本申請要求2014年6月30日提交的美國申請?zhí)?2/019,055的權(quán)益，所述申請以引用的方式整體并入本文。

發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療、抑制或減輕衰老和年齡相關(guān)性癥狀和疾病。

2.相關(guān)技術(shù)描述

代謝和衰老密切相關(guān)。與任意進食相比，飲食限制(DR)或熱量限制(CR)一致地延長壽命并且延遲進化上各種各樣的生物體的年齡相關(guān)性疾病。營養(yǎng)限制和營養(yǎng)或能量代謝的遺傳或藥理學(xué)擾動的類似條件也具有長壽益處。已經(jīng)鑒定了若干調(diào)節(jié)衰老的化合物，所述化合物具有在很大程度上不明確的分子機制。

然而，仍然存在對于年齡相關(guān)性癥狀和年齡相關(guān)性疾病(包括癌癥、糖尿病和心血管疾病)的治療以及延長受試者的壽命的需求。

發(fā)明概述

在一些實施方案中，本發(fā)明提供治療、抑制或減輕受試者的衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的抑制NADH脫氫酶的化合物。在一些實施方案中，所述化合物是酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，所述化合物是α-酮基丁酸酯或α-酮基丁酸。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物的治療有效量低于為產(chǎn)生可觀察到的相同差異所需的α-酮基戊二酸酯量。參見Chin,等人,(2014)Nature 510:397-401和與其相關(guān)的擴展數(shù)據(jù)圖表，其以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物的治療有效量小于低于為產(chǎn)生可觀察到的相同差異所需的α-酮基戊二酸酯量的一半。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物的治療有效量是為產(chǎn)生可觀察到的相同差異所需的α-酮基戊二酸酯量的約1/16。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物的治療有效量以若干劑量在給定時間段內(nèi)，例如以每日劑量在一周或更長時間內(nèi)施用。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物以約0.01-1.0、優(yōu)選約0.01-0.5、更優(yōu)選約0.1-0.2克/千克體重/天的每日劑量施用。在一些實施方案中，向所述受試者每日施用約0.05至約2克酮基丁酸酯化合物/千克所述受試者體重持續(xù)至少一周。在一些實施方案中，所述方法包括使所述受試者的α-酮基丁酸酯水平提高約30％-60％、約45％-55％、或約50％。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性癥狀是膽固醇積聚、動脈壁硬化、血壓升高、免疫衰老、肌肉損失、骨質(zhì)流失、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、記憶喪失、聽力喪失、視力下降、皺紋增多、脫發(fā)、頭發(fā)稀疏、頭發(fā)變白、應(yīng)激抗性降低、癡呆、聽力喪失、視力喪失、活動能力喪失、肌肉強度損失、持久力喪失、虛弱、疲乏、對感染的易感性增加、皮膚干燥、皮膚起皺、睡眠模式改變、晝夜節(jié)律改變、代謝變化、生物化學(xué)變化等。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性癥狀是脫發(fā)、頭發(fā)稀疏、頭發(fā)變白、活動能力喪失、持久力喪失、疲乏、對感染的易感性增加、代謝變化或生物化學(xué)變化。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性疾病是癌癥(例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等)、神經(jīng)變性疾病(例如，帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癡呆等)、肌肉減少癥、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、心血管疾病、高血壓、白內(nèi)障、老花眼、青光眼、2型糖尿病、代謝綜合征、禿發(fā)、慢性炎癥、免疫衰老等，或年齡相關(guān)性病狀如心臟肥大、心肌病、心力衰竭或心血管疾病。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性疾病是心臟肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血再灌注損傷或阿爾茨海默病。在一些實施方案中，所述受試者的壽命相較于未治療的對照受試者延長達約10％、30％、40％、50％、60％或70％。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于酮基丁酸酯化合物，其用于治療、抑制或減輕受試者的衰老；治療、抑制或減輕受試者的年齡相關(guān)性癥狀；治療、抑制或減輕受試者的年齡相關(guān)性疾??；增加受試者的壽命；或治療、抑制或減輕受試者的心臟肥大和/或心肌梗塞。在一些實施方案中，所述酮基丁酸酯化合物是α-酮基丁酸酯或α-酮基丁酸。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性癥狀是膽固醇積聚、動脈壁硬化、血壓升高、免疫衰老、肌肉損失、骨質(zhì)流失、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、記憶喪失、聽力喪失、視力下降、皺紋增多、脫發(fā)、頭發(fā)稀疏、頭發(fā)變白、應(yīng)激抗性降低、癡呆、聽力喪失、視力喪失、活動能力喪失、肌肉強度損失、持久力喪失、虛弱、疲乏、對感染的易感性增加、皮膚干燥、皮膚起皺、睡眠模式改變、晝夜節(jié)律改變、代謝變化、生物化學(xué)變化等。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性癥狀是脫發(fā)、頭發(fā)稀疏、頭發(fā)變白、活動能力喪失、持久力喪失、疲乏、對感染的易感性增加、代謝變化或生物化學(xué)變化。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性疾病是癌癥(例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等)、神經(jīng)變性疾病(例如，帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癡呆等)、肌肉減少癥、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、心血管疾病、高血壓、白內(nèi)障、老花眼、青光眼、2型糖尿病、代謝綜合征、禿發(fā)、慢性炎癥、免疫衰老等，或年齡相關(guān)性病狀如心臟肥大、心肌病、心力衰竭或心血管疾病。在一些實施方案中，所述年齡相關(guān)性疾病是心臟肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血再灌注損傷或阿爾茨海默病。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含純化和/或濃縮量的一種或多種酮基丁酸酯化合物和藥學(xué)上可接受的載體或食品。在一些實施方案中，所述組合物中的純化或濃度水平不是在自然中天然發(fā)現(xiàn)的純化或濃度水平。在一些實施方案中，所述載體或食品未在自然中發(fā)現(xiàn)與所述一種或多種酮基丁酸酯化合物相關(guān)。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種添加有一種或多種酮基丁酸酯化合物的食品，如牛奶或橙汁。在一些實施方案中，所述組合物還包含至少一種酮基戊二酸酯化合物，如α-酮基戊二酸酯(α-酮基戊二酸酯)、α-酮基戊二酸酯的衍生物(例如，在MacKenzie,等人(2007)Mol Cell Biol 27(9):3282-3289)中列出的衍生物)、α-酮基戊二酸酯的類似物(例如，膦酸酯類似物(例如，在Bunik,等人(2005)Biochemistry 44(31):10552-61中列舉的那些)、α-酮基戊二酸酯的酯(例如，α-酮基戊二酸二甲酯和α-酮基戊二酸辛酯)以及各種物種特異性類似物，例如人α-酮基戊二酸酯、豬α-酮基戊二酸酯、鼠α-酮基戊二酸酯、牛α-酮基戊二酸酯等。在一些實施方案中，所述一種或多種酮基丁酸酯化合物和所述酮基戊二酸酯化合物的量以未在自然中發(fā)現(xiàn)的量存在。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療、抑制或減輕受試者的衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病或延長所述受試者的壽命的藥劑以及制造所述藥劑的方法，所述藥劑包含治療有效量的酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，所述化合物是α-酮基丁酸酯或α-酮基丁酸。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種或多種酮基丁酸酯化合物在制造用于治療、抑制或減輕受試者的衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病或延長所述受試者的壽命的藥劑中的用途。在一些實施方案中，所述藥劑包含治療有效量的酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，所述化合物是α-酮基丁酸酯或α-酮基丁酸。

