本發(fā)明涉及一種并用白細胞介素18(以下，稱為“IL-18”)與分子靶向抗體的癌治療藥。更詳細而言，本發(fā)明涉及一種通過含有IL-18與分子靶向抗體，可取得協(xié)同的優(yōu)異的抗腫瘤效果、且副作用少的癌治療藥。

背景技術(shù)：

已知腫瘤的腹膜播散伴隨胃癌、大腸癌、卵巢癌等而發(fā)生，即便在通過手術(shù)來切除腫瘤的情況下，有時也會發(fā)病，治療非常困難。在現(xiàn)有技術(shù)中，在腹膜播散的治療中嘗試了利用化療劑的治療、將血管內(nèi)皮細胞增殖因子(VEGF)作為靶向的治療、使用雙膦酸的增敏療法等。

另外，近年來，將抑制免疫反應及/或炎癥反應的淋巴球(regulatory cells(調(diào)節(jié)細胞))以及作為在巨噬細胞中表達的抗原的CTLA-4抗原或PD-1/PD-L1抗原作為靶向，使所述淋巴球(抑制性淋巴球)減少的抗體在臨床上開始實用化(專利文獻1、2)。

所述抗體使所述抑制性淋巴球減少，另一方面，增強表達CD28或NKG2D等的效應淋巴球，并利用效應淋巴球進行腫瘤細胞的排除或病原體感染細胞的排除。

如此，使用所述抗體的治療是以通過使先天性免疫及獲得性免疫活化，持續(xù)地增加破壞腫瘤細胞的淋巴球(也稱為效應淋巴球或效應細胞)，并提高對于腫瘤的游走性而使腫瘤退縮或消滅為目標的。而且，已證明所述抗體對于在現(xiàn)有的治療法中難以治療的黑色素瘤等惡性腫瘤有效，期待能夠增大其有效性并且擴大其對于多種腫瘤的適用范圍。

另外，也進行了使用GM-CSF、IL-15及抗CTLA-4抗體來確認抗腫瘤效果的嘗試(非專利文獻1)。而且，公開了IL-18與利妥昔單抗或赫賽汀(HERCEPTIN)(注冊商標)的組合顯示出比使用單劑的情況更優(yōu)異的治療效果(專利文獻3)。進而，也公開了使用將由所限定的分子式所表示的化合物、1個以上的分子靶向抗體、及免疫刺激化合物組合而成的組合物進行癌免疫治療(專利文獻4)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開公報“WO2004/004771號(2004年1月15日公開)”

專利文獻2：日本公表專利公報“特表2004-512005號(2004年4月22日公表)”

專利文獻3：日本公表專利公報“特表2010-52239號(2010年7月1日公表)”

專利文獻4：日本公表專利公報“特表2008-539249號(2008年11月13日公表)”

非專利文獻

非專利文獻1：Fong L.等人，《癌癥研究(Cancer Res)》，2009，69：609-615。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

[發(fā)明所要解決的問題]

但是，我們認為使用所述專利文獻1、2中公開的抗體時的治療效果仍然存在改善的余地。進而，使所述抑制性淋巴球減少并增強效應淋巴球的結(jié)果，也存在可能產(chǎn)生自身免疫疾病發(fā)病等副作用這一問題。即，從提高治療效果且減輕副作用這一角度而言，可以說專利文獻1、2中公開的技術(shù)留有改善的余地。

另外，所述非專利文獻1中公開的方法存在藥劑的施用量過多以及方法不現(xiàn)實這一問題。

專利文獻3公開了對患者同時或依次地個別施用IL-18與利妥昔單抗或赫賽汀(注冊商標)，且組合的治療效果比單劑更優(yōu)異。另外，專利文獻4公開了通過將免疫增強劑添加至由所限定的分子式所表示的特定的化合物及1種以上的分子靶向抗體(利妥昔單抗、赫賽汀(注冊商標)等)中，能夠增大免疫反應。再者，所謂“分子靶向抗體”，是指能夠識別與淋巴球的功能相關(guān)的表面抗原或癌細胞的表面抗原的抗體。

但是，關(guān)于使用專利文獻3、4中所使用的抗體以外的其他抗體時可獲得何種效果、及副作用的程度并不明確。因此，關(guān)于提供可提高治療效果且減輕副作用的癌治療藥，可以說專利文獻3及4仍未提供足夠的見解。

本發(fā)明是鑒于所述現(xiàn)有技術(shù)中的問題點而做出的，其目的在于提供一種新型的癌治療藥，所述癌治療藥通過含有IL-18與所限定的抗體，可取得優(yōu)異的抗腫瘤效果，并可減輕副作用。

[解決問題的技術(shù)手段]

本發(fā)明者對能夠提高治療效果且減輕副作用的癌治療藥進行了努力研究。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過將IL-18與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體并用，可解決所述課題，從而完成了本發(fā)明。

即，為了解決所述課題，本發(fā)明的癌治療藥的特征在于：含有IL-18與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為有效成分。

[發(fā)明的效果]

本發(fā)明的癌治療藥由于含有IL-18與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為有效成分，可顯著地提升由所述抗體所產(chǎn)生的抗腫瘤效果。其結(jié)果，取得了可提供治療效果高且副作用少的癌治療藥這一效果。

附圖說明

圖1是表示以小鼠的生存率來觀察從移植CT-26細胞的日期的3日后施用含有抗CTLA-4抗體及IL-18的癌治療藥時的效果的結(jié)果的圖。

圖2是與實施例1同樣地，以腹腔內(nèi)施用CT-26細胞的小鼠的生存率來表示抗CTLA-4抗體及IL-18的用量效果的圖。

圖3是與實施例1同樣地，以小鼠的生存率來表示含有抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥的效果的圖。

圖4是以小鼠的生存率來表示從移植CT-26細胞的日期起7日后施用含有抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥等，其后每4日施用共計4次的情況的效果的圖。

圖5是以小鼠的生存率來表示從移植CT-26細胞的日期起14日后施用含有抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥等的情況的效果的圖。

圖6是表示在移植CT-26細胞的日期的3日后分別施用抗CTLA-4抗體及IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠的4日間的腹腔滲出細胞(PEC)數(shù)的變化的圖。

圖7是表示分別施用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體及IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為癌治療藥的4日后，再次分別施用這些癌治療藥的小鼠的PEC數(shù)的變化的圖。

圖8是表示向具有腫瘤的小鼠中將由抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體、及IL-18所誘導的PEC進行過繼細胞移植的情況下壽命延長效果的圖。

圖9是表示對由將僅抗PD-L1抗體；僅IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18施用至小鼠的腹腔內(nèi)所誘導的PEC的B220(CD45R)、NKG2D、及DX5(CD49b)的表達強度進行研究的結(jié)果的圖。

圖10是對由將抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體，或抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18施用至小鼠的腹腔內(nèi)所誘導的PEC的B220(CD45R)、NKG2D及DX5(CD49b)的表達強度進行研究的結(jié)果的圖。

圖11是表示確認本發(fā)明的治療藥使CD4陽性CD25陽性T細胞的數(shù)量減少的結(jié)果的圖。

圖12是表示破壞并去除自然殺傷(NK)細胞的抗asialo-GM1抗體對施用了本發(fā)明的治療藥的小鼠的生存率所造成的影響的圖。

圖13是表示由有無施用抗asialo-GM1抗體所引起的小鼠來源的PEC的分析結(jié)果的不同的圖。

圖14是表示由有無施用抗asialo-GM1抗體所引起的小鼠來源的PEC中的表面標記物的分析結(jié)果的不同的圖。

圖15是表示確認有無施用抗asialo-GM1抗體所引起的小鼠來源的PEC中的CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞的表達強度、以及CD25陽性T細胞的細胞數(shù)的結(jié)果的圖。

圖16是表示從移植CT-26細胞的日期起21日后的對照或施用治療藥的各群組的小鼠有無腹水的外觀照片。

圖17是表示對照或施用治療藥的各群組的小鼠的腹圍的變化的圖。

圖18是表示對照或施用治療藥的各群組的小鼠的體重的變化的圖。

圖19是表示對照與施用抗CTLA-4抗體的小鼠從移植CT-26細胞的日期起21日后的腹腔的樣子的圖。

圖20是表示對照與施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠從移植CT-26細胞的日期起21日后的腹腔的樣子的圖。

圖21是表示對照的小鼠的從移植CT-26細胞的日期起21日后的小腸的外觀的圖。

圖22是表示施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠從移植CT-26細胞的日期起21日后的小腸的外觀的圖。

圖23是表示對照與施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠從移植CT-26細胞的日期起21日后的十二指腸、小腸、大腸的一部分的外觀的圖。

圖24是表示實施例16中的CT-26細胞的移植與治療藥的施用日程表的圖。

圖25是表示在實施例16中測定血液中的白蛋白濃度(圖25的(a))、總膽紅素濃度(圖25的(b))、AST(GOT)濃度(圖25的(c))及ALT(GPT)濃度(圖25的(d))的結(jié)果的圖。

圖26是表示在實施例16中測定血液中的LD(LDH)濃度(圖26的(a))、肌酐濃度(圖26的(b))、ALP濃度(圖26的(c))、及尿酸濃度(圖26的(d))的結(jié)果的圖。

圖27是表示在實施例16中測定血液中的尿素氮濃度的結(jié)果的圖。

圖28是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的肝臟用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖29是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的胃用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖30是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的胃用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖31是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的十二指腸用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖32是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的小腸用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖33是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的大腸用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖34是表示實施例16中的群組1～群組4的小鼠的腎臟用蘇木精伊紅(HE)進行的組織染色結(jié)果的圖。

圖35是表示實施例17中的B16黑色素瘤細胞的移植與治療藥的施用日程表的圖。

圖36是表示對實施例17中的群組1的小鼠的肺中所生成的小結(jié)節(jié)進行觀察的結(jié)果的圖。

圖37是表示對實施例17中的群組2的小鼠的肺中所生成的小結(jié)節(jié)進行觀察的結(jié)果的圖。

圖38是表示對實施例17中的群組3的小鼠的肺中所生成的小結(jié)節(jié)進行觀察的結(jié)果的圖。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明的實施形態(tài)進行詳細說明。表示范圍的例如“A～B”般的記載表示A以上、B以下。再者，本說明書中所記載的專利文獻及非專利文獻的全部內(nèi)容作為參考而引用于本說明書中。

[實施形態(tài)1：本發(fā)明的癌治療藥]

(1)有效成分

本發(fā)明的癌治療藥含有IL-18與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為有效成分。

IL-18作為IFN-γ的誘導因子由岡村等人在1995年發(fā)現(xiàn)(岡村等人，《自然(Nature)》，378：88-91，1995)，其是近年來已明確具有各種生物學作用的細胞活素。

IL-18通過如下方式來生成：由缺乏營養(yǎng)、氧不足、紫外線等應激所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的結(jié)果，炎性體(蛋白質(zhì)的復合體，含有NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1等)得到活化，半胱天冬酶-1因該炎性體而活化，pro-IL-18通過該半胱天冬酶-1而得到加工，并變化成活性型的IL-18。

而且，已知IL-18可作用于通過抗原或細胞活素而得到活化的CD8陽性T細胞、自然殺傷細胞(以下，稱為NK細胞)、γδT細胞等效應細胞，并顯著地增加這些細胞的數(shù)量，并且抑制這些細胞的死亡，促進生存、分化(例如，Li Wen等人，《白細胞生物學期刊(J.Leukoc.Biol.)》，82，142-151，2007.)。

作為IL-18，并無特別限定，可使用專利文獻3中所記載的人類IL-18多肽(序列號1)、小鼠IL-18多肽(序列號2)等。人類IL-18與小鼠IL-18之間的氨基酸序列的相同性為65％。關(guān)于人類IL-18多肽，如專利文獻3中所記載的那樣，公開在EP0692536A2、EP0712931A2、EP0767178A1及WO97/2441等中。再者，以下在本說明書中，將IL-18多肽簡稱為“IL-18”。

如專利文獻3中所記載的那樣，所述人類IL-18是在大腸桿菌無毒株中表達的人類IL-18的重組成熟形態(tài)。小鼠及人類的IL-18cDNA對由192氨基酸及193氨基酸組成的前體蛋白質(zhì)(分別為序列號2及1)進行編碼。

