本發(fā)明涉及一種用于再生醫(yī)學的細胞制劑。更具體而言，涉及一種包含對皮膚潰瘍、包括由糖尿病引起的皮膚潰瘍的皮膚組織的修復及再生有效的多能性干細胞的細胞制劑，以及使用該多能性干細胞的治療皮膚潰瘍的方法。

背景技術：

糖尿病被認為是伴隨有持續(xù)的高血糖狀態(tài)的疾病，是由多種多樣的環(huán)境因素與遺傳因素作用之后而產生的。血糖主要的調節(jié)因子是由胰島素，高血糖，胰島素缺乏、或抑制其作用的眾多因子(例如，遺傳因素、運動不足、肥胖、以及壓力等)過多而產生的。糖尿病主要分為：因由自身免疫疾病等引起的胰胰島素分泌功能低下而產生的1型糖尿病、以及將由伴隨有持續(xù)的高胰島素分泌的胰腺枯竭引起的胰胰島素分泌功能的降低或胰島素抵抗作為原因的2型糖尿病。在日本，糖尿病已成為現(xiàn)代的國民病，超過95％的糖尿病患者(據(jù)預測如果包含處于糖尿病發(fā)病危險中的人會超過2，000萬人)患非胰島素依賴性糖尿病，隨著生活方式的變化，患者人數(shù)的增加已經(jīng)成為問題。據(jù)推測在世界水平內，糖尿病患者的人數(shù)估計為約2億人(非專利文獻1)，在2006年，糖尿病治療藥的全球市場規(guī)模約為1萬億日元。這是因為糖尿病在市場規(guī)模及人口幾乎均在第一位的原因。

糖尿病以及糖尿病的并發(fā)癥如心臟疾病、腎功能衰竭以及失明等多種重癥對個人造成影響，并且腳部并發(fā)癥帶來最大的損害。下肢全部截肢的40～70％與糖尿病有關，實際上，所有與糖尿病相關的下肢截肢的85％發(fā)生在腳部潰瘍以后。在患有糖尿病的患者中，伴隨著長期的并發(fā)癥，出現(xiàn)腳部的潰瘍等慢性皮膚潰瘍的癥狀的風險程度增加。潰瘍是由于局部缺血和/或神經(jīng)損害的結果而引起的。局部組織的缺血是糖尿病性潰瘍主要的發(fā)病原因。與大血管疾病相同，在被稱為動脈粥樣硬化、小血管疾病的微循環(huán)控制機構的損傷的過程中，糖尿病的患者具有被暴露于與非傳導性動脈相關的皮膚灌注的、更大的風險中。在正常的狀況下，血流增加以促進對損傷響應的愈合。然而，在存在有小血管疾病(以及局部缺血)的情況下，該反應顯著變慢，并在低流量的微循環(huán)中有發(fā)生血栓癥的傾向，這被認為在潰瘍的發(fā)病機制中是重要的。另一方面，相對于其對癥療法或預防神經(jīng)機能的進行性減退的任一種，神經(jīng)障礙缺乏充分確立的療法，使之成為糖尿病的主要的并發(fā)癥。特別是，末梢神經(jīng)病變的影響是復雜的。對糖尿病的神經(jīng)損傷的誘發(fā)機制至今仍未得到解決，但據(jù)說其是多元的，涉及遺傳因素、代謝及血管異常、以及缺乏有關的生長因子的擾動等。

針對上述這種難治性疾病，利用了多能性細胞的再生醫(yī)學受到關注。作為這種細胞已知有來源于脂肪組織的基質細胞(asc)，一般認為不僅具有向脂肪細胞、血管的分化能力，還具有向多種系統(tǒng)的分化能力(非專利文獻2～4)。報告有使用了該asc制備糖尿病小鼠的例子，嘗試治愈局部缺血性傷口(非專利文獻5)。此外，也有在具有末梢動脈障礙的患者的下肢的糖尿病性潰瘍的臨床治療中應用來源于脂肪組織的再生細胞的例子報道(非專利文獻6)。然而，仍然難以完全治愈傷口部位。

此外，作為從成年個體得到的具有分化能力的細胞，例如，已知具有向骨、軟骨、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌等的分化能力的間充質細胞組分(msc)(非專利文獻7及8)，但這些構成各種細胞的細胞群，其分化能力的實際情況并不清楚，在治療效果上偏差大。此外，已經(jīng)報道ips細胞來源于成年個體的多能性干細胞(專利文獻1等)，但由于在ips細胞的建立上，除了需要極其復雜的操作，例如將特定的基因導入到作為皮膚成纖維細胞組分的間充質細胞，或特定的化合物導入到體細胞以外，ips細胞還具有高腫瘤形成能力，因此在臨床應用中存在極高的障礙。

根據(jù)作為本發(fā)明的發(fā)明人之一的出澤的研究，存在于將ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3)作為表面抗原進行表達的間充質細胞組分的多能性干細胞(multilineage-differentiatingstressenduringcells多向-分化應力持久細胞；muse細胞)承擔間充質細胞組分所具有的多能性，其具有能應用于旨在組織再生的疾病治療的可能性(專利文獻2；非專利文獻9～12)。然而，在皮膚潰瘍的預防和/或治療中使用muse細胞的實施例中，并沒有明確得到所期待的治療效果。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特許公報第4183742號