前述一般描述和以下詳細描述均僅僅是示例性和解釋性的，并且意圖提供所要求保護的本發(fā)明的進一步解釋。附圖被包括來提供對本發(fā)明的進一步理解并且被并入本說明書中且構(gòu)成本說明書的一部分，闡明本發(fā)明的若干實施方案，并且與描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。

附圖描述

參考附圖進一步理解本發(fā)明，其中：

圖1示出相較于未處理的對照受試者的平均壽命，α-KB延長受試者的壽命。

圖2示出NADH脫氫酶(復(fù)合物I)驅(qū)動的偶聯(lián)測定(補充有蘋果酸酯和丙酮酸酯)的結(jié)果。在所述圖的ADP點與Oligo點之間和所述圖的FCCP點與AA點之間，從上到下的數(shù)據(jù)點是DMSO、50μMα-KB、100μMα-KB和200μMα-KB。

圖3A示出在復(fù)合物II驅(qū)動的偶聯(lián)測定(補充有琥珀酸酯和魚藤酮)中α-KB的結(jié)果。在所述圖的ADP點與Oligo點之間，上部數(shù)據(jù)點是DMSO且下部數(shù)據(jù)點是0.5mMα-KB。

圖3B示出在復(fù)合物II驅(qū)動的偶聯(lián)測定(補充有琥珀酸酯和魚藤酮)中辛基α-KG(α-酮戊二酸辛酯)和3-HB的結(jié)果。在所述圖的ADP點與Oligo點之間，下部數(shù)據(jù)點是0.6mM辛基α-KG且上部數(shù)據(jù)點是DMSO以及0.1mM、0.2mM、1mM、2mM和4mM的3-HB。

圖4A示出電子流測定中α-KB的結(jié)果。在所述圖的Rote點之前，上部數(shù)據(jù)點是媒介物，中間數(shù)據(jù)點是100μMα-KB，且下部數(shù)據(jù)點是500μMα-KB和250μMα-KB。在所述圖的Succ點與AA點之間，上部數(shù)據(jù)點是媒介物且下部數(shù)據(jù)點是250μMα-KB。

圖4B示出電子流測定中媒介物以及10mM、0.2mM、0.5mM、2mM和4mM 3-HB的結(jié)果。

圖5A示出α-KB對基礎(chǔ)呼吸的影響。

圖5B示出3-HB對基礎(chǔ)呼吸的影響。

圖6A示出α-KB對最大呼吸(在FCCP處理后的線粒體呼吸)的影響。

圖6B示出3-HB對最大呼吸(在FCCP處理后的線粒體呼吸)的影響。

圖7示出α-KB以劑量依賴性方式增加細胞ROS。

圖8圖A-C示出用α-KB處理的年老小鼠中不存在年齡相關(guān)性癥狀。圖A示出相較于未處理的對照小鼠，用α-KB處理的小鼠具有改善的毛發(fā)密度(或減少的毛發(fā)損失)。圖B示出相較于未處理的對照小鼠，α-KB處理的小鼠不具有白內(nèi)障且展示減少的頭發(fā)變白。圖C示出相較于未處理的對照，α-KB處理的小鼠具有健康肝臟(顏色、大小、脂肪含量)。

圖9A-9C示出α-KB的缺血后施用減小心肌梗塞大小。**P<0.01，n＝約5-6個小鼠/組。

圖9A示出實驗示意圖。將LAD在雄性小鼠中閉塞30分鐘，接著24小時再灌注。在再灌注開始時，經(jīng)由尾靜脈施加α-KB或PBS的一次推注。

圖9B示出危險區(qū)(AAR)除以LV的百分比。

圖9C示出梗塞大小(IS)除以AAR。

圖10左圖示出2-KB的缺血后施用在缺血后恢復(fù)心臟功能。使分離的心臟經(jīng)受30分鐘缺血，接著用對照緩沖液、2-KB、(R)-2-羥基丁酸酯、(R)-3-羥基丁酸酯(還稱為酮體)、α-KG和復(fù)合物I抑制劑魚藤酮再灌注60分鐘。LVDP被示出為時間的函數(shù)。

圖10右圖示出在再灌注之前由用所指示的化合物處理產(chǎn)生的梗塞大小。所述圖片是反轉(zhuǎn)色圖像以獲得更好再現(xiàn)性。

圖11示出相較于媒介物處理的蠕蟲，α-KB延遲秀麗隱桿線蟲的麻痹。

圖12A示出α-KB以劑量依賴性方式抑制或減輕HCV感染。巴特勒(Butler)，α-KB。

圖12B示出通過α-KB抑制HCV感染不是細胞毒性的結(jié)果。巴特勒，α-KB。

圖13示出α-KB抑制丙酮酸脫氫酶且由此降低ETC復(fù)合物I活性。在所述圖中，在媒介物之后，第一條是50μM、200μM和800μM。

圖14示出α-KB直接抑制ETC復(fù)合物I心肌黃酶(NADH：受體氧化還原酶。在所述圖中，在媒介物之后，第一條是200μm且第二條是800μm。

圖15A示出α-KB不會進一步增加長壽nuo-6(qm200)突變秀麗隱桿線蟲株系的壽命。

圖15B示出α-KB增加甚至更長壽daf-2(e1370)突變秀麗隱桿線蟲株系的壽命。

圖15C示出α-KB增加長壽eat-2(ad1116)突變秀麗隱桿線蟲株系的壽命。

發(fā)明詳述

使用衰老的模型生物體秀麗隱桿線蟲篩選若干小分子，以鑒定促進長壽且抵抗衰老和年齡相關(guān)性疾病的化合物。如本文所公開，相較于α-酮基戊二酸酯(α-KG)，一種分子α-酮基丁酸酯(α-KB)出人意料地以顯著更低量延長了秀麗隱桿線蟲的平均壽命。

