化學(xué)法，例如通過使用如上公開的抗肌營養(yǎng)不良蛋白抗體作肌肉活檢免疫染色。臨床評分的計(jì)算對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是常規(guī)的。如上面關(guān)于狗所詳述的，可以基于吞咽困難，呼吸，涎分泌過多(ptyalism)和全身活動來計(jì)算該得分。關(guān)于患者，Bushby和Connor已經(jīng)例如列出了，杜氏肌營養(yǎng)不良中的試驗(yàn)的臨床結(jié)果測量(Clin Investig(Lond).2011；1(9)：1217–1235)。

除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋，例如“分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊”，第四版(Sambrook，2012)；“寡核苷酸合成”(Gait，1984)；“動物細(xì)胞培養(yǎng)”(Freshney，2010)；“酶學(xué)方法”“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊”(Weir，1997)；“哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體”(Miller和Calos，1987)；“分子生物學(xué)簡單方法”(Ausubel，2002)；“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：原理，應(yīng)用和疑難解答”，(Babar，2011)；“最新免疫學(xué)方法”(Coligan，2002)。這些技術(shù)適用于生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸和多肽，并且因此在制備和實(shí)施本發(fā)明時可以考慮。在下面的部分中將討論用于特定實(shí)施方案的特別有用的技術(shù)。

本文引用的每個專利，專利申請和出版物的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。

無需進(jìn)一步描述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用前述說明和以下說明性實(shí)施例，制備和利用本發(fā)明的化合物并實(shí)施要求保護(hù)的方法。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

通過參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅僅是為了說明的目的，而不是限制性的。

下面給出的結(jié)果是在GRMD(金毛犬肌營養(yǎng)不良)狗模型中獲得的。它是營養(yǎng)不良病理學(xué)的最佳動物模型，以便在臨床試驗(yàn)之前評估基因治療產(chǎn)品在效果(治療劑量，穩(wěn)定性，毒性，...)以及免疫應(yīng)答方面的潛力。

圖1：全長肌營養(yǎng)不良蛋白(A)，各種微肌不良營養(yǎng)蛋白(B)和表達(dá)構(gòu)建物(C)的示意圖。

圖2：研究計(jì)劃-GRMD犬全身治療的一般方案。

圖3：A/通過靜脈內(nèi)全身遞送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體至GRMD2犬(ICI)3個月后獲得的肌肉活檢。

a/m.股二頭肌注射前

b/健康狗

c/m.橈側(cè)腕伸肌右：

82％的cMD+纖維(在82％的纖維中檢測到cMD)

2.8vg/dg(每個二倍體基因組的載體基因組)

d/m.指總伸肌右：

59％的cMD+纖維(在59％的纖維中檢測到cMD)

4.1vg/dg

e/m.橈側(cè)腕伸肌左：

62％的cMD+纖維(在62％的纖維中檢測到cMD)

6.2vg/dg

f/m.指總伸肌左：

66％的cMD+纖維(在66％的纖維中檢測到cMD)

2.6vg/dg

B/通過靜脈內(nèi)全身遞送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體至GRMD2犬(ICI)8個月后獲得的肌肉活檢：

a/m.股二頭肌右：

58％的cMD+纖維(在58％的纖維中檢測到cMD)

1.0vg/dg

b/m.股二頭肌左：

56％的cMD+纖維(56％的纖維中檢測到cMD)

0.8vg/dg

圖4：在2月齡時全身接受10¹⁴vg/kg rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體的GRMD組中獲得的臨床評分?jǐn)?shù)據(jù)。

*表示狗不再活著

圖5：全身步態(tài)指數(shù)的數(shù)據(jù)。使用通過判別分析構(gòu)建的模型計(jì)算曲線，并且表示對于未處理的GRMD和健康的狗獲得的數(shù)據(jù)。對于后者，示出了平均質(zhì)心曲線和95％置信區(qū)間。

圖6：在經(jīng)治療和未經(jīng)治療的GRMD犬上監(jiān)測的運(yùn)動膜片范圍(ROM)。健康犬顯示的ROM值在90和110％之間。

圖7：使用犬μDys肽池的IFNγELISpot(PBMC的動力學(xué))。數(shù)據(jù)在GRMD狗2(ICI)中獲得，其在2個月齡時全身接受了10¹⁴vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。

圖8：在注射的狗血清中通過Western印跡檢測抗肌營養(yǎng)不良蛋白IgG抗體。數(shù)據(jù)在GRMD狗2(ICI)中獲得，其在2月齡時全身接受了10¹⁴vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。在用pCMV-犬-MD(cμDys)轉(zhuǎn)染(或不轉(zhuǎn)染)的293細(xì)胞的細(xì)胞提取物上測試每種血清的反應(yīng)性。已經(jīng)測試了注射前(第0天)和注射后(第3周，第1.5個月，第2.5個月，第4個月和第7.5個月)的血清。陽性對照包括抗肌營養(yǎng)不良蛋白抗體MANEX 1011C和來自抗肌營養(yǎng)不良蛋白免疫的GRMD狗的陽性犬血清(C+)。

材料和方法：

1/動物

在GRMD狗模型(Kornegay等,Mamm Genome,2012)中進(jìn)行了完全全身注射微營養(yǎng)不良蛋白載體(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)的評價。對選定的雄性狗進(jìn)行DMD突變的基因分型，其由引起不準(zhǔn)確的mRNA加工的肌營養(yǎng)不良蛋白基因的內(nèi)含子6的3'共有剪接位點(diǎn)(A>G)中的單堿基變化組成。

如下表1所示處理狗(無免疫抑制)：

對照狗對應(yīng)于非注射的GRMD犬和健康狗。

2/微肌營養(yǎng)不良蛋白載體

rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體編碼在肌肉特異性啟動子(SPc5.12)控制下的mRNA序列優(yōu)化的犬肌營養(yǎng)不良蛋白(cMD)。