專利文獻2：國際公開號wo2011/007900

非專利文獻

非專利文獻1：stumvoll.m.，etal.，lancet，vol.365，p.1333-1346(2005)

非專利文獻2：rehman，j.，etal.，circulation，vol.109，p.1292-1298(2004)

非專利文獻3：planat-benard，v.，etal.，circulation，vol.109，p.656-663(2004)

非專利文獻4：miranvile，a.，etal.，circulation，vol.110，p.349-355(2004)

非專利文獻5：kim，e.k.，etal.，plast.reconstr.surg.，vol.128，p.387-394(2011)

非專利文獻6：marino，g.，etal.，j.surg.res.，vol.185，p.36-44(2013)

非專利文獻7：dezawa，m.，etal.，j.clin.invest.，vol.113，p.1701-1710(2004)

非專利文獻8：dezawa，m.，etal.，science，vol.309，p.314-317(2005)

非專利文獻9：li，s.，etal.，cancergenetherapy，vol.12，p.600-607(2005)

非專利文獻10：kuroda，y.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa，vol.107，p.8639-8643(2010)

非專利文獻11：wakao，s，etal.，proc.natl.acad.sci.usa，vol.108，p.9875-9880(2011)

非專利文獻12：kuroda，y.，etal.，nat.protoco.，vol.8，p.1391-1415(2013)

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

本發(fā)明的目的在于，提供一種在再生醫(yī)學中使用多能性干細胞(muse細胞)的醫(yī)療新用途。更具體而言，本發(fā)明的目的在于，提供一種含有muse細胞的、用于預防和/或治療皮膚潰瘍的細胞制劑。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過對糖尿病性皮膚潰瘍小鼠在皮膚潰瘍患部給予muse細胞，muse細胞能重建及修復皮膚組織，引起潰瘍的愈合，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明如下所述。

[1]一種用于預防和/或治療皮膚潰瘍的細胞制劑，其包含有從生物體的間充質組織或培養(yǎng)的間充質細胞分離的ssea-3陽性的多能性干細胞。

[2]根據(jù)上述[1]中所記載的細胞制劑，其包含通過外部壓力刺激來濃縮ssea-3陽性的多能性干細胞的細胞組分。

[3]根據(jù)上述[1]及[2]中所記載的細胞制劑，其中所述皮膚潰瘍選自由糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、靜脈淤血潰瘍、動脈性潰瘍、放射線潰瘍、壞死性筋膜炎以及三度燒傷組成的組。

[4]根據(jù)上述[1]～[3]中所記載的細胞制劑，其中所述多能性干細胞為cd105陽性。

[5]根據(jù)上述[1]～[4]中所記載的細胞制劑，其中所述多能性干細胞為cd117陰性及cd146陰性。

[6]根據(jù)上述[1]～[5]中所記載的細胞制劑，其中所述多能性干細胞為cd117陰性、cd146陰性、ng2陰性、cd34陰性、vwf陰性以及cd271陰性。

[7]根據(jù)上述[1]～[6]中所記載的細胞制劑，其中所述多能性干細胞為cd34陰性、cd117陰性、cd146陰性、cd271陰性、ng2陰性、vwf陰性、sox10陰性、snai1陰性、slug陰性、tyrp1陰性以及dct陰性。

[8]上述[1]～[7]中所記載的細胞制劑，其中所述多能性干細胞是具有以下所有性質的多能性干細胞，：

(i)端粒酶活性低或無；

(ii)具有分化為三個胚層中的任一種細胞的能力；

(iii)不顯示腫瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

[9]根據(jù)上述[1]～[8]中所記載的細胞制劑，其中，所述多能性干細胞具有分化為選自由表皮角質細胞、血管內皮細胞、血管周皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、皮膚成纖維細胞以及神經(jīng)鞘細胞組成的組中的一種及以上的細胞的能力。

發(fā)明效果

本發(fā)明對患有皮膚潰瘍的對象，在皮膚潰瘍患部給予muse細胞，通過該患部muse細胞分化為構成皮膚組織的細胞的皮膚組織再生機理，來抑制皮膚潰瘍的發(fā)展并修復皮膚組織。

附圖說明

圖1的a為：由于通常在小鼠中，本來傷口愈合能力高，傷口很快就會愈合，因此在評價藥劑的傷口愈合效果時傷口愈合的差異不明確。因此在傷口愈合效果的評價中使用以傷口愈合難以進行為特征的、具有糖尿病的免疫缺陷小鼠。為了誘發(fā)1型糖尿病，對絕食了24小時的5周齡的雄性scid小鼠腹腔內注射鏈脲霉素(stz)。在給予stz(150mg/kg)3天后，調查高血糖(血中葡萄糖＞300mg/dl)。在未發(fā)現(xiàn)高血糖的情況下，再次給予stz(150mg/kg)。在9周齡的dm-scid小鼠的背部制作皮膚缺損。b為：顯示典型的血糖值的變化。絕大多數(shù)的小鼠通過1次或2次stz注射變?yōu)楦哐恰?/p>