α-KB是參與氨基酸分解代謝和琥珀?；鵆oA合成的酮酸。使用分離的線粒體偶聯(lián)測定和電子流測定，據(jù)發(fā)現(xiàn)α-KB通過抑制NADH脫氫酶(電子傳遞鏈的復(fù)合物I)而在體內(nèi)接合不同分子靶標(biāo)。與α-KG不同，α-KB不抑制ATP合酶或TOR(雷帕霉素的靶標(biāo))。還發(fā)現(xiàn)NADH脫氫酶的遺傳突變(例如，敲低)和藥理學(xué)擾動均延長秀麗隱桿線蟲的壽命。此外，據(jù)發(fā)現(xiàn)α-KB抑制細胞呼吸且誘導(dǎo)活性氧種類(ROS)。

因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及治療、抑制或減輕受試者的衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用至少一種酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及增加受試者的壽命的方法，所述方法包括向所述受試者施用至少一種酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療、抑制或減輕受試者的衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病的組合物，所述組合物包含至少一種酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于增加受試者的壽命的組合物，所述組合物包含至少一種酮基丁酸酯化合物。在一些實施方案中，所述受試者是動物，其可以是或可以不是衰老、年齡相關(guān)性癥狀和/或年齡相關(guān)性疾病的動物模型。在一些實施方案中，所述受試者是線蟲、嚙齒類動物或非人靈長類動物。在一些實施方案中，所述受試者是人。

如本文所述，“年齡相關(guān)性癥狀”是指由衰老引起的生物和/或身體癥狀并且包括膽固醇積聚、動脈壁硬化、血壓升高、免疫衰老、肌肉損失、骨質(zhì)流失、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、記憶喪失、聽力喪失、視力下降、皺紋增多、脫發(fā)、頭發(fā)稀疏、頭發(fā)變白、應(yīng)激抗性降低、癡呆、聽力喪失、視力喪失、活動能力喪失、肌肉強度損失、持久力喪失、虛弱、疲乏、對感染的易感性增加、皮膚干燥、皮膚起皺、睡眠模式改變、晝夜節(jié)律改變、代謝變化、生物化學(xué)變化等。代謝和/或生物化學(xué)變化可通過本領(lǐng)域中已知的各種生物標(biāo)志物來證明。在一些實施方案中，年齡相關(guān)性癥狀是指指示老齡(aging)的未治療對照受試者的生物標(biāo)志物的增加。在一些實施方案中，年齡相關(guān)性癥狀是指指示年老(aged)的未治療對照受試者的生物標(biāo)志物的增加。在一些實施方案中，年齡相關(guān)性癥狀是指指示老齡的未治療對照受試者的生物標(biāo)志物概況。在一些實施方案中，年齡相關(guān)性癥狀是指指示年老的未治療對照受試者的生物標(biāo)志物概況。指示老齡的受試者和/或年老的受試者的生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物概況包括心房利鈉因子(ANF)、B型利鈉肽(BNP)以及如US20080124752中列舉的那些，所述專利以引用的方式整體并入本文。

如本文所用，“老齡”的受試者是指當(dāng)未治療的對照受試者開始在身體上、精神上和/或生物學(xué)上惡化時的生命周期內(nèi)的受試者。在一些實施方案中，老齡的受試者是實足年齡至少處于未治療的對照受試者的平均壽命的中值點的受試者。

如本文所用，“年老的”受試者是實足年齡為未治療的對照受試者的平均預(yù)期壽命的至少三分之二的受試者。例如，如果實驗室小鼠的給定株系的平均預(yù)期壽命是2年，則所述株系的年老的小鼠是至少16個月齡，并且如果實驗室小鼠的另一株系的平均預(yù)期壽命是3年，則所述株系的年老的小鼠是24個月齡。對于人，如果人的平均預(yù)期壽命是約80歲，則年老的人是約53歲。應(yīng)注意，老齡的受試者可以是或可以不是年老的受試者。

如本文所用，“年齡相關(guān)性疾病”是指通常與衰老相關(guān)的疾病和病癥并且包括癌癥(例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等)、神經(jīng)變性疾病(例如，帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癡呆等)、肌肉減少癥、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、心血管疾病、高血壓、白內(nèi)障、老花眼、青光眼、2型糖尿病、代謝綜合征、禿發(fā)、慢性炎癥、免疫衰老等。如本文所用，“年齡相關(guān)性心臟病”是指心臟肥大、心肌病、心力衰竭和心血管疾病。

在一些實施方案中，本發(fā)明的治療、抑制或減輕受試者的“衰老”的方法和組合物是與未治療的對照受試者相比，治療、抑制或減輕年齡相關(guān)性癥狀的方法和組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明的治療、抑制或減輕受試者的“衰老”的方法和組合物是與未治療的對照受試者相比和/或與治療之前受試者的基線相比，產(chǎn)生受試者的年齡相關(guān)性疾病的臨床癥狀的臨床改善的方法和組合物。在一些實施方案中，治療、抑制或減輕受試者的“衰老”的方法和組合物是產(chǎn)生具有為在年齡上比所治療受試者年輕的未治療對照受試者的特點的生物年齡和/或代謝年齡的受試者的方法和組合物。在一些實施方案中，治療、抑制或減輕受試者的“衰老”的方法和組合物是相較于在治療之前受試者的生物年齡和/或代謝年齡，產(chǎn)生所述受試者的生物年齡和/或代謝年齡的降低的方法和組合物。用于測量受試者的生物年齡和/或代謝年齡并且與受試者的實足年齡比較的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見例如，US 7,273,453和US 20080124752，其以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，增加受試者的“壽命”的方法和組合物是產(chǎn)生具有的壽命長于未治療對照受試者的平均壽命的受試者的方法和組合物。

如本文所用，“酮基丁酸酯化合物”包括α-酮基丁酸酯、α-酮基丁酸以及具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物：

其中

Ra是負電荷、H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、直鏈或支鏈C1–C4烷基、直鏈或支鏈C1–C5烷基、直鏈或支鏈C1–C10烷基、–CH₂＝CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烯基、直鏈或支鏈C1–C4烯基、直鏈或支鏈C1–C5烯基或直鏈或支鏈C1–C10烯基，

Rb是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、直鏈或支鏈C1–C4烷基、直鏈或支鏈C1–C5烷基、直鏈或支鏈C1–C10烷基、–CH₂＝CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烯基、直鏈或支鏈C1–C4烯基、直鏈或支鏈C1–C5烯基或直鏈或支鏈C1–C10烯基，

