本申請要求于2014年5月6日提交的美國臨時申請系列號61/989,398的優(yōu)先權(quán)，其通過引用被并入本文。

政府利益的聲明

本發(fā)明根據(jù)各自由美國國立衛(wèi)生研究院(the National Institute of Health；NIH)授予的P01CA168585、CA-16042和AI-28697，在政府支持下做出。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。

領(lǐng)域

本公開內(nèi)容涉及包含BRAF抑制劑的組合物和使用包含BRAF抑制劑的組合物治療傷口的領(lǐng)域。

背景

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-Raf(“B-Raf”或“BRAF”)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶，其參與調(diào)節(jié)MAP激酶/ERK信號傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞分化、分裂和分泌。BRAF^V600E是常見的致癌BRAF突變，其通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路誘導(dǎo)組成型信號傳導(dǎo)，刺激癌細(xì)胞增殖和存活。阻斷BRAF激酶的活性構(gòu)象的致癌BRAF的抑制劑的臨床開發(fā)，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法相比時，已引起高比率的目標(biāo)腫瘤反應(yīng)和總存活率的改善。然而，非黑素瘤性皮膚癌(例如，高分化皮膚鱗狀細(xì)胞癌和角化棘皮瘤)在約15％至30％的用BRAF抑制劑諸如維羅非尼(vemurafenib)和達(dá)拉菲尼(dabrafenib)(GSK-2118436)治療的患者中發(fā)展。

針對細(xì)胞培養(yǎng)物、動物模型和人類中的BRAF^V600E–突變細(xì)胞的BRAF抑制劑諸如維羅非尼的抗腫瘤活性，與致癌MAPK信號傳導(dǎo)的抑制相關(guān)，如由磷酸化的ERK(pERK)的抑制證明的，所述磷酸化的ERK(pERK)是BRAF的下游效應(yīng)物，其當(dāng)被磷酸化時是有活性的。然而，BRAF抑制劑在具有野生型BRAF的細(xì)胞系中誘導(dǎo)相反的作用——即，增加pERK，所述具有野生型BRAF的細(xì)胞系具有上游通路的激活，諸如致癌RAS或上調(diào)的受體酪氨酸激酶。BRAF野生型細(xì)胞中MAPK信號傳導(dǎo)的該RAF抑制劑依賴性激活稱為“特殊MAPK通路激活(paradoxical MAPK-pathway acitvation)”，并且受到RAF二聚體的形成驅(qū)動，其通過CRAF和隨后的MAPK通路超活化引起信號傳導(dǎo)。通過誘導(dǎo)特殊(paradoxical)MAPK激活來抑制非癌環(huán)境中BRAF抑制劑的這些皮膚增殖性副作用以加速皮膚傷口愈合將是期望的。

概述

根據(jù)本文描述的實施方案，提供了用于治療傷口的方法。此類方法包括使傷口與有效量的BRAF抑制劑接觸來刺激傷口愈合的步驟。BRAF抑制劑可以是抑制BRAF的活性的任何合適的劑，除了其他劑以外包括：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達(dá)拉菲尼(dabrafenib)，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼(vemurafenib)，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺(Difluorophenyl-sulfonamine))、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼(sorafenib)、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。

在一些方面，BRAF抑制劑可以是藥物組合物的部分。在此類情況中，藥物組合物可包含有效量的BRAF抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。在某些方面，藥物組合物是局部用劑(topoical agent)，包括軟膏、乳狀液體(cream liquid)、凝膠、水凝膠或噴霧。

此外，在一些實施方案中，BRAF抑制劑或其藥物組合物可以是用于在治療傷口中使用的傷口敷料的部分。在該情況中，傷口敷料可以用BRAF抑制劑或其藥物組合物浸漬或涂覆。可以在根據(jù)本文描述的實施方案中使用的合適的傷口敷料包括藻酸鹽敷料、抗微生物敷料、繃帶、生物合成的敷料、生物敷料、膠原敷料、復(fù)合敷料(composite dressing)、壓縮敷料(compression dressing)、接觸層敷料、泡沫敷料、紗布敷料、水膠體敷料、水凝膠敷料、皮膚密封劑或液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料或傷口填充物。

附圖簡述

圖1是圖解了在BRAF^V600E突變的黑素瘤中的BRAF抑制(圖1A)、在發(fā)展HRAS突變來源的皮膚鱗狀細(xì)胞癌和角化棘皮瘤(cuSCC/KAs)的黑素瘤患者中的BRAF野生型細(xì)胞中的BRAF抑制(圖1B)和在健康受試者中的BRAF和RAS野生型細(xì)胞中的BRAF抑制(圖1C)的差異作用的示意圖。

圖2圖解了BRAF抑制在人類角化細(xì)胞中誘導(dǎo)特殊MAPK激活，引起增加的增殖。圖2A是通過自動化顯微鏡分析儀進(jìn)行的增殖和刮傷愈合作為在維羅非尼的存在或不存在下的HEKa的重復(fù)培養(yǎng)物中在不同時間點的細(xì)胞的相對傷口密度百分比的定量分析。通過t-檢驗的P值<0.0044。在圖3A中顯示了代表性圖像。圖2B顯示了在0小時(基線)和24小時在維羅非尼的存在或不存在下人類成人上皮角化細(xì)胞(HEKa)的細(xì)胞增殖傷口愈合測定的代表性圖像。圖2C圖解了在暴露于或未暴露于維羅非尼的軟瓊脂中生長的HEKa和M249細(xì)胞的集落定量的倍數(shù)變化展示。在圖3B中顯示了代表性圖像。圖2D顯示暴露于或未暴露于維羅非尼的HEKa集落的平均斑點尺寸的增加。圖2E顯示具有和不具有維羅非尼和/或曲美替尼的HEKa集落的平均數(shù)目。圖2F是與BRAF^V600E突變的黑素瘤細(xì)胞系M249相比，HEKa中的pERK的蛋白印跡分析和Ki67的表達(dá)水平。圖2G是當(dāng)用維羅非尼、曲美替尼或維羅非尼和曲美替尼的組合處理時，與BRAF^V600E突變的黑素瘤細(xì)胞系M249相比，HEKa細(xì)胞中的pERK和pMEK的蛋白印跡分析。圖2H是用媒介物或VEM(2μM)處理并用pERK和Ki67染色的HEKa和M249細(xì)胞的磷酸化流式細(xì)胞術(shù)(phosphoflow cytometry)分析。左邊顯示HEKa和M249中單獨的pERK和Ki67表達(dá)的直方圖。pERK和Ki67的共表達(dá)水平顯示在圖的中部，且定量的和代表性的倍數(shù)變化顯示在左邊。

圖3顯示了圖2中描述的實驗的代表性結(jié)果。圖3A顯示了在維羅非尼的存在或不存在下人類成人上皮角化細(xì)胞(HEKa)的細(xì)胞增殖刮傷測定的時間進(jìn)程圖像。增殖的定量分析展現(xiàn)在圖2A中。圖3B顯示了用DMSO或VEM處理的M249和HEKa的3D培養(yǎng)物圖像。

圖4顯示了代表性磷酸化流式細(xì)胞術(shù)圖像，顯示產(chǎn)生圖2H中展現(xiàn)的數(shù)據(jù)的門控策略。圖4A顯示M249細(xì)胞的磷酸化流式細(xì)胞術(shù)圖像；圖4B顯示HEKa細(xì)胞的磷酸化流式細(xì)胞術(shù)圖像。

圖5圖解了BRAF抑制加速了小鼠中的傷口愈合。圖5A是根據(jù)一些實施方案在CH3小鼠中進(jìn)行的傷口愈合測定的示意圖。圖5B顯示在第2、6和14天，PBS治療的和VEM治療的小鼠的代表性圖像。圖5C顯示了圖解在三次重復(fù)實驗中(媒介物(DMSO/生理鹽水)和VEM；實驗#1-3)和在使用維羅非尼(VEM)和/或曲美替尼(TRAME)以及DMSO/生理鹽水作為媒介物/對照的單獨的實驗(實驗#4)中的傷口牽張強度(WTS)的一組圖，所述三次重復(fù)實驗的每次實驗具有8只小鼠/組。WTS展示為克力(gf)(對于所有三次實驗通過t-檢驗的p<0.0001)。