圖2為已知msc分泌在傷口愈合的炎癥期及細胞生長期所需要的生長因子。因此，在低氧(1％o2)或正常氧(6％o2)條件下利用elisa測定培養(yǎng)了48小時的muse細胞組分及間充質細胞組分(msc)中的生長因子產生的相對值。測定的細胞因子(生長因子)包括hgf、sdf-1、pdgf-bb、vegf、egf、tgf-β、ngf-β、scf、bfgf以及tnf-α。y軸表示450nm處的吸光度。值是平均值±sd(n＝3)。＊：p＜0.05。

圖3為在第14天依次評價皮膚缺損(直徑6mm)的傷口愈合。拍攝傷口區(qū)域，使用數(shù)字圖像分析軟件計算相對于原來的創(chuàng)口大小的傷口區(qū)域的比例(％)。在scid小鼠中，本來與野生型小鼠(wt)相比發(fā)現(xiàn)傷口愈合稍微較慢，但由stz誘發(fā)的dm-scid小鼠的傷口愈合比scid小鼠還慢。用muse細胞群處理的dm-scid小鼠的傷口閉合，比未處理dm-scid小鼠顯著快，此外，與用msc處理了的dm-scid小鼠相比，muse細胞群處理的小鼠顯示出良好的傷口愈合。＊p＜0.05。

圖4為用muse細胞或msc處理了的dm-scid傷口的人高爾基復合體的免疫組織學的分析結果。在14天后，在用muse細胞及msc處理的兩個傷口區(qū)域的表皮及上層中，觀察到人高爾基復合體陽性細胞(與移植muse細胞相當)。然而，在周圍的未受傷的區(qū)域的任一個群中均未檢測到人高爾基復合體陽性細胞。muse細胞處理樣本比msc處理樣本更高頻率地檢測出移植人細胞。

圖5為表征移植的muse細胞，進行了人高爾基復合體及分化標記物(pecam-1)的雙重免疫組織化學染色。由于表達人高爾基復合體的一些細胞在pecam-1上為陽性，因此啟示出向真皮內的血管內皮細胞的分化。

具體實施方式

本發(fā)明涉及一種用于預防和/或治療皮膚潰瘍的細胞制劑，其含有ssea-3陽性的多能性干細胞(muse細胞)。以下對本發(fā)明進行詳細地說明。

1.適用疾病

本發(fā)明使用含有ssea-3陽性的多能性干細胞(muse細胞)的細胞制劑，其目的在于預防和/或治療皮膚潰瘍。此處，所謂“皮膚潰瘍”，是指通常由炎癥引起的組織表面的缺損(暴露于真皮或皮下組織)造成的皮膚上的傷害。通過本發(fā)明的細胞制劑能夠預防和/或治療的皮膚潰瘍并沒有限定，其包含糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、靜脈淤血潰瘍、動脈性潰瘍、放射線潰瘍、壞死性筋膜炎以及三度燒傷等。所謂“糖尿病性皮膚潰瘍”，是指由高血糖引起的血管內皮細胞的損傷造成的極度難治性皮膚潰瘍，例如糖尿病性足部潰瘍和糖尿病性小腿部潰瘍。所謂“壓力性潰瘍”，意味著長時間施加在皮膚區(qū)域的壓力造成的慢性潰瘍。這種傷口經(jīng)常也被稱為褥瘡?！办o脈淤血潰瘍”是由來自破損靜脈的血液或其他液體的淤血引起的?！皠用}性潰瘍”意味著血流不暢的動脈周圍的區(qū)域的壞死皮膚。“放射線潰瘍”是指在受到放射線照射的皮膚上產生的潰瘍?！皦乃佬越钅ぱ住笔侵笇\層筋膜作為細菌感染的主要地點，隨后壞死迅速擴散的軟組織炎癥。此外，“三度燒傷”意味著延伸到全部真皮層和皮下組織的燒傷。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的細胞制劑在糖尿病性皮膚潰瘍的預防和/或治療方面特別有效。

2.細胞制劑

(1)多能性干細胞(muse細胞)

本發(fā)明的發(fā)明人之一的出澤在生物體內發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的細胞制劑中所使用的多能性干細胞的存在，并將該細胞命名為“muse(multilineage-differentiatingstressenduring)細胞”。muse細胞能從骨髄液、脂肪組織(ogura，f.，etal.，stemcellsdev.，vol.23，p.717-728(2014))或真皮結締組織等的皮膚組織獲得，也分布于各個內臟器官的結締組織。此外，該細胞是具有多能性干細胞和間充質干細胞兩種性質的細胞，例如，被鑒定為對“ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3)”和“cd105”的各個細胞表面標記物的雙陽性。因此，例如，能以這些抗原標記物作為指示劑，將muse細胞或含有muse細胞的細胞群從生物體組織分離出來。此外，通過長期暴露于由低氧、或蛋白酶例如胰蛋白酶、分散酶等引起的應激，能濃縮含有muse細胞的細胞群。muse細胞的分離、鑒定以及特征等的詳細情況在國際公開號wo2011/007900中進行了公開。此外，如wakao等人(2011，如上述)的報告，已知在從骨髄、皮膚等培養(yǎng)間充質細胞，將它們作為muse細胞的親本群體來使用的情況下，所有ssea-3陽性細胞均是cd105陽性細胞。因此，在本發(fā)明的細胞制劑中，在生物體的間充質組織或培養(yǎng)的間充質干細胞分離muse細胞的情況下，能僅將ssea-3作為抗原標記物來純化并使用muse細胞。此外，在本說明書中用于治療皮膚潰瘍的細胞制劑，將ssea-3作為抗原標記物，從生物體的間充質組織或培養(yǎng)間充質組織分離的多能性干細胞(muse細胞)或含有muse細胞的細胞群可以簡單地描述為“ssea-3陽性細胞”。