犬特異性mRNA序列優(yōu)化的cMD cDNA的構(gòu)建，引入了肌營養(yǎng)不良蛋白的CT結(jié)構(gòu)域的外顯子71-78和桿狀結(jié)構(gòu)域4-23(ΔR4-R23；圖1)的缺失，其含有肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子79的最后三個氨基酸，隨后是三個終止密碼子并摻入SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)。cDNA序列被修飾以包括共有Kozak序列?；谌祟愔械霓D(zhuǎn)移RNA頻率優(yōu)化mRNA序列并增加GC含量以提高RNA穩(wěn)定性。微肌營養(yǎng)不良蛋白(GENEART,雷根斯堡,德國)的mRNA序列優(yōu)化導(dǎo)致在犬抗肌營養(yǎng)不良蛋白中GC含量從48％增加至61％，以及23.6％的密碼子的被修飾。cMD基因cDNA的大小為3603bp，并且該載體的含側(cè)翼反向末端重復(fù)(ITR)的轉(zhuǎn)基因盒的大小為4643bp，其對應(yīng)于野生型AAV2基因組長度的4682bp的99.2％。去除肌營養(yǎng)不良蛋白基因的5'-和3'-非翻譯區(qū)以減少肌營養(yǎng)不良蛋白盒的側(cè)翼ITR大小。表達(dá)處于肌肉特異性合成啟動子(SPc5-12)的控制之下(Wang,B.,等,Gene Ther,2008.15(22)：第1489-99頁)。

這個表達(dá)盒(SEQ ID NO：2，包括AAV_ITR，Spc512啟動子，犬MD cDNA和SV40PolyA)被證明在基于Duchenne beagle的CXMDJ模型中肌內(nèi)注射后導(dǎo)致廣泛和穩(wěn)定的肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)(Koo,T.,等,J Gene Med,2011.13(9):p.497-506)。此外，這種構(gòu)建物改善肌肉病理并且減少目標(biāo)肌肉組織中的炎癥反應(yīng)。

3/rAAV2/8-SPc5.12-cMD的制備

在桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)中產(chǎn)生含有由SPc5-12啟動子調(diào)節(jié)的犬微營養(yǎng)不良蛋白cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV2/8-SPc5.12-cMD。產(chǎn)生兩個桿狀病毒批次，一個表達(dá)rep(編碼AAV2Rep蛋白)和cap(編碼AAV8Cap蛋白)AAV基因，第二個是AAV2轉(zhuǎn)移載體。產(chǎn)生病毒，庫存并用于在200升一次性生物反應(yīng)器(Sartorius)中共感染SF9細(xì)胞。在三天培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，裂解，通過澄清處理裂解液，在免疫親和柱上純化，通過切向流過濾濃縮，配制，無菌過濾和填充。純化基于攜帶結(jié)合AAV1，AAV2，AAV3，AAV5，AAV6和AAV8的單鏈抗體的商業(yè)凝膠(購自GE Healthcare的AVB)。該過程的總產(chǎn)率>20％，并產(chǎn)生145單位的4.5ml產(chǎn)物，病毒滴度>10¹³vg/ml。

4/全身給藥

已經(jīng)通過全身遞送用治療性候選物(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)載體注射GRMD狗。該試驗(yàn)組以10¹⁴vg/kg(總計(jì)約5×10¹⁴vg/動物)給藥。通過外周靜脈，在插管頭靜脈中以3mL/min的流速進(jìn)行簡單的全身注射?？傋⑸潴w積約為25mL的載體制劑(5ml/kg)，代表6％的總血液體積(10％是推薦的上限)，其結(jié)果是非常好的耐受性。

實(shí)驗(yàn)動物在2個月齡時注射，并如表1所示跟進(jìn)。它們都對在血清中缺少AAV8中和因子進(jìn)行了預(yù)篩選。在靜脈內(nèi)(IV)注射載體之前，從實(shí)驗(yàn)中丟棄顯示出深度虛弱和/或吞咽損傷的GRMD狗。從未使用免疫抑制方案，并且提供的唯一醫(yī)療護(hù)理被限制為保持動物的舒適和健康。在適當(dāng)時間獲得適當(dāng)?shù)墓芾砦募?倫理和轉(zhuǎn)基因生物處理)。所有程序均按照“實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南”進(jìn)行，并由特設(shè)動物使用和護(hù)理委員會批準(zhǔn)。

5/全身治療的評價

發(fā)病率和死亡率每天評估兩次。發(fā)現(xiàn)死亡的動物將在病理學(xué)家在場時進(jìn)行尸體剖檢，并在適當(dāng)時收集組織樣品以嘗試系統(tǒng)地確定死亡原因。

該方案的臨床和生物學(xué)耐受性

在所有狗中，在注射后定期監(jiān)測臨床實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，包括電解質(zhì)，腎和肝功能測試和全血細(xì)胞計(jì)數(shù)。在整個方案期間，還仔細(xì)和每周評估每個狗的臨床狀態(tài)，包括心臟，呼吸，消化，運(yùn)動和神經(jīng)功能。

通過Q-PCR評估載體脫落和載體生物分布

通過Q-PCR定期對尿，血清，中間肌肉活檢，來自四肢的主要骨骼肌其中屈肌和伸肌，心臟和隔膜，肝臟，脾臟，腎臟，淋巴結(jié)和睪丸進(jìn)行載體脫落和載體生物分布(檢測)，直到安樂死。使用Qiamp病毒RNA微型試劑盒(Qiagen)從流體中提取rAAV DNA。從140μL血清中提取rAAV。1/8的提取物(10μL)用于Q-PCR分析。使用Gentra Puregene試劑盒(Qiagen)和Tissue Lyzer II(Qiagen)從組織中提取基因組DNA(gDNA)。使用納米分光光度計(jì)(Implen)測定每種gDNA樣品的濃度。

