本發(fā)明在腦膜炎球菌疫苗接種的領(lǐng)域中。背景腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)是一種革蘭陰性莢膜細菌，其定居在大約10％人群的上呼吸道。針對血清群A、C、W135和Y的綴合物疫苗可用，但可用于保護免于血清群B的唯一疫苗通常是在2013年批準的BEXSERO?產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括四種主要免疫原性組分：因子H結(jié)合蛋白，‘fHbp’；肝素結(jié)合蛋白，NHBA；奈瑟氏菌黏附素A，NadA；和外膜囊泡(OMV)。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是免疫原性組合物，其包含與以下中的一種或多種組合的包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)腦膜炎球菌外膜囊泡。本發(fā)明的一個進一步方面是免疫原性組合物，其包含與以下中的一種或多種組合的腦膜炎球菌外膜囊泡：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽；其中外膜囊泡(OMV)以5-30μg/ml的濃度存在。具體地，包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽是穩(wěn)定化的和/或fHbp非結(jié)合融合多肽。又更具體地，v1fHbp包含位置R41的突變，例如R41S突變。還更具體地，v2和v3fHbp多肽在根據(jù)全長序列(SEQIDNO:1和3)以及根據(jù)ΔG序列(SEQIDNO:8和7)編號的以下位置包含一個或多個穩(wěn)定化和/或因子H(fH)非結(jié)合突變：本發(fā)明的一個進一步方面是免疫原性組合物，其包含具有式NH2—A-[-X-L]3-B—COOH的氨基酸序列的融合多肽，其中每個X是不同的變體fHbp序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N末端氨基酸序列，且B是任選的C末端氨基酸序列。本發(fā)明的一個進一步方面是保護哺乳動物諸如人免于腦膜炎球菌感染的方法，其包括施用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物。附圖簡述圖1顯示RCD曲線，其具有y軸上的比例(0.0至1.0)和x軸上的SBA滴度(0至256，以16的步幅(steps))。最上面曲線是組C；最快達到0.0的組是S。圖2提供引入v1、v2和v3fHbp多肽以產(chǎn)生731S和731SNB融合蛋白的穩(wěn)定化且因子H(fH)非結(jié)合的突變的示意圖。圖3(a)-(g)表明包含741-231融合體(SEQIDNO:10)和1/4OMV的組合物與BEXSEROTM相比引發(fā)更高的針對七種測試菌株(3a=v2，3b=v2，3c=v3，3d=v3，3e=v2，3f=v2，3g=v3)的GMT。詳述為了增強BEXSERO?產(chǎn)品，進一步增強BEXSERO?針對不同腦膜炎球菌菌株的覆蓋度(在隨著疫苗的使用擴散的潛在轉(zhuǎn)變和突變的情況下)且還減少罕見的發(fā)熱發(fā)生(當該疫苗與常規(guī)嬰兒疫苗共同施用時有時可見[1])將是有利的。為了這些目的，本發(fā)明人以兩種方式修飾BEXSERO?：(i)包括fHbp的多個等位基因或變體，以便提供對于該蛋白已知的多樣性的更廣覆蓋度；和(ii)減少每個劑量中的OMV組分的量。如本文中所示，這兩個修飾確實導致疫苗的改善。因此，在第一個實施方案中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含與以下中的一種或多種組合的包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)腦膜炎球菌外膜囊泡。此外，在第二個實施方案中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含與以下中的一種或多種組合的腦膜炎球菌外膜囊泡：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽；其中外膜囊泡以5-30μg/ml的濃度存在。類似地，組合這兩個實施方案，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含(i)包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽、(ii)NHBA多肽、(iii)NadA多肽和(iv)5-30μg/ml腦膜炎球菌外膜囊泡。因子H結(jié)合蛋白(fHbp)本發(fā)明的組合物可以包括免疫原性fHbp多肽。BEXSERO?產(chǎn)品包括fHbp多肽，且fHbp也稱為'741'(參考文獻2中的SEQIDNO:2536；本文中的SEQID1)、'NMB1870'、'GNA1870'[3-5]、'P2086'、'LP2086'或'ORF2086'[6-8]。該蛋白的3D結(jié)構(gòu)是已知的[9，10]，且該蛋白具有通過短接頭連接的兩個β-桶(β-barrels)。許多出版物都報道了該蛋白在腦膜炎球菌疫苗中的保護效力，例如參見參考文獻11-15。該蛋白在所有血清群的多種菌株中以脂化形式表達。已將fHbp序列分為三種變體[3](在本文中稱為v1、v2和v3)，并且已通常發(fā)現(xiàn)針對給定變體產(chǎn)生的血清針對表達該變體的菌株是殺細菌的，但其對表達其他兩種變體之一的菌株無活性，即存在變體內(nèi)交叉保護、但不存在變體間交叉保護(除了一些v2和v3交叉反應(yīng)性)。為了增加變體間交叉反應(yīng)性，fHbp序列已被工程改造以含有針對所有三種變體的特異性[16]。然而，代替遵循該方法，本發(fā)明利用包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽。v1fHbpv1中來自菌株MC58的全長fHbp具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:1)：成熟脂蛋白缺乏SEQIDNO:1的前19個氨基酸(加下劃線；提供SEQIDNO:4，以Cys-20開始)。BEXSERO?產(chǎn)品包括v1fHbp的‘ΔG’形式，其中全長序列被截短最多達殘基26(即去除聚甘氨酸區(qū)段，并且代替以Val-27開始)，得到SEQIDNO:7。本發(fā)明所用的v1腦膜炎球菌fHbp將包含(i)與SEQIDNO:7具有至少i%序列同一性和/或(ii)包含SEQIDNO:7的片段的氨基酸序列。i的值可以選自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其優(yōu)選為90(即，所述氨基酸序列與SEQIDNO:7具有至少90％同一性)且更優(yōu)選為95。(ii)的片段將通常為至少7個氨基酸長，例如來自SEQIDNO:7的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多個連續(xù)氨基酸。所述片段將通常包括來自SEQIDNO:7的至少一個表位。對于fHbp確立了表位鑒定和作圖[12；17-21]。與SEQIDNO:7共享至少30個連續(xù)氨基酸將是典型的，并且通常v1fHbp氨基酸序列將包括來自SEQIDNO:7的幾個(例如2、3、4、5個或更多個)片段。總體而言，v1fHbp氨基酸序列可以與SEQIDNO:7具有至少i%序列同一性且包括SEQIDNO:7的幾個片段。v1fHbp序列通常包括至少一個不存在于SEQIDNO:2中的氨基酸序列和/或至少一個不存在于SEQIDNO:3中的氨基酸序列。施用于合適宿主哺乳動物(諸如小鼠或人)之后，本發(fā)明所用且包括v1序列的多肽可以引發(fā)可以識別由SEQIDNO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽的抗體。這些抗體將包括不識別v2或v3多肽(例如，將不識別由SEQIDNO:5組成的野生型腦膜炎球菌多肽和由SEQIDNO:6組成的野生型腦膜炎球菌多肽)的一些抗體，盡管它們還可以包括與v2和/或v3多肽交叉反應(yīng)的一些抗體。所述抗體理想地針對表達v1fHbp的腦膜炎球菌菌株、例如針對MC58菌株是殺細菌的(參見下文)。v2fHbpv2中來自菌株2996的全長fHbp具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:2)：成熟脂蛋白缺乏SEQIDNO:2的前19個氨基酸(加下劃線；提供了SEQIDNO:5)，且SEQIDNO:2的ΔG形式缺乏前26個氨基酸(SEQIDNO:8)。本發(fā)明所用的v2腦膜炎球菌fHbp將包含(i)與SEQIDNO:8具有至少j%序列同一性和/或(ii)包含SEQIDNO:8的片段的氨基酸序列。j的值可以選自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更多。其優(yōu)選為90(即，所述氨基酸序列與SEQIDNO:8具有至少90％同一性)且更優(yōu)選為95。(ii)的片段將通常為至少7個氨基酸長，例如來自SEQIDNO:8的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多個連續(xù)氨基酸。所述片段將通常包括來自SEQIDNO:8的至少一個表位。