圖6是在治療后第1天(D1)、第2天(D2)和第6天(D6)的傷口愈合的病理分析的示意圖。圖6A顯示在維羅非尼(VEM)、曲美替尼(TRAME)或組合(VEM+TRAME)的存在和不存在下的代表性顯微照片H&E圖像(200X)。在每組中，切割的傷口的愈合包括相同的標(biāo)準(zhǔn)過程。傷口鄰近的表皮經(jīng)歷增生和增殖，并且來自該過程的表皮細(xì)胞向中央遷移以封閉切割的表皮缺損。切口的空間最初被纖維蛋白填充，然后其被成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞和新的毛細(xì)血管占據(jù)。在維羅非尼的存在下(圖V1、V2、V6)，愈合過程加速。相比于對照樣本(圖C2)，在維羅非尼組(圖V2)中在切割后第2天傷口鄰近的表皮增生更廣泛。皮膚表面完整性以表皮下纖維化開始在6天中重建(圖V6)，而此時，對照組中的再上皮化不完全并且不存在真皮修復(fù)性纖維化(圖C6)。僅用曲美替尼治療的組在第2天顯示輕微的損傷周圍的增生(圖M2)，并且到第6天未顯示修復(fù)的跡象(圖M6)。在維羅非尼加曲美替尼組合的組(圖VM1、VM2、VM6)中，在第2天，損傷周圍的增生(圖VM2)低于用維羅非尼治療的組(圖V2)，但高于單獨的曲美替尼(圖M2)。此外，在第6天不存在再上皮化(圖VM6)。圖6B顯示在用媒介物、維羅非尼、曲美替尼或組合治療后第1天、第2天和第6天，從傷口的右側(cè)和左側(cè)的表皮增生的長度的定量。每個條包括來自4個樣品的數(shù)據(jù)。

圖7顯示在暴露于或未暴露于維羅非尼的小鼠中，愈合皮膚傷口的基因表達(dá)譜分析。上圖顯示BRAF特征基因的熱圖，和其使用基因集合變異分析(Gene Set Variation Analysis；GVSA)計算的總體富集得分；下圖顯示傷口愈合特征基因的熱圖和總體GVSA得分。

詳述

本文提供了使用BRAF抑制劑用于治療傷口的方法、藥物組合物和傷口敷料。根據(jù)本文描述的實施方案，BRAF抑制劑可以單獨地、作為藥物組合物的部分、或作為傷口敷料的部分使用以加速傷口愈合。

目前，BRAF抑制劑被用于在諸如癌癥的疾病和狀況中利用其涉及BRAF的突變的形式的抗增殖活性(圖1A)。然而，盡管BRAF抑制劑對BRAF的突變的形式的抗增殖效果，已觀察到，用BRAF抑制劑治療癌癥諸如黑素瘤的患者發(fā)展二次增殖性狀況。

特殊MAPK激活是用BRAF抑制劑治療的患者中這些二次增殖性狀況(例如，浸潤性鱗狀細(xì)胞癌和角化棘皮瘤)的發(fā)展背后的致病基礎(chǔ)(Su等2012；Oberholzer等2012)。在這些二次皮膚損傷中的非突變的BRAF上游的RAS突變的頻繁存在導(dǎo)致強烈的RAS-GTP激活，其引起ERK的特殊地增加的磷酸化、增加的MAPK通路輸出和增強的細(xì)胞增殖(圖1B)。特殊MAPK激活是RAF抑制劑的特性(Hall-Jackson等1999)，其中與BRAF啟動子的優(yōu)先結(jié)合在強烈的上游RAS-GTP信號傳導(dǎo)的環(huán)境中引起其CRAF異二聚體配偶體的反式激活(Heidorn等2010；Poulikakos等2010；Holderfield等2013)。因此，經(jīng)BRAF抑制劑治療的患有BRAF突變的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者發(fā)展多種其他皮膚增殖性狀況(Belum等2013)，其中的大多數(shù)當(dāng)伴隨施用MEK抑制劑時被改善(Flaherty等2012)，所述MEK抑制劑阻斷特殊RAF激活的下游作用(Su等2012；Escuin-Ordinas等2013)。在下面的實施例中，表明在癌癥治療中BRAF抑制劑的皮膚增殖性副作用的該機制理解可以在另外的健康受試者(即，野生型(wt)RAS和BRAF)中被利用以通過在野生型細(xì)胞中誘導(dǎo)特殊MAPK激活加速皮膚傷口愈合(圖1C)。

BRAF抑制劑

可根據(jù)本文描述的實施方案使用的BRAF抑制劑可以包括選擇性地抑制野生型BRAF或BRAF的突變形式(例如，BRAF^V600E、BRAF^V600K、BRAF^V600D、BRAF^V600L、BRAF^V600R)的至少一部分生物活性(例如，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性)的任何劑。在一些方面，BRAF抑制劑可以是單獨的BRAF選擇性的，或可以具有針對在RAF/MEK/ERK通路中的一種或更多種另外的靶的抑制活性。例如在一方面，BRAF抑制劑可以是RAF激酶抑制劑，即，抑制劑可以具有針對除了BRAF之外的RAF激酶諸如ARAF、CRAF或二者的抑制活性。在某些實施方案中，選擇BRAF抑制劑以具有增加的特殊MAPK激活活性。如此，根據(jù)本文描述的實施方案使用的BRAF抑制劑可以充當(dāng)MAPK特殊激活物，意味著，BRAF抑制劑引起MAPK信號傳導(dǎo)的增加。在一些方面，MAPK特殊激活物是當(dāng)靶BRAF激酶是野生型BRAF激酶時呈現(xiàn)增加的MAPK信號傳導(dǎo)的BRAF抑制劑。

本領(lǐng)域已描述了若干BRAF激酶抑制劑，其中的任何一個可以適合用于在本文描述的方法、敷料和組合物中使用。合適的BRAF抑制劑可包括但不限于1,2-二-環(huán)基取代的炔化合物或衍生物；1-甲基-5-(2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)；2,6-二取代的喹唑啉、喹喔啉、喹啉和異喹啉化合物或衍生物；4-氨基-5-氧絡(luò)-8-苯基-5H-吡啶并-[2,3-D]-嘧啶化合物或衍生物；4-氨基-噻吩并[3,2-C]吡啶-7-羧酸化合物或衍生物；5-(4-氨基苯基)-異喹啉化合物或衍生物；苯磺胺噻唑化合物或衍生物；苯并咪唑化合物或衍生物；雙環(huán)化合物或衍生物；吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物的橋接、雙環(huán)雜環(huán)或螺旋雙環(huán)雜環(huán)衍生物；肉桂酰胺和氫-肉桂酰胺化合物或衍生物；二-取代的咪唑化合物或衍生物；稠合的三環(huán)吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物；雜芳基化合物或衍生物；雜環(huán)化合物或衍生物；1H-苯并[D]咪唑化合物或衍生物；咪唑并[4,5-B]吡啶化合物或衍生物；N-(6-氨基吡啶-3-基)-3-(亞磺酰氨基)苯甲酰胺化合物或衍生物；N-[3-(1-氨基-5,6,7,8-四氫-2,4,4B-三氮雜芴-9-基)-苯基]苯甲酰胺化合物或衍生物；含氮的雙環(huán)雜芳基化合物或衍生物；雜環(huán)取代的二芳基脲化合物或衍生物的N-氧化物；omega-羧基芳基取代的二苯基脲化合物或衍生物；噁唑化合物或衍生物；苯乙胺化合物或衍生物；苯基磺酰胺取代的、吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物；苯基三唑化合物或衍生物；雜環(huán)化合物或衍生物；1h-吡唑并[3,4-b]吡啶化合物或衍生物；嘌呤化合物或衍生物；吡唑[3,4-B]吡啶化合物或衍生物；吡唑化合物或衍生物；吡唑啉化合物或衍生物；吡唑并[3,4-b]吡啶、吡咯并[2,3-b]吡啶化合物或衍生物；吡唑并[3,4-d]嘧啶化合物或衍生物；吡唑并[5,1-c][1,2,4]三嗪化合物或衍生物；吡唑基化合物或衍生物；嘧啶化合物或衍生物；吡咯化合物或衍生物；吡咯并[2,3-B]吡啶化合物或衍生物；取代的6-苯基-吡啶并[2,3-D]嘧啶-7-酮化合物或衍生物；取代的氮茚化合物或衍生物；取代的苯并咪唑化合物或衍生物；取代的二芳基-脲化合物或衍生物；噻吩并吡啶化合物或衍生物；噻吩并嘧啶、噻吩并吡啶或吡咯并嘧啶化合物或衍生物；噻吩酰胺化合物或衍生物、和任何其他合適的芳基和/或雜芳基化合物或衍生物。在一些方面，本文描述的合適的BRAF抑制劑可以包括化合物或衍生物本身，或可以是其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。