在StepOne Plus(Applied Biosystem)上使用50ng一式兩份的gDNA或10μL流體提取物進(jìn)行定量PCR。使用設(shè)計(jì)用于特異性擴(kuò)增SPc5.12-cMD盒的引物和探針確定載體拷貝數(shù)。使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增犬葡萄糖醛酸酶基因的引物和探針來確定gDNA拷貝數(shù)。對于每個樣品，將Ct(循環(huán)閾值)值與用不同稀釋度的線性化標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(含有SPc5.12-cMD盒或犬葡萄糖醛酸酶基因)獲得的值進(jìn)行比較。結(jié)果以每個二倍體基因組的載體基因組(vg/dg)表達(dá)。對于流體，僅進(jìn)行轉(zhuǎn)基因特異性Q-PCR，并且結(jié)果以每μl提取流體的載體基因組表達(dá)。通過分析摻入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的從脾臟，睪丸，肝臟，腎臟或骨骼肌提取的10μL流體提取物或50nggDNA，來預(yù)先檢查在gDNA存在下，Q-PCR抑制是否不存在。

通過Q-RT-PCR評估不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)

在多種骨骼肌，心臟和隔膜，肝臟，脾臟和任何其他表現(xiàn)出高載體拷貝數(shù)的組織中通過Q-RT-PCR評估微肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)。簡言之，根據(jù)制造商的說明書，用TRIzol試劑(英杰公司)從肌肉，肝臟和脾臟中提取總RNA，并用來自TURBO DNA free試劑盒(Ambion)的無RNA酶的DNAseI處理。使用隨機(jī)引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(英杰公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。為每個樣品加工無逆轉(zhuǎn)錄酶(RT-)的陰性對照。在StepOne Plus(Applied Biosystem)上對稀釋的一式兩份cDNA進(jìn)行定量PCR。使用設(shè)計(jì)用于特異性擴(kuò)增該序列的引物來確定cMD信使的相對定量。通過已知在狗的不同組織中相似表達(dá)的犬RPL32(核糖體蛋白L32)信使的Q-PCR分析將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化(Peters,I.R.,等,.Vet Immunol Immunopathol,2007.117(1-2)：第55-66頁)。通過分析摻有不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的稀釋的cDNA來檢查在肌肉、肝臟和脾的cDNA的存在下，是否不存在Q-PCR抑制。

對于每個樣品，將Ct(循環(huán)閾值)值與用不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(含有cMD表達(dá)盒或犬RPL32信使的序列)獲得的值進(jìn)行比較。結(jié)果以相對量(RQ)表示：

RQ＝2^-ΔCt＝2^{-(Ct靶標(biāo)-Ct外源對照)}

通過蛋白質(zhì)印跡分析肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)

使用特異性Western印跡分析，評估注射的狗的不同肌肉中的微肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)：

-在一些骨骼肌，以及心臟和隔膜，在安樂死時采樣，

-在將發(fā)現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的肝臟，脾臟和任何其他組織中，在安樂死時。

從組織樣品中提取總蛋白。在SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在Red Ponceau染色后，將膜在TBS中的5％脫脂乳中封閉，并與抗肌營養(yǎng)不良蛋白MANEX1011C抗體和第二抗-小鼠IgGHRP偶聯(lián)的抗體雜交。

免疫組化分析肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)

通過免疫化學(xué)方法，在注射的狗的骨骼肌中評價微肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)：

-在中間肌肉活檢，

-在所有骨骼肌，以及心臟和隔膜，在安樂死時采樣，

-在肝臟，脾臟，睪丸，腎臟和淋巴結(jié)，安樂死時采樣。

通過免疫組織化學(xué)方法評估微肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)和定位。使用來自Novocastra的小鼠肌營養(yǎng)不良蛋白抗體(NCL-DYS-B)在每個肌肉的橫切片上進(jìn)行微肌營養(yǎng)不良蛋白多肽免疫染色。肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白的恢復(fù)是通過β肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖，β-肌蛋白聚糖，γ-肌蛋白聚糖和Utrophin的免疫染色來評估的，包括在肌漿膜上與層粘連蛋白共定位。

評估肌肉中的局部病理模式

病理學(xué)評估是討論基因治療產(chǎn)品在靶組織水平的實(shí)際益處的關(guān)鍵。使用形態(tài)測量分析，EC委員會認(rèn)證的病理學(xué)家評估注射的狗的骨骼肌中的病理模式。這些分析在具有大多數(shù)I型纖維(近肢肌肉，椎旁肌肉)的姿勢肌肉；具有大多數(shù)II型纖維(來自遠(yuǎn)端肢體肌肉的屈肌和伸肌)的運(yùn)動肌；呼吸肌，隔膜，肋間和咀嚼肌上進(jìn)行。也對心臟進(jìn)行了廣泛評估，由于不平行的取向，捕獲纖維直徑有特定困難。

內(nèi)膜纖維化在膠原I的免疫組織化學(xué)揭示(免疫過氧化酶測定)和標(biāo)記區(qū)域的百分比的自動測量之后評價。

總纖維化在膠原I的免疫組織化學(xué)揭示(免疫過氧化酶測定)之后，在與內(nèi)膜纖維化的同一載玻片上評價。還進(jìn)行總標(biāo)記區(qū)域的百分比的自動測量。