對于fHbp確立了表位鑒定和作圖(參見上文)。與SEQIDNO:8共享至少30個連續(xù)氨基酸將是典型的，并且通常v2fHbp氨基酸序列將包括來自SEQIDNO:8的幾個(例如2、3、4、5個或更多個)片段。總體而言，v2fHbp氨基酸序列可以與SEQIDNO:8具有至少j%序列同一性且包括SEQIDNO:8的幾個片段。v2fHbp序列通常包括至少一個不存在于SEQIDNO:1中的氨基酸序列和/或至少一個不存在于SEQIDNO:3中的氨基酸序列。施用于合適宿主哺乳動物(諸如小鼠或人)之后，本發(fā)明所用且包括v2序列的多肽可以引發(fā)可以識別由SEQIDNO:5組成的野生型腦膜炎球菌多肽的抗體。這些抗體將包括不識別v1或v3多肽(例如，將不識別由SEQIDNO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽和由SEQIDNO:6組成的野生型腦膜炎球菌多肽)的一些抗體，盡管它們還可以包括與v1和/或v3多肽交叉反應(yīng)的一些抗體。所述抗體理想地針對表達v2fHbp的腦膜炎球菌菌株、例如針對M2091菌株是殺細菌的(參見下文)。v3fHbpv3中來自菌株M1239的全長fHbp具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:3)：成熟脂蛋白缺乏SEQIDNO:3的前19個氨基酸(加下劃線；提供了SEQIDNO:6)，且SEQIDNO:3的ΔG形式缺乏前31個氨基酸(SEQIDNO:9)。本發(fā)明所用的v3腦膜炎球菌fHbp將包含(i)與SEQIDNO:9具有至少k%序列同一性和/或(ii)包含SEQIDNO:9的片段的氨基酸序列。k的值可以選自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更多。其優(yōu)選為90(即，所述氨基酸序列與SEQIDNO:9具有至少90％同一性)且更優(yōu)選為95。(ii)的片段將通常為至少7個氨基酸長，例如來自SEQIDNO:9的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多個連續(xù)氨基酸。所述片段將通常包括來自SEQIDNO:9的至少一個表位。對于fHbp確立了表位鑒定和作圖(參見上文)。與SEQIDNO:9共享至少30個連續(xù)氨基酸將是典型的，并且通常v1fHbp氨基酸序列將包括來自SEQIDNO:9的幾個(例如2、3、4、5個或更多個)片段?？傮w而言，v3fHbp氨基酸序列可以與SEQIDNO:9具有至少k%序列同一性且包括SEQIDNO:9的幾個片段。v3fHbp序列通常包括至少一個不存在于SEQIDNO:1中的氨基酸序列和/或至少一個不存在于SEQIDNO:2中的氨基酸序列。施用于合適宿主哺乳動物(諸如小鼠或人)之后，本發(fā)明所用且包括v3序列的多肽可以引發(fā)可以識別由SEQIDNO:6組成的野生型腦膜炎球菌多肽的抗體。這些抗體將包括不識別v1或v2多肽(例如，將不識別由SEQIDNO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽和由SEQIDNO:5組成的野生型腦膜炎球菌多肽)的一些抗體，盡管它們還可以包括與v1和/或v2多肽交叉反應(yīng)的一些抗體。所述抗體理想地針對表達v3fHbp的腦膜炎球菌菌株、例如針對M01-240355菌株是殺細菌的(參見下文)。融合多肽本發(fā)明利用包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽。作為結(jié)果，所述融合多肽可以包括來自SEQIDNO:7、8和9中每一個的至少一個表位，并且在施用于宿主哺乳動物后，可以引發(fā)可以識別以下中所有三種的抗體：(i)由SEQIDNO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽、(ii)由SEQIDNO:5組成的野生型腦膜炎球菌多肽和(iii)由SEQIDNO:6組成的野生型腦膜炎球菌多肽。這些抗體理想地針對表達v1fHbp的腦膜炎球菌菌株、表達v2fHbp的腦膜炎球菌菌株以及表達v3fHbp的腦膜炎球菌菌株(例如針對MC58、M2091和M01-240355菌株中的每一種)是殺細菌的。參考上文給出的定義，當相關(guān)時，對于所述融合多肽，優(yōu)選i=j=k。通常，本發(fā)明的fHbp融合多肽具有下式的氨基酸序列：NH2—A-[-X-L-]3-B—COOH其中每個X是不同的變體fHbp序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，且B是任選的C-末端氨基酸序列。三個X部分是如本文所討論的v1、v2和v3序列。這些可以以從N-末端至C-末端的任何順序存在，即v1-v2-v3、v1-v3-v2、v2-v1-v3、v2-v3-v1、v3-v1-v2或v3-v2-v1。最優(yōu)選的順序是v2-v3-v1。對于[-X-L-]的每種情況，接頭氨基酸序列-L-可以存在或不存在。接頭氨基酸序列-L-通常是短的(例如20個或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括促進克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(即Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQIDNO:42))和組氨酸標簽(即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQIDNO:43))。其他合適的接頭氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的。一種有用的接頭是GSGGGG(SEQIDNO:22)，其中Gly-Ser二肽從BamHI限制性位點形成，因此有助于克隆和操作。另一種有用的接頭是SEQIDNO:23，其可以任選地前置有Gly-Ser二肽(SEQIDNO:24，來自BamHI)或Gly-Lys二肽(SEQIDNO:25，來自HindIII)。-A-是任選的N-末端氨基酸序列。這通常是短的(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括引導蛋白運輸?shù)那皩蛄?。如果X1缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，則-A-可以在翻譯的多肽中提供此類甲硫氨酸殘基(例如，-A-是單個Met殘基)。Met可以在接頭序列諸如SEQIDNO:23的N-末端(即SEQID:26)，或在短序列的N-末端(例如SEQIDNO:27)。-B-是任選的C-末端氨基酸序列。這通常是短的(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括指導蛋白運輸?shù)男蛄校欣诳寺』蚣兓亩屉男蛄?例如包含組氨酸標簽，即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQIDNO:43))，或增強多肽穩(wěn)定性的序列。其他合適的C-末端氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的。一種合適的-B-部分是SEQIDNO:28，其中組氨酸標簽上游的Leu-Glu產(chǎn)生自XhoI限制性位點。適用于本發(fā)明的一種融合多肽包含SEQIDNO:10。根據(jù)上式，在SEQIDNO:10中，-A-是SEQIDNO:26，X1是v2fHbp序列(SEQIDNO:8)，-L1-是SEQIDNO:24，X2是v3fHbp序列(SEQIDNO:9)，-L2-是SEQIDNO:22，X3是v1fHbp序列(SEQIDNO:7)，且L3和B不存在。SEQIDNO:10中的三個fHbp序列如下加下劃線：用于本發(fā)明的更優(yōu)選融合多肽包含SEQIDNO:29。根據(jù)上式，在SEQIDNO:29中，-A-是SEQIDNO:26，X1是v2fHbp序列(SEQIDNO:8)，-L1-是SEQIDNO:22，X2是v3fHbp序列(SEQIDNO:9)，-L2-是SEQIDNO:22，X3是v1fHbp序列(SEQIDNO:7)，且L3和B不存在。SEQIDNO:29中的三個fHbp序列如下加下劃線：因此，本發(fā)明理想地利用具有氨基酸序列SEQIDNO:10或SEQIDNO:29的多肽，但本發(fā)明還可以使用包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:29、但通過最多達10個單一氨基酸改變(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)修飾的多肽，條件是所述多肽可以引發(fā)可以識別如上所討論的SEQIDNO:4-6的野生型腦膜炎球菌多肽中的所有三種的抗體。此外，可以修飾SEQIDNO:10或SEQIDNO:29以改變其-A-部分(例如使用SEQIDNO:26的替代物)，所以本發(fā)明所用的多肽可以包含SEQIDNO:30，其任選地通過最多達10個單一氨基酸改變來修飾(如上所討論)。例如，可以修飾SEQIDNO:30以引入破壞每個fHbp與fH相互作用的能力的點突變。例如，SEQIDNO:30可以在殘基E240、E496和R543處突變，由此得到SEQIDNO:31(包含突變E240X、E496X和R543X，其中X是除了所述氨基酸以外的任何氨基酸，即，E240X是指在殘基240處除了E以外的任何氨基酸)。