IL-18可通過硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水性相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法、凝集素色譜法、及高效液相色譜法等公知的方法，從重組細胞培養(yǎng)物進行回收及精制。

當在細胞內(nèi)的合成、單離、及/或精制時IL-18被改性的情況下，可使用關(guān)于蛋白質(zhì)的再折疊的廣為人知的技術(shù)，使活性構(gòu)象再生。對活性型的人類IL-18進行精制及制作的方法公開在WO01/098455中。IL-18也可以使用市售品。

本申請案發(fā)明的癌治療藥含有選自由抗PD-L1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為抗體。

關(guān)于抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體，在專利文獻1中有詳述。如專利文獻1中所記載的那樣，人類PD-1cDNA以EMBL/GenBank(基因銀行)Acc.No.NM_005018中所示的堿基序列構(gòu)成，小鼠PD-1cDNA以Acc.No.X67914中所示的堿基序列構(gòu)成，在胸腺細胞中，當從CD4-CD8-分化成CD⁴⁺CD⁸⁺細胞時可確認它們的表達(《國際免疫學(Int.Immunol.)》，1996年，第18卷，第5號，p.773～780，《實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)》2000年，第191卷，第5號，p.891～898)。

另外，有報道在因來自抗原受體的刺激而活化的T細胞、B細胞(《國際免疫學(Int.Immunol.)》，1996年，第18卷，第5號，p.765～772)或含有活化巨噬細胞的骨髓細胞中能夠確認末梢中的PD-1的表達。另外，還已知PD-1傳遞抑制抗原受體(TCR)信號的信號。

PD-L1是PD-1的配位體，除腫瘤細胞以外，在經(jīng)活化的單核細胞或樹突狀細胞等所謂的抗原提示細胞中表達(《實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)》2000年，第191卷，第7號，p.1027～1034)。如專利文獻1中所記載的那樣，人類PD-L1cDNA以由EMBL/GenBank Acc.No.AF233516表示的堿基序列構(gòu)成，小鼠PD-L1cDNA以由NM_021893所表示的堿基序列構(gòu)成。

這些細胞對T淋巴球細胞提示誘導各種免疫誘導信號的相互作用分子，PD-L1是誘導由PD-1所產(chǎn)生的抑制信號的分子之一。

如專利文獻1中所記載般，有報導PD-L2被鑒定為PD-1的第2個配位體，但其表達及功能與PD-L1大致相同。再者，人類PD-L2cDNA以由EMBL/GenBank Acc.No.NM_025239所示的堿基序列構(gòu)成，小鼠PD-L2cDNA以由NM_021896所表示的堿基序列構(gòu)成(《自然免疫學(Nature Immunology)》，2001年，第2卷，第3號，p.261～267)。

一般認為，來自以PD-1為代表的共軛抑制分子的抑制信號通過適當?shù)乜刂朴煽乖荏w(TCR)及共軛刺激分子所產(chǎn)生的正信號的機制，控制淋巴球產(chǎn)生或成熟過程中的免疫耐受或?qū)τ谧陨砜乖漠惓５拿庖叻磻?/p>

關(guān)于抗CTLA-4抗體，例如記載在日本專利特開2007-277242號公報中。所謂CTLA-4，是指細胞損傷性T淋巴球相關(guān)抗原4(CD152)。如日本專利特開2007-277242號公報中所記載般，若CTLA-4與作為其天然的配位體的B7.1(CD80)及B7.2(CD86)結(jié)合，則負的控制信號被傳送至T細胞中，若阻斷該負的控制信號，則在動物模型中T細胞的免疫功能及抗腫瘤活性增強(Thompson及Allison，《免疫(Immunity)》，7，445～450頁(1997)；McCoy及LeGros，《免疫學和細胞生物學(Immunol.&Cell Biol.)》77：1～10頁(1999))。

若使用抗體阻斷CTLA-4的負的控制信號，則顯示T細胞做媒介的腫瘤的死滅增加，能夠誘導抗腫瘤性免疫(例如，Leach等人，《科學(Science)》271：1734～1736頁(1996)等)。人類CTLA-4的完整的序列記載在GenBank登錄號L15006中。

CD25是分子量為55kDa的單鏈糖蛋白，作為成人T細胞性白血病細胞的表面抗原而為人所知。CD33作為急性骨髓性白血病細胞的表面抗原而為人所知，CD52作為B細胞性慢性淋巴性白血病細胞的表面抗原而為人所知。

抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體只要分別能夠阻礙由PD-L1、PD-1、PD-L2、CTLA-4、CD25、CD33、CD52所產(chǎn)生的免疫抑制信號，則可以是人類來源的抗體、小鼠來源的抗體、大鼠來源的抗體、兔子來源的抗體或山羊來源的抗體等任一種抗體，進而也可以是這些的多克隆抗體或單克隆抗體、完整型或縮短型(例如F(ab')2、Fab'、Fab或Fv片段。以下，將這些也稱為“抗體片段”)抗體、嵌合化抗體、人源化抗體或完全人源化抗體的任一種抗體。

可將PD-L1、PD-1、PD-L2、CTLA-4、CD25、CD33或CD52的細胞外區(qū)域的部分蛋白質(zhì)作為抗原，根據(jù)公知的抗體或抗血清的制造法來制造這些抗體。細胞外區(qū)域的部分蛋白質(zhì)可通過公知的蛋白質(zhì)表達及精制法來制備。

多克隆抗體可通過公知的方法來制造。例如可通過如下方式來制造：利用抗原蛋白質(zhì)、或抗原蛋白質(zhì)與載體蛋白質(zhì)的混合物，對適當?shù)膭游镞M行免疫，從該免疫動物中提取針對抗原蛋白質(zhì)的抗體含有物，并進行抗體的分離精制。

作為所使用的動物，通常可列舉：小鼠、大鼠、綿羊、山羊、兔子、及豚鼠。為了提高抗體產(chǎn)生能力，可將完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑與抗原蛋白質(zhì)一同施用。施用通常約每2周各進行1次，一般共計進行約3～10次左右。

多克隆抗體可從通過上述方法而得到免疫的動物的血液、腹水等中提取?？寡逯械亩嗫寺】贵w效價可通過ELISA法來測定。

多克隆抗體的分離精制例如可根據(jù)利用抗原結(jié)合固相、蛋白A或蛋白G等活性吸附劑的精制法，鹽析法，醇沉淀法，等電點沉淀法，電泳法，利用離子交換體的吸脫附法，超速離心法，凝膠過濾法等免疫球蛋白的分離精制法來進行。

作為所述抗體，更優(yōu)選使用單克隆抗體或其修飾體。如專利文獻1中所記載般，從用抗原免疫的動物中選擇已確認抗體效價的個體，在最終免疫的2～5日后提取脾臟或淋巴結(jié)，使脾臟或淋巴結(jié)中所含有的抗體產(chǎn)生細胞與同種動物或異種動物的骨髓瘤細胞融合，制作可傳代培養(yǎng)的單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤，由此可制作單克隆抗體產(chǎn)生細胞。

將抗原蛋白質(zhì)本身單獨施用至可產(chǎn)生抗體的部位，或與載體、稀釋劑一同施用。此時，為了提高抗體產(chǎn)生能力，通常施用完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。

另外，也可以通過被稱為“DNA免疫”的方法來對動物進行免疫。該方法是利用如下的現(xiàn)象的方法：在免疫動物的后腿脛骨前肌中處置心臟毒素(Cardiotoxin)，進而導入表達抗原蛋白質(zhì)的載體后，在組織修復的過程中載體進入至肌細胞中，并表達蛋白質(zhì)(《自然免疫學(Nature Immunology)》、2001年,第2卷,第3號,p.261～267)。

作為得到免疫的動物，可使用小鼠、大鼠、綿羊、山羊、兔子或豚鼠，優(yōu)選使用小鼠或大鼠。融合操作可通過科勒與米爾斯坦(Kohler and Milstein)的方法(《自然(Nature)》，1975年，第256卷，第5517號，p.495～497)來實施，作為融合促進劑，可使用聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒等。作為骨髓瘤細胞，可列舉P3U1、NS1、SP2/0、及AP1等骨髓瘤細胞，通常經(jīng)常利用P3U1。

如專利文獻1中所記載般，單克隆抗體產(chǎn)生細胞的挑選例如可通過利用向直接吸附或與載體一同吸附抗原蛋白質(zhì)的固相中添加雜交瘤培養(yǎng)上清的ELISA法等檢測來進行。進而，雜交瘤培養(yǎng)上清的抗體效價可通過ELISA法來測定。單克隆抗體的分離精制可根據(jù)與所述多克隆抗體的分離精制相同的免疫球蛋白的分離精制法來進行。

作為所述雜交瘤，只要使用為了制造所述抗體而通常使用的公知的雜交瘤即可。例如，在制造抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體的情況下，則可使用專利文獻1中公開的雜交瘤。

可利用蛋白酶對抗體進行處理，根據(jù)情況進行還原而獲得所述抗體片段。F(ab')2抗體片段可通過用胃蛋白酶完全地消化經(jīng)精制的單克隆抗體，并利用離子交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法的任一種公知的方法進行精制。Fab'抗體片段可通過利用2-巰基乙胺對所制備的F(ab')2進行部分還原來制作。另外，F(xiàn)ab抗體片段可在半胱氨酸存在下通過木瓜蛋白酶消化酶來直接消化，并進行精制而制作。

scFv抗體例如可通過約斯特(Jost)等人的方法(《生物化學雜志(J.Biol.Chem.)》,1994年,第269卷,第42號,p.26267～26273)來制備。

將對人類以外的哺乳動物進行免疫所制作的非人類抗體的一部分置換成人類抗體的一部分，由此可制作所述人源化抗體。具體而言，已知通過構(gòu)筑對人類抗體的恒定區(qū)域進行編碼的基因與對非人類抗體的可變區(qū)域進行編碼的基因的嵌合體，可制作人源化抗體(《美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)》(USA),1987年,第84卷,p.3439～3443，《免疫學雜志(J.Immunol.)》,1987年,第139卷,第1號,p.3521)。

人類抗體的恒定區(qū)域的DNA序列在文獻中有記載，該恒定區(qū)域的基因可從已知的克隆中容易地獲得。繼而，使對抗體的可變區(qū)域進行編碼的DNA序列融合到人類抗體的恒定區(qū)域的序列中。人類抗體的恒定區(qū)域的同種型可根據(jù)所期望的效應功能、或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(即抗體依賴性細胞損傷)中的活性來選擇。優(yōu)選的同種型為IgG1、IgG3及IgG4。另外，可使用人輕鏈恒定區(qū)、κ鏈或λ鏈的任一種。該人源化嵌合抗體可通過通常的方法來表達。

完全人源化抗體可利用導入了人類免疫球蛋白的恒定區(qū)基因的小鼠(轉(zhuǎn)基因小鼠(《化學生物學(Chemical Biology)》，2000年，第7卷，第8號，p.R185-6))等來制作，進而能夠?qū)乃鲂∈笾袉坞x的抗體產(chǎn)生淋巴球變成雜交瘤，來量產(chǎn)作為目標的抗體。另外，完全人源化抗體也可以通過噬菌體展示法(《歐洲生物化學學會聯(lián)盟通訊(FEBS Letter)》，1998年第441卷，p.20-24)來制作。

本發(fā)明的癌治療藥含有(i)IL-18與(ii)選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為有效成分。所述“一種以上的抗體”只要是選自所述群組中的抗體，則可使用幾種。

其中，在本發(fā)明的癌治療藥中，優(yōu)選含有作為癌治療藥具有實際成績的抗PD-L1抗體及/或抗CTLA-4抗體，最優(yōu)選含有IL-18與抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體。

另一方面，如上所述，PD-L1是PD-1的配位體，PD-L2是PD-1的配位體。因此，在使用抗PD-1抗體或抗PD-L2抗體來代替抗PD-L1抗體的情況下，也可期待獲得與使用抗PD-L1抗體的情況相同的效果。

另外，如上所述，CD33、CD52、及CD25分別作為急性骨髓性白血病細胞的表面抗原、B細胞性慢性淋巴性白血病細胞的表面抗原及成人T細胞性白血病細胞的表面抗原為人所知。在這些癌的患者中的已腫瘤化的白血球中，可看見許多被稱為MICA及MICB的表面抗原。