橫紋肌纖維化通過在肌肉組織的相同區(qū)域中的總纖維化和肌內(nèi)膜纖維化之間的差計(jì)算。

Anocytosis(纖維直徑的變化)通過手工形態(tài)測定法評價：每分析的肌肉橫截面測定至少200個肌纖維和6個區(qū)域的最小纖維直徑。

壞死通過茜素紅(Alizarin Red)染色測量鈣富集來評價。標(biāo)記區(qū)域的百分比在手動閾值后測量。

再生在用發(fā)育性肌球蛋白重鏈同種型的特異性抗體作免疫組織化學(xué)揭示肌管(免疫過氧化物測定)之后評價。標(biāo)記區(qū)域的百分比在手動閾值后測量。

炎癥在同一載玻片上免疫組織化學(xué)揭示T和B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞后評價(免疫過氧化酶測定)。標(biāo)記區(qū)域的百分比在手動閾值后確定。

評估不同組織中的病理模式

使用HE染色和解剖病理學(xué)專門技術(shù)在安樂死的狗的不同組織中評估脫離靶組織(肝臟，脾臟，腎臟，...)所致的潛在不良副作用。

骨骼肌的NMR成像和光譜指數(shù)

非侵入性肌肉成像和光譜指數(shù)在安樂死前一周進(jìn)行。狗被送到巴黎的肌肉學(xué)研究所(Institute of Myology，Pierre Carlier的團(tuán)隊(duì))，并接受3T西門子Trio掃描儀核磁共振(NMR)以定量和連續(xù)描述與未治療和健康動物相比的營養(yǎng)不良肌肉異常。除此之外，在Bruker biospec掃描儀中在4T下實(shí)現(xiàn)/獲取伸肌橈側(cè)腕(extensor carpi radialis)的P31光譜。相對于未治療和健康犬的組中疾病進(jìn)展的在先NMR研究期間的參考數(shù)據(jù)定位每個單獨(dú)的測量Thibaud,J.L.,等,Neuromuscul Disord,2012.22 Suppl 2:p.S85-99；Wary,C.,等,NMR Biomed,2012.25(10):p.1160-9.胸椎和骨盆/前肢在3T掃描儀中成像。如Thibaud,J.L.,等(Neuromuscul Disord,2007.17(7):p.575-84)所述，獲取標(biāo)準(zhǔn)和脂肪飽和的T1-，T2-和質(zhì)子-密度-加權(quán)圖像。還進(jìn)行T1的測量和在釓-螯合物注射后肌肉增強(qiáng)的兩小時動力學(xué)研究。已經(jīng)鑒定了在健康和未治療的GRMD犬之間不同的十個指數(shù)，其能夠解釋基因治療治療對大肌肉區(qū)域的效果。

功能評估：臨床分級

臨床檢查也每天進(jìn)行兩次，包括食物和水的消耗，活動(全身性動作，對外部刺激的反應(yīng))和身體外觀(面部，毛皮，四肢)。在每次麻醉期間對所有動物進(jìn)行包括體重在內(nèi)的全面檢查。

使用先前公開的方案(Rouger,K.,等,Am J Pathol,2011.179(5):第2501-18頁)，通過在注射后每周進(jìn)行的臨床分級來評價動物關(guān)于肌肉疾病的一般臨床狀態(tài)。該評價包括11項(xiàng)運(yùn)動標(biāo)準(zhǔn)和6項(xiàng)與一般健康狀況(包括吞咽困難，涎分泌過多，全身活動和呼吸)有關(guān)的項(xiàng)目。每個項(xiàng)目得分從0到2，0對應(yīng)于無癥狀，2對應(yīng)于最大嚴(yán)重程度。全局臨床評分表示為最大臨床評分(對于健康狗定義為100％)的百分比，并建立趨勢曲線(移動平均值為3)以表示臨床評分演變。將注射的狗中獲得的臨床評分演變與非注射的GRMD狗的臨床評分演變進(jìn)行比較。

功能評估：步態(tài)分析(肌肉功能)

由Locometrix量化的步態(tài)分析每月進(jìn)行兩次。是由3個正交放置的加速度計(jì)組成的3D加速度計(jì)設(shè)備。這種結(jié)構(gòu)允許沿著狗的背腹，頭尾和中間-橫軸記錄加速度。可以使用該設(shè)備分析速度，步頻，步長，規(guī)律性，總功率，背腹功率，頭尾功率，中間-橫軸功率和力，并且在GRMD狗中該疾病進(jìn)展期間，這些指數(shù)中的一些被修改(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75頁)。

功能評價：心功能評價

每月使用超聲心動圖和多普勒分析來評估治療的狗的心臟功能，這是一種允許檢測收縮性缺陷的敏感方法。

數(shù)據(jù)采集：

根據(jù)美國獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)院的推薦(Thomas,W.P.,等,JVet Intern Med,1993.7(4):第247-52頁)，使用配備有5-7.5和2-5MHz相控陣換能器的Vivid 7超聲單元(GE，沃基肖，威斯康辛州)，在持續(xù)ECG的監(jiān)視下，對有意識的狗以站立位置進(jìn)行常規(guī)超聲心動圖和2D彩色組織多普勒成像(TDI)。轉(zhuǎn)移所有數(shù)據(jù)，由兩名不知道狗的臨床狀態(tài)的檢查者使用特定軟件(Echo Pac 5.4，GE)進(jìn)行離線分析。如下所述測量一些參數(shù)用于評估心肌收縮性。