SEQIDNO:31的一個優(yōu)選實施方案是SEQIDNO:32(其包含突變E240A、E496A、R543S)。本發(fā)明可以使用SEQIDNO:31(例如SEQIDNO:32)，其任選地通過最多達5個單一氨基酸改變來修飾(如上所討論)，條件是殘基E240、E496和R543不存在。此外，可以修飾SEQIDNO:30以引入增加fHbp的穩(wěn)定性的點突變。例如，SEQIDNO:30可以在殘基S32、L123、S285和L379處突變，由此得到SEQIDNO:33(其包含突變S32X、L123X、S285X和L379X)。SEQIDNO:33的一個優(yōu)選實施方案是SEQIDNO:34(其包含突變S32V、L123R、S285V、L379R)。本發(fā)明可以使用SEQIDNO:33(例如SEQIDNO:34)，其任選地通過最多達5個單一氨基酸改變來修飾(如上所討論)，條件是殘基S32、L123、S285和L379不存在。一種此類多肽是SEQIDNO:35，其中v1序列已經(jīng)被修飾以包括參考文獻22中報道的突變，例如‘R41S’突變(SEQIDNO:36)。SEQIDNO:35包含突變S32X、L123X、S285X、L379X和R543X，且SEQIDNO:36包含突變S32V、L123R、S285V、L379R和R543S。‘R41S’命名法相對于成熟v1多肽(SEQIDNO:4)進行編號，因此，例如，其作為R543X存在于SEQIDNO:35融合多肽中，且作為R543S存在于SEQIDNO:36中?？梢越M合這些多種方法，因此本發(fā)明可以利用包含SEQIDNO:37的多肽(例如，具有氨基酸序列SEQIDNO:38的多肽)。SEQIDNO:37和SEQIDNO:38包含突變S32V、L123R、E240A、S285V、L379R、E496A和R543S。SEQIDNO:38進一步在N-末端包含SEQIDNO:26。在一個進一步實施方案中，本發(fā)明可以使用SEQIDNO:39(其包含突變L123X和L379X)，例如SEQIDNO:40(其包含突變L123R和L379R)。本發(fā)明可以類似地使用SEQIDNO:39(例如SEQIDNO:40)，其任選地通過最多達5個單一氨基酸改變來修飾(如上所討論)，條件是殘基L123和L379不存在(例如參見SEQIDNO：34，其通過包括如上所示的兩個S/V取代而不同于SEQIDNO:40)。一種此類多肽是SEQIDNO:41，其中v1序列已經(jīng)被修飾以包括‘R41S’突變，因此包含L123R、L379R和R543S。在進一步實施方案中，當此類融合蛋白存在于本發(fā)明的組合物中時，OMV可以以2.5μg/ml至12.5μg/ml的濃度存在。相對于特定起始序列定義對于上述突變所示的氨基酸殘基。任何其他fHbp序列中的相應(yīng)氨基酸殘基可以通過序列比對容易地鑒定，例如是這樣的氨基酸：當使用雙序列比對算法(例如，Needleman-Wunsch全局比對算法，如下面詳述)比對時，其與本文提及的氨基酸對齊。通常所述氨基酸將是相同的，但如果不是這樣，所述比對將容易地鑒定出來。fHbp是腦膜炎奈瑟氏菌的天然脂蛋白。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其當在大腸桿菌中具有其天然前導序列或具有異源前導序列表達時被脂化。本發(fā)明的多肽可具有可被脂化的N-末端半胱氨酸殘基，例如，其包含棕櫚酰基，通常形成三棕櫚酰-S-甘油酰-半胱氨酸。然而，在通常實施方案中，本發(fā)明的融合多肽在表達宿主中不被脂化(通常因為N-末端-A-部分并不引導脂化)。奈瑟氏菌肝素結(jié)合抗原(NHBA)本發(fā)明的組合物可以包括免疫原性NHBA多肽。NHBA抗原作為基因NMB2132包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[23]中(GenBank登錄號GI：7227388；本文為SEQIDNO:11)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NHBA抗原的序列。例如，NHBA的等位基因形式可見于參考文獻24的圖5和15中和參考文獻2的實施例13和圖21中(其中的SEQID3179至3184)。還已經(jīng)報道了NHBA抗原的各種免疫原性片段，包括SEQIDNO:12的‘ΔG’片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的NHBA抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQIDNO:12具有60％或更高同一性(例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQIDNO:12的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQIDNO:12的表位。在施用于合適的宿主哺乳動物(諸如小鼠或人)之后，本發(fā)明的最有用的NHBA抗原可以引發(fā)可以結(jié)合由氨基酸序列SEQIDNO:13組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于哺乳動物主體之后，用于本發(fā)明使用的有利的NHBA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發(fā)明所用的特別優(yōu)選的NHBA多肽包含SEQIDNO:12，其任選地通過最多達3個單一氨基酸改變(即1、2或3個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)來修飾，條件是所述多肽可以引發(fā)可以結(jié)合SEQIDNO:13的抗體，如上所討論。如在BEXSERO?產(chǎn)品中所見，NHBA多肽可以有用地作為融合多肽存在，例如融合至NMB1030多肽。在此類融合多肽中，NMB1030優(yōu)選在NHBA的下游。來自菌株MC58的NMB1030具有GenBank登錄號GI：7226269(本文的SEQIDNO:14)。本發(fā)明所用的NMB1030序列可以包含以下氨基酸序列：(a)與SEQIDNO:14具有60％或更高同一性(例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQIDNO:14的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是30或更多。一種有用的NMB1030片段是SEQIDNO:15。一種此類NHBA-NMB1030融合多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:16。因此，本發(fā)明可以使用SEQIDNO:16，其任選地通過最多達3個單一氨基酸改變(即1、2或3個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)來修飾，條件是所述多肽可以引發(fā)可以結(jié)合SEQIDNO:13的抗體，如上所討論。奈瑟氏菌黏附素A(NadA)本發(fā)明的組合物可以包括免疫原性NadA多肽。NadA抗原作為基因NMB1994包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[23]中(GenBank登錄號GI：7227256；本文為SEQIDNO:17)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NadA抗原的序列，并且已經(jīng)充分記錄了該蛋白作為奈瑟氏菌黏附素的活性。也已經(jīng)報道了NadA的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的NadA抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQIDNO:17具有60％或更高同一性(例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQIDNO:17的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQIDNO:17的表位。在施用于宿主哺乳動物之后，本發(fā)明的最有用的NadA抗原可以引發(fā)可以結(jié)合至由氨基酸序列SEQIDNO:18組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于宿主哺乳動物之后，用于本發(fā)明使用的有利的NadA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發(fā)明所用的特別優(yōu)選的NadA多肽具有SEQIDNO:19，其任選地通過最多達3個單一氨基酸改變(即1、2或3個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)來修飾，條件是所述多肽可以引發(fā)可以結(jié)合SEQIDNO:18的抗體，如上所討論。腦膜炎球菌外膜囊泡(OMV)本發(fā)明的組合物包括腦膜炎球菌OMV，即通過破壞腦膜炎球菌外膜或從腦膜炎球菌外膜發(fā)泡(blebbing)以由其形成保留外膜的蛋白組分(例如PorA、PorB、RmpM、Opa、Opc、Omp85、FetA/FrpB、NspA等)的囊泡而獲得的任何蛋白脂質(zhì)體囊泡，其具有50-200nm范圍內(nèi)的直徑。