若干專利和專利申請公開了可根據(jù)本文描述的實施方案使用的范例BRAF抑制劑，包括但不限于國際專利申請公布號WO2011117381、WO2011119894、WO2011117381、WO2011097594、WO2011097526、WO2011085269、WO2011090738、WO2011025968、WO2011025927、WO2011023773、WO2011028540、WO2010111527、WO2010104973、WO2010100127、WO2010078408、WO2010065893、WO2010032986、WO2009115572、WO2009108838、WO2009111277、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111280、WO2009108827、WO2009111260、WO2009100536、WO2009059272、WO2009039387、WO2009021869、WO2009006404、WO2009006389、WO2008140850、WO2008079277、WO2008055842、WO2008034008、WO2008115263、WO2008030448、WO2008028141、WO2007123892、WO2007115670、WO2007090141、WO2007076092、WO2007067444、WO2007056625、WO2007031428、WO2007027855、WO2007002433、WO2007002325、WO2006125101、WO2006124874、WO2006124780、WO2006102079、WO2006108482、WO2006105844、WO2006084015、WO2006076706、WO2006050800、WO2006040569、WO2005112932、WO2005075425、WO2005049603、WO2005037285、WO2005037273、WO2005032548；和美國專利號US8642759、US8557830、US8504758、US7863288、US7491829、US7482367和US7235576；其所有的說明書在此通過引用被并入，如同在本文充分陳述。

在某些實施方案中，BRAF抑制劑可以從選自以下的一組分子中選擇：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽或XL281(BMS-908662)。

在一些實施方案中，BRAF抑制劑具有式(I)或式(II)的結(jié)構(gòu)或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中：

R¹是H、任選地用氰基取代的C3-C6環(huán)烷基、任選地用氰基取代的C1-C3烷基、-C(O)NH₂、羥基、-X¹NHC(O)OR^1a、-X¹NHC(O)NHR^1a，其中X¹是任選地用1至3個基團(tuán)取代的C1-C4亞烴基，所述基團(tuán)的每個獨立地選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基，并且R^1a是H、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基；

R^1b是H或甲基；

R²是H或鹵素；

R³是H、鹵素、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、鹵素取代的C1-C4烷氧基、或鹵素取代的C1-C4烷基；

R⁴是鹵素、H或C1-C4烷基；

R⁵是C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C8支鏈烷基、鹵素取代的C1-C6烷基、鹵素取代的C3-C8支鏈烷基、C3-C6環(huán)烷基-(C1-C3)-亞烴基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基的每個獨立地選自鹵素、CH₃或CF₃；

R⁶是H、C1-C4烷基或鹵素；并且

R⁷是H、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、1-甲基-(C3-C6)-環(huán)烷基、1-(鹵素取代的-甲基)-(C3-C6)-環(huán)烷基、C3-C8支鏈烷基、鹵素取代的C1-C6烷基、鹵素取代的C3-C8支鏈烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基，優(yōu)選地其中R⁷是H、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、1-甲基-(C3-C6)-環(huán)烷基、C3-C8支鏈烷基或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基。

在式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的一個特定的實施方案中，R¹是任選地用氰基取代的C1-C3烷基、-C(O)NH₂、羥基、-X¹NHC(O)OR^1a，其中X¹是任選地用1至3個基團(tuán)取代的C1-C4亞烴基，所述基團(tuán)的每個獨立地選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基，并且R^1a是H、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基；

R²是H或鹵素；

R³是H、鹵素、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、鹵素取代的C1-C4烷氧基、或鹵素取代的C1-C4烷基；

R⁴是鹵素、H或C1-C4烷基；

R⁵是C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C8支鏈烷基、鹵素取代的C1-C6烷基或鹵素取代的C3-C8支鏈烷基；

R⁶是H、C1-C4烷基或鹵素；并且

R⁷是H、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、1-甲基-(C3-C6)-環(huán)烷基、1-(鹵素取代的-甲基)-(C3-C6)-環(huán)烷基、C3-C8支鏈烷基、鹵素取代的C1-C6烷基、或鹵素取代的C3-C8支鏈烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基，優(yōu)選地其中R⁷是H、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、1-甲基-(C3-C6)-環(huán)烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、C1-C4烷基或鹵素取代的C1-C4烷基。

在優(yōu)選的實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽(本文還被稱作“LGX818”或“encorafenib”)，其中

R¹是–CH₂-(S)-CH(CH₃)NHC(O)OCH₃；

R^1b是H；

R²是H；

R³是Cl；

R⁴是H；

R⁵是CH₃；

R⁶是F；并且

R⁷是異丙基。

在另一個實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中

R²是H或F；

R³是H、鹵素、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基、鹵素取代的C1-C2烷氧基、或鹵素取代的C1-C2烷基；

R⁴是H或甲基；

R⁵是C1-C4烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C5支鏈烷基、鹵素取代的C1-C4烷基、鹵素取代的C3-C6支鏈烷基或C3-C6環(huán)烷基-(C1-C3)-亞烴基；

R⁶是H、C1-C2烷基或鹵素；并且

R⁷是C3-C6環(huán)烷基、1-甲基-(C3-C6)-環(huán)烷基或C3-C6支鏈烷基。

在另一個實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中

R²是H；

R³是H、Cl、F、甲氧基、甲基或二氟甲氧基；

R⁴是H；

R⁵是甲基、環(huán)丙基、乙基、丙基、異丙基、仲丁基、異丁基、三氟甲基或3,3,3-三氟丙基；

R⁶是H、甲基、F或Cl；并且

R⁷是叔丁基、環(huán)丙基或1-甲基環(huán)丙基。

在一些實施方案中，BRAF抑制劑是式(III)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中：

a為0、1、2或3；

每個R¹是相同的或不同的，并且獨立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、–OR⁶、–CO₂R⁶、–NR⁶R⁷和–CN；

環(huán)A選自C3-C6環(huán)烷基、苯基、5-6元雜環(huán)和5-6元雜芳基，所述雜環(huán)和所述雜芳基每個具有1或2個選自N、O和S的雜原子；

Q¹、Q²、Q³和Q⁴中的每個是CH、CR²或N，其中Q¹、Q²、Q³和Q⁴中不超過一個是N；

每個R²是相同的或不同的，并且獨立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基和–OR⁶；

W選自–O–和–S–；

R³選自H、烷基、鹵代烷基-、-亞烴基-OH、–NR⁵R⁷、–C3-C6環(huán)烷基、-亞烴基-C(O)-OH、-亞烴基-NH₂和Het；

其中當(dāng)R³是C3-C6環(huán)烷基時，所述C3-C6環(huán)烷基任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，并且獨立地選自鹵素、C1-C3烷基、鹵代-(C1-C3)-烷基、OH、O-(C1-C3)-烷基、氧絡(luò)、S-(C1-C3)-烷基)、SO₂、NH₂、N(H)(C1-C3)-烷基和N(C1-C3烷基)₂；

Het是具有1或2個選自N、O和S的雜原子的5-6元雜環(huán)，并且任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，并且每個獨立地選自鹵素、C1-C3烷基、鹵代-(C1-C3)-烷基、O-(C1-C3)-烷基、C1-C3亞烴基-O-(C1-C3)-烷基、OH、C1-C3亞烴基-OH、氧絡(luò)、SO₂((C1-C3)-烷基)、C1-C3亞烴基-SO₂((C1-C3)-烷基)、NH₂、N(H)((C1-C3)-烷基)、N(C1-C3烷基)₂、CN和–CH₂CN；