當本發(fā)明的癌的治療藥含有IL-18與選自由抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體時，所述抗體分別將CD25、CD33、CD52作為靶向。另外，如后述的實施例中所示般，IL-18能夠強化NKG2D的表達強度高的NK細胞的誘導。而且，該NK細胞可通過NKG2D來識別MICA及MICB，并使表達這些表面抗原的細胞融解。

因此，可認為當本發(fā)明的癌的治療藥含有IL-18與選自由抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體時，該治療藥有可能對于治療急性骨髓性白血病、B細胞性慢性淋巴性白血病及成人T細胞性白血病有效地發(fā)揮作用。

在本發(fā)明的癌治療藥中，關(guān)于IL-18與所述抗體的使用量的比，當使用一種所述抗體時，IL-18與所述抗體的質(zhì)量比優(yōu)選1：10～1：200、1：25～1：200、1：25～1：50或1：30～1：50，當將所施用的生物體(實驗對象、患者)的體重每1kg的IL-18的施用量設(shè)為0.1mg/kg時，優(yōu)選以上述質(zhì)量比施用抗體。

另外，當使用兩種以上的所述抗體時，使IL-18的質(zhì)量與將兩種以上的抗體的質(zhì)量合計所得的值的比作為所述質(zhì)量比，抗體彼此的質(zhì)量比可以為任意的比。

即，IL-18的質(zhì)量與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體的質(zhì)量(所使用的抗體的質(zhì)量的合計)的比優(yōu)選1：10～1：200、1：25～1：200、1：25～1：50或1：30～1：50，抗體彼此的質(zhì)量比可為任意的比。

例如，在使用兩種抗體的情況下，當將IL-18的所述施用量設(shè)為0.1mg/kg時，能夠以質(zhì)量比1：50：50使用IL-18與第一種抗體及第二種抗體。

本發(fā)明的癌治療藥將IL-18與所述抗體(選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體)作為有效成分。所述癌治療藥可以是將IL-18與所述抗體混合而成的組合物。另外，IL-18與所述抗體也可以不混合而分別存在。

即，作為有效成分，只要使用IL-18與所述抗體，則即便不將IL-18與所述抗體混合，也包含在本發(fā)明的癌治療藥的范圍內(nèi)。

例如，即便在如對患者先施用IL-18后再施用所述抗體般，分別施用IL-18與所述抗體的情況下，由于并用了IL-18與所述抗體作為有效成分，因此不將IL-18與所述抗體混合的形態(tài)也相當于含有IL-18與所述抗體作為有效成分的本發(fā)明的癌治療藥。但是，施用的順序并不限定于此，也可以對患者施用所述抗體后再施用IL-18、或者也可以對患者同時施用所述抗體與IL-18。

當所述抗體為多種抗體時，該抗體的施用形態(tài)可為同時施用多種抗體的形態(tài)，但并不限定于此。例如當使用兩種抗體時，能夠以任意的順序?qū)颊叻謩e經(jīng)時地施用IL-18與第一種抗體及第二種抗體。例如，可為以IL-18、抗PD-L1抗體及抗CTLA-4抗體這一順序，或IL-18、抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體這一順序?qū)颊哌M行施用的形態(tài)等。當經(jīng)時地施用IL-18與一種或多種抗體時，IL-18與抗體的施用間隔、或抗體與抗體的施用間隔優(yōu)選2～5日。

另外，IL-18與各個抗體的施用部位可以相同，也可以不同。例如，可以是將IL-18與多種抗體全部進行靜脈注射的施用形態(tài)，也可以是如將IL-18進行靜脈注射，將第一種抗體進行皮下注射，將第二種抗體進行皮內(nèi)注射般的施用形態(tài)。通常若鑒于施用的簡便性，則優(yōu)選對相同的部位施用IL-18與抗體。

本發(fā)明的癌治療藥的有效成分(IL-18及所述抗體)的用量根據(jù)患者的年齡、癥狀等而不同，因此無法一概而論，但在1次的施用中，通常相對于患者的體重，作為有效成分，IL-18優(yōu)選0.1mg/kg，抗體優(yōu)選1mg/kg～20mg/kg，抗體更優(yōu)選2.5mg/kg～5.0mg/kg或3.0mg/kg～5.0mg/kg。再者，在有效成分中所占的IL-18與所述抗體的質(zhì)量比如上所述。

另外，在后述的實施例中使用小鼠作為實驗對象，但相對于小鼠的體重的施用量與相對于人類的體重的施用量無大的差異。在對人類進行施用的情況下，作為一例，可考慮當將IL-18設(shè)為0.1mg/kg時，將抗體設(shè)為1mg/kg～20mg/kg，且每3周施用4次的施用形態(tài)。

(2)其他成分

除所述有效成分以外，本發(fā)明的癌治療藥根據(jù)需要可進一步含有例如專利文獻3中所記載的醫(yī)藥上所允許的載體、稀釋劑或賦形劑。

所述載體可為水及包括花生油、大豆油、礦物油或芝麻油等，或石油、源自動物、植物、或合成的油的油等無菌的液體。

當靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的癌治療藥時，可將水用作載體。例如，作為注射溶液用的液體載體，也可以使用生理鹽水以及葡萄糖及甘油的水溶液。

作為適當?shù)尼t(yī)藥賦形劑，可列舉：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、小麥粉、碳酸鈣粉(胡粉)、硅膠、硬脂酸鎂、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水及乙醇等。

本發(fā)明的癌治療藥根據(jù)需要也可以含有少量的保濕劑或者乳化劑，或pH緩沖劑。本發(fā)明的癌治療藥可采用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸藥、膠囊、粉末或緩釋制劑等形態(tài)。

本發(fā)明的癌治療藥可作為具有三甘油脂等現(xiàn)有的結(jié)合劑及載體的栓劑來配制?？诜苿┛珊嗅t(yī)藥級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素或碳酸鎂等標準的載體。本發(fā)明的癌治療藥在含有所述有效成分的同時也可含有適量的載體。制劑的形式只要結(jié)合施用方式而適宜調(diào)整即可。

本發(fā)明的癌治療藥對患者的施用形態(tài)并無特別限定，但在本發(fā)明的一實施形態(tài)中，所述癌治療藥是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的程序，作為適合于向人的靜脈內(nèi)施用的醫(yī)藥組合物來開處方。

如專利文獻3中所記載般，靜脈內(nèi)施用的組合物典型地是無菌且等張性的水性緩沖液中的溶液。在適當?shù)那闆r下，所述組合物也可以含有可溶化劑及緩和注射部位的疼痛的利諾卡因等局部麻醉劑。

通常，成分例如作為顯示活性劑的量的安瓿或小袋等密封容器內(nèi)的干燥冷凍粉末或不含水的濃縮物，以單位用量形態(tài)個別地供給或一次性混合來供給。再者，如上所述，所述癌治療藥可不必將IL-18與所述抗體混合。因此，IL-18與所述抗體可個別地供給。

當注入施用所述癌治療藥時，可通過存儲無菌的醫(yī)藥級的水或生理鹽水的注入瓶來進行分注。當注射施用所述癌治療藥時，可供給無菌的注射用水或生理鹽水的安瓿，并在施用前將成分混合。

本發(fā)明的癌治療藥可作為非口服施用的溶液或冷凍干燥粉末來配制。在使用前，粉末可通過添加適當?shù)南♂寗┗蚱渌t(yī)藥上所允許的載體來進行還原。液體制劑可為完成緩沖且等張性的水溶液。適當?shù)南♂寗┑睦釉谕ǔ５牡葟埿陨睇}水、水或者乙酸鈉緩沖液或乙酸銨緩沖液中為5％的標準的葡萄糖。

所述制劑適合于非口服施用，但也可以用于口服施用，也可以存儲在吸入用的用量計量型吸入器或噴霧器中。在所述癌治療藥中，有時希望添加聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉或檸檬酸鈉等賦形劑。

為了口服施用，所述癌治療藥也可以進行膠囊化、進行片劑化、制備成乳劑或糖漿。也可以添加醫(yī)藥上所允許的固體或液體的載體，而使所述癌治療藥增強或穩(wěn)定化，也可以使所述癌治療藥的制備容易化。

固體的載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。

液體的載體包括糖漿、花生油、橄欖油、生理鹽水及水。另外，載體可包括單獨的、或者伴有蠟的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等緩釋用材料。

固體載體的量各式各樣，但平均用量單位為約20mg～約1g。當醫(yī)藥制劑為片劑形態(tài)時，只要適當，則可按照包括粉碎、混合、造粒及壓縮的現(xiàn)有的制藥法來制作，當醫(yī)藥制劑為硬質(zhì)明膠膠囊形態(tài)時，可按照包括粉碎、混合及填充的現(xiàn)有的制藥法來制作。

當使用液體的載體時，制劑為糖漿、酏劑、乳劑、或者水性或非水性的懸浮液的形態(tài)。此種液體制劑可通過口服(p.o.)而直接施用，或填充至軟質(zhì)明膠膠囊中來施用。

本發(fā)明的癌治療藥可用作為了注射而準備的形態(tài)中的以生理pH含有完成緩沖的所述癌治療藥的水性懸浮液或水溶液。作為水性載體，例如可使用0.4％生理鹽水或0.3％甘氨酸等各種水性載體。這些溶液為無菌，通常不含粒狀物質(zhì)。

所述水性懸浮液或水溶液可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的殺菌法(例如過濾法)來進行殺菌。本發(fā)明的癌治療藥可含有pH調(diào)整劑或緩沖劑等為了接近生理條件所需的醫(yī)藥上所允許的輔助物質(zhì)。

含有此種載體、輔助物質(zhì)等的醫(yī)藥制劑中的本發(fā)明的癌治療藥的濃度只要根據(jù)所選擇的具體的施用方式，基于流體容量、粘稠度等來選擇即可。

[實施形態(tài)2：本發(fā)明的癌治療藥的施用]

本發(fā)明的癌治療藥可通過任一種適當?shù)捏w內(nèi)路徑而對患者進行施用。

作為施用的方法，例如可使用專利文獻3中所記載的現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法。即，已知在脂質(zhì)體中封入、微粒子、微膠囊、具有表達化合物的能力的重組細胞、經(jīng)由受體的內(nèi)吞作用(例如參照Wu等人、《生物化學雜志(J.Biol.Chem.)》，第262卷4429～4432頁(1987))、作為反轉(zhuǎn)錄病毒載體或其他載體的一部分的核酸的構(gòu)筑等各種輸送系統(tǒng)，可用于本發(fā)明的癌治療藥的施用。

導入法包括皮內(nèi)路徑、肌肉內(nèi)路徑、腹腔內(nèi)路徑、靜脈內(nèi)路徑、皮下路徑、鼻腔內(nèi)路徑、硬膜外路徑及口服路徑，但并不限定于這些路徑。所述癌治療藥可通過任意的適宜的路徑，例如注入或彈丸注射、經(jīng)由上皮或由粘膜皮膚所形成的內(nèi)膜(例如口腔粘膜、直腸及腸粘膜等)的吸收來進行施用，且可與其他生物活性劑一同施用。

施用可為全身施用或局部施用。此外，本發(fā)明的癌治療藥有時希望通過包括腦室內(nèi)注射、及蛛網(wǎng)膜下注射的任意的適當?shù)穆窂絹韺胫林袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中，腦室內(nèi)注射例如可通過安裝在奧馬耶貯器等容器中的腦室內(nèi)導管而容易化。例如，通過使用具有吸入器或噴霧器及噴霧劑的制劑，也可以采用肺內(nèi)施用。

施用如上所述，有效成分(IL-18及所述抗體)的用量理想的是每1次施用，相對于患者的體重，以IL-18為0.1mg/kg，抗體為1mg/kg～20mg/kg，更優(yōu)選為2.5mg/kg～5.0mg/kg或3.0～5.0mg/kg的方式進行。

[實施形態(tài)3：本發(fā)明的癌治療藥的抗腫瘤效果]

如上所述，本發(fā)明的癌治療藥是并用IL-18與規(guī)定的抗體作為有效成分的。如后述的實施例中所示般，通過進行該并用來施用本發(fā)明的癌治療藥，與單獨使用IL-18的情況及單獨使用抗體的情況相比，能夠取得協(xié)同且顯著地提升移植了引起腹膜播散的大腸癌細胞的小鼠的生存率的效果。