簡單而言，通過單獨使用抗體到作為細胞表面標記物對應的ssea-3，或同時使用各個抗體到ssea-3及cd105，能將muse細胞或含有muse細胞的細胞群，從生物體組織(例如，間充質組織)進行分離。此處，所謂“生物體”，是指哺乳動物的生物體。在本發(fā)明中，對于生物體而言，不包含受精卵、胚胎在開始發(fā)育階段到囊胚期，但包含胎兒、包含囊胚及囊胚期以后的發(fā)育階段的胚胎。對于哺乳動物而言包括但不限于人、猴子等的靈長類；小鼠、大鼠、家兔、豚鼠等的嚙齒類；貓、狗、羊、豬、牛、馬、驢、山羊、鼬等。在本發(fā)明的細胞制劑中所使用的muse細胞，在以具有直接標記物的方式從生物體的組織進行分離的觀點方面，明確區(qū)別于胚胎干細胞(es細胞)、ips細胞。此外，所謂“間充質組織”，是指如骨、骨膜、脂肪、血液、骨髄、骨骼肌、真皮、韌帶、肌腱、牙髓、臍帶、臍帶血等組織及各種內臟器官。例如，muse細胞能從骨髄、皮膚、脂肪組織獲得。例如，優(yōu)選選取生物體的間充質組織，從該組織分離muse細胞，進而來利用。此外，也可以使用上述分離方法，從成纖維細胞、骨髄間充質干細胞等的培養(yǎng)間充質細胞分離muse細胞。需要說明的是，在本發(fā)明的細胞制劑中，所使用的muse細胞相對于接受細胞移植的接受者可以是自體或異體。

如上所述，muse細胞或含有muse細胞的細胞群，例如，能因其ssea-3陽性、及ssea-3和cd105的雙重陽性作為標記從生物體組織分離，但已知在人成人皮膚中，含有各種類型的干細胞及前體細胞。然而，muse細胞與這些細胞并不相同。對于這種干細胞及前體細胞而言，可以舉出來源于皮膚的前體細胞(skp)、神經(jīng)嵴干細胞(ncsc)、成黑素細胞(mb)、血管周圍細胞(pc)、內皮前體細胞(ep)以及來源于脂肪的干細胞(adsc)的例子。能將在這些細胞中固有的標記物的“非表達”作為標記，分離muse細胞。更具體而言，muse細胞能將選自由cd34(ep及adsc的標記物)、cd117(c-kit)(mb的標記物)、cd146(pc及adsc的標記物)、cd271(ngfr)(ncsc的標記物)、ng2(pc的標記物)、vwf因子(血管假性血友病因子)(ep的標記物)、sox10(ncsc的標記物)、snai1(skp的標記物)、slug(skp的標記物)、tyrp1(mb的標記物)以及dct(mb的標記物)組成的組中的、11個標記物中的至少1個，例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或者11個標記物的非表達作為標記進行分離。例如，雖然沒有限定，但能將cd117及cd146的非表達作為標記進行分離，進而，能將cd117、cd146、ng2、cd34、vwf以及cd271的非表達作為標記進行分離，進而，能將上述11個標記物的非表達作為標記進行分離。