因此，該術(shù)語可以包括OMV(有時被稱為“小泡(bleb)”)以及被稱為微泡(MV[25])或“天然OMV”(“NOMV”[26])的囊泡。還參見參考文獻27-33。典型的外膜囊泡從細菌人工制備，并且可使用去污劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去污劑方式(例如參見參考文獻37)制備。用于形成OMV的技術(shù)包括：用膽汁酸鹽去污劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、熊膽酸等的鹽，且脫氧膽酸鈉[34和35]優(yōu)選用于處理奈瑟氏菌)在不沉淀去污劑的足夠高pH下處理細菌[36]。其他技術(shù)基本上可以在去污劑不存在的情況下[37,38]使用技術(shù)諸如超聲處理、均質(zhì)化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、弗氏壓碎器壓碎(Frenchpress)、混合等來進行。不用去污劑或使用低去污劑的方法可以保留有用的抗原，諸如NspA和fHbp[127]。因此，本發(fā)明使用的OMV可以使用含有約0.5％或更低、例如約0.2％、約0.1％、＜0.05％或甚至零的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩沖液來制備。被稱為MV和NOMV的囊泡是天然存在的膜囊泡，其在細菌生長期間自發(fā)形成，且釋放至培養(yǎng)基中?？梢酝ㄟ^以下獲得MV：在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟氏菌，將肉湯培養(yǎng)基中的全細胞與較小MV分離(例如，通過過濾或通過低速離心以僅沉淀細胞而不沉淀較小囊泡)，然后從細胞耗竭的培養(yǎng)基收集MV(例如，通過過濾，通過差速沉淀或MV的聚集，通過高速離心以沉淀MV)。通?？筛鶕?jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量來選擇用于產(chǎn)生MV的菌株，例如，參考文獻45和46描述了具有高MV產(chǎn)量的奈瑟氏菌。囊泡可以從已經(jīng)遺傳操作的細菌制備[39-42]，例如，以增加免疫原性(例如超表達免疫原)、降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調(diào)PorA表達等。它們可以從高發(fā)泡菌株(hyperblebbingstrains)制備[43-46]?？墒褂脕碜跃哂胁煌琁類外膜蛋白亞型的細菌的囊泡，例如，使用兩種不同的遺傳工程改造的囊泡群體(各自展示三種亞型)的六種不同亞型[47,48]，或使用三種不同的遺傳工程改造的囊泡群體(各自展示三種亞型)的九種不同亞型等。有用的亞型包括：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1；P1.18-1,3,6。然而，通常，對于本發(fā)明優(yōu)選的是，從野生型腦膜炎球菌菌株制備OMV。因此，本發(fā)明所用的囊泡可以從任何野生型腦膜炎球菌菌株制備。所述囊泡通常來自血清群B菌株，但也可能從除了B以外的血清群(例如，參考文獻36公開了血清群A的方法)諸如A、C、W135或Y來制備囊泡。所述菌株可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亞型(例如，P1.4)和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3,7；L3,7,9；L10；等)。所述腦膜炎球菌可以來自任何合適的譜系，包括高侵襲性和高毒力譜系，例如以下七種高毒力譜系中的任一種：亞群I；亞群III；亞群IV-1；ET-5復合群(complex)；ET-37復合群；A4簇；譜系3。最優(yōu)選地，從菌株NZ98/254或具有P1.4PorA血清亞型的另一菌株制備OMV。本發(fā)明有利地使用BEXSERO?和MENZB?產(chǎn)品中使用的從菌株NZ98/254制備的相同OMV。囊泡將通常包括腦膜炎球菌LOS(也稱為LPS)，但OMV中的LOS的熱原效應(yīng)比用相同量的純化的LOS所見的熱原效應(yīng)低得多，并且OMV至氫氧化鋁的吸附進一步降低熱原性。LOS水平以內(nèi)毒素的國際單位(IU)表示，并且可以通過LAL測定法(鱟變形細胞溶解物)測試。優(yōu)選地，LOS以小于2000IU/μgOMV蛋白存在。當LOS存在于囊泡中，可處理囊泡，以便連接其LOS和蛋白組分(“泡內(nèi)”綴合[49])。用于OMV純化的一種有用方法描述于參考文獻50中，并且涉及對粗制OMV超濾，而非代替高速離心。該方法可以涉及在超濾進行之后的超離心的步驟。OMV也可以使用參考文獻51中描述的兩階段大小過濾方法進行純化。OMV可以在已經(jīng)制備它們之后有用地懸浮于蔗糖溶液中。組合本發(fā)明的組合物可以包括以下中的每種：(a)包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽、(b)NHBA多肽、(c)NadA多肽和(d)OMV。在此類組合中：(a)fHbp融合多肽理想地包含氨基酸序列SEQIDNO:10，但其任選地通過最多達10個單一氨基酸改變來修飾，如上所討論；(b)NHBA多肽理想地包含氨基酸序列SEQIDNO:12，但其任選地通過最多達3個單一氨基酸改變來修飾，如上所討論；且(c)NadA多肽理想地包含氨基酸序列SEQIDNO:19，但其任選地通過最多達3個單一氨基酸改變來修飾，如上所討論。更優(yōu)選地：(a)fHbp融合多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:10；(b)NHBA多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:12；且(c)NadA多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:19。甚至更優(yōu)選地：(a)fHbp融合多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:10；(b)NHBA多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:16；且(c)NadA多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:19。本發(fā)明的組合物中的多肽可以以導致宿主中的有效免疫應(yīng)答的任何濃度存在。該給藥可以通過常規(guī)測試建立，特別是鑒于由BEXSERO?產(chǎn)品提供的指導，所述BEXSERO?產(chǎn)品具有各自以100μg/ml存在的fHbp、NHBA和NadA多肽。因此，fHbp、NHBA和/或NadA多肽可以各自以20μg/ml至400μg/ml、例如50-150μg/ml、80-120μg/ml或約100μg/ml的濃度存在于本發(fā)明的組合物中。抗原濃度容易地通過標準蛋白測定法來定量。類似地，本發(fā)明的組合物中的OMV可以以導致宿主中的有效免疫應(yīng)答的任何濃度存在。該給藥可以通過常規(guī)測試建立，特別是鑒于由BEXSERO?產(chǎn)品提供的指導，在所述BEXSERO?產(chǎn)品中OMV以50μg/ml存在。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，OMV可以以20μg/ml至100μg/ml、例如30-75μg/ml、40-60μg/ml或理想地約50μg/ml的濃度存在于組合物中。然而，在本發(fā)明的第二個實施方案中，OMV以較低濃度(即5μg/ml至30μg/ml、例如10μg/ml至15μg/ml或理想地約12.5μg/ml)存在。在某些實施方案中，OMV以2.5μg/ml至12.5μg/ml、例如2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、5.5μg/ml、6.0μg/ml、6.5μg/ml、7.0μg/ml、7.5μg/ml、8.0μg/ml、8.5μg/ml、9.0μg/ml、9.5μg/ml和10μg/ml的較低濃度存在。本發(fā)明的組合物中的OMV量和濃度以與BEXSERO?產(chǎn)品中相同的方式、即通過參考其總蛋白含量來定義。這可以使用各種測定法來評價，例如，參考文獻29公開了Folin-Lowry測定法的使用。總蛋白可以根據(jù)歐洲藥典Ph.Eur.測定法2.5.33使用七種藥典方法中的任一種測定。方法2提供了Lowry測試，這是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的第二個實施方案的組合物包括具有5-30μg/ml總蛋白的OMV。多肽可通過各種方式，例如通過化學合成(至少部分地)，通過使用蛋白酶消化較長多肽，通過從RNA翻譯，通過從細胞培養(yǎng)物(例如從重組表達或從腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)物)純化等制備本發(fā)明的多肽。大腸桿菌宿主中的異源表達是優(yōu)選的表達途徑。本發(fā)明的多肽理想地為至少100個氨基酸長，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更長。