常規(guī)參數(shù)：測量左心室(LV)尺寸，后壁和室間隔壁的厚度。

計(jì)算左心室縮短和射血分?jǐn)?shù)(Teichholz方法)。二尖瓣流入的脈沖多普勒用于測量早期相對于晚期舒張流速(E/A)的比率。

組織多普勒成像：從在后壁中的乳頭肌水平的短軸視圖和在隔壁和側(cè)壁基底部分水平的尖4腔視圖獲得徑向心肌速度和應(yīng)變率的測量值。

斑點(diǎn)跟蹤成像：在短軸視圖中，測量5個預(yù)定段中的每一個中的節(jié)段應(yīng)變。平均周向和徑向通過手動計(jì)算所獲得的測量的平均值來確定。在4個腔室視圖中，總體縱向應(yīng)變用程序自動測量，該程序?qū)?個自動檢測的段的分析導(dǎo)出的測量值進(jìn)行積分。預(yù)注射數(shù)據(jù)和模擬注射的GRMD用作參考。

功能評價：呼吸功能評價

呼吸功能每月評價，并通過使用對有意識的狗進(jìn)行胸部放射鏡采集來完成。在提取呼氣末和吸氣末后圖像之后，計(jì)算2個指數(shù)：

-膜片的尾部回縮指數(shù)(RI)反映膜片的回縮；

-隔膜運(yùn)動范圍(ROM)反映了隔膜的移動性：它是在(i)在吸氣末和呼氣末獲得的2個圖像的疊加之后獲得的，(ii)測量每個圖像上尾部腔靜脈孔的中心點(diǎn)位置之間的距離，(iii)將該距離通過第13胸椎(T13)的長度歸一化。

這2個指數(shù)與膈肌的收縮和移動性相關(guān)，其在GRMD狗的疾病進(jìn)展期間被修改(Barthelemy,I.,等,Myology congress,2011)。在GRMD狗中獲得的結(jié)果相對于在未注射的未處理動物中獲得的結(jié)果進(jìn)行定位。

呼吸功能的臨床隨訪：

呼吸功能也通過觀察呼吸運(yùn)動/周期來評估，其修改揭示一些呼吸異常，那可能是隔膜和其他呼吸肌無力的結(jié)果。

通過由專業(yè)獸醫(yī)每兩個月進(jìn)行的臨床檢查來評價關(guān)于呼吸異常的顯現(xiàn)和惡化的動物狀態(tài)。特別地，評價呼吸運(yùn)動/周期的數(shù)量和規(guī)律性。

功能評價：消化功能評價

消化功能的臨床隨訪：

如在DMD患者中所見，吞咽困難(即吞咽困難)是GRMD狗中疾病進(jìn)展的典型癥狀，作為明顯的口腔和咽部肌肉虛弱的結(jié)果(van den Engel-Hoek,J Neurol,2013,260(5):1295-303)。

通過由專業(yè)獸醫(yī)每兩個月進(jìn)行的臨床檢查來評價關(guān)于吞咽困難的顯現(xiàn)和惡化的動物狀態(tài)。特別地，評價舌頭大小，口腔內(nèi)異常量的唾液的存在和動物吃固體或軟食物的能力。

免疫反應(yīng)的隨訪

在整個研究期間，收集來自參與研究的狗的血液樣品(血漿，血清和外周血單核細(xì)胞-PBMC)以監(jiān)測：

-針對rAAV8的體液免疫應(yīng)答

-針對微肌營養(yǎng)不良蛋白的體液免疫應(yīng)答

-針對rAAV8的細(xì)胞免疫應(yīng)答

-針對微肌營養(yǎng)不良蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答

-注射后早期的炎癥性免疫應(yīng)答

血液樣品根據(jù)法國L2生物安全性要求處理，并進(jìn)行血液學(xué)和臨床生物化學(xué)處理。定期獲得專用血清樣品用于以下免疫學(xué)評估：(i)抗AAV抗體和抗肌營養(yǎng)不良蛋白抗體；(ii)通過Luminex測量炎癥細(xì)胞因子；(iii)補(bǔ)體激活。還在治療之前和之后收集全血以分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，隨后監(jiān)測針對AAV和/或肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的潛在細(xì)胞免疫應(yīng)答。

對rAAV8載體的體液免疫應(yīng)答：

在載體注射后的不同時間點(diǎn)評價狗血清：(i)通過定制ELISA檢測IgG的和對rAAV8特異性的IgM存在；(ii)通過定制中和測定揭示的rAAV8中和能力。

對肌營養(yǎng)不良蛋白的體液免疫應(yīng)答：

通過Western-Blot分析常規(guī)地進(jìn)行IgG抗肌營養(yǎng)不良蛋白抗體的檢測。簡言之，將含有犬肌營養(yǎng)不良蛋白的細(xì)胞提取物進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移到Hybond ECL硝酸纖維素膜上。過夜飽和后，將膜與來自注射動物的實(shí)驗(yàn)犬血清一起溫育。隨后，通過與過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗狗IgG抗體雜交，隨后通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測進(jìn)行檢測。陽性對照包括抗肌營養(yǎng)不良蛋白MANEX 1011C抗體(Wolfson遺傳性神經(jīng)肌肉疾病中心(Wolfson Center for Inherited Neuromuscular Diseases))。

對AAV8和肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的細(xì)胞免疫應(yīng)答評估如下：簡言之，用編碼AAV8的VP蛋白或犬肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的慢病毒載體(LV)進(jìn)行IFN-γELISPOT測定。LV載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)PBMC。使用覆蓋犬肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的犬序列的重疊肽文庫的補(bǔ)充方法也用于刺激淋巴細(xì)胞。

炎癥免疫應(yīng)答(細(xì)胞因子)通過Luminex技術(shù)在載體施用前和施用后不同時間點(diǎn)觀察IL2，IL4，IL6，IL8，IL10，IL15，IFN和TNF進(jìn)行定量。

結(jié)果：

如圖2所示，通過外周靜脈的簡單全身注射，2個月大的GRMD犬已被注射1×10¹⁴vg/kg的上述rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。載體施用后瞬間以及長達(dá)數(shù)月從未檢測到臨床，生物化學(xué)和血液學(xué)不良反應(yīng)。

