發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及澳瑞他汀或基于澳瑞他汀（auristatin）的抗體-藥物-綴合物(adc)與第二種活性劑（諸如pi3k/mtor抑制劑、mek抑制劑、紫杉烷或其它抗癌劑）的組合。本發(fā)明還涉及通過將這些組合施用給患者來治療異常細(xì)胞生長（例如癌癥）的方法。

發(fā)明概述

在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種治療異常細(xì)胞生長（諸如癌癥）的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用有效量的澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc與選自pi3k/mtor抑制劑、mek抑制劑、紫杉烷和其它抗癌劑的第二種藥劑的組合。

癌癥藥物靶標(biāo)mtor以兩類復(fù)合物形式存在：含有raptor亞基的mtorc1和含有rictor的mtorc2。如本領(lǐng)域已知的，“rictor”表示具有人基因座sp13.1的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)蛋白。這些復(fù)合物被不同地調(diào)節(jié)且具有不同的底物范圍。mtorc2通常對雷帕霉素和選擇性抑制劑不敏感。認(rèn)為mtorc2通過磷酸化一些agc激酶（諸如akt）的c-端疏水基序來調(diào)節(jié)生長因子信號傳遞。在許多細(xì)胞背景下，mtorc2是akt的s473位點的磷酸化所必需的。因而，mtorc1活性部分地受akt控制，而akt本身部分地受mtorc2控制。磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)的生長因子刺激會造成通過在兩個關(guān)鍵位點s473和t308處的磷酸化實現(xiàn)的akt活化。已經(jīng)報道，akt的完全活化需要s473和t308active的磷酸化。akt會以許多方式促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，所述方式包括抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)葡萄糖攝取和改變細(xì)胞代謝。在akt上的2個磷酸化位點中，認(rèn)為由pdki介導(dǎo)的在t308處的激活環(huán)磷酸化是激酶活性所必不可少的，而在s473處的疏水基序磷酸化會增強(qiáng)akt激酶活性。在s473處的akt磷酸化可以用作pi3k/aktmtor途徑的組成性活化的標(biāo)志物。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和pi3k-mtor抑制劑，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑是pf-384。

在另一個實施方案中提供了一種用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和pi3k-mtor抑制劑，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502，且其中所述澳瑞他汀是下式的化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或所述化合物或鹽或溶劑合物的抗體-藥物綴合物，其中，在每次出現(xiàn)時獨立地，

w是

r¹是氫、c1-c8烷基或c1-c8鹵代烷基；

r²是氫、c1-c8烷基或c1-c8鹵代烷基；

r^3a和r^3b是以下任一種：

(i)r^3a是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基、鹵素或芳烷基；且

r^3b是c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基、芳烷基或鹵素；或

(ii)r^3a和r^3b一起是c2-c8亞烷基或c1-c8亞雜烷基；

r^4a和r^4b是以下任一種：

(i)r^4a是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基或芳烷基；且

r^4b是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基或芳烷基；或

(ii)r^4a和r^4b一起是c2-c8亞烷基或c1-c8亞雜烷基；

r⁵是

c1-c10雜環(huán)基、c3-c8碳環(huán)基和c6-c14芳基，其任選地被1、2、3、4或5個基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨立地選自-c1-c8烷基、-c1-c8烷基-n(r’)2、-c1-c8烷基-c(o)r’、-c1-c8烷基-c(o)or’-o-(c1-c8烷基)、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、鹵素、-n3、-n(r')2、-cn、-nhc(=nh)nh2、-nhconh2、-s(=o)2r'和-sr'，其中每個r'獨立地選自氫、c1-c8烷基和未被取代的芳基，或兩個r’可以與它們所連接的氮一起形成c1-c10雜環(huán)基；

或r⁵是，其任選地被1、2、3、4或5個基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨立地選自c1-c8烷基、-c1-c8烷基-n(r’)2、-c1-c8烷基-c(o)r’、-c1-c8烷基-c(o)or’、-o-(c1-c8烷基)、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、鹵素、-n3、-n(r')2、-cn、-nhc(=nh)nh2、-nhconh2、-s(=o)2r'、-sr'和亞芳基-r’，其中每個r'獨立地選自氫、c1-c8烷基、c1-c8雜環(huán)基、c1-c10亞烷基-c3-c8雜環(huán)基和芳基，或兩個r’可以與它們所連接的氮一起形成c1-c10雜環(huán)基；

r⁶是氫、-c1-c8烷基、-c2-c8烯基、-c2-c8炔基或-c1-c8鹵代烷基；

r¹²是氫、c1-c4烷基、c1-c10雜環(huán)基或c6-c14芳基；

r¹³是c1-c10雜環(huán)基；且

x是o。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502，且所述澳瑞他汀選自抗體藥物綴合物5t4-adc、pf-101和mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502，且所述澳瑞他汀是抗體藥物綴合物5t4-adc。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502，且所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502，且所述澳瑞他汀是mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療肺癌。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述pi3k-mtor抑制劑和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療乳腺癌。

在這樣的方法的另一個實施方案中，同時施用或相繼施用所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc和所述pi3k-mtor抑制劑。

在這樣的方法的另一個實施方案中，以任一種次序依次施用所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc和所述pi3k-mtor抑制劑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；一定量的pf-384或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和mek抑制劑。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述mek抑制劑是pd-901。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑是pd-901，且所述澳瑞他汀選自抗體藥物綴合物5t4-adc、pf-101和mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑是pd-901，且所述澳瑞他汀是抗體藥物綴合物5t4-adc。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑是pd-901，且所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑是pd-901，且所述澳瑞他汀是mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療肺癌。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述mek抑制劑和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療乳腺癌。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc或其藥學(xué)上可接受的鹽，和一定量的pd-901或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和紫杉烷。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽，且所述澳瑞他汀選自抗體藥物綴合物5t4-adc、pf-101和mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽，且所述澳瑞他汀是抗體藥物綴合物5t4-adc。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽，且所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽，且所述澳瑞他汀是mmaf。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療肺癌。

在這樣的方法的另一個實施方案中，所述紫杉烷和所述澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc用于治療乳腺癌。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或基于澳瑞他汀的adc或其藥學(xué)上可接受的鹽，和一定量的選自紫杉醇和多西他賽或其藥學(xué)上可接受的鹽的紫杉烷；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