例如，fHbp融合多肽通常為至少500aa長，NHBA多肽通常為至少400aa長，且NadA多肽通常為至少250aa長。優(yōu)選制備實質(zhì)上純或?qū)嵸|(zhì)上分離的形式的多肽(即實質(zhì)上不含其他奈瑟氏菌或宿主細胞多肽)。通常，在非天然存在的環(huán)境中提供所述多肽，例如，將其與其天然存在的環(huán)境分開。在某些實施方案中，與起始材料相比，所述多肽存在于富含所述多肽的組合物中。因此提供純化的多肽，其中純化的意指所述多肽存在于實質(zhì)上不含其他表達多肽的組合物中，其中實質(zhì)上不含意指所述組合物的總多肽中的超過50%(例如>75%、>80%、>90%、>95%或>99%)為本發(fā)明的多肽。多肽可以采用各種形式(例如，天然的，融合體，非糖基化的，脂化的，二硫鍵等)。序列諸如SEQIDNO:19不包括N-末端甲硫氨酸。如果通過在生物宿主中翻譯來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，則需要起始密碼子，其在大多數(shù)宿主中將提供N-末端甲硫氨酸。因此，本發(fā)明的多肽將至少在新生階段包括位于所述SEQIDNO序列上游的甲硫氨酸殘基。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物中的多肽可以包括(適當時)fHbp、NHBA或NadA多肽序列的上游的N-末端序列。在一些實施方案中，所述多肽在N-末端具有單一甲硫氨酸，隨后緊接著相關(guān)免疫原的氨基酸序列；在其他實施方案中，可以使用更長的上游序列。這樣的上游序列可以較短(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括指導蛋白運輸?shù)那皩蛄校蛴欣诳寺』蚣兓亩屉男蛄?例如組氨酸標簽，即Hisn，其中n＝4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQIDNO:44))。本發(fā)明的多肽也可以包括fHbp、NHBA或NadA(適當時)氨基酸序列的最后氨基酸下游的氨基酸。這樣的C-末端延伸可以較短(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括指導蛋白運輸?shù)男蛄?，有利于克隆或純化的短肽序?例如包含組氨酸標簽，即Hisn，其中n＝4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQIDNO:44))，或增強多肽穩(wěn)定性的序列。其他合適的C-末端氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的。術(shù)語“多肽”是指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語也涵蓋天然或通過干預修飾的氨基酸聚合物；所述干預例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分綴合。該定義還包括，例如，含有氨基酸的一個或多個類似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。多肽可以作為單鏈或締合鏈存在。本發(fā)明的多肽優(yōu)選在異源宿主(例如，在大腸桿菌中)重組表達，然后純化，然后與OMV組合并配制以提供本發(fā)明的組合物。在一些實施方案中，多肽包含如上所述的氨基酸序列，除了N-末端處的最多達10個(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸和/或C-末端處的最多達10個(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸缺失。殺細菌應(yīng)答如上所提及，本發(fā)明的優(yōu)選多肽和組合物可以引發(fā)針對腦膜炎球菌殺細菌的抗體應(yīng)答。殺細菌抗體應(yīng)答在免疫小鼠后方便地測量，并且是疫苗效力的標準指標(例如，參見參考文獻52的尾注14；還有參考文獻53)。因此，所述抗體在合適的血清殺細菌測定法(SBA)中針對測試菌株是殺細菌的。融合fHbp多肽可以優(yōu)選地引發(fā)針對表達v1fHbp的腦膜炎球菌菌株、表達v2fHbp的腦膜炎球菌菌株以及表達v3fHbp的腦膜炎球菌菌株殺細菌的抗體應(yīng)答。用于SBA測試的合適v1菌株是MC58，其為廣泛可得的(例如ATCCBAA-335)，并且是在參考文獻23中測序的菌株。用于SBA測試的合適的v2菌株是M2091(ATCC13091)。用于SBA測試的合適的v3菌株是M01-240355，其為已經(jīng)完全測序(參見EMBLIDCP002422[55])的奈瑟氏菌MLST參考菌株(參考文獻54中的id19265)。因此，優(yōu)選的fHbp融合多肽可以在小鼠中引發(fā)抗體，所述抗體在血清殺細菌測定中針對菌株MC58、M2091和M01-240355中的每種是殺細菌的。例如，本發(fā)明的組合物可以提供>1:4的血清殺細菌滴度(其使用用人補體的Goldschneider測定[56-58])，和/或提供>1:128的血清殺細菌滴度(其使用幼兔補體)。免疫如上所討論的多肽可用作免疫原性組合物的活性成分，所以本發(fā)明提供了本發(fā)明的包含如上所討論的多肽的免疫原性組合物（例如，疫苗）。本發(fā)明還提供在哺乳動物、諸如小鼠或人中產(chǎn)生抗體應(yīng)答的方法，其包括向哺乳動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物。所述抗體應(yīng)答優(yōu)選為保護性和/或殺細菌抗體應(yīng)答。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物，其用于此類方法中。本發(fā)明還提供了用于保護哺乳動物、諸如小鼠或人免于奈瑟氏菌(例如腦膜炎球菌)感染的方法，其包括向哺乳動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物。本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物，其用作藥物(例如，作為免疫原性組合物或作為疫苗)。在一個實施方案中，其還提供包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽以及以下中的一種或多種：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)腦膜炎球菌外膜囊泡在制備用于在哺乳動物中預防奈瑟氏球菌(例如腦膜炎球菌)感染的藥物中的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供腦膜炎球菌外膜囊泡以及以下中的一種或多種：(i)NHBA多肽、(ii)NadA多肽和/或(iii)包含v1、v2和v3腦膜炎球菌fHbp中的所有三種的融合多肽在制備用于預防哺乳動物中的奈瑟氏球菌(例如腦膜炎球菌)感染的藥物中的用途，其中所述藥物中的外膜囊泡的濃度在5-30μg/ml之間。所述哺乳動物優(yōu)選是人。所述人可以是成人或優(yōu)選為兒童。當所述疫苗用于預防性用途時，所述人優(yōu)選是兒童(例如幼童或嬰兒)；當疫苗用于治療用途時，所述人優(yōu)選是成人。意圖用于兒童的疫苗也可施用于成人，例如，以評估安全性、劑量、免疫原性等。所述用途和方法特別可用于預防/治療疾病，包括但不限于腦膜炎(特別是細菌性腦膜炎，諸如腦膜炎球菌性腦膜炎)和菌血癥。例如，它們適合于針對由腦膜炎奈瑟氏菌(例如血清群B中)引起的侵襲性腦膜炎球菌疾病主動免疫個體。治療性治療的效力可以通過在施用本發(fā)明的組合物之后監(jiān)測奈瑟氏菌感染來測試。預防性治療的效力可以通過在施用所述組合物之后監(jiān)測針對fHbp、NHBA、NadA和PorA(適當時)的免疫應(yīng)答來測試。本發(fā)明的組合物的免疫原性可通過向測試主體(例如，12-16月齡的兒童，或動物模型)施用它們，然后確定標準參數(shù)，包括血清殺細菌抗體(SBA)和ELISA滴度(GMT)來確定。通常在施用所述組合物之后約4周確定這些免疫應(yīng)答，并與施用所述組合物之前測定的值進行比較。至少4倍或8倍的SBA增加是優(yōu)選的。當施用多于一個劑量的組合物時，可以進行多于一次施用后確定。本發(fā)明的優(yōu)選組合物可以在患者中賦予抗體滴度，所述抗體滴度優(yōu)于各抗原組分對于可接受百分比的人主體的血清保護的標準。具有這樣的相關(guān)抗體滴度的抗原是眾所周知的，高于所述相關(guān)抗體滴度宿主被認為針對抗原是血清轉(zhuǎn)化的，并且這樣的滴度由組織諸如WHO公布。優(yōu)選多于80%的統(tǒng)計學顯著的主體的樣品發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，更優(yōu)選多于90%，仍更優(yōu)選多于93%，最優(yōu)選96-100%。本發(fā)明可用于引發(fā)全身和/或粘膜免疫。本發(fā)明的組合物將通常直接施用于患者。直接遞送可通過腸胃外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或至組織間隙)，或通過直腸、經(jīng)口、陰道、局部、透皮、鼻內(nèi)、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。優(yōu)選在大腿或上臂進行肌內(nèi)施用。注射可以經(jīng)由針頭(例如皮下針頭)進行，但或者可以使用無針注射。