R⁴選自H、烷基、鹵代烷基、烯基、–OR⁶、–R⁵-OR⁶、–R⁵-CO2R⁶、–R⁵-SO2R⁶、–R⁵-Het、–R⁵-C(O)-Het、–N(H)R⁸、–N(CH3)R⁸和–R⁵-NR⁶R⁷；每個R⁵是相同的或不同的，并且獨立地是C1-C4亞烴基；

每個R⁶和每個R⁷是相同的或不同的，并且獨立地選自H、烷基、鹵代烷基、–OR⁶–C(O)-烷基和–C(O)-環(huán)烷基；

R⁸選自H、烷基(任選地被–OH取代)、鹵代烷基、C3-C6環(huán)烷基、–R⁵-(C3-C6)-環(huán)烷基、Het²、–R⁵-Het²、–R⁵-OR⁶、–R⁵-O-R⁵-OR⁶、–R⁵-C(O)₂R⁶、–R⁵-C(O)NR⁶R⁷、–R⁵-N(H)C(O)-R⁶、–R⁵-N(H)C(O)-R⁵-OR⁶、–R⁵-N(H)C(O)₂-R⁵-R⁵-NR⁵R⁷、–R⁵-S(O)₂R⁶、–R⁵-CN和–R⁵-N(H)S(O)₂R⁶；

其中當(dāng)R⁸是C3-C6環(huán)烷基時，所述C3-C6環(huán)烷基任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，并且獨立地選自鹵素、C1-C3烷基、鹵素-(C1-C3)-烷基、OH、O-(C1-C3)-烷基、氧絡(luò)、S-(C1-C3)-烷基、SO₂(C1-C3烷基)、NH₂、N(H)-(C1-C3)-烷基和N(C1-C3烷基)₂、和N(H)SO₂-(C1-C3)-烷基；并且

Het²是具有1或2個選自N、O和S的雜原子的4-6元雜環(huán)，并且任選地用1、2、3、4或5個C1-C3烷基或1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，并且每個獨立地選自鹵素、C1-C3烷基、鹵代-(C1-C3)-烷基、O-(C1-C3)-烷基、C1-C3亞烴基-O-(C1-C3烷基)、OH、C1-C3亞烴基-OH、氧絡(luò)、SO₂(C1-C3烷基)、C1-C3亞烴基-SO₂(C1-C3烷基)、NH₂、N(H)-(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)₂、N(H)SO₂-(C1-C3烷基)、C(O)(C1-C3烷基)、CO₂(C1-C4烷基)、CN和–CH₂CN；

并且R⁹和R¹⁰獨立地選自H和烷基。

在優(yōu)選的實施方案中，提供了式(III)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中

a是2；

R¹是F；

每個R²是F；

R³是叔丁基；

R⁴是N(H)R⁸；

R⁸是H；并且

W是S(在本文稱為“GSK2118436”、“達(dá)拉菲尼”或)。

在某些實施方案中，BRAF抑制劑是式(IV)的化合物：

其中：

R²、R⁴、R⁵和R⁶獨立地選自由以下組成的組：氫、鹵素、任選地取代的低級烷基、任選地取代的低級烯基、任選地取代的低級炔基、任選地取代的環(huán)烷基、任選地取代的雜環(huán)烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、-CN、-NO₂、-CR^aR^bR²⁶和-LR²⁶；

R³選自由以下組成的組：氫、鹵素，任選地取代的低級烷基、任選地取代的低級烯基、任選地取代的低級炔基、任選地取代的環(huán)烷基、任選地取代的雜環(huán)烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、-CN、-NO₂、-CR^aR^bR²⁶、-LR²⁶和-A-Ar-L1-R²⁴；

A選自由以下組成的組：-O-、-S-、-CR^aR^b-、-NR¹-、-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-和-S(O)₂-；

R¹選自由以下組成的組：氫、低級烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、-C(O)R⁷、-C(S)R⁷、-S(O)₂R⁷、-C(O)NHR⁷、-C(S)NHR⁷和-S(O)₂NHR⁷，其中低級烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR⁸R⁹，其中低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基，然而，條件是，結(jié)合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，然而，另外條件是，當(dāng)R¹是低級烷基時，結(jié)合到-NR¹-的N的低級烷基碳上的任何取代是氟，并且其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：鹵素、-OH、-NH₂、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基；R⁷選自由以下組成的組：低級烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中低級烷基任選用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、低級烷基硫、單烷氨基、二烷氨基和-KR⁸R⁹，然而，條件是，結(jié)合到-C(O)NHR⁷、-C(S)NHR⁷或-S(O)₂NHR⁷的N的烷基碳的任何取代是氟，其中低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基，然而，條件是，結(jié)合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，并且其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：鹵素、-OH、-NH₂、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基；

Ar選自由任選地取代的亞芳基和任選地取代的雜亞芳基組成的組；

在每次出現(xiàn)時，L獨立地選自由以下組成的組：-(alk)_a-S-(alk)_b-、-(alk)_a-O-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a～C(O)-(alk)_b-、-(alk)_a-C(S)-(alk)_b-、-(aUc)_a-S(O)-(alk)_b-、-(alk)_a-S(O)₂-(alk)_b-、-(alk)_a-OC(O)-(alk)_b-、-(alk)_a-C(O)O-(alk)_b-、-(alk)_a-OC(S)-(alk)_b-、-(alk)_a-C(S)O-(alk)_b-、-(alk)_a-C(O)NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-C(S)NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-S(O)₂NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(O)-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(S)-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵S(O)₂-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(O)O-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(S)O-(alk)_b-、-(alk)_a-OC(O)NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-OC(S)NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(O)NR²⁵-(alk)_b-、-(alk)_a-NR²⁵C(S)NR²⁵-(alk)_b-和-(alk)_a-NR²⁵S(O)2NR²⁵-(alk)_b-；a和b獨立地是0或1；alk是C1-C3亞烴基或用一個或更多個取代基取代的C1-C3亞烴基，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR⁸R⁹，其中低級烷基或低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基，然而，條件是，與烷氧基的O、烷硫基的S或單或二烷氨基的N結(jié)合的烷基鏈碳的任何取代是氟；

L1是-(CR^aR^b)_v-或L，其中v是1、2或3；其中在每次出現(xiàn)時R^a和R^b獨立地選自由以下組成的組：氫、氟、-OH、-NH₂、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR⁸R⁹，其中低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基，然而，條件是，結(jié)合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟；或在相同或不同碳上的R^a和R^b中的任何兩個組合以形成3-7元單環(huán)環(huán)烷基或5-7元單環(huán)雜環(huán)烷基，并且R^a和R^b的任何其他的獨立地選自由以下組成的組：氫、氟、-OH、-NH₂、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR⁸R⁹，其中低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基，然而，條件是，結(jié)合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，并且其中3-7元單環(huán)環(huán)烷基或5-7元單環(huán)雜環(huán)烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：鹵素、-OH、-NH₂、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環(huán)烷氨基；

R⁸和R⁹與其附接的N組合以形成5-7元雜環(huán)烷基，所述5-7元雜環(huán)烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH₂、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基和氟取代的低級烷硫基；

在每次出現(xiàn)時R²⁵獨立地選自由以下組成的組：氫、任選地取代的低級烷基、任選地取代的環(huán)烷基、任選地取代的雜環(huán)烷基、任選地取代的芳基和任選地取代的雜芳基；和

在每次出現(xiàn)時R²⁴和R²⁶獨立地選自由以下組成的組：氫，然而，條件是，氫不與L或Li的S(O)、S(O)₂、C(O)或C(S)中的任何一個結(jié)合；任選地取代的低級烷基；任選地取代的低級烯基，然而，條件是，當(dāng)R²⁴或R²⁶是任選地取代的低級烯基時，其烯烴碳不結(jié)合到L或L1的N、S、O、S(O)、S(O)₂、C(O)或C(S)；任選地取代的低級炔基，然而，條件是，當(dāng)R²⁴或R²⁶是任選地取代的低級炔基時，其炔烴碳不結(jié)合到L或L1的N、S、O、S(O)、S(O)₂、C(O)或C(S)；任選地取代的環(huán)烷基；任選地取代的雜環(huán)烷基；任選地取代的芳基和任選地取代的雜芳基。