Rc任選地存在，并且如果存在，Rc是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、直鏈或支鏈C1–C4烷基、直鏈或支鏈C1–C5烷基、直鏈或支鏈C1–C10烷基、–CH₂＝CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烯基、直鏈或支鏈C1–C4烯基、直鏈或支鏈C1–C5烯基或直鏈或支鏈C1–C10烯基，并且如果存在，Z是雙鍵，

以及其藥學(xué)上可接受的溶劑化物、鹽、前藥和代謝物。

在一些實施方案中，Ra是負電荷、H或–CH₃。在一些實施方案中，Rb是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、–CH₂＝CH₃或直鏈或支鏈C1–C3烯基。在一些實施方案中，Z是雙鍵。在一些實施方案中，Ra是負電荷、H或–CH₃，并且Rb是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、直鏈或支鏈C1–C4烷基、直鏈或支鏈C1–C5烷基、直鏈或支鏈C1–C10烷基、–CH₂＝CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烯基、直鏈或支鏈C1–C4烯基、直鏈或支鏈C1–C5烯基或直鏈或支鏈C1–C10烯基。在一些實施方案中，Ra是負電荷、H或–CH₃，并且Rb是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、–CH₂＝CH₃或直鏈或支鏈C1–C3烯基。在一些實施方案中，Ra是負電荷、H或–CH₃，Rb是H、–CH₃、–CH₂–CH₃、直鏈或支鏈C1–C3烷基、–CH₂＝CH₃或直鏈或支鏈C1–C3烯基，并且Z是雙鍵。

如本文所用，“C1–Cn烷基”是指具有1-n個碳原子的烷基，其中“n”是正整數(shù)。類似地，“C1–Cn烯基”是指具有1-n個碳原子的烯基，其中“n”是正整數(shù)。如針對式I所示的烷基和烯基可被一個或多個合適的官能團取代或未被取代，所述官能團可提高或降低、但不完全消除所述化合物抑制或降低NADH脫氫酶的活性的能力。

如本文所用，縮寫“KB”可用于指術(shù)語“酮基丁酸酯”，例如α-酮基丁酸酯被縮寫為α-KB。酮基丁酸酯化合物還包括各種物種特異性類似物。例如，除非明確指定為特定物種，否則“α-KB”包括人α-酮基丁酸酯、豬α-酮基丁酸酯、鼠α-酮基丁酸酯、牛α-酮基丁酸酯等。

“藥學(xué)上可接受的溶劑化物”是指指定化合物的溶劑化物形式，其保留此類化合物的生物有效性。溶劑化物的實例包括本發(fā)明的化合物與水、異丙醇、乙醇、甲醇、二甲亞砜、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺或丙酮的組合。有機化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，許多有機化合物可與溶劑形成復(fù)合物，在所述溶劑中它們進行反應(yīng)或者從中沉淀或結(jié)晶。這些復(fù)合物被稱為“溶劑化物”。例如，與水的復(fù)合物被稱為“水合物”。式I化合物的溶劑化物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。有機化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解，許多有機化合物可以多于一種結(jié)晶形式存在。例如，結(jié)晶形式可因溶劑化物而異。因此，式I化合物的所有結(jié)晶形式或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指藥理學(xué)上可接受的并且對用本發(fā)明的化合物治療的受試者基本上無毒的鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括由合適的無毒有機或無機酸或無機堿形成的常規(guī)酸加成鹽或堿加成鹽。示例性酸加成鹽包括由無機酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸獲得的鹽，以及由有機酸如對甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷-二磺酸、羥乙磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、苯基乙酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、谷氨酸、水楊酸、對氨基苯磺酸和富馬酸獲得的鹽。示例性堿加成鹽包括衍生自氫氧化銨(例如，氫氧化季銨如四甲基氫氧化銨)的鹽、衍生自無機堿如堿金屬或堿土金屬(例如，鈉、鉀、鋰、鈣或鎂)氫氧化物的鹽、以及衍生自無毒有機堿如堿性氨基酸的鹽。

“藥學(xué)上可接受的前藥”是可在生理條件下或通過溶劑分解轉(zhuǎn)化成指定化合物或此種化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的化合物?！八帉W(xué)活性代謝物”是指通過指定化合物在體內(nèi)代謝而產(chǎn)生的藥理學(xué)活性產(chǎn)物或其鹽?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)來鑒定化合物的前藥和活性代謝物。參見例如，Bertolini,G.等人,(1997)J.Med.Chem.40:2011-2016；Shan,D.等人,J.Pharm.Sci.,86(7):765-767；Bagshawe K.,(1995)Drug Dev.Res.34:220-230；Bodor,N.,(1984)Advances in Drug Res.13:224-331；Bundgaard,H.,Design of Prodrugs(Elsevier Press,1985)以及Larsen,I.K.,Design and Application of Prodrugs,Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen等人,編,Harwood Academic Publishers,1991)。

在一些實施方案中，施用至受試者的酮基丁酸酯化合物的量是治療有效量。“治療有效量”是指與對照相比，當(dāng)施用至受試者時，(i)治療或抑制特定疾病、病狀或病癥，(ii)減弱、改善或消除所述特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀，和/或(iii)抑制或延遲所述特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)作的本發(fā)明的一種或多種化合物的量。本發(fā)明的一種或多種化合物的治療有效量將取決于如給定化合物、藥物制劑、施用途徑、疾病或病癥的類型、疾病或病癥的程度以及所治療的受試者的特性的因素而變化，但仍然可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的“治療有效量”是治療、抑制或減輕受試者的衰老的量。在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的“治療有效量”是治療、抑制或減輕受試者的一種或多種年齡相關(guān)性癥狀的量。在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的“治療有效量”是治療、抑制或減輕受試者的一種或多種年齡相關(guān)性疾病的量。在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的“治療有效量”是增加受試者的壽命的量。

在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的治療有效量以約0.01-2、約0.25-2、約0.5-2、約1-2或約2克/千克受試者體重/天的每日劑量施用。如本文所公開，在治療、抑制或減輕衰老和年齡相關(guān)性癥狀方面，α-KB的功效比α-KG高約1倍。因此，在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物的治療有效量以約0.1-1、約0.25-1、約0.5-1或約1克/千克受試者體重/天的每日劑量施用。在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物以約0.01-1.0、約0.01-0.5或約0.1-0.2克/千克受試者體重/天的每日劑量施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量，所述因素包括但不限于，疾病或病癥的嚴重程度、先前治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡以及存在的其他疾病。在一些實施方案中，施用至受試者的一種或多種酮基丁酸酯化合物的量是產(chǎn)生受試者中的α-KB水平的約10％-50％、約20％-50％、約30％-50％或約40％-50％增加的量。在一些實施方案中，施用至受試者的一種或多種酮基丁酸酯化合物的量是產(chǎn)生受試者中的α-KB水平的約25％增加的量。在一些實施方案中，施用至受試者的一種或多種酮基丁酸酯化合物的量是產(chǎn)生受試者中的α-KB水平的約50％增加的量。