還提供了這樣的實施方案，其中同時施用或相繼施用所述澳瑞他汀和所述紫杉烷。

還提供了這樣的實施方案，其中以任一種次序依次施用所述澳瑞他汀和所述紫杉烷。

另一個實施方案包括一種藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；一定量的紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

提供了一個實施方案，其中，在本文描述的并行施用方法（包括澳瑞他汀與pi3k/mtor抑制劑一起、澳瑞他汀與mek抑制劑一起、和澳瑞他汀與紫杉烷一起施用）中的任一種中，通過并行施用實現(xiàn)的抗癌效果大于通過非并行地施用所述第一種和第二種藥物組合物實現(xiàn)的抗癌效果。

提供了用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型實施方案，其包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)pi3k-mtor抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502；和(c)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

提供了用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型實施方案，其包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)mek抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述mek抑制劑是pd-901；和(c)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

提供了用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型實施方案，其包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101；(b)紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽；和(c)和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

提供了試劑盒實施方案，其包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；(b)在第一單位劑型中的pi3k-mtor抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。

提供了試劑盒實施方案，其包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；(b)在第一單位劑型中的mek抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述mek抑制劑是pd-901；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。

提供了試劑盒實施方案，其包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101；(b)在第一單位劑型中的紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。

附圖簡述

圖1：在一組癌細(xì)胞系中的聯(lián)合指數(shù)(ci)值的總結(jié).a.點圖顯示了分析含有pf-384（一種雙重pi3k/mtor抑制劑）或含有mtor-特異性的抑制劑的藥物組合以后得到的ci指數(shù)值的范圍。b.點圖顯示了分析含有ptx的藥物組合以后得到的ci指數(shù)值的范圍。使用如在材料和方法中所述的choutalalay方法確定a.和b.的ci指數(shù)，并且對于每個組合以ed50水平呈現(xiàn)。結(jié)果是至少三個獨立實驗的平均值。已經(jīng)如下解釋ci：非常強(qiáng)的協(xié)同作用(<0.1)、強(qiáng)協(xié)同作用(0.1-0.3)、協(xié)同作用(0.3-0.7)、中等協(xié)同作用(0.7-0.85)、輕微協(xié)同作用(0.85-0.9)、接近累加(0.9-1.1)、輕微拮抗作用(1.1-1.2)和中等拮抗作用(1.2-1.45)。虛線是在1.1和0.7的ci值處。ptx，紫杉醇；vino，長春瑞濱；aur101，澳瑞他汀-101；mtori，wye-132。

圖2：用xceligence系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測mda-468細(xì)胞中的細(xì)胞生長.a.5t4-adc、pf-384或組合在mda-468細(xì)胞中的濃度-和時間-依賴性的細(xì)胞毒性效應(yīng)。在a.中，顯示了三個不同實驗的一個代表。b.呈現(xiàn)了8-天時間點的阻抗指數(shù)值，并顯示了5t4-adc+pf-384組合的細(xì)胞生長抑制的統(tǒng)計上顯著的增強(qiáng)。c.mmaf-ome、pf-384或組合在mda-468細(xì)胞中的濃度-和時間-依賴性的細(xì)胞毒性效應(yīng)。在c.中，顯示了三個不同實驗的一個代表。d.呈現(xiàn)了8-天時間點的阻抗指數(shù)值，并顯示了mmaf-ome+pf-384組合的細(xì)胞生長抑制的統(tǒng)計上顯著的增強(qiáng)。

圖3：5t4-adc或mmaf-ome與pf-384或ptx的組合導(dǎo)致3d培養(yǎng)物中細(xì)胞生長的更強(qiáng)抑制。如在材料和方法中所述，測量在基質(zhì)膠中作為3d球狀體生長的mda-468(a-f)或h-1975(g-j)細(xì)胞和球狀體生存力。值是平均值±sem。a，用遞增劑量的5t4-adc、固定劑量的pf-384(10nm)或兩種藥物的組合處理7天的mda-468細(xì)胞。描繪了相對于各個未經(jīng)處理的對照的生長百分比。虛線指示固定劑量的pf-384的%生存力。b，在來自a的指示的藥物濃度處選擇的數(shù)據(jù)點的直方圖。星號代表相對于5t4-adc+pf-384的顯著差異(**p<0.01，student氏t檢驗)。c，用遞增劑量的pf-384、固定劑量的mmaf-ome(0.8nm)或兩種藥物的組合處理7天的mda-468細(xì)胞。描繪了相對于各個未經(jīng)處理的對照的生長百分比。虛線指示固定劑量的mmaf-ome的%生存力。d，在來自(c)的指示的藥物濃度處選擇的數(shù)據(jù)點的直方圖。星號代表相對于mmaf-ome+pf-384的顯著差異(**p<0.01，***p<0.001；student氏t檢驗)。e，用遞增劑量的5t4-adc、固定劑量的ptx(1nm)或兩種藥物的組合處理7天的mda-468細(xì)胞。描繪了相對于各個未經(jīng)處理的對照的生長百分比。虛線指示固定劑量的ptx的%生存力。f，在來自(e)的指示的藥物濃度處選擇的數(shù)據(jù)點的直方圖。值是平均值±sem。星號代表相對于5t4-adc+ptx的顯著差異(**p<0.01，***p<0.001；student氏t檢驗)。g，用遞增濃度的pf-384、固定劑量的5t4-adc(5或10g/ml)或兩種藥物的組合處理的h-1975球狀體的劑量響應(yīng)曲線。h.在來自g的指示的藥物濃度處選擇的數(shù)據(jù)點的直方圖。星號代表相對于5t4-adc(10μg/ml)+pf-384(*p<0.05，***p<0.001；student氏t檢驗)或相對于5t4-adc(5μg/ml)+pf-384(*p<0.05；student氏t檢驗)組合的顯著差異。i，用遞增濃度的pf-384、固定劑量的mmaf-ome(0.3或0.8nm)或兩種藥物的組合處理的h-1975球狀體的劑量響應(yīng)曲線。j.在來自i的指示的藥物濃度處選擇的數(shù)據(jù)點的直方圖。星號代表相對于mmaf-ome(0.3nm)+pf-384(*p<0.05；student氏t檢驗)或相對于mmaf-ome(0.8nm+pf-384(**p<0.01，****p<0.0001，student氏t檢驗)組合的顯著差異。