在優(yōu)選的實施方案中，提供了式(III)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：

R²是H；

R³是-A-Ar-L1-R²⁴；

A是-C(O)-；

Ar是2,4-二氟苯基；

L1是-SO₂-；

R⁴是H；

R⁵是4-氯苯基；

R⁶是H；

R²⁴是正丙基(本文稱為“PLX4032”、“維羅非尼”或)。

在其他實施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用體外、體內(nèi)、計算機模擬或本領(lǐng)域已知的其他篩選方法產(chǎn)生或鑒定出新型BRAF抑制劑。例如，可以使用用于檢測在MAPK信號傳導(dǎo)級聯(lián)中BRAF的下游分子(例如，MEK和/或ERK)的磷酸化的測定，從小分子、肽或核酸的訓(xùn)練集鑒定野生型BRAF的BRAF抑制劑。BRAF抑制劑可以發(fā)揮阻遏(suppress)或抑制(inhibit)BRAF表達(dá)和/或信號傳導(dǎo)功能的作用，從而降低MEK和ERK的磷酸化?？梢栽诖祟悓嵤┓桨钢惺褂玫娜舾闪姿峄瘻y定是可得的，包括但不限于激酶活性測定(例如，由R&DLife 銷售的那些)；用于與免疫測定諸如蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)一起使用的磷酸化特異性抗體；質(zhì)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化-蛋白多重測定。在某些實施方案中，可以使用測量候選抑制劑激活MAPK通路的能力的篩選方法鑒定用于在本文描述的實施方案中使用的BRAF抑制劑?？梢酝ㄟ^反式激活CRAF實現(xiàn)MAPK通路的這一激活。與用于在治療癌癥和與異常的BRAF表達(dá)相關(guān)的其他疾病中使用的典型的BRAF抑制劑篩選不同，以此方式鑒定的BRAF抑制劑(本文還被稱作MAPK特殊激活物)可被使用以利用特殊MAPK激活通過誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞的增加的增殖來加速皮膚傷口愈合。

如本文使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”意指本發(fā)明的化合物的對于在受試者中應(yīng)用是安全并且有效的，并且具有所需的生物活性的那些鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括存在于本發(fā)明的化合物中的酸或堿基團(tuán)的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸、龍膽酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即，1,11-亞甲基-二-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))、鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅和二乙醇胺鹽。本發(fā)明的某些化合物可以與多種氨基酸形成藥學(xué)上可接受的鹽。對于藥學(xué)上可接受的鹽的綜述，參見Berge等,66J.Pharm.Sci.1-19(1977)，其通過引用并入本文。

藥物組合物

在一些實施方案中，以上描述的一種或更多種BRAF抑制劑可以是藥物組合物的部分。在一些方面，藥物組合物包括至少一種BRAF抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。如本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意指參與將BRAF抑制劑從一個位置、體液、組織、器官(內(nèi)部或外部)、或身體的部分?jǐn)y帶或運輸?shù)搅硪晃恢?、體液、組織、器官或身體的部分的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。

在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和與式(I)或式(II)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和與式(III)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和與式(IV)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。

從與制劑的其他成分例如BRAF抑制劑是相容的并且適合用于在與生物系統(tǒng)的組織或器官接觸中使用而無過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)、免疫原性或其他問題或并發(fā)癥，與合理的效益/風(fēng)險比相稱的意義上而言，每種載體是“藥學(xué)上可接受的”。

可以用作藥學(xué)上可接受的載體的材料的一些實例包括：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素和其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末化的黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲的生理鹽水；(18)林格氏溶液；(19)醇，諸如乙醇和丙烷醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)在藥物制劑中采用的其他無毒相容的物質(zhì)諸如丙酮。

藥物組合物可根據(jù)需要包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理條件，所述藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等等。另外，用于藥物組合物的制劑還可包括潤濕劑、著色劑、脫模劑(release agent)、包衣劑、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑或其他輔助成分。

在一個實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是水性載體，例如緩沖的生理鹽水等等。在某些實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是極性溶劑，例如丙酮和醇。在某些方面，藥學(xué)上可接受的載體是合適的材料，所述合適的材料允許、促進(jìn)或增強經(jīng)皮、局部、霧化吸入、可吸入或任何其他合適的施用方式，諸如在下面詳細(xì)描述的那些施用途徑。

在這些制劑中的BRAF抑制劑的濃度可以廣泛不同，并且將主要基于流體體積、粘度、體重等等，根據(jù)選擇的特定施用方式和生物系統(tǒng)的需要被選擇。通常，存在于藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的量將是將產(chǎn)生治療效果的量。例如，在一些實施方案中，藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的重量/體積(w/v)或重量百分比(wt％)濃度可以是在約0.001％到100％、0.001％到90％、0.001％到80％、0.001％到70％、0.001％到60％、0.001％到50％、0.001％到40％、0.001％到30％、0.001％到20％、0.001％到10％、0.001％到1％、0.01％到100％、0.01％到90％、0.01％到80％、0.01％到70％、0.01％到60％、0.01％到50％、0.01％到40％、0.01％到30％、0.01％到20％、0.01％到10％、0.01％到1％、0.1％到100％、0.1％到90％、0.1％到80％、0.1％到70％、0.1％到60％、0.1％到50％、0.1％到40％、0.1％到30％、0.1％到20％、0.1％到10％、0.1％到1％、1％到100％、1％到90％、1％到80％、1％到70％、1％到60％、1％到50％、1％到40％、1％到30％、1％到20％、1％到10％、1％到5％、1％到4％、1％到3％、1％到2％、0.1％到0.9％、0.1％到0.8％、0.1％到0.7％、0.1％到0.6％、0.1％到0.5％、0.1％到0.4％、0.1％到0.3％、0.1％到0.2％、0.2％到1％、0.3％到1％、0.4％到1％、0.5％到1％、0.6％到1％、0.7％到1％、0.8％到1％或0.9％到1％之間。

在其他實施方案中，藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的濃度可以是約1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M。在一些方面，BRAF抑制劑在受試者(例如，人類或其他哺乳動物)中產(chǎn)生治療效果的濃度(摩爾濃度或wt％)可以從體外或體內(nèi)數(shù)據(jù)、從細(xì)胞培養(yǎng)物和/或動物實驗諸如以下實施例中描述的那些來推斷。

在一些方面，藥物組合物還包含至少一種另外的治療劑。除了一種或更多種BRAF抑制劑之外，可以作為藥物組合物的部分被包含的合適的治療劑包括但不限于，傷口治療劑諸如生長因子(例如，重組血小板來源的生長因子(PDGF；/貝卡普勒明凝膠))、基于魚皮的MariGen Omega3組織再生技術(shù)、糖、抗酸藥、維生素A、維生素D、抗微生物劑和防腐劑(例如，醋酸、酸化亞硝酸鹽、acticoat 7、aquacel-Ag、抗微生物肽、桿菌肽、BCTP納米乳劑、卡地姆碘、碘、西曲溴銨、氯己定、精油、flammacerium、FPQC、夫西地酸、慶大霉素、葡糖酸鹽、六氯酚、蜂蜜、碘化合物、碘酊、脂質(zhì)體碘、醋酸磺胺米隆、甲硝唑、莫匹羅星、莫匹羅星鈣、硫酸新霉素、新孢霉素(neosporin)、硝基糠腙、制霉菌素、噬菌體療法、木瓜、益生素、多粘菌素B、聚維酮碘、瑞他帕林、次氯酸鈉、過氧化氫、銀、silvercel、銀羊膜、硝酸銀、銀敷料、銀泡沫、磺胺嘧啶銀、磺胺醋酰Na⁺和超氧水)；和止痛劑諸如發(fā)紅劑(例如，水楊酸鹽、煙酸鹽、辣椒素、辣椒提取物)、NSAID(例如，布洛芬、雙氯芬酸、聯(lián)苯乙酸、酮洛芬、吡羅昔康、萘普生、氟比洛芬)、氫化可的松、苯扎氯銨、芐達(dá)明、多磺酸粘多糖、水楊酰胺、苯酚、冷卻噴霧、爐甘石和局部麻醉劑(例如，利多卡因、利諾卡因、丙胺卡因、苯佐卡因、普莫卡因、地布卡因)。