治療有效量可以單一劑量或多個劑量在一定時間段內(nèi)施用。例如，可用一種或多種酮基丁酸酯化合物治療受試者至少一次。然而，對于給定治療期，可用一種或多種酮基丁酸酯化合物治療所述受試者約每周一次至約每日一次。治療期的長度將取決于多種因素，如疾病或病癥的嚴重程度、本發(fā)明的一種或多種化合物的濃度和活性或其組合。還應(yīng)了解用于治療的一種或多種化合物的有效劑量可在特定治療過程內(nèi)提高或降低。

待施用至受試者的一種或多種酮基丁酸酯化合物可提供為藥物制劑。藥物制劑可以適用于所需施用模式的單位劑型制備。本發(fā)明的藥物制劑可通過任何合適的途徑施用，所述途徑包括口服、直腸、鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道和胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))施用。應(yīng)了解，施用途徑可隨受體的狀況和年齡、待治療的病狀的性質(zhì)以及本發(fā)明的給定化合物而變化。在一些實施方案中，施用途徑是口服。在一些實施方案中，一種或多種酮基丁酸酯化合物以食品形式提供。

應(yīng)了解，在藥物制劑中使用的酮基丁酸酯化合物的實際劑量將根據(jù)所使用的特定化合物、所配制的特定組合物、施用模式以及所治療的特定部位、受試者和疾病而變化。鑒于給定化合物的實驗數(shù)據(jù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用劑量確定測試來確定針對一組給定條件的最佳劑量?？梢耘c完全活性形式的重量水平化學(xué)上等效的重量水平給予前藥的施用。

本發(fā)明的藥物制劑包含治療有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物和惰性的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。如本文所用，詞語“藥學(xué)上可接受的載體”意圖包括與藥物施用相容的任何以及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑以及吸收延緩劑等。所采用的藥物載體可以是固體或液體。固體載體的實例包括乳糖、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。液體載體的實例是糖漿、花生油、橄欖油、水等。類似地，載體或稀釋劑可包括本領(lǐng)域中已知的延時或定時釋放物質(zhì)，如單獨或與蠟一起的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯等。所述介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中已知的。

在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏?，可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序確定酮基丁酸酯化合物的毒性和治療功效，例如，用于測定LD₅₀(群體的50％致死劑量)和ED₅₀(群體的50％治療有效劑量)。在毒性作用與治療作用之間的劑量比是治療指數(shù)，且其可表示為比率LD₅₀/ED₅₀。優(yōu)選表現(xiàn)出大治療指數(shù)的化合物。雖然可使用表現(xiàn)毒性副作用的化合物，但應(yīng)小心設(shè)計以使所述化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)，以便使對未受感染的細胞的潛在損害減到最小，并由此降低副作用。

可在配制用于人的劑量范圍中使用由細胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)。所述化合物的劑量優(yōu)選處于包括ED₅₀的具有極小或無毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可取決于所采用的劑型和所利用的施用途徑而在這個范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，治療有效劑量最初可由細胞培養(yǎng)測定來估計?？稍趧游锬Ｐ椭信渲苿┝?，以達到包括如在細胞培養(yǎng)物中測定的IC₅₀(即，測試化合物的實現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。所述信息可用于更準(zhǔn)確地測定人中的有用劑量。血漿水平可例如通過高效液相色譜法來測量。

以下實施例意圖說明而不限制本發(fā)明。

實施例

α-KB延長秀麗隱桿線蟲成蟲的平均和最大壽命

為了顯示α-KB延長壽命延長，進行以下實驗。通過進行定時產(chǎn)卵或卵制備(在70μl M9緩沖液、25μl漂白劑和5μl 10N NaOH中混合<100妊娠蠕蟲)來使秀麗隱桿線蟲同步。一旦蠕蟲達到成蟲期，就將它們挑取到含有1.5％二甲亞砜(DMSO；Sigma D8418)、49.5μM 5-氟-2'-脫氧尿苷(FUDR，Sigma F0503)、50μg/ml氨芐西林和α-KB(Sigma K401)的NGM處理板上。通過添加NaOH將含有α-KB的板調(diào)整至pH 6.0(即，相同pH作為對照板)。將處理板接種OP50大腸桿菌作為秀麗隱桿線蟲食物來源。為了評估蠕蟲的存活，每2-3天用鉑絲戳所述動物，且未能反應(yīng)的那些動物被評分為死亡。將蠕蟲每4天移動至新的板。在20℃下進行所有壽命實驗。

圖1示出相較于未處理的對照受試者的平均壽命，α-KB延長受試者的壽命。

α-KB特異性地抑制NADH脫氫酶

為了顯示α-KB抑制NADH脫氫酶，進行以下實驗。在批準(zhǔn)的UCLA動物研究方案下進行動物研究。從3月齡C57BL/6小鼠分離線粒體。簡言之，取出肝，在4℃下在MSHE+BSA(70mM蔗糖、210mM甘露醇、5mM HEPES、1mM EGTA以及無BSA的0.5％脂肪酸，pH 7.2)中切碎，并且沖洗若干次以除去血液。在冰上或在4℃下進行所有隨后步驟。用玻璃杜恩斯(Dounce)勻漿器(5-6沖程)在10體積的MSHE+BSA中破壞組織，并且在800x g下離心勻漿10分鐘以除去組織碎片和核。將上清液通過細胞濾網(wǎng)傾析且在8,000x g下離心10分鐘。將深色線粒體沉淀重新懸浮于MSHE+BSA中且在8,000x g下再次離心10分鐘。將最終線粒體沉淀重新懸浮于30μl的MAS緩沖液(70mM蔗糖、220mM甘露醇、10mM KH₂PO₄、5mM MgCl₂、2mM HEPES、1mM EGTA以及無BSA的0.2％脂肪酸，pH 7.2)中。通過進行如所描述的偶聯(lián)測定和電子流測定來測量分離的線粒體呼吸。

對于偶聯(lián)測定，在4℃下將17μg的在完全MAS緩沖液(補充有10mM琥珀酸酯和2μM魚藤酮或補充有10mM丙酮酸鈉和2mM蘋果酸酯的MAS緩沖液)中的線粒體通過在2,000g下離心20分鐘來接種到XF24Seahorse板中。就在測定之前，將線粒體補充完全MAS緩沖液以達到總計500μl(具有1％DMSO或α-KB)，并且在37℃下溫?zé)?0分鐘，之后開始OCR測量。線粒體呼吸以偶聯(lián)狀態(tài)2開始；通過2mM ADP起始狀態(tài)3；通過2.5μM寡霉素誘導(dǎo)狀態(tài)4o(寡霉素不敏感的，即不依賴復(fù)合物V的)；并且通過4μM FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙，ab120081，Abcam)誘導(dǎo)狀態(tài)3u(FCCP-未偶聯(lián)的最大呼吸量)。最后，在測定結(jié)束時注射1.5μg mL抗霉素A。