肌內(nèi)劑量通常為約0.5ml(例如，如BEXSERO?產(chǎn)品中所見)。劑量治療可以是單劑量時間表或多劑量時間表。多劑量可用于初次免疫時間表和/或加強免疫時間表。初次劑量時間表之后可以是加強劑量時間表?？梢猿Ｒ?guī)確定引發(fā)劑量之間(例如4-16周之間)和引發(fā)和加強之間的合適時機。例如，取決于主體(例如嬰兒或其他)，BEXSERO?產(chǎn)品作為兩個或三個劑量施用，注意分開少于1個月或不少于2個月。本發(fā)明的免疫原性組合物將通常包括藥學上可接受的載體，其可以是本身不誘導產(chǎn)生對接受所述組合物的患者有害的抗體的任何物質(zhì)，且可以在無不當毒性的情況下施用。藥學上可接受的載體可包括液體，諸如水、鹽水、甘油和乙醇。輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等也可存在于這樣的媒介物中。合適運體的充分討論可見于參考文獻59中。例如，BEXSERO?產(chǎn)品包括氯化鈉、組氨酸、蔗糖、氫氧化鋁和注射用水。奈瑟氏菌感染影響機體的各個區(qū)域，所以可將本發(fā)明的組合物以各種形式制備。例如，可將所述組合物制備為可注射劑，作為液體溶液或懸浮液。也可制備適合在注射前溶解或懸浮于液體媒介物中的固體形式。適合于腸胃外注射(例如至肌肉)的組合物是最優(yōu)選的。所述組合物優(yōu)選是無菌的。其優(yōu)選不含熱原。其優(yōu)選被緩沖的，例如在pH6到pH8之間，通常為約pH7。當組合物包含氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選使用組氨酸緩沖劑[60]。本發(fā)明的組合物相對于人可以是等張的。免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及需要的任何其他的其他指定組分?！懊庖哂行Я俊币庵敢詥我粍┝炕蜃鳛橐幌盗袆┝康牟糠窒騻€體施用該量對于治療或預防是有效的。該量取決于待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的年齡、分類組(例如非人靈長類動物、靈長類動物等)、個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、期望的保護程度、疫苗制劑、治療醫(yī)生對醫(yī)學情況的評估和其他相關(guān)因素而不同。預期所述量將落入可通過常規(guī)試驗確定的相對寬范圍內(nèi)。劑量治療可以是單劑量時間表或多劑量時間表(例如，包括加強劑量)。所述組合物可與其他免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合施用。本發(fā)明的組合物中可以使用的佐劑包括但不限于不溶性金屬鹽，水包油乳劑(例如MF59或AS03，兩者均含有角鯊烯)，皂苷，LPS的無毒衍生物(諸如單磷酰脂質(zhì)A或3-O-脫?；疢PL)，免疫刺激性寡核苷酸，脫毒的細菌ADP-核糖基化毒素，微粒，脂質(zhì)體，咪唑并喹諾酮類(imidazoquinolones)，或其混合物。充當免疫刺激劑的其他物質(zhì)公開于參考文獻61的第7章。使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑是特別優(yōu)選的，并且多肽通常吸附至這些鹽。這些鹽包括羥基氧化物和羥基磷酸鹽(例如參見參考文獻61的第8和9章)。所述鹽可采取任何合適的形式(例如，凝膠、晶體、無定形等)。Al+++應(yīng)當以<1mg/劑量存在。最優(yōu)選的佐劑是氫氧化鋁，如BEXSERO?產(chǎn)品中所使用。本發(fā)明的組合物中的多肽和OMV可以吸附至該佐劑，如BEXSERO?產(chǎn)品中所見。氫氧化鋁可以以約1mg/mlAl+++(即0.5mg/0.5ml劑量)被包括。其他抗原性組分本發(fā)明的組合物可以包含除了fHbp、NHBA、NadA和/或OMV以外的其他腦膜炎球菌多肽免疫原。例如，其可以包括NspA、App、NhhA、HmbR等中的一種或多種。本發(fā)明的組合物還可以包括‘936’抗原。936抗原作為基因NMB2091包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[23]中(本文為SEQIDNO:20)。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的936抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQIDNO:21具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQIDNO:21的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQIDNO:21的表位。在施用于宿主哺乳動物之后，本發(fā)明的最有用的936抗原可以引發(fā)可以結(jié)合由氨基酸序列SEQIDNO:20組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。936抗原是fHbp的良好融合伴侶(例如，參見參考文獻62和63)。除了腦膜炎球菌多肽抗原以外，所述組合物可包括用于針對其他疾病或感染免疫的抗原。例如，所述組合物可包括以下其他抗原中的一種或多種：-來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，諸如參考文獻64中公開的來自血清群C的糖(還參見參考文獻65)或參考文獻66中的糖。-來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[例如，67，68，69]。-來自甲型肝炎病毒，諸如滅活病毒的抗原[例如，70，71]。-來自乙型肝炎病毒的抗原，諸如表面和/或核心抗原[例如，71，72]。-白喉抗原，諸如白喉類毒素[例如參考文獻73的第3章]，例如CRM197突變體[例如，74]。-破傷風抗原，諸如破傷風類毒素(例如參考文獻73的第4章)。-來自百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的抗原，諸如來自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3組合(例如參考文獻75和76)。-來自流感嗜血桿菌B（HaemophilusinfluenzaeB）的糖抗原[例如65]。-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如，77，78]，諸如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原(例如參考文獻73的第9、10和11章)。-流感抗原(例如參考文獻73的第19章)，諸如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。-來自卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)的抗原[例如79]。-來自無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(B群鏈球菌)的蛋白抗原[例如80，81]。-來自無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(B群鏈球菌)的糖抗原。-來自釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(A群鏈球菌)的抗原[例如81，82，83]。-來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原[例如84]。所述組合物可以包含這些其他抗原中的一種或多種。必要時，可使毒性蛋白抗原脫毒(例如通過化學和/或遺傳方式使百日咳毒素脫毒[76])。當所述組合物中包括白喉抗原時，優(yōu)選還包括破傷風抗原和百日咳抗原。類似地，當包括破傷風抗原時，優(yōu)選還包括白喉和百日咳抗原。類似地，當包括百日咳抗原時，優(yōu)選還包括白喉和破傷風抗原。DTP組合因此是優(yōu)選的。糖抗原優(yōu)選為綴合物的形式。下文更詳細討論綴合物的載體蛋白。組合物中的抗原通常各以至少1μg/ml的濃度存在。通常，任何給定抗原的濃度將足以引發(fā)針對該抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物可以治療性地(即，治療已有感染)或預防性地(即，預防將來的感染)使用。作為本發(fā)明的免疫原性組合物中使用蛋白抗原的替代方案，可使用編碼該抗原的核酸(其可以是RNA，諸如自復制RNA，或DNA，諸如質(zhì)粒)。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含來自腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4種的綴合的莢膜糖抗原。在其他實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種綴合的肺炎球菌莢膜糖抗原。腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A目前的血清群C疫苗(MENJUGATE?[64，85]，MENINGITEC?和NEISVAC-C?)包括綴合的糖。MENJUGATE?和MeningitecMENINGITEC?