傷口敷料

本文描述的BRAF抑制劑和其藥物組合物可以與一種或更多種傷口敷料組合或聯(lián)合使用。在某些實施方案中，一種或更多種BRAF抑制劑或其藥物組合物被用于浸漬或涂覆傷口敷料。任何傷口敷料，諸如下面描述的那些，可以用一種或更多種BRAF抑制劑或包含一種或更多種BRAF抑制劑的藥物組合物來浸漬或涂覆。上文詳細(xì)描述了此類藥物組合物。

在一個實施方案中，用包含一種或更多種BRAF抑制劑的藥物組合物浸漬或涂覆的傷口敷料可以作為單一的傷口愈合敷料或一組獨立包裝的傷口愈合敷料出售。在此類情況中，當(dāng)應(yīng)用于傷口時，在單一的敷料單元中一起供應(yīng)的敷料和BRAF抑制劑不但起作用以賦予典型的敷料的傷口愈合特性(例如，停止出血、減輕疼痛、保護(hù)免受進(jìn)一步傷害或損傷、保護(hù)免受感染)，還行使增強和/或加速傷口愈合的功能。

若干合適的傷口敷料是已知的并且在本領(lǐng)域中被使用以促進(jìn)傷口愈合、保護(hù)開放的傷口、提供疼痛緩解和防止感染和/或污染，其中的任何一個可以根據(jù)本文描述的實施方案使用。合適的傷口敷料的實例包括但不限于藻酸鹽、抗微生物劑、繃帶、生物合成制品、生物制品、膠原、復(fù)合敷料、壓縮繃帶、接觸層、泡沫、紗布、水膠體、水凝膠、皮膚密封劑/液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料、傷口填充物。在一些方面，可以在傷口上使用用一種或更多種BRAF抑制劑浸漬或涂覆的多于一種傷口敷料。在其他方面，傷口敷料可以與局部用軟膏、凝膠、噴霧、糊劑、液體或其他制劑組合使用，其中的每一個可以包含一種或更多種BRAF抑制劑或其組合物。

根據(jù)一些實施方案，用單獨的或作為藥物組合物的部分的一種或更多種以上描述的BRAF抑制劑浸漬或涂覆傷口敷料。在某些方面中，可以用于浸漬或涂覆傷口敷料的一種或更多種BRAF抑制劑選自以下的一種或更多種：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。浸漬的或涂覆的傷口敷料可以直接地應(yīng)用到傷口，使得敷料向傷口提供一種或更多種BRAF抑制劑的治療作用。

在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(I)或式(II)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或涂覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(III)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或涂覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(IV)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或涂覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。

使用方法

在一些實施方案中，單獨的或作為藥物組合物的部分的以上描述的BRAF抑制劑可以在用于治療受試者傷口的方法中使用。本文描述的此類方法可以用于治療任何類型的傷口，包括但不限于急性非穿透性傷口(例如，擦傷、撕裂傷、挫傷)、急性穿透性傷口(例如，戳傷、表面切口、刮傷或撕裂傷、手術(shù)切口和傷口、槍傷)、熱傷口(例如，燒傷、曬傷和凍傷)、潰瘍(例如，慢性糖尿病性潰瘍、壓迫性潰瘍/褥瘡)、化學(xué)傷口、動物或昆蟲咬傷和蜇傷、和電傷口。

用于治療傷口的方法可以包括使傷口與有效量的一種或更多種BRAF抑制劑接觸以加速傷口愈合的步驟。可以根據(jù)本文描述的方法使用的合適的BRAF抑制劑包括但不限于以上描述的那些。在某些方面中，一種或更多種BRAF抑制劑可以選自以下的一種或更多種：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。

在一些實施方案中，可以根據(jù)本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(I)或式(II)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，可以根據(jù)本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(III)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達(dá)拉菲尼，)或其鹽或衍生物。

在一些實施方案中，可以根據(jù)本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(IV)或其藥學(xué)上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。

根據(jù)本文描述的方法，使傷口與一種或更多種BRAF抑制劑或其藥物組合物接觸可通過任何合適的遞送或施用途徑實現(xiàn)。為了治療傷口，BRAF抑制劑或其藥物組合物可通過本領(lǐng)域已知的任何施用途徑遞送或施用，包括但不限于，口服、經(jīng)鼻、局部、霧化吸入、經(jīng)粘膜、表皮、經(jīng)皮、皮膚、眼、肺、皮下和/或吸入。取決于施用方法，藥物組合物可以以多種單位劑型施用。例如，適合于經(jīng)皮施用的單位劑型包括經(jīng)浸漬的或涂覆的貼劑、繃帶、紗布或本文描述的任何其他敷料。

根據(jù)一些實施方案，BRAF抑制劑或其藥用組合物可以以適合每種施用途徑的制劑或制品的形式給予受試者。可用于本發(fā)明的方法中的制劑可以包含一種或更多種BRAF抑制劑、一種或更多種用于其的藥學(xué)上可接受的載體和任選地一種或更多種另外的治療劑或成分。制劑可以呈單位劑型方便地呈現(xiàn)，并且可通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備。取決于待被治療的受試者和特定的施用方式，可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將不同?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生藥學(xué)上有效劑量的BRAF抑制劑的量通常將是產(chǎn)生治療效果的BRAF抑制劑的量。

在一些實施方案中，制劑可以適合于口服施用，以用于治療口腔傷口或瘡。在此類實施方案中，制劑可以呈固體劑型(例如，膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用風(fēng)味基礎(chǔ)，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)、散劑、顆粒劑)，或呈液體劑型(例如，作為在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液、作為水包油或油包水液體乳劑或微乳劑、作為酏劑或糖漿、作為糖果錠劑(使用惰性基質(zhì)，諸如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或作為漱口劑等等)，每種含有預(yù)定量的BRAF抑制劑作為活性成分。

在用于口服施用的固體劑型(例如，膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等等)中，BRAF抑制劑可以與一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣和/或以下的任何一種混合：1)填充物(filler)或填充劑(extender)，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；2)粘合劑，諸如，例如，羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；3)保濕劑，諸如甘油；4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；6)吸收加速劑，諸如季銨化合物；7)潤濕劑，諸如，例如，乙?；己蛦斡仓岣视王?；8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、以及其混合物；和10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可以被采用作為在使用諸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等等的賦形劑的軟填充和硬填充的明膠膠囊中的填充物。

在液體劑型中，BRAF抑制劑可以與本領(lǐng)域中通常使用的惰性稀釋劑混合，諸如，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯、以及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、香味劑和防腐劑。另外，懸浮液可以包含助懸劑，如例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃芪膠、以及其混合物。

在一些實施方案中，用于BRAF抑制劑組合物的局部、經(jīng)皮、表皮或皮膚施用的制劑包括散劑、噴霧、軟膏、糊劑、乳霜、洗液、凝膠、溶液、貼劑、敷料和吸入劑。活性組分可以在無菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體、以及與可需要的任何防腐劑、緩沖液或推進(jìn)劑混合。此類軟膏、糊劑、乳霜和凝膠除了BRAF抑制劑組合物之外可以包含賦形劑，諸如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。散劑和噴霧除了BRAF抑制劑組合物之外可以包含賦形劑，諸如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末、或這些物質(zhì)的混合物。噴霧可以另外含有通常的推進(jìn)劑，諸如氯氟烴和揮發(fā)性的未被取代的烴，諸如丁烷和丙烷。