對于電子流測定，將MAS緩沖液補充10mM丙酮酸鈉(復(fù)合物I底物)、2mM蘋果酸酯(復(fù)合物II抑制劑)和4μM FCCP，并且以如針對偶聯(lián)測定所描述的相同方式接種線粒體。在基礎(chǔ)讀數(shù)之后，相繼注射如下：2μM魚藤酮(復(fù)合物I抑制劑)、10mM琥珀酸酯(復(fù)合物II底物)、4μM抗霉素A(復(fù)合物III抑制劑)以及10mM/100μM抗壞血酸酯/四甲基苯二胺(復(fù)合物IV底物)。

結(jié)果表明當(dāng)通過NADH脫氫酶底物(丙酮酸酯和蘋果酸酯)驅(qū)動呼吸時，α-KB僅抑制狀態(tài)3和狀態(tài)3u呼吸。一致地，在電子流測定中α-KB僅抑制NADH脫氫酶活性。

為了研究α-KB對線粒體呼吸的作用，使用分離的線粒體進行了偶聯(lián)測定和電子流測定。如先前所描述從小鼠肝臟分離線粒體。將最終線粒體沉淀重新懸浮于30μl的MAS緩沖液(70mM蔗糖、220mM甘露醇、10mM KH₂PO₄、5mM MgCl₂、2mM HEPES、1mM EGTA以及無BSA的0.2％脂肪酸，pH 7.2)中。

通過進行偶聯(lián)測定和電子流測定來測量線粒體呼吸。對于偶聯(lián)測定，在4℃下將20μg的在完全MAS緩沖液(補充有10mM琥珀酸酯和2μM魚藤酮或10mM丙酮酸酯和2mM蘋果酸酯的MAS緩沖液)中的線粒體通過在2,000g下離心20分鐘來接種到XF24Seahorse板中。就在測定之前，將線粒體補充完全MAS緩沖液以達到總計500μl(具有1％DMSO或α-KB)，并且在37℃下溫?zé)?0分鐘，之后開始OCR測量。線粒體呼吸以偶聯(lián)狀態(tài)2開始；通過2mM ADP起始狀態(tài)3；通過2.5μM寡霉素誘導(dǎo)狀態(tài)4o(寡霉素不敏感的，即不依賴復(fù)合物V的)；并且通過4μM FCCP誘導(dǎo)狀態(tài)3u(FCCP-未偶聯(lián)的最大呼吸量)。最后，在測定結(jié)束時注射1.5μg/mL抗霉素A。

對于電子流測定，將MAS緩沖液補充10mM丙酮酸鈉(復(fù)合物I底物)、2mM蘋果酸酯(復(fù)合物II抑制劑)和4μM FCCP，并且以如針對偶聯(lián)測定所描述的相同方式接種線粒體。在基礎(chǔ)讀數(shù)之后，相繼注射如下：2μM魚藤酮(復(fù)合物I抑制劑)、10mM琥珀酸酯(復(fù)合物II底物)、4μM抗霉素A(復(fù)合物III抑制劑)以及10mM/100μM抗壞血酸酯/四甲基苯二胺(復(fù)合物IV底物)。

發(fā)現(xiàn)

當(dāng)通過NADH脫氫酶(補充有NADH脫氫酶底物丙酮酸酯和蘋果酸酯)驅(qū)動呼吸時，在α-KB處理后存在ADP誘導(dǎo)的和FCCP誘導(dǎo)的呼吸的顯著減少；當(dāng)補充復(fù)合物II底物(琥珀酸酯)時，α-KB對線粒體呼吸不存在影響。這些結(jié)果有力地表明NADH脫氫酶受α-KB特異性地抑制。這一假設(shè)通過電子流測定進一步證實，其中僅NADH脫氫酶相關(guān)的呼吸受α-KB處理抑制。類似的內(nèi)源性代謝物(R)-3-羥基丁酸酯(3-HB)不影響復(fù)合物II驅(qū)動的偶聯(lián)或電子流中的任何步驟，從而進一步表明α-KB在抑制NADH脫氫酶中的特異性。

圖2示出NADH脫氫酶(復(fù)合物I)驅(qū)動的偶聯(lián)測定(補充有蘋果酸酯和丙酮酸酯)的結(jié)果。復(fù)合物II驅(qū)動的偶聯(lián)測定(補充有琥珀酸酯和魚藤酮)的結(jié)果在圖3A(α-KB)和圖3B(3-HB)中示出。電子流測定的結(jié)果在圖4A(α-KB)和圖4B(3-HB)中示出。

α-KB影響人細胞中的線粒體生物能學(xué)

不僅分離的線粒體模型中而且細胞模型中的α-KB均影響線粒體生物能學(xué)。據(jù)發(fā)現(xiàn)α-KB抑制細胞呼吸。此外，α-KB提高細胞ROS水平。這些表型類似于魚藤酮的作用，魚藤酮是NADH脫氫酶的已知抑制劑。這些結(jié)果一起表明α-KB可能通過抑制NADH脫氫酶而影響線粒體。

耗氧速率(OCR)的測量。使用Seahorse XF-24分析儀(Seahorse Bioscience)進行OCR測量。將C2C12細胞在Seahorse XF-24細胞培養(yǎng)微板中以30,000個細胞/孔接種于補充有10％FBS和10mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并且在37℃和5％CO₂下孵育過夜。用α-KB或DMSO(媒介物對照)處理1小時。就在測量之前在未緩沖的DMEM培養(yǎng)基(pH 7.4，10mM葡萄糖)中洗滌細胞，并且在此緩沖液中維持所指示的α-KB濃度。在基礎(chǔ)條件下測量OCR三次并且根據(jù)每孔的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

在α-KB處理后，類似于魚藤酮處理，基礎(chǔ)呼吸(圖5A)和最大呼吸(在FCCP處理之后的線粒體呼吸)(圖6A)均受到抑制。如圖5B和6B中所示，3-HB再次不在此測定中具有任何影響。

ROS的測量。將C2C12細胞以250,000個細胞/mL的密度接種于96孔板中。在藥物處理3小時后，使用2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)測量活性氧種類(ROS)。