在實施例中，當使IL-18與抗CTLA-4抗體的質(zhì)量比為1：25～1：50，并以IL-18為2μg/25g、抗CTLA-4抗體為50～100μg/25g的方式施用至小鼠的腹腔內(nèi)時(后述的圖2)，以及將IL-18、抗PD-L1抗體及抗CTLA-4抗體施用至小鼠的腹腔內(nèi)時(后述的圖4)，非常強烈地實現(xiàn)該效果。

即，即便大腸癌細胞的移植后經(jīng)過60日，供試的小鼠也全部生存，且也未見腹水的存積，也未見自身免疫樣的病變，從而保持健康的狀態(tài)。即，可認為未產(chǎn)生副作用。

另外，如后述的實施例中所示般，通過所述并用，可長時間持續(xù)地增加腹腔內(nèi)滲出細胞的數(shù)量，也觀察到由所述腹腔內(nèi)滲出細胞所帶來的小鼠的壽命延長效果。而且，觀察到在所述腹腔內(nèi)滲出細胞中，在活性型的NK細胞增殖且長時間持續(xù)地存在的同時，如CD4陽性CD25陽性T細胞般的炎癥抑制性的細胞減少。

即，可認為本發(fā)明的癌治療藥通過IL-18促進NK細胞等效應細胞的增強，使經(jīng)活化的效應細胞長時間持續(xù)地存在并使炎癥抑制性的細胞減少，從而進一步增強并用的抗體的抗腫瘤效果。

另外，當單獨使用所述抗體時，如上所述，存在會產(chǎn)生自身免疫疾病的發(fā)病等副作用這一問題，但本發(fā)明的癌治療藥具有此種副作用少的優(yōu)點。

鑒于本發(fā)明的癌治療藥的優(yōu)異的抗腫瘤效果，本發(fā)明的癌治療藥可應用于各種癌的治療。作為可適用的癌種，例如可列舉：鱗狀細胞癌(子宮頸管、眼瞼、結(jié)膜、陰道、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、食道)以及腺癌(例如前列腺、小腸、子宮內(nèi)膜、子宮頸管、大腸、肺、胰、食道、直腸、子宮、胃、乳房、卵巢)。進而，肉瘤(例如肌源性肉瘤)、白血病、神經(jīng)瘤、黑色素瘤、淋巴瘤也包含在可適用的癌種中。

本申請案發(fā)明包括以下的發(fā)明。

本發(fā)明的癌治療藥的特征在于：含有IL-18與選自由抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD25抗體、抗CD33抗體及抗CD52抗體所組成的群組中的一種以上的抗體作為有效成分。

根據(jù)所述構(gòu)成，從后述的實施例中所示的結(jié)果推測，通過IL-18促進效應細胞的增殖、生存、分化，且對抑制性T細胞的增殖進行抑制，可顯著地提高所述抗體的抗腫瘤效果。其結(jié)果，與僅使用所述抗體的情況或僅使用IL-18的情況相比，本發(fā)明的癌治療藥可顯示出協(xié)同的非常優(yōu)異的抗腫瘤效果。而且，對于難以治療的腹膜播散的抑制非常有效果，另一方面，存在減輕副作用的可能性。

因此，可提供治療效果非常高的癌治療藥，同時可大幅度降低副作用對患者所造成的痛苦。

另外，本發(fā)明的癌治療藥優(yōu)選所述抗體為抗PD-L1抗體及/或抗CTLA-4抗體。

根據(jù)所述構(gòu)成，由于并用IL-18，因此與單獨使用抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體的情況相比，可獲得顯著優(yōu)異的抗腫瘤效果。因此，可進一步提高對于癌治療具有實際成績的這些抗體的抗腫瘤效果，并提供更優(yōu)異的癌治療藥。

進而，所述構(gòu)成之中，當所述抗體為抗PD-L1抗體及抗CTLA-4抗體時，如后述的實施例中所示般，與含有IL-18與抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體的癌治療藥相比，也可以獲得協(xié)同的非常優(yōu)異的抗腫瘤效果，而不僅僅是相加的效果。

因此，可提供抗腫瘤效果更優(yōu)異、且副作用少的癌治療藥。

本發(fā)明的癌治療藥優(yōu)選IL-18的質(zhì)量與所述一種以上的抗體的質(zhì)量的合計的比為1：25～1：200。

根據(jù)所述構(gòu)成，如后述的實施例中所示般，可將IL-18與抗體向生物體中的施用量設(shè)為準確的量，因此在獲得所述協(xié)同的非常優(yōu)異的抗腫瘤效果方面優(yōu)選。

而且，本發(fā)明的癌治療藥優(yōu)選為選自由胃癌、大腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、及白血病所組成的群組中的一種以上的癌的治療藥。

所述癌多伴有腫瘤的腹膜播散，即便在切除腫瘤的情況下，有時腹膜播散也會發(fā)病。根據(jù)所述構(gòu)成，如后述的實施例中所示般，可顯示出對于腹膜播散的高治療效果。

因此，可提供特別適合于伴有腹膜播散的所述癌、且副作用少的癌治療藥。

本發(fā)明并不限定于上述各實施形態(tài)，可在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進行各種變更，將在不同的實施形態(tài)中分別公開的技術(shù)手段適宜組合而獲得的實施形態(tài)也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。進而，通過將在各實施形態(tài)中分別公開的技術(shù)手段加以組合，可形成新的技術(shù)特征。

實施例

以下，通過實施例來更詳細地說明本發(fā)明。再者，本發(fā)明并不限定于以下的實施例。

首先，對實施例中所使用的材料及實驗方法進行說明。

[材料]

(1)小鼠及細胞系

作為小鼠，使用從日本SLC(浜松市)購入的BALB/C野生型小鼠(6～8周齡，雄性)。在25℃下，且在12小時明、12小時暗的循環(huán)控制照明的條件下，以無病原體的狀態(tài)飼養(yǎng)所述小鼠。小鼠呈可自由地攝取水及顆粒狀的飼料的狀態(tài)。

CT-26小鼠結(jié)腸癌細胞的細胞系從美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)購入，在37℃、含有5％CO₂的大氣環(huán)境下，在含有10％胎牛血清(FBS，Bio West)及青霉素/鏈霉素(Gibco BRL,USA)的RPMI1640培養(yǎng)基(納卡萊泰思科(Nacalai Tesque)(股份)制造)中進行維持。

所述細胞使用含有0.05％胰蛋白酶及0.01％EDTA、且無Ca²⁺及Mg²⁺的杜氏(Dulbecco's)PBS(pH7.4，納卡萊泰思科(股份)制造。以下，稱為“胰蛋白酶-EDTA”)進行處理并回收。

(2)試劑

使用由葛蘭素史克有限公司好意贈與的重組小鼠IL-18(葛蘭素史克制造，商品號SB-528775，以下簡稱為“IL-18”)。

使用從BioXcell購入的抗小鼠CD152/CTLA-4單克隆抗體(mAb，克隆UC10-4F10-11。以下簡稱為“抗CTLA-4抗體”)及抗小鼠PD-L1抗體(克隆10F.9G2。以下簡稱為“抗PD-L1抗體”)。兔子抗asialo-GM1抗體(Cat.No.014-09801，和光純藥(股份)制造)、抗CD8抗體(Cat.No.SC-18913，圣克魯斯(Santa Cruz)制造)及兔子IgG(Cat.No.PMO35，MBL制造)全部為市售的抗體。

[實驗方法]

(1)在活體內(nèi)(In vivo)的處置

通過使用胰蛋白酶-EDTA剝離來從培養(yǎng)容器中回收處于近匯合(sub-confluent)狀態(tài)的CT-26細胞，并使用PBS清洗兩次?；罴毎臄?shù)量通過臺盼藍染料排除試驗來計數(shù)，以各種細胞濃度使活細胞懸浮在PBS中來制備懸浮液。所述細胞濃度為5.0×10⁴個/0.25ml。

將所述懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)。在移植CT-26細胞后的適當?shù)娜掌?，將各種量(25～100μg)的抗CTLA-4抗體或抗PD-L1抗體與L-18(1～2μg)一同注射至所述小鼠的腹腔內(nèi)，或不使用IL-18而注射至所述小鼠的腹腔內(nèi)。為了研究NK細胞或T細胞在活體內(nèi)的參與情況，也施用抗NK細胞抗體或抗T細胞抗體。各實施例中所使用的抗體及IL-18的具體的量、施用間隔記載在各實施例中。

(2)細胞的制備及培養(yǎng)

小鼠的腹腔滲出細胞(PEC)用5ml的PBS清洗3次，由此從腹腔中回收，用ACK溶解緩沖液(自家制)去除紅血球3次，并用PBS清洗3次。

淋巴球是在含有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(Gibco BRL制造)、青霉素/鏈霉素及2-巰基乙醇(西格瑪(Sigma)公司制造的M7154)的RPMI1640培養(yǎng)基(納卡萊泰思科(股份)制造)中，在37℃、含有5％CO₂的大氣環(huán)境下進行培養(yǎng)。

(3)過繼細胞移入

過繼細胞移入實驗用的PEC從移植了CT-26細胞的小鼠的腹腔中進行制備。在移植CT-26細胞的日期的3日后，對小鼠的腹腔內(nèi)注射抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的各種組合的治療藥。在腹腔內(nèi)注射上述治療藥的日期的4日后回收PEC。所回收的細胞的大部分為淋巴球。對該淋巴球進行清洗，并以2.5×10⁷細胞/ml的細胞密度懸浮在PBS中來制備細胞懸浮液。為了過繼細胞移入，對移植了CT-26細胞的小鼠的腹腔內(nèi)，在移植日的3日后、7日后、11日后注射所述細胞懸浮液0.2ml(約5×10⁶cells/小鼠)。

(4)流式細胞術(shù)

PEC的細胞表面標記物及脾細胞的細胞表面標記物的分析是利用流式細胞術(shù)來進行。細胞表面標記物是使用FITC標記抗CD4抗體(eBioscience制造，克隆GK1.5)、APC標記抗CD8抗體(Biolegend制造，克隆54-6.7)、生物素標記抗CD8抗體(eBioscience制造，克隆53-6.7)、生物素標記抗CD11c抗體(Beckton Dickinson制造，克隆HL3)、APC標記抗CD45R/B220抗體(Biolegend制造，克隆RA3-6B2)、PE標記抗CD49b抗體(Beckton Dickinson制造，克隆DX5)進行染色。利用流式細胞術(shù)的分析是使用FACS Calibur流式細胞儀(Beckton Dickinson Biosciences制造)來進行。

即，利用以特異的FITC、PE、APC或生物素對CD4、CD8、CD11c、CD45R/B220、CD49b進行標記的單克隆抗體對細胞進行染色，繼而，使用FACS Calibur流式細胞儀進行分析。另外，將抗小鼠CD16/32抗體(eBioscience制造，克隆93)用作Fc受體阻斷劑。數(shù)據(jù)使用Cell Quest軟件(注冊商標，Beckton Dickinson Biosciences制造)進行分析。

在本說明書中，流式細胞術(shù)的條件是固定的，根據(jù)Becton-Dickinson immunocytometry system,1995.中所記載的條件來進行。再者，在本說明書中，細胞表面標記物的表達強度全部是指通過流式細胞術(shù)所測定的表達強度。

[實施例1：相對于腹腔內(nèi)施用CT-26細胞的小鼠的生存率的、含有抗CTLA-4抗體及IL-18的癌治療藥的效果]

關(guān)于上述實驗方法的(1)中所記載的CT-26細胞，將細胞濃度為5.0×10⁴個/0.25ml的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；僅施用2μg IL-18的群組；僅施用100μg抗CTLA-4抗體的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組，各群組由5只小鼠組成。在注射所述CT-26細胞的日期的3日后、7日后、10日后、14日后，腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次。以下，在所有實施例中，實驗重復進行3次。

再者，所述兔子IgG抗體、抗CTLA-4抗體及IL-18的施用量(μg)是每25g的小鼠體重的施用量。

圖1是表示以小鼠的生存率來觀察從移植CT-26細胞的日期的3日后施用含有抗CTLA-4抗體及IL-18的癌治療藥時的效果的結(jié)果的圖。在圖1中，橫軸表示從移植(腹腔內(nèi)注射)CT-26細胞的日期起的天數(shù)，縱軸表示小鼠的生存率。