在某些方面，BRAF抑制劑或其藥物組合物可以通過霧化吸入被施用。這通過制備含有BRAF抑制劑的水性氣霧劑、脂質(zhì)體制品或固體顆粒或粉末來實現(xiàn)?？梢允褂梅撬?例如，氟碳化合物推進(jìn)劑)懸浮液。也可以使用聲波噴霧器。水性氣霧劑通過將劑的水性溶液或懸浮液與常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體和穩(wěn)定劑配制在一起制成。載體和穩(wěn)定劑隨著特定化合物的需要而不同，但通常包括非離子型表面活性劑(吐溫、普朗尼克或聚乙二醇)、無害的蛋白質(zhì)如血清白蛋白、脫水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(諸如甘氨酸)、緩沖液、鹽、糖或糖醇。通常從等滲溶液制備氣霧劑。

經(jīng)皮貼劑或傷口敷料還可以用于將BRAF抑制劑或其藥物組合物遞送到傷口部位。在上文詳細(xì)描述了可以使用的傷口敷料的實例。此類制劑可以通過將劑溶解或分散在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中制成。吸收促進(jìn)劑還可以用于增加擬肽穿透皮膚的通量。此類通量的速率可通過提供速率控制膜或?qū)M肽分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制。

在一些實施方案中，在治療傷口的方法中使用的BRAF抑制劑或其藥物組合物是傷口敷料的部分。在一些方面，這意味著，BRAF抑制劑或其藥物組合物被用于涂覆或浸漬如上文描述的傷口敷料的全部或一部分?？梢愿鶕?jù)該實施方案使用的傷口敷料包括，藻酸鹽敷料、抗微生物敷料、繃帶、生物合成的敷料、生物敷料、膠原敷料、復(fù)合敷料、壓縮敷料、接觸層敷料、泡沫敷料、紗布敷料、水膠體敷料、水凝膠敷料、皮膚密封劑或液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料或傷口填充物。

如本文使用的術(shù)語“有效量”指產(chǎn)生期望的效果的BRAF抑制劑的量。例如，細(xì)胞群體可以與有效量的BRAF抑制劑接觸以研究其體外效果(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)或以產(chǎn)生期望的離體或體外治療效果。有效量的BRAF抑制劑可以用于在受試者中產(chǎn)生治療效果，諸如治療靶狀況、緩解與狀況相關(guān)的癥狀或產(chǎn)生期望的生理作用。例如，BRAF抑制劑的有效量可以是刺激傷口愈合的量。在此類情況中，BRAF抑制劑的有效量是“治療有效量”、“治療有效濃度”或“治療有效劑量”。精確的有效量或治療有效量是在給定的受試者或細(xì)胞群體中在治療功效方面將產(chǎn)生最有效結(jié)果的BRAF抑制劑的量。該量將取決于多種因素而不同，所述因素包括但不限于BRAF抑制劑的特征(包括活性、藥代動力學(xué)、藥效動力學(xué)和生物利用度)、受試者的生理狀況(包括年齡、性別、傷口類型和狀態(tài)、全身性狀況、對給定劑量的反應(yīng)和藥物的類型)或細(xì)胞的生理狀況、制劑中的藥學(xué)上可接受的一種或更多種載體的性質(zhì)、和施用途徑。另外，取決于BRAF抑制劑是單獨施用還是與化合物、藥物、療法或其他治療方法或方式組合施用，有效量或治療有效量可以不同。臨床和藥理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過常規(guī)實驗將能夠確定有效量或治療有效量，也就是通過監(jiān)測細(xì)胞或受試者對施用的BRAF抑制劑的反應(yīng)并且相應(yīng)地調(diào)整劑量將能夠確定有效量或治療有效量。對于另外的指導(dǎo)，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21^st Edition,Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005，其在此通過引用被并入，如同在本文充分陳述。

傷口的治療“(treating)”或“治療(treatment)”可以指使用任何劑或敷料以幫助治愈、保護(hù)、修復(fù)或恢復(fù)急性或慢性受傷的、損傷的或患病的組織的結(jié)構(gòu)和功能；預(yù)防狀況，減慢狀況的發(fā)作或發(fā)展的速率，預(yù)防或降低發(fā)生繼發(fā)于傷口的狀況的風(fēng)險，殺死存在于傷口部位的抗微生物感染，預(yù)防或延遲與傷口相關(guān)的疼痛和其他癥狀的發(fā)展，減少或終止與傷口相關(guān)的疼痛和其他癥狀，產(chǎn)生傷口的完全或部分消退，或其一些組合。

在一些實施方案中，如以上描述的BRAF抑制劑或其藥物組合物可以與一種或更多種另外的治療劑組合或聯(lián)合施用或遞送。BRAF抑制劑與治療劑可一起疊加地或協(xié)同地作用。如本文使用的“組合”、“與……組合”或“與……聯(lián)合”意指在治療同一受試者的同一傷口的過程中，以任何順序并且以任何次數(shù)的應(yīng)用，使用兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合。這包括同時施用及以間隔多達(dá)若干天的時間上間隔的順序的施用。兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合可以是單一應(yīng)用或施用的部分，或可被分開應(yīng)用或施用。例如，BRAF抑制劑可以作為藥物組合物或制劑的成分被施用。該組合物或制劑可以包括作為單一局部用組合物被應(yīng)用的一種或更多種另外的治療劑，或可選地，該組合物可與含有一種或更多種另外的治療劑的第二治療組合物或制劑一起應(yīng)用于傷口。當(dāng)應(yīng)用組合物或制劑后，可在局部用組合物上應(yīng)用傷口敷料。在另一個實例中，BRAF抑制劑可單獨地或作為藥物組合物的部分被用于浸漬傷口敷料。組合治療還可以包括多于一次施用劑、藥物、治療方案或治療方式中的任何一種或更多種。此外，兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合的施用可通過同一或不同的施用途徑進(jìn)行。

可以與BRAF抑制劑和其藥物組合物組合或聯(lián)合施用或遞送的合適的治療劑可包括但不限于傷口治療劑諸如生長因子(例如，重組血小板來源的生長因子(PDGF；/貝卡普勒明凝膠))、基于魚皮的MariGen Omega3組織再生技術(shù)、糖、抗酸藥、維生素A、維生素D、抗微生物劑和防腐劑(例如，醋酸、酸化亞硝酸鹽、acticoat 7、aquacel-Ag、抗微生物肽、桿菌肽、BCTP納米乳劑、卡地姆碘、碘、西曲溴銨、氯己定、精油、flammacerium、FPQC、夫西地酸、慶大霉素、葡糖酸鹽、六氯酚、蜂蜜、碘化合物、碘酊、脂質(zhì)體碘、醋酸磺胺米隆、甲硝唑、莫匹羅星、莫匹羅星鈣、硫酸新霉素、新孢霉素、硝基糠腙、制霉菌素、噬菌體療法、木瓜、益生素、多粘菌素B、聚維酮碘、瑞他帕林、次氯酸鈉、過氧化氫、銀、silvercel、銀羊膜、硝酸銀、銀敷料、銀泡沫、磺胺嘧啶銀、磺胺醋酰Na⁺和超氧水)；和止痛劑諸如發(fā)紅劑(例如，水楊酸鹽、煙酸鹽、辣椒素、辣椒提取物)、NSAID(例如，布洛芬、雙氯芬酸、聯(lián)苯乙酸、酮洛芬、吡羅昔康、萘普生、氟比洛芬)、氫化可的松、苯扎氯銨、芐達(dá)明、多磺酸粘多糖、水楊酰胺、苯酚、冷卻噴霧、爐甘石和局部麻醉劑(例如，利多卡因、利諾卡因、丙胺卡因、苯佐卡因、普莫卡因、地布卡因)。

以下實施例旨在說明本發(fā)明的多種實施方案。如此，討論的特定實施方案不被解釋為對本發(fā)明范圍的限制。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的是可以做出多個等同物、變化和修改而不偏離發(fā)明的范圍，并且應(yīng)理解，此類等同的實施方案將被本文包括。例如，盡管下面的實施例針對的是用維羅非尼治療進(jìn)行的實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，其他BRAF抑制劑可被用于代替維羅非尼以產(chǎn)生類似的結(jié)果。此外，本公開內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)在此通過引用以其整體被并入，如同在本文充分陳述。