如圖7中所示，與魚藤酮類似，α-KB增加細胞ROS。這進一步支持α-KB抑制NADH脫氫酶的假設(shè)。

α-KB挽救小鼠模型中的心臟肥大和心力衰竭

與UCLA的Jake Lusis、Meisheng Jiang和Yibin Wang合作，使用細胞和動物模型，據(jù)發(fā)現(xiàn)α-KB表現(xiàn)出針對由異丙腎上腺素和橫間主動脈縮窄(TAC)誘導(dǎo)的心臟肥大的有希望的活性。例如，向C57BL/6小鼠施用α-KB挽救TAC誘導(dǎo)的心臟肥大心力衰竭。在用媒介物或α-KB處理之前一天進行外科手術(shù)。通過經(jīng)由回聲測定心臟射血分數(shù)(EF)在處理后3周評估心輸出量。與媒介物處理的小鼠(0.218±0.014)相比，EF在α-KB處理的小鼠中降低(0.168±0.023)，P<0.05。

在另外的實驗中，通過膠原酶消化分離新生大鼠的心肌細胞并且在含有10％FCS的DMEM中培養(yǎng)過夜，且然后將培養(yǎng)基更換為補充有ITS(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉)的無血清高葡萄糖DMEM。

兒茶酚胺誘導(dǎo)的心臟肥大。通過用1mM異丙腎上腺素(ISO)或苯腎上腺素(PE)處理心肌細胞48小時來誘導(dǎo)所述細胞的肥大。α-KB(1mM)完全消除ISO和PE誘導(dǎo)的肥大，以及抑制所誘導(dǎo)的ANF和BNP的過度表達，所述ANF和BNP是肥大相關(guān)標(biāo)志物。

小鼠中的橫間主動脈縮窄(TAC)用于誘導(dǎo)壓力超負荷誘導(dǎo)的心力衰竭和心臟肥大。在用媒介物或α-KB處理之前一天進行TAC外科手術(shù)。將C57BL/6雄性小鼠用飲用水中的30mg/kg體重/天的α-KB處理。通過測定經(jīng)由回聲測量的心臟射血分數(shù)(EF)在處理后3周評估心輸出量。

在TAC手術(shù)之后三周對照小鼠的EF是0.218±0.014(n＝8，包括在先前實驗中測試的5只)，且α-KB處理的動物的EF是0.268±0.023(n＝7)(平均值，SEM)，P<0.05。在實驗結(jié)束時(5周)，心臟(mg)/體重(g)比率對于對照組是13.23±1.0(n＝2)，且對于α-KB處理組是10.72±1.98(n＝6)(平均值，STEDV)，P＝0.147。因此，α-KB顯著增強TAC誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中的心輸出量，并且似乎還降低這些小鼠的死亡率。

α-KB逆轉(zhuǎn)年老小鼠中的年齡相關(guān)性癥狀

向包括雄性和雌性的老齡小鼠(22-23月大的C57BL/6J)供給水或α-KB(在飲用水中8mM或90mg/kg體重)持續(xù)7個月。在研究期期間，在處理的動物中未觀察到α-KB的副作用。相較于未處理的對照動物，Α-KB處理的小鼠在測試期期間表現(xiàn)出正常行為和身體活動。針對不健康的病征至少一周兩次檢查小鼠，并且使病重或不動的小鼠終止。α-KB處理的雄性組的壽命被延長。未處理對照組中的所有雄性(5只中的5只)在完成7個月測試之前死亡或由于嚴重疾病而終止。顯著地，α-KB處理組中的大多數(shù)雄性(5只中的4只)健康地活著，并且在7個月研究期結(jié)束時仍然非常健康。

雖然處理組和未處理組中雌性的壽命不可辨別，但用α-KB處理的雌性小鼠在所述動物接受α-KB處理之后約2至約3個月開始表現(xiàn)出改善的毛發(fā)和皮毛外觀(圖8，圖A示出在處理后7個月時的雌性小鼠)。處理的雌性組中的毛發(fā)密度高于未處理對照中的毛發(fā)密度(圖8，圖A)。α-KB處理組中的灰白毛發(fā)相較于未處理組減少(圖8，圖B)。對于處理的雄性組，對灰白毛發(fā)和毛發(fā)密度的影響似乎是最小的。α-KB處理還極大改善肝外觀。在老齡未處理的動物中，肝喪失其特征性微紅色顏色并且呈現(xiàn)微黃色色調(diào)。來自雄性和雌性經(jīng)處理動物的肝表現(xiàn)出微紅色的健康外觀而無任何微黃色色調(diào)(圖8，圖C)?？傊@些結(jié)果表明α-KB具有抗衰老特性以延遲或甚至逆轉(zhuǎn)哺乳動物的衰老過程。

α-KB用于減輕缺血再灌注損傷和心肌梗死

為了檢查α-KB的心臟保護作用，使用缺血再灌注損傷的體內(nèi)模型。在雄性小鼠中使左冠狀動脈閉塞30分鐘，隨后24小時再灌注。在再灌注開始時通過尾靜脈施加PBS(媒介物對照)或α-KB(800μM)的一次單次推注(圖9A)。危險區(qū)(AAR)與左心室比率在兩組中是類似的，在α-KB中64.1±2.3(n＝6)對比在對照處理中56.8±3.3(n＝5)，從而指示所述兩組經(jīng)受可比較程度的缺血性風(fēng)險(圖9B)。然而，相較于對照，α-KB組中的梗塞大小顯著更??；梗塞大小與AAR的比率在α-KB中是31.2±3.6(n＝6)對比在對照中44.5±3.0(n＝5)，P＝0.02(圖9C)。圖10示出在再灌注之前由處理產(chǎn)生的梗塞大小。

α-KB延遲秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默氏病模型中的麻痹

為了顯示α-KB延遲秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默氏病模型中的麻痹，使用由澳大利亞墨爾本大學(xué)的Gawain McColl開發(fā)的GMC101秀麗隱桿線蟲株系，其在體壁肌肉細胞中表達全長人淀粉樣蛋白-β1-42蛋白，從而導(dǎo)致完全滲透的年齡進行性麻痹。通過用約100個妊娠蠕蟲進行定時產(chǎn)卵持續(xù)3小時且將卵置于20℃孵育箱中來使蠕蟲年齡同步。一旦所述卵在產(chǎn)卵后42小時發(fā)育至L4階段，就將它們挑取到含有49.5μM用于防止后代產(chǎn)生的5-氟-2'-脫氧尿苷(FUDR，Sigma F0503)和4mMα-KB或媒介物(水)對照的的NGM處理板上。然后將蠕蟲轉(zhuǎn)換至30℃以誘導(dǎo)淀粉樣蛋白-β聚集和麻痹。在第二天處理開始針對麻痹通過在用鉑絲輕戳之后進行全身彎曲和顯著向前和向后移動的失敗每日評估蠕蟲。大多數(shù)麻痹的蠕蟲仍然能夠移動它們的頭部和其身體的一部分。在第4天將所有蠕蟲轉(zhuǎn)移至新鮮處理板。如圖11中所示，相較于媒介物處理的蠕蟲，4mMα-KB使麻痹延遲達37％。