此外，在本發(fā)明的細胞制劑中所使用的、具有上述特征的muse細胞還可以具有選自以下至少1個性質：

(i)端粒酶活性低或無；

(ii)具有分化為三胚層的任一種胚層細胞的能力；

(iii)不顯示腫瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。在本發(fā)明的一個方面中，在本發(fā)明的細胞制劑中所使用的muse細胞具有上述所有的性質。此處，關于上述(i)，所謂“端粒酶活性低或無”，例如，是指在使用trapezexltelomerasedetectionkit(millipore公司)檢測端粒酶活性的情況下，檢測結果低或無法檢測。所謂端粒酶活性“低”，例如，是指具有與作為體細胞的人成纖維細胞同等程度的端粒酶活性，或者與hela細胞相比具有1/5以下，優(yōu)選具有1/10以下的端粒酶活性。對于上述(ii)，muse細胞在體內和體外，具有分化為三胚層(內胚層系、中胚層系以及外胚層系)的能力，例如，通過以體外的方式進行誘發(fā)培養(yǎng)，能夠分化為肝細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、骨細胞以及脂肪細胞等。此外，在移植到睪丸的情況下有時也顯示出以體內的方式分化為三胚層的能力。進而，通過利用靜脈注射移植到生物體內，具有遷移及附著到受損傷的內臟器官(心臟、皮膚、脊髄、肝以及肌肉等)，分化為與組織相對應的細胞的能力。對于上述(iii)，muse細胞具有所謂的在懸浮培養(yǎng)中以增殖速度約為1.3天的方式進行增殖，在懸浮培養(yǎng)中從1個細胞開始增殖，形成類胚胎狀樣細胞塊，到14天左右增殖停止的性質，但當將這些類胚胎狀樣細胞塊進行貼壁培養(yǎng)時，細胞生長再次開始，從細胞塊增殖的細胞開始逐漸擴散。進而在移植到睪丸的情況下，具有至少半年時間不癌化的性質。此外，對于上述(iv)，muse細胞具有自我更新(自己復制)能力。此處，所謂“自我更新”，是指能確認從類胚胎狀樣細胞塊中所含的細胞向三胚層的細胞分化，其中所述類胚胎狀樣細胞塊是通過從一個muse細胞以懸浮培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng)所得到的，同時能確認通過將類胚胎狀樣細胞塊的細胞再次以1個細胞進行懸浮培養(yǎng)，使其形成下一代的類胚胎狀樣細胞塊，從此開始再次向三胚層的細胞分化和懸浮培養(yǎng)中的類胚胎狀樣細胞塊。使自我更新重復進行1個或多個周期即可。

(2)細胞制劑的制備及使用

本發(fā)明的細胞制劑沒有限定，但能夠通過將上述(1)中所得到的muse細胞或含有muse細胞的細胞群懸濁于生理鹽水、適當?shù)木彌_液(例如，磷酸緩沖生理鹽水)中獲得。在該情況下，在從自體或異體組織分離的muse細胞數(shù)少的情況下，也可以在細胞移植前培養(yǎng)細胞，直至獲得規(guī)定的細胞濃度再進行增殖。需要說明的是，如已經(jīng)報告的那樣(國際公開號wo2011/007900)，由于muse細胞不腫瘤化，因此即使從生物體組織回收的細胞保持未分化的狀態(tài)，癌化的可能性也低，是安全的。此外，雖然沒有特別限定，回收的muse細胞能在通常的生長培養(yǎng)基(例如，含有10％小牛血清的α-最小基本培養(yǎng)基(α-mem))中進行。更詳細而言，能參照上述國際公開號wo2011/007900，在muse細胞的培養(yǎng)及增殖中，適當?shù)剡x擇培養(yǎng)基、添加物(例如，抗生素、血清)等，制備含有規(guī)定濃度的muse細胞的溶液。在將本發(fā)明的細胞制劑給予受試者的情況下，從人的髂骨提取數(shù)ml左右的骨髄液，例如，在將從骨髄液來的骨髄間充質干細胞作為黏附細胞進行培養(yǎng)、增加到能分離有效的治療量的細胞量的muse細胞之后，能將ssea-3的抗原標記物作為標記分離muse細胞，將自體或異體的muse細胞作為細胞制劑進行制備。此外，能通過將muse細胞暴露于低氧、蛋白酶等的壓力下濃縮含有muse細胞的細胞群，作為細胞制劑來進行制備。或者，例如，能在將ssea-3的抗原標記物作為標記分離muse細胞后，在培養(yǎng)細胞增加達到有效的治療量后，將自體的muse細胞作為細胞制劑來進行制備。

此外，在細胞制劑中使用muse細胞的情況下，為了保護該細胞可以在細胞制劑中含有二甲基亞砜(dmso)、血清白蛋白等，為了防止細菌的污染及增殖也可以含有抗生素等。進而，在細胞制劑中也可以含有藥理學上容許的其他成分(例如，載體、賦形劑、崩解劑、緩沖劑、乳化劑、懸濁劑、安撫劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑以及生理鹽水等)、間充質干細胞中所含的muse細胞以外的細胞或成分。本領域技術人員能向細胞制劑以適當?shù)臐舛忍砑舆@些因子及藥劑。如此，muse細胞也能作為含有各種添加物的藥物組合物來使用。

在上述制備的細胞制劑中，為了在皮膚潰瘍的治療中得到所需的效果(例如，皮膚組織的重建等)，所含有的muse細胞數(shù)，能考慮對象的性別、年齡、體重、患部的狀態(tài)以及使用的細胞的狀態(tài)等，進行適當?shù)卣{整。在后述的實施例3～5中，對于通過給予鏈脲霉素(stz)制作的免疫缺陷糖尿病小鼠模型，研究了由muse細胞移植進行的各種效果。對于大約20～30g的scid小鼠，通過在患部給予ssea3陽性細胞1.0×10⁵細胞/頭，得到了非常優(yōu)異的效果。從該結果可以期待通過給予體重換算每個哺乳動物3.3～5×10⁶細胞/kg的細胞量可以得到優(yōu)異的效果。需要說明的是，設為對象的個體包含但不限于小鼠、人。此外，本發(fā)明的細胞制劑，可以在患部或靜脈內多次(例如，2～10次)、適當間隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次、1個月1次、2個月1次、3個月1次以及6個月1次)地給予，直到可以獲得所需的治療效果。因此，雖然根據(jù)對象的狀態(tài)調整，但作為治療上的有效量，優(yōu)選地例如，一個個體1×10³細胞～1×10⁷細胞、1～10次的給予量。一個個體的投與總量包括但不限于，例如1×10³細胞～1×10⁸細胞、1×10⁴細胞～5×10⁷細胞、2×10⁴細胞～2×10⁷細胞、5×10⁴細胞～5×10⁶細胞、1×10⁵細胞～1×10⁶細胞等。