圖4:5t4-adc或mmaf-ome與pf-384或ptx的組合對天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活性的誘導(dǎo)。a,d在用5t4-adc(10μg/ml)+pf-384(1m)處理24小時的mda-468(a)或h-1975(e)細(xì)胞中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7的增強(qiáng)的誘導(dǎo)。b,f在用mmaf-ome(2nm)+pf-384(1μm)處理24小時的mda-468(b)或h-1975(f)細(xì)胞中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7的增強(qiáng)的誘導(dǎo)。c,d在用5t4-adc(1μg/ml)+ptx(6nm)(c)或mmaf-ome(0.22nm)+ptx(6nm)(d)處理48小時的mda-468細(xì)胞中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活性的增強(qiáng)的誘導(dǎo)。如在材料和方法中所述，確定天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活性的誘導(dǎo)倍數(shù)。顯示了一式三份實驗的平均值和sem。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。星號顯示了每種單獨藥物和組合之間的統(tǒng)計上顯著的差異；student氏t檢驗。

圖5:5t4adc、mmaf-ome、pf-384的單一藥劑處理和它們的組合對細(xì)胞周期狀況的影響.用媒介物(cntrl)、5t4-adc(1μg/ml)、pf-384(100nm)作為單一藥劑或5t4-adc(1μg/ml)+pf-384(100nm)組合處理24(a)和36(b)小時的mda-468的細(xì)胞周期階段分布。c，單一藥劑處理5t4-adc、pf-384和它們的組合對有絲分裂指數(shù)的影響。對于在a、b中所示的實驗，通過流式細(xì)胞計量術(shù)將有絲分裂指數(shù)確定為群體中磷酸-組蛋白h3-陽性的細(xì)胞的百分比。用flowcellectbivariatecellcycle試劑盒通過流式細(xì)胞計量術(shù)執(zhí)行細(xì)胞周期分析和有絲分裂指數(shù)。將細(xì)胞周期的g1、s、g2期標(biāo)繪為帶有標(biāo)準(zhǔn)誤差的總細(xì)胞群體的平均百分比。結(jié)果是一式三份地運行的兩個獨立實驗的代表，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖6：5t4-adc+pf-384組合治療導(dǎo)致在體內(nèi)乳腺癌和肺癌模型中增強(qiáng)的治療效果。a，用媒介物、5t4-adc(靜脈內(nèi)2mg/kg，q4dx4)、pf-384(靜脈內(nèi)7.5mg/kg，q4dx4)或組合治療的攜帶皮下mda-468腫瘤的小鼠。將達(dá)到端點的時間(tte)定義為動物實現(xiàn)腫瘤消退的所逝去的時間。kaplan-meier圖顯示了具有腫瘤的動物的百分比隨時間的變化。tte分析證實了與5t4-adc的單一藥劑活性相比，對于5t4-adc和pf-384的組合而言顯著增加的腫瘤消退速率(p<0.0001，時序mantel-cox檢驗)。pf-384在該實驗中沒有引起消退。b，在第53天對(a)所示的數(shù)據(jù)的單個腫瘤體積分析。5t4-adc+pf-384導(dǎo)致與單獨的5t4-adc(p<0.05)或pf-384(p<0.0001)治療相比平均腫瘤體積的統(tǒng)計上顯著的抑制。圖顯示了在第53天(在任何實驗組中從研究取出≥15%的小鼠時的時間)的單個腫瘤體積，條指示每組的平均腫瘤體積。cr，通過完全腫瘤消退定義的完全緩解。c，用5t4-adc(靜脈內(nèi)3mg/kg，q4dx4)、pf-384(靜脈內(nèi)7.5mg/kg，q4dx4)或組合治療攜帶皮下h-1975腫瘤的小鼠。將端點定義為腫瘤體積已經(jīng)增至三倍的時間。kaplan-meier圖顯示了隨時間變化的具有小于3倍的腫瘤體積增加的動物的百分比。數(shù)據(jù)的tte分析證實了與單獨的5t4-adc(p=0.0356，時序檢驗)或pf-384(p<0.0001時序檢驗)的單一藥劑活性相比，對于5t4-adc+pf-384組合而言腫瘤增至三倍的速率的顯著延遲。d，在第21天在(c)中顯示的數(shù)據(jù)的單個腫瘤體積分析。5t4-adc導(dǎo)致與單獨的5t4-adc(p<0.01)或pf-384(p<0.0001)治療相比平均腫瘤體積的統(tǒng)計上顯著的抑制。

圖7：5t4-adc和ptx組合治療導(dǎo)致在體內(nèi)乳腺癌和肺癌模型中增強(qiáng)的治療效果。a，用5t4-adc(靜脈內(nèi)2mg/kg，q4dx4)、ptx(口服10mg/kg，q4dx4)或組合治療攜帶皮下mda-468腫瘤的小鼠。數(shù)據(jù)的tte分析證實了與5t4-adc(p=0.0071，時序檢驗)或ptx(p=0.01，時序檢驗)的單一藥劑活性相比，用5t4-adc和ptx的組合實現(xiàn)的顯著更快的完全腫瘤消退速率。b，在第53天對(a)所示的數(shù)據(jù)的單個腫瘤體積分析。5t4-adc+ptx(10mg/kg)導(dǎo)致與單獨的5t4-adc(p<0.05)或ptx(p<0.001)治療相比平均腫瘤體積的顯著增強(qiáng)的抑制。條指示每組的平均腫瘤體積。cr，通過完全腫瘤消退定義的完全緩解。c，類似于(a)，但是以22.5mg/kg(口服q4dx4)的劑量使用ptx。數(shù)據(jù)的tte分析顯示了與5t4-adc(p=0.00821，時序檢驗)或ptx（所述藥劑在該劑量沒有產(chǎn)生任何腫瘤消退）的單一藥劑活性相比，用5t4-adc+ptx的組合實現(xiàn)的顯著更快的完全腫瘤消退速率。d，在第53天對(c)中所示的數(shù)據(jù)的單個腫瘤體積分析。5t4-adc+ptx(22.5mg/kg)導(dǎo)致與單獨的5t4-adc(p<0.05)或ptx(p=0.07)治療相比平均腫瘤體積的增強(qiáng)的抑制。條指示每組的平均腫瘤體積。cr，通過完全腫瘤消退定義的完全緩解。e，用5t4-adc(靜脈內(nèi)3mg/kg，q4dx4)、ptx(口服10mg/kg，q4dx4)或組合治療攜帶皮下h-1975腫瘤的小鼠。與ptx組合的5t4-adc比用單一藥劑治療更有效。與圖3c類似地執(zhí)行的數(shù)據(jù)的tte分析證實了與單獨的5t4-adc(p<0.0001，時序檢驗)或ptx(p=0.0001，時序檢驗)的單一藥劑活性相比，對于5t4-adc+ptx組合而言腫瘤增至三倍的速率的顯著延遲。f，在第46天對(e)中所示的數(shù)據(jù)的單個腫瘤體積分析。5t4-adc+ptx(22.5mg/kg)導(dǎo)致與單獨的5t4-adc(p<0.0001)或ptx(p<0.0001)治療相比平均腫瘤體積的增強(qiáng)的抑制。條指示每組的平均腫瘤體積。g，用5t4-adc(靜脈內(nèi)3mg/kg，q4dx4)、ptx(口服22.5mg/kg，q4dx4)或組合治療攜帶皮下37622a1肺癌pdx腫瘤的小鼠。誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。在第56天終止研究，此時一個組(媒介物)已經(jīng)喪失超過15%的動物。在媒介物組終止時進(jìn)行統(tǒng)計分析(***p<0.001，****p<0.0001，雙因素方差分析)。