如圖1中所示般，對照組在移植CT-26細胞的日期起24日后生存率開始下降，在27日后所有小鼠死亡。另外，僅施用IL-18的群組與僅施用抗CTLA-4抗體的群組顯示出類似的生存率的下降傾向，分別在42日后、49日后所有小鼠死亡。

另一方面，在施用抗CTLA-4抗體及IL-18的群組中，連腹水的存積也不存在，完全未看見小鼠的死亡，即便從移植CT-26細胞的日期起60日后，所有小鼠也都生存。而且，未看見小鼠的衰弱，保持健康的狀態(tài)。

根據(jù)以上的結(jié)果而明確，在施用抗CTLA-4抗體及IL-18的群組中，顯示出非常優(yōu)異的協(xié)同的抗腫瘤效果，而不僅僅是由IL-18與抗CTLA-4抗體所產(chǎn)生的相加的抗腫瘤效果。即，已明確通過將IL-18與抗CTLA-4抗體并用，可飛躍性地提高抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。

[實施例2：抗CTLA-4抗體及IL-18的用量效果]

關(guān)于所述[實驗方法]的(1)中所記載的CT-26細胞，將細胞濃度為5.0×10⁴個/0.25ml的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；施用25μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組；施用50μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及1μg的IL-18的群組，各群組包含5只小鼠。在注射所述CT-26細胞的日期的3日后、7日后、10日后、14日后，腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次。

再者，所述兔子IgG抗體、抗CTLA-4抗體及IL-18的施用量(μg)是每25g的小鼠體重的施用量。

圖2與實施例1同樣地，以腹腔內(nèi)施用CT-26細胞的小鼠的生存率來表示抗CTLA-4抗體及IL-18的用量效果的圖。橫軸及縱軸與圖1相同。

如圖2中所示般，對照組在移植CT-26細胞的日期起24日后生存率開始下降，在28日后所有小鼠死亡。

另一方面，施用抗CTLA-4抗體及IL-18的群組之中，在施用25μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組中，從CT-26細胞的移植日起28日后生存率開始下降，在42日后所有小鼠死亡。但是，若與對照進行比較，則可見壽命延長的效果。

在施用100μg的抗CTLA-4抗體及1μg的IL-18的群組中，從CT-26細胞的移植日起35日后生存率下降至80％，但其后即便是60日后，生存率也得到維持。生存的小鼠的健康狀態(tài)良好。

在施用50μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組、以及施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組中，即便是從所述施用日起60日后，所有小鼠也都生存。小鼠的健康狀態(tài)良好。

如以上般，當將抗CTLA-4抗體與IL-18并用時，在4個施用群組中的3個施用群組中可獲得非常優(yōu)異的抗腫瘤效果，并可獲得高治療效果。另外，可確認即便是施用25μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組，也顯示出壽命延長效果。

[實施例3：相對于向腹腔內(nèi)移植了CT-26細胞的小鼠的生存率的、含有抗PD-L1抗體及IL-18的治療藥的效果]

將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；僅施用2μg的IL-18的群組；僅施用100μg的抗PD-L1抗體的群組；施用100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組，各群組由5只小鼠組成。在注射所述CT-26細胞的日期的3日后、7日后、10日后、14日后，腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次。再者，所述施用量是每25g的小鼠體重的量。

圖3是與實施例1同樣地，以小鼠的生存率來表示含有抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥的效果的圖。橫軸及縱軸與圖1相同。

如圖3中所示般，對照組及僅施用IL-18的群組的生存率的推移與實施例1相同。在施用抗PD-L1抗體與IL-18的群組中，至移植CT-26細胞的日期的35日后為止顯示出與僅施用IL-18的群組相同的傾向，但35日后以后，在僅施用IL-18的群組中42日后所有小鼠死亡，相對于此，在施用抗PD-L1抗體與IL-18的群組中，即便是60日后，生存率也維持在60％。另外，生存的小鼠的健康狀態(tài)良好。

僅施用抗PD-L1抗體的群組的生存率比僅施用IL-18的群組差。根據(jù)該結(jié)果可見，通過施用抗PD-L1抗體與IL-18、即使用含有抗PD-L1抗體及IL-18的治療藥，顯示出非常優(yōu)異的協(xié)同的抗腫瘤效果，而不僅僅是由IL-18與抗PD-L1抗體所產(chǎn)生的相加的抗腫瘤效果。

即，已明確通過將IL-18與抗PD-L1抗體并用，可飛躍性地提高抗PD-L1抗體的抗腫瘤效果。另外，已知抗PD-L1抗體的副作用比抗CTLA-4抗體少，因此通過所述協(xié)同的抗腫瘤效果，可提供抗腫瘤效果高且副作用少的癌的治療藥。

[實施例4：相對于向腹腔內(nèi)移植了CT-26細胞的小鼠的生存率的、含有抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及IL-18的癌治療藥的效果(其1)]

將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；僅施用2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及100μg的抗PD-L1抗體的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體、100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組，各群組由5只小鼠組成。從注射CT-26細胞的日期起7日后，在腹腔內(nèi)注射所述治療藥，其后，每4日在腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次。

圖4是以小鼠的生存率來表示從移植CT-26細胞的日期起7日后施用含有抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥等，其后每4日施用共計4次的情況的效果的圖。橫軸及縱軸與圖1相同。再者，所述施用量是每25g的小鼠體重的量。

在實施例4中，與實施例1～3不同，在將CT-26細胞移植至腹腔內(nèi)的日期的7日后開始治療藥的施用。即，在腫瘤比實施例1～3更加成長后開始治療藥的施用，如圖4所示，與施用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的群組相比，施用抗CTLA-4抗體及IL-18的群組及施用抗PD-L1抗體及IL-18的群組顯示出非常高的生存率。另外，生存的小鼠的健康狀態(tài)良好。

進而，在施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的群組中，雖然在從向腹腔內(nèi)的移植(腫瘤移植)CT-26細胞起7日后開始施用，但可獲得即便是從施用起60日后，所有小鼠也都生存這一應大書特書的結(jié)果。而且，該小鼠的健康狀態(tài)非常良好。

[實施例5：相對于向腹腔內(nèi)移植CT-26細胞的小鼠的生存率的、含有抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及IL-18的癌治療藥的效果(其2)]

圖5是以小鼠的生存率來表示從移植CT-26細胞的日期起14日后施用含有抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的癌治療藥等的情況的效果的圖。橫軸及縱軸與圖1相同。

作為治療藥，使用100μg的實施例4中所使用的所述對照；100μg的抗CTLA-4抗體及100μg的抗PD-L1抗體；100μg的抗CTLA-4抗體、100μg的抗PD-L1抗體、及2μg的IL-18，在向腹腔內(nèi)移植CT-26細胞的日期的14日后在腹腔內(nèi)注射所述治療藥，除此以外，以與實施例4相同的方式進行實驗。再者，所述施用量是每25g的小鼠體重的量。

如圖5中所示，可見與施用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的情況相比，作為癌治療藥，施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況顯示出較高的生存率。

實施例5中，在腫瘤移植的14日后開始癌治療藥的施用，因此當施用癌治療藥時已形成腫瘤塊，并且還觀察到腹水的存積。盡管如此，當使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18時，觀察到明確的壽命延長效果。這一點暗示含有抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體、及IL-18的治療藥即便在形成腫瘤塊后施用的情況下，也有可能獲得治療效果。

[實施例6：腹腔滲出細胞數(shù)的變化]

在實施例6中顯示，抗CTLA-4抗體及IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；以及抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18能夠增加移植了CT-26細胞的小鼠的腹腔滲出細胞(PEC)的數(shù)量。

將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)。在進行所述注射的日期的3日后，將下述的治療藥注射至各小鼠的腹腔內(nèi)。每種治療藥準備16只小鼠，在施用治療藥的日期的1日后～4日后，每日從4只中回收PEC，使用計數(shù)盤對PEC數(shù)進行計數(shù)，并求出4只的PEC數(shù)的平均值。

圖6是表示在移植CT-26細胞的日期的3日后分別施用抗CTLA-4抗體及IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠的4日間的腹腔滲出細胞(PEC)數(shù)的變化的圖。橫軸表示從施用所述治療藥的日期起的天數(shù)，縱軸表示每1只小鼠的PEC數(shù)(4只的平均值)。

圖6的(a)是表示作為治療藥，施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；僅施用100μg的抗CTLA-4抗體的群組；僅施用2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組中的PEC數(shù)的變化的圖。

圖6的(b)是表示作為治療藥，施用100μg的所述兔子IgG的群組；僅施用100μg的抗PD-L1抗體的群組；僅施用2μg的IL-18的群組；施用100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組中的PEC數(shù)的變化的圖。

圖6的(c)是表示作為治療藥，施用100μg的所述兔子IgG的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及100μg的抗PD-L1抗體的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體、100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組中的PEC數(shù)的變化的圖。圖中，所謂“NE-PEC”，是指施用了作為對照的兔子IgG的小鼠的腹腔滲出細胞。再者，所述施用量是每25g的小鼠體重的量。

可知在圖6的(a)～(c)的任一者中，與僅施用抗體的情況相比，在并用抗體與IL-18的情況下均可大幅度地增加PEC的數(shù)量。

另外，對在分別施用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體及IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的4日后，再次分別施用這些癌治療藥的小鼠的PEC數(shù)的變化也進行觀察。所述癌治療藥的第1次的施用、第2次的施用的施用量均與圖6中所示者相同。

圖7是表示其結(jié)果的圖。圖7的(a)是將所述癌治療藥的第1次的施用日設(shè)為第0日(圖中，表示為“注射1”)，表示向腹腔內(nèi)移植CT-26細胞的日期(圖中，表示為“CT-26細胞接種”)、進行PEC的回收及分析的日期(圖中，表示為1～8及分析1～7)、以及所述癌治療藥的第2次的施用日(圖中，表示為“注射2”)。

圖7的(b)表示圖7的(a)中所示的第0日～第8日的每1只小鼠的PEC數(shù)(4只的平均值)。至第4日為止與圖6中所示的結(jié)果相同。

根據(jù)圖7的(b)可知，在施用所述癌治療藥的日期的4日后開始下降的PEC的數(shù)量因在同日再次施用所述癌治療藥而再次顯示出上升傾向。另外，與使用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的情況相比，將IL-18與抗體并用的情況的PEC的數(shù)量更多，在使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況下變得最多。

[實施例7：由腹腔滲出細胞帶來的壽命延長效果]

將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。而且，如所述[實驗方法]的(3)中所記載般，在移植CT-26細胞的日期的3日后將癌治療藥注射至腹腔內(nèi)。作為癌治療藥，使用在以上針對實施例6的圖6的(c)的說明中所提及的部位中記載的量的兔子IgG；抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18。

如所述[實驗方法]的(3)中所記載般，在腹腔內(nèi)注射所述治療藥的日期的4日后回收PEC，并制備PEC的細胞懸浮液，對移植了CT-26細胞的小鼠的腹腔內(nèi)，在移植日的3日后、7日后、11日后注射該細胞懸浮液0.2ml(約5×10⁶細胞/小鼠)。

圖8是表示向具有腫瘤的小鼠中將由抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18所誘導的PEC進行過繼細胞移入的情況的壽命延長效果的圖。橫軸表示從在腹腔內(nèi)施用PEC的日期起的日數(shù)，縱軸表示小鼠的生存率。

另外，凡例的“對照PEC”表示施用了將兔子IgG作為治療藥施用所獲得的PEC的情況的結(jié)果，“αCTLA-4+αPD-L1誘導的PECs”表示施用了將抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體作為治療藥施用所誘導的PEC(以下，在本項中稱為“PEC-1”)的情況的結(jié)果，“αCTLA-4+αPD-L1+IL-18誘導的PECs”表示施用了將抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥施用所誘導的PEC(以下，在本項中稱為“PEC-2”)的情況的結(jié)果。

如根據(jù)圖8而可知，在對照組中從在腹腔內(nèi)施用PEC的日期起28日后所有小鼠死亡。在施用PEC-1的小鼠中，與對照組相比可見壽命延長效果，但從在腹腔內(nèi)施用PEC-1的日期起35日后所有小鼠死亡。另一方面，在施用PEC-2的小鼠中，即便是從施用日起58日后，也顯示出20％的生存率，與施用PEC-1的情況相比，顯示出若干的壽命延長效果。