3.小鼠糖尿病性皮膚潰瘍模型的制作和由muse細胞的治療效果

在本說明書中，為了研究由本發(fā)明的細胞制劑對皮膚潰瘍的治療效果，構建和使用了小鼠糖尿病性皮膚潰瘍模型。雖然沒有特別的限定，但一般而言，作為該模型使用的小鼠可以例如scid小鼠、balb/c小鼠。糖尿病性皮膚潰瘍模型通過對這些小鼠腹腔內給予鏈脲霉素(stz)制作而得。stz是葡萄糖的衍生物，對胰腺的β細胞造成損傷，可以用于使動物出現(xiàn)糖尿病的癥狀。根據(jù)本發(fā)明，stz的給藥量，優(yōu)選為150mg/kg1次，也可以多次給藥。

由于本發(fā)明的細胞制劑是來源于人的muse細胞，與給予了該制劑的小鼠是異種的關系。通常，在模型動物中在給予了異種的細胞等的實驗中，為了在異種細胞的生物體內抑制排斥反應，在異種細胞的給予前或給予同時給予免疫抑制劑(環(huán)孢菌素等)。至此，本發(fā)明的發(fā)明人等先前發(fā)現(xiàn)，若作為muse細胞的母本間充質細胞先天具有強的免疫抑制，則muse細胞也具有相同的作用。因此，在本發(fā)明中，除了scid小鼠以外，在未使用免疫抑制劑的小鼠模型中也可以使用免疫抑制劑。

在本發(fā)明的實施方式中，本發(fā)明的細胞制劑能治療患者的皮膚潰瘍，重建正常的皮膚。此處，所謂“重建正常的皮膚”，意味著具有皮膚潰瘍的患部的傷口愈合，變成完全治愈的狀態(tài)。重建了的皮膚的狀態(tài)，是表面全部被上皮角質細胞覆蓋的狀態(tài)，優(yōu)選上皮化完成的狀態(tài)。進而，進一步優(yōu)選在上皮的下面構建了具有足夠厚度真皮的狀態(tài)。進而更優(yōu)選汗腺和/或毛囊等的皮膚附屬器再生了的狀態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明的其他的方式，通過將muse細胞在低氧狀態(tài)(例如，氧濃度1％)下進行培養(yǎng)，能使muse細胞分泌各種細胞因子(參照實施例3)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種提高vegf、egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β的至少任一種細胞因子的生產能力的方法。

通過以下的實施例，進一步對本發(fā)明進行具體的說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。

實施例

實施例1：人muse細胞的制備

(1)人組織的取樣及細胞分離

得到東京大學醫(yī)學系研究科的倫理委員會的認可，通過吸脂手術從取得知情同意的5個女性非肥胖患者(年齡＝26.6±8.7，bmi＝21.5±2.0)的腹部和/或大腿得到了脂肪抽取物。從抽取的脂肪進行分離含有來源于脂肪的干細胞/間質細胞(asc)的間質血管組分(svf)，如前文所述(參照yoshimurak，etal.，j.cellphysiol.，vol.208，p.64-76(2006)參照)。簡單而言，用pbs清洗抽取的脂肪組織，在37℃下振蕩器上，在含有0.075％的膠原酶的pbs中進行消化30分鐘。通過離心分離將成熟脂肪細胞及結締組織與沉淀分離。重懸細胞沉淀，以100μm、70μm以及40μm的網(wǎng)眼進行過濾和裂解。將含有來源于脂肪的基質/干細胞的(asc)細胞沉淀(相當于svf)，在含有補充了10％胎牛血清(fbs)的杜爾貝科改良鷹培養(yǎng)基(dmem；nissui、tokyo、japan)的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。在從培養(yǎng)開始約2周時間后，使用相同培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)增殖了的hasc。使用含有2mm的edta的0.25％胰蛋白酶，在37℃下5分鐘的過程中對第二代的傳代培養(yǎng)hasc進行回收，然后用于muse細胞的分離。

(2)muse細胞的分離

為了回收ssea-3陽性的muse細胞，使用了磁激活細胞分選裝置(magnetic-activatedcellsorting(macs)，automacs，miltenyibiotec，bergischgladbach，germany)。由于muse細胞在其表面表達ssea-3，因此在macs分離muse細胞中使用藻紅蛋白(pe)(1：3稀釋，miltenyibiotec)及抗pe微珠(1：2稀釋，miltenyibiotec)結合的抗ssea-3抗體。將用微珠標記了的目標細胞在磁場內進行捕捉，然后作為陽性組分進行回收。未與磁性柱結合的細胞溶液，作為陰性組分進行回收。為了更好地純化muse細胞，使用macs程序，以非常慢的速度將細胞溶液兩次添加到磁性柱上。將得到的陽性細胞組分作為muse細胞群，另一方面，將陰性細胞組分作為間充質細胞組分(msc)，在以下的實施例中進行使用。