具有與CRM197載體綴合的寡糖抗原，而NEISVAC-C?使用與破傷風類毒素載體綴合的完整多糖(脫-O-乙酰化)。MENACTRA?疫苗含有來自血清群Y、W135、C和A每種的綴合的莢膜糖抗原。本發(fā)明的組合物可包括來自腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一種或多種的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白綴合和/或是寡糖。例如，所述組合物可包括來自：血清群C；血清群A和C；血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或來自血清群A、C、W135和Y中的所有四種的莢膜糖抗原。每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的典型量為1μg至20μg，例如，約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg或約10μg(表示為糖)。當混合物包含來自血清群A和C的莢膜糖時，MenA糖∶MenC糖的比率(w/w)可以為大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。在混合物包含來自血清群Y以及血清群C和W135之一或兩者的莢膜糖時，MenY糖:MenW135糖的比率(w/w)可以大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)，和/或MenY糖:MenC糖的比率(w/w)可以小于1(例如，1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。來自血清群A:C:W135:Y的糖的優(yōu)選比率(w/w)為：1:1:1:1；1:1:1:2；2:1:1:1；4:2:1:1；8:4:2:1；4:2:1:2；8:4:1:2；4:2:2:1；2:2:1:1；4:4:2:1；2:2:1:2；4:4:1:2；和2:2:2:1。來自血清群C:W135:Y的糖的優(yōu)選比率(w/w)為：1:1:1；1:1:2；1:1:1；2:1:1；4:2:1；2:1:2；4:1:2；2:2:1；和2:1:1。優(yōu)選使用實質(zhì)上相等質(zhì)量的各種糖?？梢允褂霉烟切问降那v膜糖。這些通過以下方便地形成：對純化的莢膜多糖進行片段化(例如通過水解)，通常隨后為純化期望大小的片段。優(yōu)選進行多糖的片段化，以使寡糖的最終平均聚合度(DP)小于30(例如，對于血清群A，10至20，優(yōu)選約10；對于血清群W135和Y，15至25，優(yōu)選約15-20；對于血清群C，12至22；等)。DP可通過離子交換層析或通過比色測定方便地測量[86]。如果進行水解，則通常對水解產(chǎn)物進行篩分，以去除短長度寡糖[65]。這可以各種方式諸如超濾和隨后離子交換層析實現(xiàn)。對于血清群A，優(yōu)選去除聚合度小于或等于約6的寡糖；對于血清群W135和Y，優(yōu)選去除聚合度小于約4的寡糖。參考文獻85中公開了優(yōu)選的MenC糖抗原，如Menjugate?中所使用。共價綴合本發(fā)明的組合物中的莢膜糖通常與載體蛋白綴合。通常，綴合增強糖的免疫原性，因為所述綴合可將糖從T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)化為T-依賴性抗原，因此引發(fā)免疫記憶。綴合對于兒科疫苗是特別有用的，并且是眾所周知的技術(shù)。典型的載體蛋白是細菌毒素，諸如白喉或破傷風毒素或類毒素或其突變體。CRM197白喉毒素突變體[87]是有用的，并且是PREVNAR?產(chǎn)品中的載體。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白復合物[88]、合成肽[89,90]、熱休克蛋白[91,92]、百日咳蛋白[93,94]、細胞因子[95]、淋巴因子[95]、激素[95]、生長因子[95]、包含多種來自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細胞表位的人工蛋白[96]諸如N19[97]、來自流感嗜血桿菌(H.influenzae)的蛋白D[98-100]、肺炎球菌溶血素[101]或其無毒衍生物[102]、肺炎球菌表面蛋白PspA[103]、攝鐵蛋白[104]、來自艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[105]、重組銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[106]等。可以使用任何合適的綴合反應(yīng)，在必要時使用任何合適的接頭。糖通常將在綴合前活化或官能化?；罨缮婕袄缜杌瘎?cyanylatingreagents)，諸如CDAP(例如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽(1-cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborate)[107、108等])。其他合適的技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷(norborane)、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU等。可使用任何已知程序，例如參考文獻109和110中描述的程序，經(jīng)由接頭基團進行連接。一種類型的連接涉及多糖的還原胺化，將所得氨基與己二酸接頭基團的一個末端偶聯(lián)，然后將蛋白偶聯(lián)至己二酸接頭基團的另一末端[111，112]。其他接頭包括B-丙酰胺基[113]、硝基苯基-乙胺[114]、鹵代酰基鹵化物[115]、糖苷鍵[116]、6-氨基己酸[117]、ADH[118]、C4至C12部分[119]等。作為使用接頭的替代方案，可使用直接連接。與蛋白的直接連接可包括氧化多糖，隨后與蛋白還原胺化，如例如參考文獻120和121中所述。優(yōu)選涉及以下的方法：將氨基引入糖中(例如通過用-NH2替代末端=O基團)，隨后用己二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生化，并且與載體蛋白反應(yīng)。另一種優(yōu)選的反應(yīng)使用CDAP活化蛋白D載體，例如對于MenA或MenC。一般概念術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可包括額外物質(zhì)，例如X+Y。提及“包含(comprising)”(或“包含(comprises)”等)可以任選地被提及“由...組成(consistingof)”(或“由…組成(consistsof)”等)替代。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的，并且意指，例如x±10％。詞語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。必要時，可以從本發(fā)明的定義中省略詞語“基本上”。“序列同一性”優(yōu)選通過Needleman-Wunsch全局比對算法[122]使用默認參數(shù)(例如，缺口開放罰分＝10.0和缺口延伸罰分＝0.5，使用EBLOSUM62評分矩陣)確定。在EMBOSS軟件包中的needle工具方便地進行該算法[123]。當應(yīng)用是指與具體SEQID的序列同一性，應(yīng)當經(jīng)該SEQID的全長來計算同一性。血清群之后，腦膜炎球菌分類包括血清型、血清亞型和然后免疫型，并且標準命名法列出血清群、血清型、血清亞型和免疫型，其各自通過冒號隔開，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B內(nèi)，一些譜系經(jīng)常引起疾病(高侵襲性)，一些譜系引起比其他譜系更嚴重形式的疾病(高毒力)，且其他譜系完全很少引起疾病。識別七種高毒力譜系，即亞群I、III和IV-1、ET-5復合群、ET-37復合群、A4簇和譜系3。這些已經(jīng)通過多位點酶電泳(MLEE)定義，但多位點序列分型(MLST)也已經(jīng)用于分類腦膜炎球菌。四種主要的高毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11復合群。實施例實施例1：BEXSERO?疫苗(用于參考)BEXSERO?產(chǎn)品是安全且有效的，且在歐洲和其他地方已被授權(quán)用于人類使用。其每0.5ml劑量具有以下免疫原性成分：免疫原量注釋fHbp50μg在N-末端具有NMB2091的融合多肽NHBA50μg在C-末端具有NMB1030的融合多肽NadA50μg-OMV25μg(總蛋白)菌株NZ98/254(B:4:P1.7-2,4,L1,3)這些免疫原被吸附至氫氧化鋁佐劑(每個劑量0.5mgAl+++)。所述組合物還包括NaCl、組氨酸緩沖劑和蔗糖。實施例2：穩(wěn)定化和穩(wěn)定化的非結(jié)合融合多肽本發(fā)明人已經(jīng)研究了v2和v3中的兩種不同類型的突變：首先，他們已經(jīng)鑒定了SEQIDNO:2和SEQIDNO:3內(nèi)可以被修飾以增加多肽的穩(wěn)定性的殘基。其次，他們已經(jīng)鑒定了減少與人因子H(fH)的結(jié)合的殘基。