肌肉活檢：

在全身注射后3和8個月，獲取GRMD狗的來自一些不同肌肉的中間活檢。

根據(jù)上述方法，研究了在載體的全身遞送后3個月，表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的肌纖維的百分比。GRMD狗2的結(jié)果如圖3A所示。

連同表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因的纖維的百分比，每個二倍體細(xì)胞的載體基因組數(shù)(vg/dg)在遵循上文所述的方法學(xué)之后說明。對于平均2-4vg/dg，在活組織檢查中，表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白的纖維的平均百分比從59％到82％(圖3A c/到f/)，這被解釋為非常令人鼓舞?？梢宰⒁獾街饕?xì)胞浸潤的缺乏和相當(dāng)顯著保存的組織結(jié)構(gòu)。

在載體的全身遞送后8個月，對于1vg/dg，在活組織檢查中表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白的纖維的百分比為約50％(圖3B)。

所有可用的數(shù)據(jù)匯編在下表2中：

N/A：不適用，因?yàn)榛顧z的質(zhì)量低

此外，在注射后7，5個月的GRMD狗3的組織中發(fā)現(xiàn)的載體基因組拷貝的進(jìn)一步定量顯示在下表中：

表3：在處死時(注射后7,5個月)在GRMD3的肌肉中發(fā)現(xiàn)的載體基因組拷貝。

以非常有趣的方式，觀察到即使在這個晚期時間點(diǎn)，在身體的所有骨骼肌中檢測到大量的轉(zhuǎn)基因顆粒(甚至在注射部位的遠(yuǎn)端，即右頭靜脈)，還有在心臟和隔膜中。這有利于轉(zhuǎn)基因在整個生物體內(nèi)的優(yōu)良的生物分布。

臨床評價：

如上所述對5只經(jīng)治療的GRMD狗的臨床評價的初步數(shù)據(jù)針對8只其他未經(jīng)治療的年齡匹配的GRMD狗進(jìn)行。圖4顯示了在載體注射后的不同時間點(diǎn)，基本上根據(jù)吞咽困難、呼吸、多涎、全身活性的臨床評分的改善。100％評分對應(yīng)于健康個體。即使臨床結(jié)果同一組內(nèi)的治療個體之間可能不同(在未治療的GRMD之間通常是這種情況)，這些結(jié)果表明治療的GRMD動物表現(xiàn)出迄今相當(dāng)穩(wěn)定的表型，優(yōu)于大多數(shù)未治療的動物。在治療的狗中評價的臨床評分保持在對應(yīng)于在健康狗中獲得的最大評分(100％)的至少50％的水平，一些動物高于70％，而大多數(shù)未經(jīng)治療的動物的臨床評分迅速下降至40％以下甚至更少(圖4)。

值得注意的是，臨床隨訪表明，即使在一歲大，治療的GRMD狗能夠跑，跳躍障礙，以他們的后肢站立。這對于未經(jīng)治療的GRMD犬而言從未觀察到，其預(yù)期壽命很少超過一年。

圖4所示的數(shù)據(jù)還支持治療的狗的心臟和呼吸功能的改善，以及與未治療的狗相比延長的生存期，連同改善的生活質(zhì)量。

步態(tài)表征：

如上所述，使用裝置每兩個月進(jìn)行步態(tài)評估。在3軸上記錄加速度：背腹(DV)，內(nèi)外側(cè)(ML)和頭尾(CC)。通過7個步態(tài)變量(步頻，規(guī)律性，總功率，頭尾功率，背腹功率，中間-側(cè)向功率和步長)的統(tǒng)計(jì)判別因子分析的步態(tài)特征示于圖5。

在注射的狗中獲得的結(jié)果相對于以前在25只未治療的GRMD和9只正常狗的組中疾病進(jìn)展的3D加速度計(jì)研究期間收集的參考數(shù)據(jù)定位(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75頁)。

數(shù)據(jù)顯示，μdys治療的GRMD狗產(chǎn)生了與年齡匹配的未治療的GRMD犬中觀察到的非常不同并且大大改善的整體步態(tài)指數(shù)。注射后僅3到4個月后，它們迅速改善他們的步態(tài)表現(xiàn)，顯示與健康狗十分接近的步態(tài)。從這些數(shù)據(jù)，看起來μdys治療的GRMD狗呈現(xiàn)出接近同一品種的健康狗的步態(tài)。

心臟和呼吸功能：

圖4所示的臨床評分支持心臟和呼吸功能的改善。

更具體地，圖6支持改善的呼吸功能，盡管狗之間存在顯著的變化，但是在治療的GRMD犬中顯示出ROM指數(shù)更好的值，與隔膜的改善的活動性相關(guān)。

這些數(shù)據(jù)也證實(shí)了下表4中報道的狗的臨床隨訪：

GRMD犬的呼吸異常的特征在于呼吸運(yùn)動/周期的改變。與DMD患者一樣，這些異常是膈肌和其他呼吸肌無力的結(jié)果。表4顯示了在治療的GRMD(μDys)狗中呼吸異常顯現(xiàn)的延遲或甚至抑制。

消化功能：

吞咽困難(吞咽困難)是GRMD犬的疾病進(jìn)展的典型癥狀。與DMD患者一樣，吞咽困難是明顯的口腔和咽部肌肉虛弱的結(jié)果。

已經(jīng)研究了治療對消化功能的可能好處，并且結(jié)果報告在下表5中：

這種臨床隨訪揭示了在治療的GRMD(μDys)狗中吞咽困難出現(xiàn)的延遲，具有癥狀嚴(yán)重程度較輕。

免疫反應(yīng)/毒性：

注射后3和8個月(圖3)的蛋白質(zhì)檢測以及圖4所示的良好臨床評分表明對重組AAV載體和微肌營養(yǎng)不良蛋白不存在不良和有害的免疫應(yīng)答。