實施例2：免疫缺陷糖尿病小鼠模型的制成

從cleajapan，inc.(tokyo，japan)購買5周齡的雄性重癥復合免疫缺陷(scid)小鼠(c.b17/icr-scid，scid/scid)。所有的動物實驗，均是在得到東京大學的機構動物管理使用委員會的認可之后進行實施的。在使scid小鼠禁食24小時后，在腹腔內注射含有新鮮制備的鏈脲霉素(stz；150mg/kg，sigma-aldrich，st.louis，mo)的檸檬酸鹽緩沖鹽水(ph4.5)。在stz注射后的第3天，使用血糖儀及測試條(glucosepilot，aventirbiotechllc，carlsbad，ca)測定血糖水平。當血糖水平超過300mg/dl時，則認為小鼠具有糖尿病(dm)。在未顯示高血糖(＞300mg/dl)的小鼠中，進行第二次的stz注射(150mg/kg)，在3日后檢測其血糖水平(圖1a)。

為了評價皮膚傷口的愈合，如前所述在小鼠的背部制作皮膚缺損(參照galiano，r.d.，etal.，woundrepairregen.，vol.12，p.485-492(2004)；tepper，o.m.，diabetes，vol.10，2337/db09-0185)。簡單而言，通過逐個進行戊巴比妥(65mg/kg)的腹腔內注射來麻酔小鼠。在用電推子及脫毛膏進行背部除毛后，使用消毒過的圓形的活檢穿孔器(kaiindustriesco.，tokyo，japan)，在小鼠的背部產生貫通皮膚肌肉層的2個全層皮膚傷口(直徑6mm)。為了避免傷口的收縮，貼上環(huán)形硅夾板(內徑及外徑分別為9以及15mm；1.0mm厚度的硅橡膠片，kyowaindustries，saitama，japan)，使用6-0尼龍的縫合線進行固定(圖1a)。為了傷口的干燥及防止瘡痂形成使用密封繃帶(perme-roll，nittomedical，osaka，japan)。

準備5個實驗群：野生型小鼠、非dm-scid小鼠、dm誘導的scid小鼠、用muse細胞群處理的dm誘導的scid小鼠以及用間充質細胞組分(msc)處理的dm誘導的scid小鼠。每群使用6只小鼠。將muse細胞(1.0×10⁵細胞/小鼠)與0.1ml交聯(lián)的透明質酸(restylane，q-med，uppsala，sweden)混合后，皮下注射到傷口周邊。調查肉眼可見的傷口閉合的時間(直到上皮完全再生的天數(shù))。使用普通的數(shù)碼相機(ixydigital90，canon，tokyo，japan)，在第0、3、7、10以及14天依次拍攝傷口。使用圖像分析軟件(photoshopcs6，adobesystems，sanjose，ca)評價照片測定傷口面積。

實施例3：細胞因子生產試驗(elisa法)

已知msc分泌傷口愈合的炎癥期及細胞生長期所需要的生長因子(例如，pdgf、bfgf、tgf-β以及egf等)(maxson，s.，etal.，stemcellstransl.med.，vol.1，p.142-149(2012))。因此，在低氧條件下及正常氧條件下，體外培養(yǎng)muse細胞群及msc，研究培養(yǎng)液中所分泌的細胞因子。以如下方式進行實驗。在60mm培養(yǎng)皿接種4.0×10⁵個的muse細胞群及msc，在無血清的dmem中，在低氧(1％o2)或正常氧(6％o2)條件下進行培養(yǎng)。48小時后，回收培養(yǎng)培養(yǎng)基，使用0.22μm過濾器(millex-gvfilter，millipore，billerica，ma)進行過濾。使用用于肝細胞生長因子(hgf)及基質細胞衍生因子1(sdf-1)的elisa試劑盒(兩者均為r&dsystems，minneapolis，mn)，以及用于血管內皮生長因子(vegf)、上皮生長因子(egf)、血小板衍生生長因子(pdgf-bb)、神經(jīng)生長因子-β(ngf-β)、干細胞因子(scf)、腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)以及轉化生長因子-β(tgf-β)(signosis#ea-1101，santaclara，ca)的細胞因子芯片試劑盒，比較研究分泌的細胞因子量。使用infinite酶標儀(m1000，tecangroup，mannedorf，switzerland通過分光光度法)在450nm處測定吸光度。

在正常氧(6％o2)或低氧(1％o2)條件下muse細胞群以及msc貼壁培養(yǎng)，比較48小時后的培養(yǎng)培養(yǎng)基中的細胞因子的濃度的結果顯示在圖2中。與在相同的氧分壓下培養(yǎng)的msc相比，muse細胞群釋放出更大量的egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β。進而，在muse細胞群中，低氧條件下的vegf、egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β的濃度，比正常氧條件較高。