即，可認為通過將抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體與IL-18并用，能夠誘導抗腫瘤效果更優(yōu)異的PEC，其結(jié)果，可取得比使用抗CTLA-4及抗PD-L1抗體的情況更優(yōu)異的壽命延長效果。

[實施例8：腹腔內(nèi)滲出細胞中的NK細胞的增強]

在本實施例中，利用流式細胞術(shù)來研究通過以與實施例6相同的方法，將實施例6中所使用的治療藥之中，僅抗PD-L1抗體；僅IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18施用至小鼠的腹腔內(nèi)所誘導的腹腔內(nèi)滲出細胞為何種性狀的細胞。作為供于流式細胞術(shù)的腹腔內(nèi)滲出細胞，使用如下的細胞：各治療藥使用5只的小鼠，從施用所述治療藥的日期起4日后所回收的細胞。

流式細胞術(shù)是使用所述[實驗方法]的(4)中所示的APC標記的抗CD45R/B220抗體(Biolegend制造，克隆RA3-6B2)、抗NKG2D抗體(BD-pharmingem562347)及PE標記的抗CD49b抗體(Beckton Dickinson制造，克隆DX5)，并通過所述[實驗方法]的(4)中所示的方法來進行。

圖9是表示對分別作為表面標記物的B220(CD45R)、NKG2D及DX5(CD49b)的表達強度進行研究的結(jié)果的圖。(a)～(j)的橫軸表示DX5的表達強度，(a)～(e)的縱軸表示B220(CD45R)的表達強度，(f)～(j)的縱軸表示NKG2D的表達強度。(a)～(j)的“第3.036天”等的表述表示對在施用所述治療藥的日期的3日后所回收的PEC進行分析。

圖9的(a)～(e)分別如圖中所示般分割成4個區(qū)域，右上方的區(qū)域中所存在的細胞可以說B220(CD45R)的表達強度高且DX5的表達強度高。而且，圖9的(f)～(j)也分別分割成4個區(qū)域，右上方的區(qū)域中所存在的細胞可以說NKG2D的表達強度高且DX5的表達強度高。

若對圖9的(a)及(b)與(c)進行比較，則在(c)中所示的使用抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，右上方的區(qū)域中所存在的細胞變多。另外，若對(d)與(e)進行比較，則在(e)中所示的使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，右上方的區(qū)域中所存在的細胞變多。

而且，如圖9的(h)中所示般，與(g)中所示的僅使用IL-18的情況相比，在使用抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，右上方的區(qū)域中所存在的細胞的比例變少。但是，如對圖9的(i)與(j)進行比較而可知，與使用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的情況相比，在使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，右上方的區(qū)域的細胞的比例變多。因此，可見通過并用抗體與IL-18，由抗體所產(chǎn)生的NK細胞向腹腔內(nèi)的誘導得到進一步強化。

如此，根據(jù)圖9的(a)～(j)中所示的結(jié)果可見，NK細胞之中，B220(CD45R)、NKG2D及DX5的表達強度高的NK細胞，即活性型的NK細胞向腹腔內(nèi)的誘導通過并用抗體與IL-18而得到強化。可認為這是本發(fā)明的治療藥顯示出高抗腫瘤效果的一個原因。

[實施例9：在小鼠腹腔內(nèi)誘導的NK細胞的維持]

在本實施例中，對將抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為癌治療藥施用時，從施用起經(jīng)過長時間后是否還可以維持在小鼠腹腔內(nèi)誘導的NK細胞進行研究。

將具有與實施例1中所使用者相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)。在進行所述注射的日期的3日后，腹腔內(nèi)注射下述的治療藥。

以與實施例6相同的方法，將抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體，或抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥施用至小鼠的腹腔內(nèi)，并對從施用日起11日后回收的PEC進行分析。

流式細胞術(shù)是使用所述APC標記的抗CD45R/B220抗體(Biotegend制造，克隆RA3-6B2)、PE標記的抗CD49b抗體(Beckton Dickinson制造，克隆DX5)、抗NKG2D抗體(BD Pharmingen562349)，并通過所述[實驗方法]的(4)中所示的方法來進行。

圖10是表示對分別作為表面標記物的B220(CD45R)、NKG2D及DX5(CD49b)的、在所述PEC中的表達強度進行研究的結(jié)果的圖。圖10的(a)～(c)的橫軸表示DX5的表達強度，縱軸表示B220(CD45R)的表達強度。

圖10的(a)、(d)為對照，表示移植CT-26細胞后，不施用治療藥而回收的PEC的數(shù)據(jù)。圖10的(b)、(e)分別表示使用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體作為治療藥時的PEC的數(shù)據(jù)，圖的(c)、(f)分別表示使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥時的PEC的數(shù)據(jù)。

在圖10的(a)～(c)中，用框包圍的記載為“R5”的區(qū)域表示可以說DX5的表達強度與B220(CD45R)的表達強度均高的PEC，在未施用治療藥的對照(圖10的(a))中，該PEC在細胞整體中所占的比例為43.93％，從施用所述抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的日期起11日后所回收的PEC的所述比例為45.57％，基本沒什么變化(圖10的(b))。相對于此，從施用所述抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的日期起11日后所回收的PEC的所述比例高達59.79％(圖10的(c))。

另外，圖10的(d)～(f)的橫軸表示NKG2D的表達強度，縱軸表示細胞數(shù)。NKG2D的表達強度與細胞數(shù)的關(guān)系在圖10的(d)～(f)中基本沒什么變化。

根據(jù)以上的結(jié)果而明確，當施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥時，從施用起經(jīng)過11日這一長時間后，也可以維持在腹腔內(nèi)誘導的活性型的NK細胞(DX5的表達強度與B220(CD45R)的表達強度均高的細胞)。

即，已明確本發(fā)明的治療藥可增強對腫瘤細胞進行攻擊、破壞的效應細胞，并使其長時間持續(xù)地存在。

[實施例10：CD4陽性CD25陽性T細胞的減少]

在本實施例中，對施用本發(fā)明的癌治療藥的小鼠中的CD4陽性CD25陽性T細胞的數(shù)量的變化進行研究。

將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。在進行所述注射的日期的3日后，腹腔內(nèi)注射下述的治療藥。

作為治療藥，使用僅抗PD-L1抗體；僅IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18，并對從施用日起7日后所回收的PEC進行分析。施用量與實施例6相同。

圖11是表示確認本發(fā)明的治療藥使CD4陽性CD25陽性T細胞的數(shù)量減少的結(jié)果的圖。

圖11的(a)～(e)、(f)～(j)表示分別使用抗PD-L1抗體；IL-18；抗PD-L1抗體及IL-18；抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體；抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥時的結(jié)果，(a)～(e)表示求出CD4陽性T細胞在所述PEC整體中所占的比例的結(jié)果。

(a)～(e)的橫軸表示TCR-β(T細胞受體β)的表達強度，縱軸表示CD4的表達強度。圖11的(a)～(e)中，用圓圈包圍的區(qū)域為存在CD4陽性T細胞的區(qū)域，例如圖11的(a)的記載為“20.35％”的數(shù)字是圖11的(a)的用圓圈包圍的區(qū)域中所存在的CD4陽性T細胞在所述PEC整體中所占的比例。

另外，圖11的(f)～(j)表示CD4陽性CD25陽性T細胞的檢測結(jié)果，橫軸表示CD4陽性CD25陽性T細胞的表達強度，縱軸表示CD4陽性CD25陽性T細胞的細胞數(shù)。(f)～(j)的圖中的數(shù)值表示CD4陽性CD25陽性T細胞在圖11的(a)～(e)中用圓圈包圍的區(qū)域中所存在的CD4陽性T細胞中所占的比例。

CD4陽性T細胞、CD25陽性T細胞是具有在癌細胞增殖時，抑制免疫反應、炎癥反應的作用的抑制性淋巴球(Treg)。即，所述細胞的增加有助于癌細胞的增殖。

根據(jù)圖11的(a)～(c)可知，與僅使用抗PD-L1抗體、僅使用IL-18的情況相比，在使用抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，CD4陽性細胞減少。另外，根據(jù)圖11的(d)、(e)可知，與使用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的情況相比，在使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，CD4陽性細胞減少。

另外，根據(jù)圖11的(f)～(j)可知，與僅使用抗PD-L1抗體、僅使用IL-18的情況相比，在使用抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，CD4陽性CD25陽性T細胞的比例也少，與使用抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體的情況相比，在使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的情況下，CD4陽性CD25陽性T細胞的比例也少。

根據(jù)以上的結(jié)果可知，與僅使用抗體的情況相比，本發(fā)明的癌治療藥進一步抑制抑制性淋巴球的增殖?？烧J為其原因在于：通過并用IL-18，由抗體所產(chǎn)生的抑制性淋巴球的增殖抑制效果進一步提高。

另外，如上所述，本發(fā)明的癌治療藥可促進效應細胞的增強、增殖。如此，可認為本發(fā)明的癌治療藥由于能夠抑制抑制性淋巴球的增殖且促進效應細胞的增強、增殖，因此可發(fā)揮非常高的抗腫瘤效果。

[實施例11：關(guān)于NK細胞對于抗腫瘤效果的重要性]

在本實施例中，使用作為針對NK細胞的抗體的抗asialo-GM1抗體，對NK細胞在本發(fā)明的癌治療藥的抗腫瘤效果中所發(fā)揮的作用進行研究。

用PBS來將50μl的兔子抗asialo-GM1抗體或50μg的兔子IgG稀釋成250μl，并在CT-26細胞移植的1日前注射至小鼠的腹腔內(nèi)。在進行所述兔子抗asialo-GM1抗體或兔子IgG的所述腹腔內(nèi)注射的日期的3日后，再次將所述250μl的稀釋液進行腹腔內(nèi)注射，其后，每4日在腹腔內(nèi)注射2次所述250μl的稀釋液。即，在CT-26細胞移植的1日前、2日后、6日后、10日后進行所述腹腔內(nèi)注射。

作為小鼠的治療藥，分成施用50μg的作為對照的兔子IgG的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體、100μg的抗PD-L1抗體及2μg的IL-18的群組，各群組由5只小鼠組成。

在腹腔內(nèi)注射所述抗asialo-GM1抗體或兔子IgG的日期的1日后，將具有與實施例1中所用的相同的細胞濃度(5.0×10⁴個/0.25ml)的CT-26細胞的懸浮液0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)。而且，在進行所述注射的日期的3日后，將所述治療藥進行腹腔內(nèi)注射，其后，每4日腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次(即，移植CT-26細胞的日期的3日后、7日后、11日后、15日后)。

圖12是表示破壞并去除自然殺傷(NK)細胞的抗asialo-GM1抗體對施用本發(fā)明的癌治療藥的小鼠的生存率所造成的影響的圖。圖12的(a)是表示所述兔子抗asialo-GM1抗體或兔子IgG、以及所述治療藥的施用日程表的圖。圖12的(b)是表示實驗結(jié)果的圖。

圖12的(a)的上段表示將移植CT-26細胞的日期設(shè)為零日，并如所述般在其3日后、7日后、11日后、15日后施用所述治療藥這一日程表。圖12的(a)的下段表示如所述般在CT-26細胞移植的1日前、2日后、6日后、10日后施用兔子抗asialo-GM1抗體或兔子IgG這一日程表。

圖12的(b)中，白圓圈表示對照(在CT-26細胞移植的1日前及移植的2日后、6日后、10日后施用兔子IgG，作為治療藥以上述方式也施用兔子IgG)的結(jié)果，三角形表示在CT-26細胞移植的1日前及移植的2日后、6日后、10日后施用兔子IgG，并如所述般施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18作為治療藥的群組(以下，稱為“群組1”)的結(jié)果，四角形表示在與由三角形所表示的相同的實驗中施用抗asialo-GM1抗體來代替兔子IgG的群組(以下，稱為“群組2”)的結(jié)果。圖12的(b)的橫軸表示從施用CT-26細胞的日期起的日數(shù)，縱軸表示小鼠的生存率。

在所述群組1中，例如與實施例4中所示者同樣地，所有小鼠在從移植CT-26細胞的日期起經(jīng)過60日后也都生存，健康狀態(tài)也良好。另一方面，在群組2中，與對照組相比可見壽命延長效果，雖然使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18，但效果遠差于群組1，從移植CT-26細胞的日期起35日后所有小鼠死亡。