肌肉活檢(圖3)以及圖4所示的良好臨床評分支持所述基因治療產(chǎn)品的無毒性。

在生物安全性方面，通過干擾素γElispot使用在PBMC的動力學(xué)上孵育的cMDYF肽庫來評價針對cMD的細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖7)。無論注射劑量如何，注射的動物無一表現(xiàn)出可檢測的干擾素γ分泌，表明不存在針對cMDYF的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

還通過免疫western印跡評價了針對cMD的體液免疫應(yīng)答(圖8)。所有可用的結(jié)果匯編在下表6中：

這里，在注射10¹⁴vg/kg AAV-cMD載體的5只狗中的2只中檢測到抗μ肌營養(yǎng)不良蛋白抗體的存在。重要的是，針對cMD的這種體液免疫應(yīng)答只是短暫的(最大檢測范圍＝在注射后2周和4個月之間)，并且似乎不與任何臨床有害作用相關(guān)，表明在這些動物中可能發(fā)生免疫耐受。

生存期：

圖4清楚地顯示生存期延長：

-在8-9個月時，8只未治療的GRMD狗中僅有2只仍然存活。相反，所有經(jīng)治療的GRMD狗仍然存活且健康；

-以一般方式，未治療的GRMD犬的預(yù)期壽命為約12個月，在該年齡時具有非常差的臨床狀態(tài)。相反，經(jīng)過長期隨訪測試的2只治療的GRMD狗(μDys1和2)在該截止時間后保持存活(分別為19和17個月的年齡)，并且處于良好的臨床狀態(tài)。

治療劑量：

該研究顯示，就在狗中的效果和毒性而言，全身給藥的相對低劑量10¹⁴vg/kg是合適的劑量。

結(jié)論：

總之，這些功能數(shù)據(jù)與中間肌肉活檢中的肌營養(yǎng)不良蛋白多肽的實(shí)質(zhì)性表達(dá)(>50％表達(dá)微肌營養(yǎng)不良蛋白的纖維)良好相關(guān)。它們顯示MD微肌營養(yǎng)不良蛋白構(gòu)建物的治療效果，并且支持全身遞送可能有益于停止/減少疾病的進(jìn)展。從這個GRMD的系統(tǒng)性試驗(yàn)組獲得的結(jié)果表明，從分子，病理學(xué)和功能方面測量的一些結(jié)果支持人類中系統(tǒng)性基因治療。

該研究證明了這樣的概念：全身靜脈注射單劑量后，編碼序列優(yōu)化的微肌營養(yǎng)不良蛋白并衣殼化在AAV8衣殼中的SPc5.12-cMD治療盒，為杜氏肌病(Duchenne myopathy)的狗模型提供臨床益處。不僅微肌營養(yǎng)不良蛋白多肽在多種肌肉中高度表達(dá)，而且還導(dǎo)致步態(tài)改善和改善的臨床結(jié)果測量，延長的生存期，無不良免疫反應(yīng)。以本發(fā)明人的知識，這是令人鼓舞和令人意想不到的結(jié)果的第一次報道，特別是在全身用藥的情況下。

序列表

<110> 吉尼松公司

皇家霍洛威和貝德福德新學(xué)院

<120> 營養(yǎng)不良性疾病的高效全身治療

<130> G143-B-43539 PCT

<150> EP14174848.3

<151> 2014-06-27

<150> PCT/EP2015/058964

<151> 2015-04-24

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 4640

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV_ITR_Spc512-人 MD1

<400> 1

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120

gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180

acatggctcg acagatcgag ctccaccgcg gtggcggccg tccgccctcg gcaccatcct 240

cacgacaccc aaatatggcg acgggtgagg aatggtgggg agttattttt agagcggtga 300

ggaaggtggg caggcagcag gtgttggcgc tctaaaaata actcccggga gttattttta 360

gagcggagga atggtggaca cccaaatatg gcgacggttc ctcacccgtc gccatatttg 420

ggtgtccgcc ctcggccggg gccgcattcc tgggggccgg gcggtgctcc cgcccgcctc 480

gataaaaggc tccggggccg gcggcggccc acgagctacc cggaggagcg ggaggcgcca 540

agctctagaa ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg ccaccatgct gtggtgggag 600