圖8：5t4-adc+吉西他濱組合治療導(dǎo)致在體內(nèi)肺癌模型中增強(qiáng)的治療效果。

用5t4-adc(靜脈內(nèi)4mg/kg，q4dx4)、吉西他濱(靜脈內(nèi)30mg/kg，q7dx3)或組合治療攜帶皮下h-1975人肺腫瘤異種移植物的小鼠。圖顯示了在治療開始以后在指定的時間確定的具有腫瘤體積的腫瘤生長曲線。點，來自10只小鼠/組的值的平均值；條，se。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明中，以下術(shù)語如下所示進(jìn)行描述，除非另外指出。

澳瑞他汀：本文中使用的術(shù)語“澳瑞他?。ā癮uristatin”或“auristatins”）”表示一類基于多肽的化合物，包括從天然產(chǎn)物dolabellaauricularia衍生出的藥物和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物諸如澳瑞他汀-101、mmae和mmaf。如本文中使用的，為了描述本發(fā)明的一種或多種組合的組分，“澳瑞他汀”也表示摻入或包含澳瑞他汀的生物綴合的分子，例如抗體-藥物綴合物(adc)，其中所述生物基團(tuán)諸如抗體(ab)連接至多肽基團(tuán)。代表性的基于澳瑞他汀多肽的分子包括澳瑞他汀-101、mmae和mmaf。代表性的澳瑞他汀adc包括5t4-adc。

“澳瑞他汀-101”表示下式的澳瑞他汀多肽化合物：2-甲基丙氨?；?n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-纈氨酰胺：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或其衍生物。

“mmae”表示被稱作單甲基澳瑞他汀e且具有下式的澳瑞他汀多肽化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或其衍生物。

“mmaf”表示被稱作單甲基澳瑞他汀f、或(s)-2-((2r,3r)-3-((s)-1-((3r,4s,5s)-4-((s)-n,3-二甲基-2-((s)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚?；?吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙烷酰氨基)-3-苯基丙酸且具有下式的澳瑞他汀多肽化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或其衍生物。

“5t4-adc”表示包含澳瑞他汀多肽mmaf的分子，所述澳瑞他汀多肽mmaf通過“mc”連接基綴合至對5t4抗原特異性的抗體。

“抗-5t4抗體-藥物綴合物”表示通過不可切割的馬來酰亞氨基己?；?mc)連接基與有效的微管蛋白抑制劑單甲基澳瑞他汀f(mmaf)連接的抗-5t4a1抗體。在一個稱為a1mcmmaf的抗-5t4adc中的靶向試劑是特異性地識別人5t4的人化的igg1單克隆抗體a1(saprap,damelinm,dijosephj,marquettek,geleskg,golasj,等人.long-termtumorregressioninducedbyanantibody-drugconjugatethattargets5t4,anoncofetalantigenexpressedontumor-initiatingcells.molecularcancertherapeutics.2013;12:38-47)。mcmmaf的馬來酰亞胺綴合至抗體上的半胱氨酸巰基。得到的adc含有4mol/mol的平均藥物:抗體比率。有人提出，在內(nèi)化進(jìn)靶細(xì)胞中后，adc在溶酶體中分解代謝，導(dǎo)致cysmcmmaf的釋放，所述cysmcmmaf抑制微管蛋白聚合從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。

本文中使用的“pi3k/mtor抑制劑”表示能夠雙重抑制pi3k和mtor靶標(biāo)的化合物。這樣的雙特異性抑制劑會結(jié)合mtor和pi3k的atp結(jié)合位點。這樣的抑制劑的例子包括渥曼青霉素、ly294002、pi-103(caymanchemical)、sf1126(semafore)、bgt226(novartis)、xl765(exelixis)和nvp-bez235(novartis)(liu等人.,naturereview,8,627-644,2009)。在某些方面，雙特異性抑制劑將是咪唑并喹唑啉(例如，咪唑并[4,5-c]喹啉衍生物)。關(guān)于化合物是否結(jié)合和/或抑制pi3k和/或mtor的示例性測定是本領(lǐng)域眾所周知的。

術(shù)語”對象”和“患者”在本文中可互換地使用?！皩ο蟆被颉盎颊摺钡睦影ā⒌幌抻谌?、大鼠、小鼠、豚鼠、猴、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和家禽。在一個示例性實施方案中，所述對象或患者是人。

還在臨床開發(fā)中且對于本發(fā)明特別重要的pi3k/mtor抑制劑是2-氨基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環(huán)己基]-6-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或其衍生物，和1-(4-{[4-(二甲基氨基)哌啶-1-基]羰基}苯基)-3-[4-(4,6-二嗎啉-4-基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，或其衍生物。