包含兩種類型的突變的突變體fHbp多肽具有增強的特性。具體地，不結(jié)合因子H、但保留免疫原性的fHbp突變體是有利的，因為所得抗體應(yīng)答針對fH結(jié)合位點中或附近的表位。在使用野生型fHbp疫苗抗原接種后，此類表位可能被因子H結(jié)合遮蔽。最感興趣的氨基酸如下，其根據(jù)全長序列(SEQIDNO:1和3)以及還根據(jù)ΔG序列(SEQIDNO:8和7)進行編號：**當這些殘基中只有一個被突變時，其優(yōu)選為亮氨酸。將用于穩(wěn)定性和fHbp結(jié)合的突變組合入v2和v3的突變體形式，并與包含R41S突變的突變體v1序列融合。將突變體以順序v2-v3-v1融合，并使用接頭連接，以得到731SNB(SEQIDNO:38)。與三種野生型序列相比，該融合多肽包括總共7個點突變(圖2)。分別將v2和v3中用于穩(wěn)定性的突變與‘R41S’突變體v1序列以順序v2-v3-v1融合，并使用接頭連接，以得到731S(SEQIDNO:40)。因此，與三種野生型序列相比，該融合多肽包括總共5個點突變(圖2)。在轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中測試fHbp的非fH結(jié)合形式引發(fā)SBA滴度的能力：這些數(shù)據(jù)表明fHbp的非結(jié)合形式可以是更具免疫原性的。實施例3：NMB2091-fHbp融合體的取代通過用fHbp變體的“三聯(lián)融合體”多肽(其中從N-末端至C-末端，v2-v3-v1)代替NMB2091-fHbp融合多肽來修飾BEXSERO?產(chǎn)品。該融合多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:10。此外，去除OMV組分。在第0、21和35天免疫的小鼠中比較兩種疫苗，其中在第34和49天針對各種克隆復合群(MLST和ET分類)中的一組15種血清群B菌株評價血清。使用3mg/ml的佐劑，以20μg/劑量施用抗原。具有高于各個閾值的SBA滴度的菌株的比例如下：閾值初始疫苗修飾疫苗>128100%100%>102493%80%>409653%60%因此，在高抗MenBSBA滴度(>4096)下，使用v2-v3-v1融合多肽可以提供針對組的更高比例(60%vs.53%)的覆蓋。實施例4：OMV劑量的4倍減少通過用“三聯(lián)融合體”fHbpv2-v3-v1多肽(SEQIDNO:10)代替NMB2091-fHbp融合多肽并且還通過(i)將OMV劑量4倍減少至12.5μg/ml或(ii)去除OMV組分來修飾BEXSERO?產(chǎn)品。因此，制備三種組合物：為了評價這三種疫苗的免疫原性，人主體以每月時間間隔接受三次劑量(第0、1、2個月)。在第0、1、2和3個月取血清，然后在第三個劑量后6個月(第8個月)取血清，用于針對一組相關(guān)菌株進行評價。滴度(GMT)如下：合并的患者血清用于評價一組7種表達v1fHbp的MenB菌株的覆蓋度。在每組中充分覆蓋相似數(shù)目的菌株，但組C中的滴度(GMT)是最高的：MCS時間零<10<10<103個月70140408個月155010針對一組6種表達v2或v3fHbp的MenB菌株測試單個患者血清(一種菌株測試兩次)。再次，組C中的滴度(GMT)是最高的：此外，與組M和S相比，組C中SBA滴度高于1:8的經(jīng)免疫主體的比例通常更高，例如3次劑量后菌株M1239為80％或更高，相比之下，其他兩組種為50％或更低。SBA滴度的RCD曲線(反向累積分布)也顯示更好的概況，例如，圖1顯示針對菌株UK293的3月血清的曲線，其中組C明顯高于其他組。合并的患者血清用于評價一組26種表達v2或v3fHbp的MenB菌株的覆蓋度。再次，組C中的滴度(GMT)是最高的：MCS3個月2391258個月7439因此，這些數(shù)據(jù)顯示疫苗‘C’(其中fHbp免疫原已經(jīng)被替代并且OMV劑量減少4倍)不遜于BEXSERO?疫苗。實際上，當與BEXSERO?疫苗相比時，單個主體和合并的血清都對于疫苗‘C’顯示更好的血清反應(yīng)率、更高的GMT和增加的菌株覆蓋度。實施例5：抗體親合力使用基于Gyrolab的系統(tǒng)比較來自組‘C’和‘S’中的患者的抗體的親合力(avidity)，所述基于Gyrolab的系統(tǒng)包括使用離液劑以從抗原解離低親和力(affinity)抗體的洗滌步驟，給出作為總v1.fHbp-特異性抗體中高親和力抗-v1.fHbp抗體的百分比的“親合力指數(shù)”。在第一個劑量后1個月和第三個劑量后1個月評價20份分離血清。此外，針對菌株H44/76評價SBA滴度，并測定親合力指數(shù)和SBA滴度(log2)之間的相關(guān)性。結(jié)果(通過Pearson相關(guān)性的R和p)如下：因此，在組‘C’中在兩個時間點的SBA滴度和親合力指數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性，但在組‘S’中不存在。在接受具有12.5μg/mlOMV的疫苗的主體中，親合力指數(shù)與SBA滴度相關(guān)，這表明OMV的存在對誘導的抗體的質(zhì)量具有積極影響?？傮w而言，在接受OMV的主體中，趨勢是殺細菌滴度是較高的，并且它們與由疫苗制劑誘導的抗體的親合力相關(guān)?；谝韵聵藴蔬x擇var2/3菌株的亞組用于單個主體血清測試：(i)先前臨床試驗中未被Bexsero覆蓋的菌株，(ii)菌株屬于相關(guān)克隆復合群，(iii)菌株表達流行病學相關(guān)的fHbp亞變體(subvariant)，(iv)fHbp表達水平為中等，(v)菌株被741-231(競爭性hSBA)特異性殺死。結(jié)果顯示于圖3(a)至3(g)中，證明741-231+1/4OMV+明礬(alum)針對所測試的7種菌株引發(fā)更高的GMT。因此，hSBA測試表明包括741-231融合體的制劑不遜于Bexsero。事實上，對var2/3菌株的單個主體血清和合并血清分析顯示對于包括741-231+1/4OMV+明礬(alum)的制劑的更好的血清反應(yīng)率、更高的GMT滴度和增加的菌株覆蓋度。實施例6：OMV劑量的減少以及731‘S’和731‘SNB’的使用通過用“三聯(lián)融合體”穩(wěn)定化或穩(wěn)定化的非結(jié)合fHbpv2-v3-v1多肽(分別為SEQIDNO:40和38)代替NMB2091-fHbp融合多肽并且還通過將OMV劑量減少至10μg/ml或2.5μg/ml來修飾BEXSERO?產(chǎn)品：為了制備小鼠抗血清，使用20μgNadA、NHBA-NMB1030以及NMB2091-fHbp、fHbp231S或fHbp231SNB與10μg或2.5μg源自菌株NZ98/254的OMV來免疫6周齡CD1雌性小鼠(CharlesRiver)。每組使用8只小鼠。在第0、21和35天，將所述抗原與氫氧化鋁(3mg/ml)一起腹膜內(nèi)施用。在最后一次取血后2周收集血清，并在測試前在56℃下熱滅活30分鐘。用動物血清和人補體的血清殺細菌測定如前所述評估針對Nm菌株的血清殺細菌活性。來自健康成人的人血清或血漿(當以25或50％的最終濃度測試時沒有內(nèi)在殺細菌活性)用作補體來源。血清殺細菌滴度被定義為導致細菌與反應(yīng)混合物孵育60分鐘后的每ml菌落形成單位(CFU)與在時間0時的每ml對照CFU相比減少50％的血清稀釋度。對于每種血清測試的最低稀釋度為1:16(檢測限值)。為了分析的目的，將低于檢測限值的滴度設(shè)定為該限值的一半，并且將陽性閾值定義為與該值(即32)相比的4倍上升。來自用Bexsero制劑免疫的小鼠的合并血清在所測試的34種菌株中的14種菌株的陽性閾值之下，而源自第二代制劑的合并血清在含有fHbp231SNB的疫苗制劑的情況下對于僅1種菌株在檢測限值之下，且在含有fHbp231S的制劑的情況下對于1種菌株在檢測限值之下。下表中報道的hSBA數(shù)據(jù)顯示，在一組測試的34種菌株中，與Bexsero相比，含有fHbp231S或fHbp231SNB的疫苗制劑引發(fā)的覆蓋度的增加：應(yīng)該理解的是，本發(fā)明僅借助實例上文進行描述，并且可以作出修改，而仍在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。參考文獻[1]Carter(2013)BioDrugs27:263-74.[2]WO99/57280.[3]Masignani等人(2003)JExpMed197:789-799.[4]Welsch等人(2004)JImmunol172:5605-15.[5]Hou等人(2005)JInfectDis192(4):580-90.[6]WO03/063766.[7]Fletcher等人(2004)InfectImmun72:2088-2100.[8]Zhu等人(2005)InfectImmun73(10):6838-45.[9]Cendron等人(2011)ActaCrystallogrSectFStructBiolCrystCommun.67:531-5.[10]Mascioni等人(2009)JBiolChem284:8738-46.[11]Pizza等人(2008)Vaccine26Suppl8:I46-8.[12]Malito等人(2013)PNASUSA110:3304-9.[13]Marshall等人(2012)PediatrInfectDisJ31:1061-8.[14]McNeil等人(201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