gaagtggagg actgctacga gagagaggac gtgcagaaga aaaccttcac caagtgggtg 660

aacgcccagt tcagcaagtt cggcaagcag cacatcgaga acctgttcag cgacctgcag 720

gatggcagga gactgctgga tctgctggag ggactgaccg gccagaagct gcccaaggag 780

aagggcagca ccagagtgca cgccctgaac aacgtgaaca aggccctgag agtgctgcag 840

aacaacaacg tggacctggt gaatatcggc agcaccgaca tcgtggacgg caaccacaag 900

ctgaccctgg gcctgatctg gaacatcatc ctgcactggc aggtgaagaa cgtgatgaag 960

aacatcatgg ccggcctgca gcagaccaac agcgagaaga tcctgctgag ctgggtgagg 1020

cagagcacca gaaactaccc ccaggtgaac gtgatcaact tcaccacctc ctggagcgac 1080

ggcctggccc tgaacgccct gatccacagc cacagacccg acctgttcga ctggaacagc 1140

gtggtgtgtc agcagagcgc cacccagaga ctggagcacg ccttcaacat cgccagatac 1200

cagctgggca tcgagaagct gctggacccc gaggacgtgg acaccaccta ccccgacaag 1260

aaaagcatcc tgatgtatat tacctctctg tttcaggtgc tgccccagca ggtgtccatc 1320

gaggccatcc aggaagtgga aatgctgccc aggcccccca aagtgaccaa ggaggagcac 1380

ttccagctgc accaccagat gcactatagc cagcagatca ccgtgtccct ggcccagggc 1440

tatgagagaa ccagcagccc caagcccaga ttcaagagct acgcctacac ccaggccgcc 1500

tacgtgacca cctccgaccc caccagaagc cccttcccca gccagcacct ggaggccccc 1560

gaggacaaga gcttcggcag cagcctgatg gagagcgaag tgaacctgga cagataccag 1620

accgccctgg aggaagtgct gtcttggctg ctgtccgccg aggacaccct gcaggcccag 1680

ggcgagatca gcaacgacgt ggaagtggtg aaggaccagt tccacaccca cgagggctac 1740

atgatggatc tgaccgccca ccagggcaga gtgggcaata tcctgcagct gggcagcaag 1800

ctgatcggca ccggcaagct gagcgaggac gaggagaccg aagtgcagga gcagatgaac 1860

ctgctgaaca gcagatggga gtgcctgaga gtggccagca tggagaagca gagcaacctg 1920

caccgcgtgc tgatggacct gcagaaccag aagctgaagg agctgaacga ctggctgacc 1980

aagaccgagg agcggaccag aaagatggag gaggagcccc tgggccccga cctggaggac 2040

ctgaagagac aggtgcagca gcacaaagtg ctgcaggagg acctggaaca ggagcaggtg 2100

cgcgtgaaca gcctgaccca catggtggtc gtggtggacg agagcagcgg cgaccacgcc 2160

acagccgccc tggaagagca gctgaaagtg ctgggcgaca gatgggccaa catctgccgg 2220

tggaccgagg acagatgggt gctgctgcag gacatcctgc tgaagtggca gagactgaca 2280

gaggagcagt gcctgtttag cgcctggctg agcgagaagg aggacgccgt gaacaagatc 2340

cacaccaccg gcttcaagga ccagaacgag atgctgagca gcctgcagaa gctggccgtg 2400

ctgaaggccg atctggagaa gaaaaagcag agcatgggca agctgtactc cctgaagcag 2460

gacctgctgt ccaccctgaa gaacaagagc gtgacccaga aaaccgaggc ctggctggac 2520

aatttcgccc ggtgctggga caatctggtg cagaaactgg agaagagcac cgcccagatc 2580

agccaggccg tgaccaccac ccagcccagc ctgacacaga ccaccgtgat ggagaccgtg 2640

accacagtga ccaccaggga gcagatcctg gtgaagcacg cccaggagga gctgccccct 2700

cccccccctc agaagaagcg gcagatcaca gtggacaccc tggagagact gcaggagctg 2760

caggaagcca ccgacgagct ggacctgaag ctgagacagg ccgaagtgat caagggcagc 2820

tggcagcctg tgggcgatct gctgatcgac agcctgcagg accacctgga gaaagtgaag 2880

gccctgcggg gcgagatcgc ccccctgaag gagaatgtga gccacgtgaa cgacctggcc 2940

agacagctga ccaccctggg catccagctg agcccctaca atctgagcac cctggaagat 3000

ctgaacaccc ggtggaaact gctgcaggtg gccgtggagg atagagtgag gcagctgcac 3060

gaggcccaca gagacttcgg ccctgcctcc cagcacttcc tgagcaccag cgtgcagggc 3120

ccctgggaga gagccatctc ccccaacaaa gtgccctact acatcaacca cgagacccag 3180

accacctgct gggaccaccc taagatgacc gagctgtacc agagcctggc cgacctgaac 3240

aatgtgcggt tcagcgccta cagaaccgcc atgaagctgc ggagactgca gaaggccctg 3300

tgcctggacc tgctgagcct gagcgccgcc tgcgacgccc tggaccagca caacctgaag 3360

cagaacgacc agcccatgga cattctgcag atcatcaact gcctgaccac catctacgat 3420

cggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcccc tgtgcgtgga catgtgcctg 3480

aattggctgc tgaacgtgta cgacaccggc aggaccggca gaatcagagt gctgtccttc 3540

aagaccggca tcatcagcct gtgcaaggcc cacctggagg ataagtaccg ctacctgttc 3600

aagcaggtgg ccagcagcac cggcttctgc gatcagagga gactgggcct gctgctgcac 3660

gatagcatcc agatccctag gcagctgggc gaagtggcca gctttggcgg cagcaacatc 3720

gagccctctg tgaggagctg cttccagttc gccaacaaca agcccgagat cgaggccgcc 3780

ctgttcctgg attggatgag gctggagccc cagagcatgg tgtggctgcc tgtgctgcac 3840

agagtggccg ccgccgagac cgccaagcac caggccaagt gcaacatctg caaggagtgc 3900

cccatcatcg gcttccggta caggagcctg aagcacttca actacgacat ctgccagagc 3960

tgctttttca gcggcagagt ggccaagggc cacaagatgc actaccccat ggtggagtac 4020

tgcaccccca ccacctccgg cgaggatgtg agagacttcg ccaaagtgct gaagaataag 4080

ttccggacca agcggtactt tgccaagcac cccaggatgg gctacctgcc cgtgcagacc 4140

gtgctggagg gcgacaacat ggagaccgac accatgtgat gatgagcggc cgcttccctt 4200

tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 4260

acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 4320

tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 4380

tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 4440

ggtaaaatcc gataaggact agagcatggc tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc 4500

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4560

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 4620

gtgagcgagc gagcgcgcag 4640

<210> 2

<211> 4643

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV_ITR_Spc512-犬 MD1

<400> 2