該第二種基于三嗪的化合物也被稱作pf-05212384、pf-‘384、pf-384或pki-587。

在本文中使用的另外術(shù)語包括：2d(二維細(xì)胞培養(yǎng))；3d(三維細(xì)胞培養(yǎng))；5t4(癌胚胎抗原或tpbg)；5t4-adc(5t4mab或mab與mcmmaf毒素的綴合物)；cr(完全應(yīng)答)；ci(聯(lián)合指數(shù))；ed50(50%有效劑量)；ic50(半數(shù)最大抑制濃度)；igg(免疫球蛋白g)；ihc(免疫組織化學(xué))；mc(不可切割的馬來酰亞氨基己酰基連接基)；mcmmaf(與不可切割的馬來酰亞氨基己酰基連接基連接的單甲基澳瑞他汀f)；mmaf-ome(單甲基澳瑞他汀f的可滲透形式)；mtor(雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo))；pd-901(mek抑制劑pd0325901)；pf-384(雙重pi3k/mtor抑制劑pf-05212384或pki-587)；pi3k(磷酸肌醇3-激酶)；ptx(紫杉醇)；rnaseq(rna測序)；soc(護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn))；tcga(thecancergenomeatlas，癌癥基因組圖譜)；和wye-132(通用mtor抑制劑wye-125132)。

用在本發(fā)明中的另一類活性部位抑制劑是選擇性的mtor抑制劑。這類mtor抑制劑相對于一種或多種i型磷脂酰肌醇3-激酶選擇性地抑制mtorc1和mtorc2活性。所述i型磷脂酰肌醇3-激酶可以選自，例如，pi3激酶u、pi3激酶p、pi3激酶7或pi3激酶6。這些活性部位抑制劑會結(jié)合mtor的活性部位，但是不會結(jié)合pi3k的活性部位。這樣的抑制劑的例子包括torin1(guertin和sabatini)、pp242(2-(4-氨基-1-異丙基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-1h-吲哚-5-醇)、pp30、ku-0063794、way-600(wyeth)、way-687(wyeth)、way-354(wyeth)和azd8055(sparks和guertin,oncogene,29,2733-2744,2010,liu等人,naturereview,8,627-644,2009)。在某些方面，所述mtor抑制劑將是吡唑并嘧啶。用于確定mtor抑制劑的選擇性的方法是本領(lǐng)域已知的。用在本發(fā)明中的另一類mtor抑制劑在本文中被稱作“雷帕霉素類似物”。本文中使用的術(shù)語“雷帕霉素類似物”表示這樣的化合物：其特異性地結(jié)合mtorfrb結(jié)構(gòu)域(fkbp雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，在結(jié)構(gòu)上與雷帕霉素相關(guān)，且保留mtor抑制性能。

本文中使用的術(shù)語“pi3k抑制劑”表示結(jié)合pi3k并抑制pi3k的至少一種活性的化合物或配體。所述pi3k蛋白可以分成三類：1類pi3k、2類pi3k和3類pi3k。pi3k抑制劑的例子包括bkm120(1類pi3k抑制劑,novartis)、xl147(1類pi3k抑制劑,exelixis)、gdc0941(1類pi3k抑制劑,genentech)、gsk1059615(pan-pi3k抑制劑,glaxosmithkline)、px-866(1類pi3k抑制劑;p110u、p110p和p1107異形體,oncothyreon)和cal-101(1類pi3k抑制劑;p1106異形體,calistoga)。

除了本文中已經(jīng)提及的那些以外，與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的pi3k或pi3k/mtor抑制劑包括gdc0941(pi3ki)和gdc-0980(pi3k/mtori)(genetech/roche)；bez235(pi3k/mtori)、bgt226(pi3k/mtori)、bkm120(pi3ki)和依維莫司(mtorc1i雷帕霉素類似物)(novartis)；xl-767(pi3k/mtori)、xl-147(pi3ki)和xl-388(exelixis/sanofi-aventis)；azd8055(mtori)(astrazeneca)；gsk214179(akti)和gsk2126458(pi3k/mtori)(gsk)；osi-027(mtori)和oxa-01(mtori)(osi)；cal-101(pi3kδ)和cal120(pi3kγ/δi)(calistoga)；sf1126(pi3ki)(semafore)；ink-128(mtori)、pi3kγ/δ和pi3kα/βi(intellikine)；sb2312(pi3k/mtori)(s*bio)；ar-mtor-1(mtori)和ar-mtor-26(mtori)(array)；px-866(pi3ki)(oncothyreon)；aezs-126(pi3ki)(aeternazentaris)；zstk474(日本癌癥研究基金會)；wx037(wilex)；nv-128(mtori)(novagen)；ezn-4150(pi3ki)(enzon)；和由xcovery、cellzome和其它單位開發(fā)的化合物。除了本文中已經(jīng)提及的那些以外，與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的fgfr抑制劑包括azd-4547(astrazeneca)；ly2874455(lilly)；bgj-398和度維替尼(novartis)；丙氨酸布立尼布(bms)；sulfatinib(hutchinsonmedipharm)；intedanib(boehringeringelheim)；lenvatinib(eisai)；和tsu-68(taihopharmaceutical)。

本文中使用的“mek抑制劑”是抑制促分裂原活化蛋白激酶mek1和/或mek2的化學(xué)試劑或藥物。mek抑制劑可以用于影響mapk/erk途徑，該途徑經(jīng)常在某些癌癥中是過度活躍的。因此，mek抑制劑具有用于治療某些癌癥的潛力，所述癌癥包括braf-突變的黑素瘤和kras/braf突變的結(jié)直腸癌。mek抑制劑包括：trametinib(gsk1120212)，其被fda批準(zhǔn)用于治療braf突變的黑素瘤，且在與braf抑制劑dabrafenib組合治療braf突變的黑素瘤的研究中；司美替尼，其在用于非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的2期臨床試驗中表現(xiàn)出改善的pfs，且用于眼色素層黑素瘤和分化的甲狀腺癌的其它臨床試驗在進(jìn)行中；binimetinib或mek162，其已經(jīng)具有用于膽道癌和黑素瘤的1期試驗；pd-325901或pcd-901，其已經(jīng)與乳腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤關(guān)聯(lián)地進(jìn)行研究；cobimetinib或xl518，在iii期試驗中，與vemurafenib(zelboraf(r))聯(lián)合用于治療晚期黑素瘤；和ci-1040。與本發(fā)明特別相關(guān)的是mek抑制劑pd-325901。