如實施例8中所示般，本發(fā)明的癌治療藥促進活性型的NK細胞向腹腔內(nèi)的誘導?？烧J為其原因在于：IL-18促進由抗體帶來的所述誘導。但是，可認為在施用抗asialo-GM1抗體的群組2中，NK細胞因該抗體而減少，因此獲得如圖12般的結(jié)果。如此，暗示在由本發(fā)明的癌治療藥所產(chǎn)生的抗腫瘤效果中，由抗體與IL-18所誘導的活性型NK細胞發(fā)揮重要的作用。

[實施例12：施用抗asialo-GM1抗體的小鼠中的NK細胞數(shù)的變化]

在本實施例中，利用流式細胞術(shù)對施用抗asialo-GM1抗體的小鼠的PEC進行分析，并對NK細胞數(shù)的變化進行研究。

分別準備5只實施例11的群組1及群組2的小鼠，以與實施例11相同的日程表進行抗asialo-GM1抗體或兔子IgG的施用、CT-26細胞的移植及治療藥的施用，在施用治療藥的日期的4日后回收PEC，并供于流式細胞術(shù)。

流式細胞術(shù)是使用所述APC標記的抗CD45R/B220抗體(Biolegend制造，克隆RA3-6B2)、PE標記的抗CD49b抗體(Beckton Dickinson制造，克隆DX5)，并通過所述[實驗方法]的(4)中所示的方法來進行。

圖13是表示由有無施用抗asialo-GM1抗體所引起的小鼠來源的PEC的分析結(jié)果的不同的圖。圖13的(a)～(d)表示未施用抗asialo-GM1抗體的小鼠(所述群組1)來源的PEC的分析結(jié)果，(e)～(h)表示施用抗asialo-GM1抗體的小鼠(所述群組2)來源的PEC的分析結(jié)果。

在圖13的(a)及(e)中，橫軸表示DX5的表達強度，縱軸表示B220(CD45)的表達強度。R4表示表達NKG2D的細胞，R5表示T細胞，R6表示NK細胞(包含Pre-mMK)。

在圖13的(a)中，R4為47.91％，R5為21.99％，R6為16.96％。另外，在圖13的(e)中，R4為36.82％，R5為48.97％，R6為4.45％。

圖13的(b)及(f)分別表示(a)、(e)的R4中所存在的表達NKG2D的細胞的數(shù)量，圖13的(c)及(g)分別表示(a)、(e)的R5中所存在的T細胞的數(shù)量，圖13的(d)及(h)分別表示(a)、(e)的R6中所存在的NK細胞(包含Pre-mMK)的數(shù)量。

根據(jù)圖13可知，在所述群組2來源的PEC中，NK細胞的比例大幅度地減少，T細胞的比例增加?？烧J為此種NK細胞的減少帶來圖12中所示的結(jié)果。即，可認為在由本發(fā)明的癌治療藥所產(chǎn)生的抗腫瘤效果中，由抗體及IL-18所誘導的活性型的NK細胞發(fā)揮重要的作用。

[實施例13：由抗asialo-GM1抗體的施用所引起的在NK細胞中特異的細胞表面標記物的表達的變化]

在本實施例中，利用流式細胞術(shù)對施用抗asialo-GM1抗體的小鼠的PEC進行分析，并對在NK細胞中特異的細胞表面標記物的表達的變化進行研究。

與實施例12同樣地，針對所述群組1及群組2的小鼠回收PEC，并供于流式細胞術(shù)。流式細胞術(shù)是使用所述生物素標記的抗CD11c抗體(Beckton Dickinson制造，克隆HL3)、PE標記的抗NK1.1抗體(BD Bioscience制造，克隆PK136)、APC標記的抗CD62L抗體(BD Bioscience制造，克隆MEL-14)、PE標記的抗CD69抗體(eBiocience制造，克隆H1.2F3)、PE標記的抗CD49b抗體(Beckton Dickinson制造，克隆DX5)，并通過所述[實驗方法]的(4)中所示的方法來進行。

圖14是表示由有無施用抗asialo-GM1抗體所引起的小鼠來源的PEC中的表面標記物的分析結(jié)果的不同的圖。圖14的(a)～(d)表示未施用抗asialo-GM1抗體的小鼠(所述群組1)來源的PEC的表面標記物的分析結(jié)果，(e)～(h)表示施用抗asialo-GM1抗體的小鼠(所述群組2)來源的PEC的表面標記物的分析結(jié)果。橫軸表示DX5的表達強度，縱軸表示各表面標記物的表達強度。

圖14中所示的NK1.1、CD11c、CD62L、CD69均為在NK細胞(包含Pre-mMK)中特有的表面標記物。若分別對圖14的(a)～(d)與(e)～(h)進行對比，則可知在所述群組2來源的PEC中，表達任一種表面標記物的細胞均減少?？烧J為此種NK細胞的減少帶來圖12中所示的結(jié)果。即，可認為在由本發(fā)明的癌治療藥所產(chǎn)生的抗腫瘤效果中，由抗體與IL-18所誘導的活性型的NK細胞發(fā)揮重要的作用。

[實施例14：由抗asialo-GM1抗體的施用所引起的CD4陽性CD25陽性T細胞的增加]

在本實施例中，利用流式細胞術(shù)對施用抗asialo-GM1抗體的小鼠的PEC進行分析，并對CD4陽性CD25陽性T細胞的細胞數(shù)的變化進行研究。

與實施例12同樣地，針對所述群組1及群組2的小鼠回收PEC，并供于流式細胞術(shù)。

流式細胞術(shù)是使用所述FITC標記的抗CD4抗體(eBioscience制造，克隆GK1.5)、APC標記的抗CD8抗體(Biolegend制造，克隆54-6.7)、PE標記的抗CD25抗體(BD Bioscience制造，克隆PC-61)，并通過所述[實驗方法]的(4)中所示的方法來進行。

圖15是表示確認有無施用抗asialo-GM1抗體所帶來的、小鼠來源的PEC中的CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞的表達強度、以及CD25陽性T細胞的細胞數(shù)的結(jié)果的圖。

在圖15的(a)、(c)中，橫軸表示TCR-β的表達強度，縱軸表示CD4的表達強度。在圖15的(b)、(d)中，橫軸表示CD25的表達強度，縱軸表示CD4陽性CD25陽性T細胞的數(shù)量。在圖15的(e)、(f)中，橫軸表示TCR-β的表達強度，縱軸表示CD8的表達強度。

如上所述，CD4陽性T細胞、CD25陽性T細胞是抑制性的T淋巴球，所述細胞的增加有助于癌細胞的增殖。另一方面，CD8陽性T細胞是具有抗腫瘤效果的細胞。

當施用抗asialo-GM1抗體時，根據(jù)圖15的(a)與(c)的對比可知，圖中的右上方的區(qū)域中所存在的CD4陽性T細胞在整個PEC中所占的比例從7.59％大幅度增加至17.02％。

另外，根據(jù)圖15的(b)與(d)的對比可知，CD4陽性CD25陽性細胞在整個PEC中所占的比例也從2.34％大幅度增加至7.87％。另一方面，根據(jù)圖15的(e)與(f)的對比可知，CD8陽性T細胞在整個PEC中所占的比例從2.26％至1.22％大致減少了一半。

該結(jié)果表示在預先施用抗asialo-GM1抗體的小鼠中，即便施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18，也會增加抑制性淋巴球，且CD8陽性T細胞減少。已知NK細胞使CD8陽性T細胞活化，若NK細胞減少，則CD8陽性T細胞也減少。

因此，根據(jù)本實施例的結(jié)果，暗示本發(fā)明的癌治療藥使NK細胞活化，并使NK細胞作為活性型而長時間持續(xù)，其結(jié)果，使CD8陽性T細胞活化，由此顯示出優(yōu)異的抗腫瘤效果。

[實施例15：對于腹水的存積的治療效果]

在本實施例中，對本發(fā)明的癌治療藥對于移植了腫瘤細胞的小鼠中的腹水存積的效果進行研究。

將CT-26細胞的懸浮液(5.0×10⁴個/0.25ml)0.25ml注射至所述BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)。作為小鼠的治療藥，分成施用100μg的作為對照的兔子IgG的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體的群組；施用100μg的抗CTLA-4抗體及2μg的IL-18的群組，各群組由5只小鼠組成。在從移植CT-26細胞的日期起3日后，將所述治療藥進行腹腔內(nèi)注射，其后，每4日腹腔內(nèi)注射所述治療藥共計4次。而且，在從移植CT-26細胞的日期起21日后，研究對于腹水的存積的治療效果。

圖16是對于從移植CT-26細胞的日期起21日后的所述各群組的小鼠，表示有無腹水的外觀照片。

圖17是表示所述各群組的小鼠的腹圍的變化的圖。橫軸表示從移植CT-26細胞的日期起的天數(shù)，縱軸表示腹圍(mm)。對組成各群組的小鼠測定腹圍，并求出其平均值。

如圖17中所示，對照組是在CT-26細胞的移植后第26日，腹圍伴隨腹水的存積而顯著增加并達到115mm，以后維持在這一數(shù)值。另一方面，施用抗CTLA-4抗體及IL-18的小鼠的腹圍停留在80mm前后這一低水準，即便在CT-26細胞的移植后第56日，也與移植后第1日基本沒什么變化。另外，與僅施用抗CTLA-4抗體的小鼠相比，施用抗CTLA-4抗體及IL-18的小鼠的腹圍也得到大幅度抑制，未見腹水的存積。

圖18是表示所述各群組的小鼠的體重的變化的圖。橫軸與圖17相同，縱軸表示體重(g)。對組成各群組的小鼠測定體重，并求出其平均值。

關(guān)于體重，對照組可見因腹水的存積而顯著上升，即便是僅施用抗CTLA-4抗體的小鼠，在CT-26細胞的移植后第42日以后，也增加至與對照組無大的差別的體重。

另一方面，施用抗CTLA-4抗體及IL-18的小鼠未見腹水的存積，如圖18中所示，明顯抑制在低體重，并維持在低的狀態(tài)。

圖19是對于所述對照組(圖19的(a))與施用抗CTLA-4抗體的小鼠(圖19的(b))，表示從移植CT-26細胞的日期起21日后的腹腔的樣子的圖。如圖19中所示，兩者均可看見許多腫瘤塊，也看見臟器的粘連。

圖20是對于所述對照組(圖20的(a)及作為其放大圖的(b))與施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠(圖20的(c)及作為其放大圖的(d))，表示從移植CT-26細胞的日期起21日后的腹腔的樣子的圖。在施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠中，未見腫瘤塊及臟器的粘連，臟器的狀態(tài)非常良好地保持。

圖21是表示所述對照組的從移植CT-26細胞的日期起21日后的小腸的外觀的圖。圖22是表示施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠的從移植CT-26細胞的日期起21日后的小腸的外觀的圖。如根據(jù)兩者的對比可見，在對照組中形成有多個腫瘤塊，相對于此，在施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠中，幾乎未觀察到腫瘤塊。

圖23是對于所述對照組(圖23的(a)～(c))與施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠(圖23的(d)～(f))，表示從移植CT-26細胞的日期起21日后的十二指腸((a)、(d))、小腸((b)、(e))、大腸((c)、(f))的一部分的外觀的圖。

根據(jù)圖23，在大腸中，在對照組與施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠中基本未見差異，但在十二指腸及小腸中，在對照組中形成有腫瘤塊，相對于此，在施用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的小鼠中保持干凈的狀態(tài)。

如圖20的(c)、(d)，圖22，圖23的(d)～(f)中所示，在腸等器官中未見發(fā)生了強烈的自身免疫樣的病變。另外，施用抗CTLA-4抗體及/或抗PD-L1抗體、以及IL-18的小鼠觀察到的均是健康的，也未見體重的減少等。

根據(jù)以上的結(jié)果可知，當使用抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18時，由移植作為小鼠大腸癌細胞的CT-26細胞所引起的腹膜播散得到充分抑制。已知胃癌、大腸癌、卵巢癌、骨肉瘤及白血病等會進行腹膜播散從而導致治療困難，而本發(fā)明的癌治療藥可有效地抑制腹膜播散，因此可以說是對這些癌的治療非常有效的治療藥。