實施例4：dm-scid小鼠的傷口愈合

鏈脲霉素(stz)通過損傷胰腺β細胞誘發(fā)1型dm，但stz的給予用量及方法與迄今為止的報告(參照schmidt，r.e.，etal.，am.j.pathol.，vol.163，p.2077-2091(2003)；lee，r.h.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa.，vol.103，p.17438-17443(2006)；schmidt，r.e.，etal.，exp.neurol.，vol.209，p.161-170(2008))不同。當給予200mg/kg的stz時，scid小鼠大多數(shù)由于重度的體重減少及代謝異常，在給藥的1周時間以內就會死亡。然而，當向禁食24小時后的scid小鼠注射150mg/kg的stz時，能比較一致地誘發(fā)高血糖，dm狀態(tài)(＞300mg/dl的血中葡萄糖)持續(xù)超過30天(圖1b)。在傷口愈合實驗中，在30天間使用單次(29只中的9只小鼠；31.0％)或兩次(29只中的13只小鼠；44.8％)的stz注射scid小鼠，在最后注射stz以后，成功地誘導了scid小鼠的dm。

在與野生型(wt)小鼠(n＝6)或非dm-scid小鼠(n＝6)比較的情況下，dm-scid小鼠的傷口愈合顯著延遲(圖3)。wt及非dm-scid小鼠在第7天分別顯示出56.9±12.0％及67.5±6.5％的傷口大小，但dm-scid小鼠(n＝6)顯示出95.4±3.1％的傷口大小(wtvs.dm-scid；p＜0.0001)。此外，即使在第14天，dm-scid小鼠也顯示出比wt或非dm-scid小鼠大的傷口大小。因此，能確認dm-scid小鼠是具有傷口愈合障礙的免疫缺陷的動物模型。

通過皮下注射muse細胞群或msc來進行處理dm-scid小鼠的皮膚傷口。用muse細胞處理的dm-scid小鼠(n＝6)顯示出比用msc處理了的dm-scid小鼠(n＝6)更優(yōu)異的傷口愈合。在第7天，用muse細胞及msc處理了的dm-scid小鼠的傷口大小分別為51.05±7.2％及74.0±6.6％(p＜0.0001)。在第14天，在用muse細胞處理了的dm-scid小鼠中傷口完全愈合，但用msc處理了的dm-scid小鼠的傷口大小仍為30.3±6.7％(p＝0.0235)。在用muse細胞處理的dm-scid小鼠中，傷口愈合比得上wt群的傷口愈合。

實施例5：組織學的分析

將小鼠皮膚樣本包埋于oct化合物(sakurafinetek，tokyo，japan)中，在液氮中進行凍結，并在-80℃下進行保存直至切片。將冷凍切片(8μm)置于載玻片上，在室溫下干燥20分鐘，然后用4％多聚甲醛(pbs中)固定1分鐘，用pbs清洗5分鐘。用蘇木精及曙紅(h&e)對載玻片進行染色，并進行免疫組織化學分析。

如上所述(參照kuroda，y.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa.，vol.107，p.8639-8643(2010))實施免疫組織化學分析。為了通過辣根過氧化物酶(hrp)反應檢測人高爾基體蛋白質，將切片在含有0.3％雙氧水的甲醇中處理30分鐘，以使內因性過氧化物酶活性失活，用兔子抗人58k高爾基體蛋白質(1：100稀釋，abcam，cambridge，uk)及驢抗兔子igg-hrp(1：500稀釋，jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)依次進行溫育。通過使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(dab)的過氧化物酶反應顯示人58k高爾基蛋白質的表達。將凍結切片與以下的第一抗體一起進行溫育，用共焦距激光顯微鏡觀察：小鼠抗人線粒體(1：100稀釋，abcam)、兔抗人58k高爾基體蛋白質、兔抗人-ck14(1：200稀釋，abcam)或山羊抗人血小板內皮細胞粘附分子-1(pecam-1；1：50稀釋，santacruzbiotechnology，santacruz，ca)。接著，將切片與以下的第二抗體一起進行溫育：驢抗小鼠igg-alexa488、驢抗兔igg-alexa680或者兔抗山羊igg-alexa488(全部1：500稀釋，invitrogen，carlsbad，ca)。細胞核用dapi進行對比染色，使用共焦距顯微鏡(c1sinikon，nikon，tokyo，japan)進行檢查。

通過人高爾基復合體的免疫組織學的分析，顯示出在第14天，在用muse細胞群及msc處理了的各個樣本中，在傷口區(qū)域的表皮及真皮上層中，檢測到了移植細胞。然而，在周圍的的未受損區(qū)域未發(fā)現(xiàn)人高爾基復合體+細胞(圖4)。此外，在皮下層檢測到注入的透明質酸的沉積。進而，真皮內的一些人高爾基復合體+細胞對h-pecam-1也是陽性(圖5)。這些數(shù)據(jù)表明，移植的muse細胞能在表皮及真皮的任一個中存活，并且分化為表皮角質細胞及血管內皮細胞。

產業(yè)上的可利用性

本發(fā)明的細胞制劑，通過給予到糖尿病性皮膚潰瘍小鼠模型的皮膚潰瘍患部，能重建及修復皮膚組織，能應用于糖尿病性皮膚潰瘍的治療。

本說明書中引用的所有的出版物及專利文獻，由于參照作為全體均在本說明書中被援用。需要說明的是，盡管為了示例的目的，在本說明書中對本發(fā)明的特定的實施方式進行了說明，但本領域技術人員應該能容易地理解，只要不脫離本發(fā)明的精神及范圍，就能夠對其進行各種改變。