紫杉醇是在癌癥化學(xué)療法中使用的有絲分裂抑制劑；它和多西他賽代表“紫杉烷”家族的藥物。

在該方法的一個實施方案中，所述異常細(xì)胞生長是癌癥，包括、但不限于，間皮瘤、肝膽(肝和膽管)、原發(fā)性或繼發(fā)性cns腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性腦腫瘤、肺癌(nsclc和sclc)、鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸的癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、胃腸(胃、結(jié)腸直腸和十二指腸)癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、膽囊癌、多發(fā)性骨髓瘤、膽管上皮癌、纖維肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤或前述癌癥中的一種或多種的組合。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述癌癥選自肺癌(nsclc和sclc)、頭或頸的癌癥、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、乳腺癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和脊柱軸腫瘤；或選自肺癌(nsclc和sclc)、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥；或選自肺癌(nsclc和sclc)、卵巢癌、結(jié)腸癌和直腸癌；或選自膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肺癌(nsclc和sclc)、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌；或選自子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肺癌(nsclc和sclc)、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌；或選自子宮內(nèi)膜癌、胃癌和肺癌(nsclc和sclc)；或前述癌癥中的一種或多種的組合。

在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和pi3k-mtor抑制劑，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述pi3k-mtor抑制劑是pf-384的那些。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述澳瑞他汀是下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、或所述化合物或鹽或溶劑合物的抗體-藥物綴合物的那些：

其中，在每次出現(xiàn)時獨立地，

w是

r¹是氫、c1-c8烷基或c1-c8鹵代烷基；

r²是氫、c1-c8烷基或c1-c8鹵代烷基；

r^3a和r^3b是以下任一種：

(iii)r^3a是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基、鹵素或芳烷基；且

r^3b是c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基、芳烷基或鹵素；或

(iv)r^3a和r^3b一起是c2-c8亞烷基或c1-c8亞雜烷基；

r^4a和r^4b是以下任一種：

(iii)r^4a是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基或芳烷基；且

r^4b是氫、c1-c8烷基、c1-c8鹵代烷基、c3-c8碳環(huán)基、c1-c10雜環(huán)基、芳基、雜芳烷基或芳烷基；或

(iv)r^4a和r^4b一起是c2-c8亞烷基或c1-c8亞雜烷基；

r⁵是

c1-c10雜環(huán)基、c3-c8碳環(huán)基和c6-c14芳基，其任選地被1、2、3、4或5個基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨立地選自-c1-c8烷基、-c1-c8烷基-n(r’)2、-c1-c8烷基-c(o)r’、-c1-c8烷基-c(o)or’-o-(c1-c8烷基)、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、鹵素、-n3、-n(r')2、-cn、-nhc(=nh)nh2、-nhconh2、-s(=o)2r'和-sr'，其中每個r'獨立地選自氫、c1-c8烷基和未被取代的芳基，或兩個r’可以與它們所連接的氮一起形成c1-c10雜環(huán)基；

或r⁵是，

其任選地被1、2、3、4或5個基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨立地選自c1-c8烷基、-c1-c8烷基-n(r’)2、-c1-c8烷基-c(o)r’、-c1-c8烷基-c(o)or’、-o-(c1-c8烷基)、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、鹵素、-n3、-n(r')2、-cn、-nhc(=nh)nh2、-nhconh2、-s(=o)2r'、-sr'和亞芳基-r’，其中每個r'獨立地選自氫、c1-c8烷基、c1-c8雜環(huán)基、c1-c10亞烷基-c3-c8雜環(huán)基和芳基，或兩個r’可以與它們所連接的氮一起形成c1-c10雜環(huán)基；

r⁶是氫、-c1-c8烷基、-c2-c8烯基、-c2-c8炔基或-c1-c8鹵代烷基；

r¹²是氫、c1-c4烷基、c1-c10雜環(huán)基或c6-c14芳基；

r¹³是c1-c10雜環(huán)基；且

x是o或s；

前提條件是，當(dāng)r^3a是氫時x是s。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述澳瑞他汀選自抗體藥物綴合物5t4-adc、pf-101和mmaf的那些。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述澳瑞他汀是抗體藥物綴合物5t4-adc的那些。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101的那些。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中所述澳瑞他汀是mmaf的那些。

本發(fā)明的另外實施方案包括癌癥的治療方法，其中所述癌癥是肺癌。

本發(fā)明的另外實施方案包括癌癥的治療方法，其中所述癌癥是乳腺癌。

本發(fā)明的另外實施方案包括其中同時或依次施用所述澳瑞他汀和所述pi3k-mtor抑制劑的那些。依次施用可以以任一種次序發(fā)生-首先或第二施用澳瑞他汀。

本發(fā)明的實施方案包括藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；一定量的pf-384或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

本發(fā)明的實施方案也包括用于治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和mek抑制劑。

另外的實施方案包括其中所述mek抑制劑是pd-901的那些。

另外的實施方案包括其中所述澳瑞他汀選自抗體藥物綴合物5t4-adc、pf-101和mmaf的那些。

在某些實施方案中，所述澳瑞他汀是抗體藥物綴合物5t4-adc。

在某些實施方案中，所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101。

在某些實施方案中，所述澳瑞他汀是mmaf。

在澳瑞他汀/mek組合中，實施方案包括其中所述癌癥是肺癌的那些和其中所述癌癥是乳腺癌的那些。

在本發(fā)明的某些實施方案中，同時施用或相繼施用所述澳瑞他汀和所述mek抑制劑，且如果相繼施用的話，以任一種次序。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；一定量的pd-901或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療對象中的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的對象并行地施用澳瑞他汀和紫杉烷，其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101，且其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽。這些方法包括治療肺癌的方法和治療乳腺癌的方法。

在本發(fā)明的某些實施方案中，同時施用或相繼施用所述澳瑞他汀-101和所述紫杉烷，且如果相繼施用的話，以任一種次序。

本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含：一定量的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；一定量的紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