[實施例16：關(guān)于本發(fā)明的癌治療藥的副作用的研究]

在實施例15中，在施用本發(fā)明的癌治療藥的小鼠中，未見強烈的自身免疫樣的病變，也未確認到體重的減少等，因此暗示本發(fā)明的癌治療藥是副作用得到減輕的癌治療藥。因此，在本實施例中，對本發(fā)明的癌治療藥的副作用進行更詳細的研究。具體而言，對IL-18抵抗(憎悪)作為所述癌治療藥的有效成分的抗體的副作用的可能性進行研究。

與實施例1同樣地，將CT-26細胞(細胞濃度為5.0×10⁴個/0.25ml)的懸浮液0.25ml注射至BALB/C野生型小鼠的腹腔內(nèi)來進行移植。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用0.25ml的作為對照的PBS的群組(群組1)；施用100μg的抗CTLA-4抗體及200μg的抗PD-L1抗體的群組(群組2)；施用100μg的抗CTLA-4抗體、200μg的抗PD-L1抗體及IL-18(2μg)的群組(群組3)；施用100μg的抗CTLA-4抗體、200μg的抗PD-L1抗體及IL-18(10μg)的群組(群組4)，各群組由5只小鼠組成。再者，PBS、抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的施用量(μg)是每25g的小鼠體重的施用量。

從注射所述CT-26細胞的日期的3日后，每4日將所述治療藥注射至所述小鼠的腹腔內(nèi)共計4次。在注射所述CT-26細胞的日期的18日后提取血液及組織，除肝功能、腎功能以外，對腸、肝臟、腎臟等的組織病變進行調(diào)查。再者，實驗重復進行3次。

圖24是表示所述CT-26細胞的移植與治療藥的施用日程表的圖，表示將移植CT-26細胞的日期設(shè)為“第0日”，在該日期的3日后、7日后、11日后、15日后進行所述治療藥的腹腔內(nèi)施用，在18日后屠宰小鼠。

圖25是表示測定所述血液中的白蛋白濃度(圖25的(a))、總膽紅素濃度(圖25的(b))、AST(GOT)濃度(圖25的(c))及ALT(GPT)濃度(圖25的(d))的結(jié)果的圖。圖26是表示測定所述血液中的LD(LDH)濃度(圖26的(a))、肌酐濃度(圖26的(b))、ALP濃度(圖26的(c))及尿酸濃度(圖26的(d))的結(jié)果的圖。圖27是表示測定所述血液中的尿素氮濃度的結(jié)果的圖。再者，圖中的“陰性對照(Negative Control)”是使用未進行CT-26細胞的移植及治療藥的施用的健康小鼠(以下稱為“健康對照群組”)的血液的情況的結(jié)果。

如圖25的(a)的“αCTLA-4+αPD-L1”所示，在施用100μg的抗CTLA-4抗體及200μg的抗PD-L1抗體的所述群組2中，與健康對照群組相比，血中白蛋白濃度顯著地下降。圖28的(a)～(d)是表示所述群組1～群組4的小鼠的肝臟的利用蘇木精伊紅(HE)的組織染色結(jié)果的圖，倍率為200倍。

將所述群組2的肝臟的組織的觀察結(jié)果示于圖28的(b)中。在該群組的所有小鼠中，與圖28的(b)同樣地，可看見多個細胞分裂像。圖25的(a)及圖28的(b)中所示的結(jié)果表示抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體具有肝組織損傷等副作用的可能性。

另外，如圖26的(b)的“αCTLA-4+αPD-L1”所示，在所述群組2中存在血中肌酐高的傾向，可想到對于腎臟也會有引起輕度的損傷的可能性。

另一方面，在將抗CTLA-4抗體及抗PD-L1抗體與IL-18組合施用的群組(群組3、群組4)中，如圖25的(a)中所示，血中白蛋白濃度與健康小鼠幾乎相同。另外，如圖28的(c)、(d)中所示，也未見肝臟組織中的細胞分裂像。進而，如圖26的(b)中所示，關(guān)于血中肌酐，在群組3、群組4中也與健康對照群組大致相同。血中的尿素氮如圖27中所示，在群組3中可看見抑制傾向。

如圖26的(c)、圖25的(d)中所示，血中ALP及血中ALT(GPT)的值在僅移植癌細胞而未實施治療的群組(圖中由“PBS”所表示的所述群組1)中顯著下降，但在群組3及群組4中顯示出與健康對照群組的值接近的值。另一方面，關(guān)于群組2，血中ALP與群組1幾乎無變化，血中ALT(GPT)比群組1顯著下降。根據(jù)圖26的(c)、圖25的(d)的結(jié)果，暗示在群組3及群組4中，用IL-18改善了血中ALP及血中ALT(GPT)的值。

本實施例的結(jié)果表示抗CTLA-4抗體與抗PD-L1抗體的組合帶來作為副作用的對肝臟、腎臟等造成損傷的可能性，且暗示IL-18抑制了所述副作用或促進了從損傷中的修復。關(guān)于抗CTLA-4抗體與抗PD-L1抗體中的哪種抗體與組織損傷相關(guān)等問題，今后需要進行進一步的研究。

如上所述，在所述群組2中，白蛋白、ALT(GPT)及ALP的血中濃度比健康對照群組大幅度下降，肌酐的血中濃度比健康對照群組大幅度增加。另一方面，關(guān)于所述群組3及群組4，在群組4中顯示出AST(GOT)比健康對照群組增加的傾向(圖25的(c))，在群組3中顯示出尿素氮比健康對照群組得到抑制的傾向(圖27)。另外，關(guān)于尿酸，在群組3及群組4中比健康對照群組有所增加(圖26的(d))。

但是，鑒于在圖25～27中所示的9個項目之中，在群組2中4個項目的結(jié)果大幅度背離健康對照群組，以及群組3與群組4與健康對照群組相比結(jié)果較差的均僅為尿酸的情況，綜合來看，可認為所述群組3及群組4中所使用的治療藥的副作用比群組2中所使用的治療藥少。

圖29及30、圖31、圖32、圖33、圖34分別表示胃、十二指腸、小腸、大腸、腎臟用蘇木精伊紅(HE)的組織染色結(jié)果，在圖29～34中，(a)～(d)分別表示對所述群組1～群組4的小鼠的組織進行觀察的結(jié)果。根據(jù)圖29～34可知，胃、十二指腸、小腸、大腸及腎臟的組織在群組1～群組4之間幾乎未見差異。

[實施例17：癌治療藥對于B16黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移的效果]

B16黑色素瘤細胞(黑色素瘤)經(jīng)常用作癌的轉(zhuǎn)移模型。在本實施例中，從小鼠(C57BL/6，日本SLC)的尾靜脈移入B16黑色素瘤細胞(2×10⁵個)，在幾周后清點肺中所形成的黑的小結(jié)節(jié)(小瘤)的數(shù)量并測定轉(zhuǎn)移的多少。

B16黑色素瘤細胞的細胞系使用從ATCC購入者，通過與實施例1中記載的方法相同的方法，制備細胞濃度為2×10⁵個/0.25ml的懸浮液，并將該懸浮液0.25ml注射至所述C57BL/6小鼠的尾靜脈中。

作為所述小鼠的治療藥，分成施用0.25ml的作為對照的PBS的群組(群組1)；施用100μg的抗CTLA-4抗體及200μg的抗PD-L1抗體的群組(群組2)；施用100μg的抗CTLA-4抗體、200μg的抗PD-L1抗體及IL-18(2μg)的群組(群組3)，各群組由4只小鼠組成。再者，PBS、抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的施用量(μg)是每25g的小鼠體重的施用量。

圖35是表示B16黑色素瘤細胞的移植與治療藥的施用日程表的圖，表示將移植B16黑色素瘤細胞的日期設(shè)為“第0日”，在該日期的3日后、7日后、11日后、15日后進行所述治療藥的腹腔內(nèi)施用，在28日后屠宰小鼠。

從所屠宰的小鼠中摘出肺，清點肺中所生成的黑的小結(jié)節(jié)(小瘤)的數(shù)量并測定轉(zhuǎn)移的多少。圖36～38分別是表示對所述群組1～群組3的小鼠的肺中所生成的小結(jié)節(jié)進行觀察的結(jié)果的圖，各圖的(a)～(d)表示供試的4只小鼠的結(jié)果。

對照群組(所述群組1)中的肺表面的小結(jié)節(jié)的數(shù)量平均為233+/-22.6，但在從B16黑色素瘤細胞的移植3日后起每4日施用抗CTLA4抗體及抗PD-L1抗體共計4次的群組(所述群組2)中為179+/-14.0，在施用抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及IL-18的群組(所述群組3)中為121+/-42.7。

相對于所述群組2的結(jié)果，所述群組3的結(jié)果未顯示出統(tǒng)計學上的顯著差異，但根據(jù)圖37與圖38的對比可知，群組3比群組2更抑制了向臟器的轉(zhuǎn)移。根據(jù)該結(jié)果，雖然在本實施例中供試了4只小鼠，但可認為通過進一步增加供試的小鼠的數(shù)量，或如實施例1般經(jīng)時地求得從移植B16黑色素瘤細胞的日期起的小鼠的生存率，十分有可能會顯示出所述顯著差異。

再者，在向腹腔內(nèi)施用抗CTLA4抗體及抗PD-L1抗體，在皮下施用IL-18的情況下，所述群組3的治療效果與將所述抗體及IL-18一并進行腹腔內(nèi)施用的情況也無不同?？烧J為其原因在于：由于所述抗體及IL-18均向血中轉(zhuǎn)移，因此不論施用路徑如何均顯示出相同的效果。

[總結(jié)]

如實施例中所示，已明確本發(fā)明的癌治療藥通過將抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體等分子靶向抗體與IL-18并用，在癌腹膜播散模型中顯示出非常優(yōu)異的抗腫瘤效果。除此以外，在肺轉(zhuǎn)移模型或?qū)嶓w癌模型中也同樣地顯示出強的抗腫瘤效果?？烧J為其原因在于：IL-18顯著地提高了分子靶向抗體的治療效果。

即，可認為IL-18在移入有腫瘤細胞的小鼠的腹腔中促進了CD8陽性T細胞、NK細胞等效應細胞的活化或增殖，由此提高了分子靶向抗體的治療效果。

尤其，暗示了B220陽性、DX5陽性、CD11c陽性的NK樣細胞(被稱為IKDC。IKDC是Interferon introducing killer dendritic cells(干擾素誘導的殺傷樹突狀細胞)的略稱)由IL-18引起的增加與由所述并用所帶來的抗腫瘤效果的增大相關(guān)。

另一方面，可認為由于所述并用抑制了CD4陽性T細胞的增殖，因此不會因所述并用而促進Treg等具有免疫/炎癥抑制作用的淋巴球的增殖。

另外，施用抗CTLA-4抗體及/或抗PD-L1抗體、以及IL-18的小鼠健康，未見體重減少等，在腸等器官中未見強烈的自身免疫樣的病變。另外，對肝功能、腎功能及組織病變進行研究的結(jié)果，已確認可認為本發(fā)明的癌治療藥的副作用少。

根據(jù)以上所述，本發(fā)明的癌治療藥可以說是顯示出優(yōu)異的抗腫瘤效果的有用的治療藥，尤其，可以說對于伴有腹膜播散的癌的治療有效。

[產(chǎn)業(yè)上的可利用性]

本發(fā)明可有效地用于癌的治療，特別是伴有腹膜播散的癌的治療?？稍卺t(yī)藥及與其相關(guān)的領(lǐng)域中廣泛利用。

序列表

<110> 學校法人兵庫醫(yī)科大學

<120> 并用IL-18與分子靶向抗體的癌治療藥

<130> FP1V170038ZX/JPHA/HF

<150> JP2014-161799

<151> 2014-08-07

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn

1 5 10 15

Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp

20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile

35 40 45

Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile

50 55 60

Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile

65 70 75 80

Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys

85 90 95

Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys

100 105 110

Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu

115 120 125

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu

130 135 140

Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp

145 150 155

<210> 2

<211> 157

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 2

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn

1 5 10 15

Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met

20 25 30

Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile

35 40 45

Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser

50 55 60

Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile

65 70 75 80

Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser

85 90 95

Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu

100 105 110

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu

115 120 125

Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp

130 135 140

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser

145 150 155