實施例

BRAF抑制劑對于治療患有BRAF^V600E突變的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者是高度有活性的，其主要副作用是一系列的皮膚增殖變化，從過度角化到浸潤性鱗狀細(xì)胞癌。這些副作用的致病基礎(chǔ)是由MAPK通路的特殊激活介導(dǎo)的，其中BRAF抑制劑增加了為BRAF野生型的細(xì)胞中的MAPK通路信號傳導(dǎo)。在下面的研究中利用了該現(xiàn)象以通過誘導(dǎo)增加的皮膚細(xì)胞增殖來加速皮膚傷口愈合。在刮傷測定中，BRAF抑制劑維羅非尼加速了人類角化細(xì)胞的增殖和遷移，這是由增加的ERK磷酸化和細(xì)胞周期進(jìn)程介導(dǎo)的。在傷口愈合小鼠模型中，局部應(yīng)用的維羅非尼通過特殊MAPK激活改善了愈合的傷口的牽張強度，如通過基因表達(dá)譜分析評價的。因此，局部用BRAF抑制劑可在加速皮膚傷口的愈合方面具有應(yīng)用。

實施例1：BRAF抑制劑增強角化細(xì)胞的再生長以覆蓋體外刮傷部位

使在96孔板中培養(yǎng)的人類成人上皮角化細(xì)胞(HEKa)經(jīng)歷刮傷測定，其中增殖的角化細(xì)胞應(yīng)該再生長并且覆蓋刮傷。將具有或不具有BRAF抑制劑維羅非尼的重復(fù)培養(yǎng)物放置在具有自動顯微鏡分析儀的培養(yǎng)箱中，并且隨著時間的推移記錄了原始刮傷中有核細(xì)胞的數(shù)目。維羅非尼的存在誘導(dǎo)了覆蓋原始刮傷方面的統(tǒng)計學(xué)上顯著的改善，這在研究開始后的6、8和12小時非常明顯(圖2A和圖3A)。使用在每個孔的中部具有播種機閉鎖裝置(seeder stopper)的96孔板，在維羅非尼的存在下培養(yǎng)的HEKa的增殖優(yōu)勢也是明顯的；用維羅非尼處理的增殖的角化細(xì)胞在24小時后覆蓋孔的中部，而對照處理的孔在中部仍沒有細(xì)胞(圖2B)。通過將曲美替尼(一種MEK抑制劑)添加到用維羅非尼處理的培養(yǎng)物中抑制了增強的遷移(圖2B；“TRAME”)。此外，三維軟瓊脂集落測定了暴露于維羅非尼后增殖的HEKa集落，而BRAF^V600E突變的黑素瘤系M249具有集落的減少(圖2C和圖3B)。HEKa集落不但數(shù)目增加，而且其平均斑點尺寸也顯著地增加(通過t-檢驗的p＝0.007，圖2D)。添加曲美替尼減小了由維羅非尼誘導(dǎo)的HEKa集落的數(shù)目和尺寸(圖2E)。使用這些培養(yǎng)物，通過蛋白印跡(圖2F-2G)和定量磷酸化流式細(xì)胞術(shù)(圖2H和圖4A-4B)分析了特殊MAPK激活和細(xì)胞增殖。通過這兩種測定，維羅非尼在BRAF^V600E突變的人類黑素瘤細(xì)胞系M249中誘導(dǎo)了預(yù)期降低的pERK和細(xì)胞周期停滯，而在HEKa細(xì)胞中則存在pERK和細(xì)胞周期進(jìn)程的特殊增加(通過t-檢驗的p＝0.0225)。

實施例2：BRAF抑制劑由于上皮細(xì)胞的特殊增殖增強皮膚傷口的愈合

在C3H小鼠中的受控制的傷口愈合測定中，誘導(dǎo)了2.5cm的背部皮膚傷口并且用媒介物對照(DMSO/生理鹽水)或在媒介物中的2mM的維羅非尼的懸浮液(通過粉碎該劑的臨床級丸劑獲得)填充。在第0天用手術(shù)方法剪出皮膚傷口，并且追蹤小鼠直到第14天(圖5A-5B)。在這段時間，每隔一天分別向測試組中的24只小鼠或?qū)φ战M中的24只小鼠局部應(yīng)用維羅非尼懸浮液或媒介物對照，每只小鼠共七個劑量。在第14天，小鼠被安樂處死并且取下含有傷口的皮膚并且安裝在20mm條狀物中，每個條狀物中一個橫斷面(horizontal)傷口樣品。使用拉力計分析傷口牽張強度(WTS)，所述拉力計拉伸條狀物并且記錄以克力(gf)計的WTS。在三次獨立的重復(fù)實驗中，用維羅非尼治療的小鼠相比于生理鹽水對照在WTS方面具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的改善(52.6％、32.9％和42.8％，通過t-檢驗的p<0.0001；圖5C，實驗#1-3)。在單獨的皮膚傷口愈合測定中，通過用維羅非尼治療的WTS方面的37％的改善(對比媒介物對照通過t-檢驗的p＝0.01)通過添加1mg/kg的曲美替尼被部分地逆轉(zhuǎn)(圖5B；“TRAME”、“VEM+TRAME”)。對于這些傷口，相比于媒介物對照，WTS降低至29％(通過t-檢驗的p<0.0001；圖5C，實驗#4)。

傷口和其周圍的區(qū)域由兩名病理學(xué)家通過H&E染色在組織學(xué)上進(jìn)行分析，并且在治療后第1天、第2天和第6天測量在愈合的傷口兩側(cè)的表皮增生的程度(圖6A和6B)。在切割后第1天，在維羅非尼的存在下傷口鄰近的表皮炎癥更廣泛，強烈和快速的再上皮化在第2天起始。到第6天，在維羅非尼治療的組中表面完整性被重建，而在用媒介物、曲美替尼或組合治療的小鼠中未觀察到真皮修復(fù)性纖維化的跡象。在曲美替尼或維羅非尼和曲美替尼治療的小鼠中未觀察到愈合或再上皮化的征象，并且傷口潰爛，尤其是僅用曲美替尼治療的小鼠(圖6A)。在第1天和第2天，來自維羅非尼組的皮膚傾向展示比其他治療組覆蓋更大距離的表皮增生(通過單因素ANOVA，分別地，p＝0.0132和p＝0.0338)，而到第6天，維羅非尼組具有較少的表皮增生，與較快的傷口消退相一致(通過單因素ANOVA的p＝0.0012；圖4B)。到第6天，79％的對照傷口顯示再上皮化，而100％的維羅非尼治療的傷口完全再上皮化。在單獨的曲美替尼中和維羅非尼與曲美替尼組合的組中未觀察到再上皮化。

實施例3：BRAF抑制劑增強MAPK和傷口愈合通路輸出

通過RNASeq分析從用維羅非尼或媒介物治療的小鼠獲得的皮膚樣品的MAPK和傷口愈合通路輸出中的變化。將MAPK的基因輸出與公布的數(shù)據(jù)或與公布的皮膚傷口愈合基因特征比較，所述公布的數(shù)據(jù)關(guān)于通過使用BRAF抑制劑阻斷突變的BRAF^V600E下游的致癌MAPK信號傳導(dǎo)被差異調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。如在圖7中通過基因表達(dá)熱圖顯示的，到第2天(“D2”)，在維羅非尼治療后的BRAF特征中存在略微增加，但在傷口愈合特征中幾乎無變化。到第6天(“D6”)，在維羅非尼治療的樣品中兩種特征相比于其各自的對照被顯著富集。在維羅非尼治療的傷口中觀察到BRAF和傷口愈合特征的更明顯的降低，與較快愈合相一致。特征的基因集合變異分析(GSVA)富集得分顯示相同的趨勢。

總體地，在上文實施例1-3中描述的研究表明，通過BRAF抑制劑的特殊MAPK激活現(xiàn)象可以被利用以增強皮膚傷口愈合。這可以具有加速其中惡性腫瘤前期或惡性腫瘤不是臨床問題的皮膚傷口諸如擦傷、手術(shù)切口和糖尿病性皮膚潰瘍的愈合的用途。

參考文獻(xiàn)

下面列出的參考文獻(xiàn)、專利和公布的專利申請，及以上說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)在此通過引用以其整體被并入，如同在本文充分陳述。

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