在本文所述的某些實施方案中，通過所述并行施用實現(xiàn)的抗癌效果大于通過非并行地施用所述第一種和第二種藥物組合物實現(xiàn)的抗癌效果。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型，所述劑型包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)pi3k-mtor抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502；和(c)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型，所述劑型包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)mek抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述mek抑制劑是pd-901；和(c)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于治療哺乳動物中的癌癥的劑型，所述劑型包含：(a)澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101；(b)紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽；和(c)和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于在哺乳動物中實現(xiàn)治療效果的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；(b)在第一單位劑型中的pi3k-mtor抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述pi3k-mtor抑制劑選自pf-384和pf-502；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于在哺乳動物中實現(xiàn)治療效果的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；(b)在第一單位劑型中的mek抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述mek抑制劑是pd-901；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了一種用于在哺乳動物中實現(xiàn)治療效果的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)在第一單位劑型中的澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述澳瑞他汀是澳瑞他汀-101；(b)在第一單位劑型中的紫杉烷或其藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽；和(c)用于容納所述第一劑型和第二劑型的裝置。在本發(fā)明的一個實施方案中，涉及2-氨基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環(huán)己基]-6-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(化合物1a)：

其描述在國際專利申請公開號wo2008/002578、美國公開號us2008-0090801a1和美國專利號7,696,213中，它們通過引用并入本文?；衔?a是結(jié)構(gòu)上新穎的、有效的、atp-競爭性的和可逆的i類pi3k和mtor的雙重抑制劑?；衔?a表現(xiàn)出對pi3k家族的高度選擇性，如利用dundeeuniversity和invitrogen激酶篩選服務(wù)在一組81種蛋白激酶和iii類pi3k家族hvps34中的活性缺乏所證實的。對于評價的激酶中的任一種，直到10μm都沒有觀察到顯著的抑制活性(>500選擇性)。從體內(nèi)大鼠pk研究中，化合物1a表現(xiàn)出低的清除率和良好的口服生物利用度(f(%)56±16)?；衔?a在大鼠中表現(xiàn)出中等血漿蛋白結(jié)合，具有20.2%的未結(jié)合分?jǐn)?shù)(fu)。所以，未結(jié)合的1a的清除率較低。已經(jīng)轉(zhuǎn)化這些性能來證實穩(wěn)健的體內(nèi)性能，且化合物1a在移植了具有pi3k途徑畸變的人癌細(xì)胞系的小鼠異種移植物模型中具有體內(nèi)活性。

在本發(fā)明的另一個實施方案中涉及1-(4-{[4-(二甲基氨基)哌啶-1-基]羰基}苯基)-3-[4-(4,6-二嗎啉-4-基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(化合物1b)

其描述在國際專利申請公開號wo2009/044774、美國公開號us2009-0291079a1和美國專利號8,039,469中，它們通過引用并入本文?；衔?b是一種靜脈內(nèi)施用的、非常有效的pan-pi3k/mtor抑制劑。在化學(xué)上，化合物1b是結(jié)合在pi3k酶的atp結(jié)合槽中的2,4-二嗎啉代-6-芳基脲基三嗪。關(guān)鍵結(jié)合相互作用是嗎啉代氧與鉸鏈區(qū)val851、脲氧與lys-802氨基之間的h-鍵以及脲基-nh與asp810羧酸酯之間的雙h-鍵?；衔?b對pi3k和pikk是高選擇性的，如它的針對236種激酶的激酶選擇性篩選(invitrogen)所證實的。所述化合物在超過50種不同人腫瘤細(xì)胞系中具有強(qiáng)抗增殖作用，ic50<100nm。此外，化合物1b在具有升高的pi3k信號傳遞和受抑制的pi3k/mtor下游效應(yīng)物（諸如akt）的磷酸化的癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在特別響應(yīng)性的細(xì)胞系之一mda-mb-361中，30nm的化合物1b在4h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如被切割的parp的抑制所證實的。將這些體外結(jié)果轉(zhuǎn)化成體內(nèi)結(jié)果，其中化合物1b在乳腺(bt474、mda-mb-361)、結(jié)腸(hct116)、肺(h1975)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(u87mg)異種移植物模型中抑制腫瘤生長。以25mg/kg每周1次施用的化合物1b使大(1000mm³)mda-mb-361腫瘤縮小且抑制再生長。該腫瘤消退與mda-mb-361模型中磷酸化的akt的消退相關(guān)。

在本發(fā)明的另一個實施方案中涉及1-環(huán)戊基-7-(4-二乙基氨基-丁基氨基)-3-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基-苯基)-3,4-二氫-1h-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-酮：

其描述在國際專利申請公開號wo2004/011465、美國公開號us2004-0019210a1和美國專利號7,196,090中，它們通過引用并入本文?；衔?是一種可口服利用的、有效的和高選擇性的、fgfr家族酪氨酸激酶（fgfr1、2、3和4）的小分子抑制劑?；衔?選擇性地對fgfr遺傳改變的細(xì)胞系有效，且在體外和體內(nèi)胃和肺癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出優(yōu)先敏感性?；衔?對>60種試驗的激酶顯示出高激酶選擇性。在細(xì)胞測定中，所述化合物相對于fgfr2對vegfr2的選擇性超過100倍，且已經(jīng)被證實會在體外和在體內(nèi)抑制fgfr和其它下游標(biāo)志物的磷酸化。所述化合物已經(jīng)被證實會在多種以fgfr基因擴(kuò)增或突變?yōu)樘卣鞯漠惙N移植物腫瘤模型中抑制體內(nèi)腫瘤生長?；衔?具有藥物-樣藥學(xué)性能，且預(yù)期具有適合每天1次（qd）或每天2次（bid）口服施用的藥代動力學(xué)特性。

除非另有說明，本文中使用的術(shù)語“治療”是指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制這樣的術(shù)語所應(yīng)用的障礙或病癥的進(jìn)展或者阻止所述障礙或病癥，或逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制、阻止這樣的障礙或病癥的一種或多種癥狀。除非另有說明，本文中使用的術(shù)語“治療”將治療的行為當(dāng)作上面剛剛定義的“治療”。

要根據(jù)本發(fā)明治療的患者包括任何溫血動物，例如，但不限于人、馬、狗、豚鼠或小鼠。例如，所述患者是人。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地能夠鑒別各個罹患癌癥且需要治療的患者。

本文中使用的術(shù)語“同時施用”或“并行施用”表示多種治療性化合物的施用，使得所述各種治療性化合物同時（包括在重疊的時間段內(nèi)）存在于對象內(nèi)。同時施用或并行施用還可以表示一個階段或療程，在此期間患者接受多種治療性化合物，不論各種治療性化合物是否在相同的或重疊的時間段內(nèi)存在于個體中。