α-KB幫助減輕HCV感染

隨著受試者衰老，其對感染的易感性增加。因此，為了確定α-KB是否減輕對年齡相關(guān)性感染的易感性，使Huh7.5細胞感染海腎報道體HCV 5小時且隨后用1mM和1μM的α-KB處理。在處理后72小時，將細胞溶解且測量熒光素酶活性。JG-98(其是病毒組裝的抑制因子)用作陽性對照且水用作陰性對照。如圖12A中所示，α-KB抑制或減輕病毒感染。為了確認α-KB的抗病毒活性不是細胞毒性的結(jié)果，將Huh7.5細胞用1mM、100μM、10μM、1μM和100nMα-KB處理。在處理后每24小時進行MTT測定直到72小時。木犀草素(一種為細胞毒性的抗癌化合物)用作陽性對照且水用作陰性對照。如圖12B中所示，α-KB不是細胞毒性的。

α-KB抑制丙酮酸脫氫酶，從而導(dǎo)致降低的ETC復(fù)合物I活性

為了檢查α-KB對丙酮酸脫氫酶的影響，使用丙酮酸脫氫酶(PDH)酶活性微板測定試劑盒(Abcam，ab109902)。根據(jù)所提供的方案進行所述測定。將去污劑添加至牛心臟線粒體溶解產(chǎn)物(Abcam，ab110338)且隨后在4℃下孵育20分鐘以釋放PDH。然后將樣品在14,000x g下離心10分鐘。將上清液用孵育緩沖液稀釋且添加至PDH抗體涂覆的96孔板。在3小時孵育接著用穩(wěn)定劑緩沖液2X洗滌之后，將所述孔添加200μL的含有10、20、50、200和800μMα-KB的反應(yīng)混合物或媒介物對照(蒸餾水)。一式三份地進行每種條件。取得在450nm下1分鐘時間間隔的吸光度的動力學(xué)測量值，并且從吸光度與時間的斜率計算PDH活性。將讀數(shù)針對媒介物平均值(為100％)標(biāo)準(zhǔn)化。如圖13中所示，200和800μMα-KB處理的孔的標(biāo)準(zhǔn)化活性(百分比)顯著低于對照：媒介物(水)，100±14.9；200μMα-KB，68.0±11.8，P＝0.0408；800μMα-KB，41.6±7.89，P＝0.004。

α-KB直接抑制ETC復(fù)合物I心肌黃酶(NADH：受體氧化還原酶)

為了評估α-KB是否能夠影響復(fù)合物I的心肌黃酶(NADH：受體氧化還原酶)活性，使用復(fù)合物I酶活性微板測定試劑盒(Abcam，ab109721)。根據(jù)所提供的方案進行所述測定。將牛心臟線粒體溶解產(chǎn)物(Abcam，ab110338)添加去污劑，隨后在冰上孵育30分鐘以釋放復(fù)合物I，且隨后在12,000g、4℃下離心20分鐘。收集上清液且用所提供的緩沖液稀釋，并且隨后添加至復(fù)合物I抗體涂覆的96孔板。在3小時孵育接著用穩(wěn)定劑緩沖液2X洗滌之后，將所述孔添加200μL的含有50、200或800μMα-KB的反應(yīng)混合物或媒介物對照(蒸餾水)。一式三份地進行每種條件。取得在450nm下1分鐘時間間隔的吸光度的動力學(xué)測量值，并且從吸光度與時間的斜率計算復(fù)合物I心肌黃酶活性。將讀數(shù)針對媒介物平均值(為100％)標(biāo)準(zhǔn)化。

α-KB不延長長壽復(fù)合物I突變秀麗隱桿線蟲株系的壽命

nuo-6基因編碼線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I(還稱為NADH脫氫酶復(fù)合物)的NDUFB4/B15亞單位的秀麗隱桿線蟲直向同源物。如圖15A中所示，nuo-6(qm200)突變株系具有降低的復(fù)合物I功能并且相較于野生型N2秀麗隱桿線蟲長壽。α-KB不能延長nuo-6(qm200)株系的壽命與通過復(fù)合物I介導(dǎo)的α-KB的抗衰老機制一致。另一方面，如圖15B中所示，α-KB確實延長甚至更長壽daf-2(e1370)株系或eat-2(ad1116)株系的壽命，如圖15C中所示。這些發(fā)現(xiàn)是重要的，因為它們證明α-KB的抗衰老作用與兩種主要衰老途徑無關(guān)，所述途徑是胰島素/IGF-1信號傳導(dǎo)途徑(daf-2)和飲食限制途徑(eat-2)。這不僅證明通過線粒體ETC抑制延長壽命的特異性，而且表明α-KB可與通過胰島素/IGF-1途徑和飲食限制途徑兩者延長壽命的分子協(xié)同作用。

除非另外指明，否則在本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域中通常使用的意義。

如本文所用，術(shù)語“受試者”包括人和非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、馬、綿羊、狗、牛、豬、雞以及其他獸醫(yī)受試者和測試動物。

除非另外明確說明，否則單數(shù)的使用可包括復(fù)數(shù)。如在說明書和所附權(quán)利要求中所使用，除非上下文另外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個/種(a/an)”和“所述(the)”可包括復(fù)數(shù)指示物。除非另外說明，否則“或”的使用可意指“和/或”。如本文所用，“和/或”意指“和”或者“或”。例如，“A和/或B”意指“A、B或A和B兩者”；并且“A、B、C和/或D”意指“A、B、C、D或其組合”，并且所述“其組合”意指A、B、C和D的任何子集，例如，單成員子集(例如，A或B或C或D)、二成員子集(例如，A和B；A和C；等)，或三成員子集(例如，A、B和C；或A、B和D；等)，或所有四個成員(例如，A、B、C和D)。

在理解或完成本發(fā)明的公開內(nèi)容所必需的程度上，本文提及的所有出版物、專利和專利申請以引用的方式明確并入本文，其程度如同各自單獨地如此并入。

已經(jīng)如此描述了本發(fā)明的示例性實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)注意，公開內(nèi)容內(nèi)的實施方案僅是示例性的，并且可在本發(fā)明的范圍內(nèi)做出各種其他替代方案、改變和修改。因此，本發(fā)明不限于如本文所示的具體實施方案，而是僅由以下權(quán)利要求限制。