依次施用表示這樣的療程：在此期間相繼施用多種治療性化合物，從而在第一個規(guī)定的時間段給患者提供第一種治療性化合物，并在第二個規(guī)定的時間段給患者提供第二種治療性化合物，以此類推，具有或沒有在其中不施用治療性化合物期間的時間段。

在該方法的一個實施方案中，所述癌癥包括但不限于：間皮瘤、肝膽(肝和膽管)、原發(fā)性或繼發(fā)性cns腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性腦腫瘤、肺癌(nsclc和sclc)、鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸的癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、胃腸(胃、結(jié)腸直腸和十二指腸)癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、膽囊癌、多發(fā)性骨髓瘤、膽管上皮癌、纖維肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤或前述癌癥中的一種或多種的組合。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述癌癥選自肺癌(nsclc和sclc)、頭或頸的癌癥、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、乳腺癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱軸腫瘤或前述癌癥中的一種或多種的組合。

本文中使用的術(shù)語“協(xié)同”表示比兩種或更多種單一藥劑的累加作用更有效的治療劑組合。例如5t4-mcmmaf(或mmaf或其它澳瑞他汀)與一種或多種化學(xué)治療劑之間的協(xié)同相互作用的確定可以是基于從本文描述的測定得到的結(jié)果。使用chou和talalay聯(lián)合方法和劑量-效應(yīng)分析（采用calcusyn軟件），分析這些測定的結(jié)果，以便得到聯(lián)合指數(shù)“ci”(chou和talalay(1984)adv.enzymeregul.22:27-55)。已經(jīng)在幾個測定系統(tǒng)中評價了由本發(fā)明提供的組合，且可以利用用于量化抗癌劑之間的協(xié)同作用、累加作用和拮抗作用的標(biāo)準(zhǔn)程序來分析數(shù)據(jù)。優(yōu)選地利用的程序是chou和talalay在“newavenuesindevelopmentalcancerchemotherapy,”academicpress,1987中描述的程序。小于0.8的聯(lián)合指數(shù)(ci)值指示協(xié)同作用，大于1.2的值指示拮抗作用，且在0.8-1.2之間的值指示累加作用。所述聯(lián)合治療可以提供“協(xié)同作用”并證實“協(xié)同”，即，當(dāng)所述活性成分一起使用時實現(xiàn)的效應(yīng)大于分別使用所述化合物引起的效應(yīng)的總和。在以下情況下可以實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)：將活性成分(1)在組合的單位劑量制劑中共配制并同時施用或遞送；(2)作為單獨制劑交替地遞送；或(3)通過一些其它方案。當(dāng)在交替療法中遞送時，當(dāng)依次施用或遞送（例如，通過在單獨注射器中的不同注射劑）化合物時可以實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。一般而言，在交替療法中，依次（即，在時間上相繼）施用有效劑量的每種活性成分。

在測量體內(nèi)或治療協(xié)同作用時，協(xié)同作用的一種量度被稱作“超越最高單一藥劑”協(xié)同作用。在以下情況下發(fā)生超越最高單一藥劑協(xié)同作用：當(dāng)固定劑量的組合使得它優(yōu)于兩種它的組分劑量時，則將其稱作“超越最高單一藥劑”(參見fda的政策，在21cfr300.50，其采用這樣的方法來批準(zhǔn)組合藥物產(chǎn)品；和,borisy等人(2003)proceedingsofthenationalacademyofscience.)。當(dāng)然，“協(xié)同作用”在本文中的應(yīng)用也包括體內(nèi)協(xié)同作用，如通過另外的和/或替代性的方法所測量的。

本發(fā)明的某些方面涉及藥學(xué)上可接受的鹽的施用。除非另有說明，本文中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”包括可能存在于本發(fā)明的化合物中的酸性或堿性基團(tuán)的鹽。代表性的鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等。這些可以包括基于堿金屬和堿土金屬（諸如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等）的陽離子，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括、但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(參見，例如，s.m.berge,等人,“pharmaceuticalsalts,”j.pharm.sci.,1977;66:1-19，其通過引用并入本文)；和handbookofpharmaceuticalsalts,p.heinrichstahl,camilleg.wermuth(編),vhca(蘇黎士,瑞士)和wiley-vch(魏因海姆,德國)于2002年聯(lián)合出版。該術(shù)語也包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，且有關(guān)的化合物可能作為水合物或溶劑合物存在，并且水合物和溶劑合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

化合物(或其藥學(xué)上可接受的鹽)的有效量可以理解為包括在本發(fā)明的組合中足以阻止或抑制腫瘤細(xì)胞的生長或癌癥轉(zhuǎn)移的進(jìn)展的量。劑量和施用方案的治療或藥理學(xué)有效性也可以表征為在經(jīng)歷特定腫瘤的患者中誘導(dǎo)、增強(qiáng)、維持或延長緩解的能力。

可以以臨床上常用的藥量或劑量施用要用在本發(fā)明的方法或組合中的化合物。考慮到因素諸如年齡、重量、一般健康、施用的化合物、施用途徑、需要治療的癌癥的性質(zhì)和進(jìn)展以及其它藥物治療的存在，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)已知方法確定在本發(fā)明的組合中使用的每種化合物的適當(dāng)有效量或劑量以施用給患者。

通過能夠?qū)⒒衔镞f送至作用部位的任何方法，可以實現(xiàn)本發(fā)明的組合的化合物的施用。這些方法包括口服途徑、十二指腸內(nèi)途徑、胃腸外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)、局部和直腸施用。

可以在施用之前配制本發(fā)明的方法或組合的化合物。所述制劑優(yōu)選地適合特定施用模式。這些化合物可以用本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體配制，且以本領(lǐng)域已知的多種劑型施用。在制備本發(fā)明的藥物組合物時，經(jīng)常將活性成分與藥學(xué)上可接受的載體混合，或用載體稀釋，或包封在載體內(nèi)。這樣的載體包括、但不限于固體稀釋劑或填充劑、賦形劑、無菌的水性介質(zhì)和各種無毒的有機(jī)溶劑。劑量單位形式或藥物組合物包括片劑、膠囊劑（諸如明膠膠囊劑）、丸劑、粉劑、顆粒、水性和非水性口服溶液和混懸液、錠劑、糖錠、硬糖果、噴霧劑、乳膏劑、油膏劑、栓劑、膠凍劑、凝膠劑、糊劑、洗劑、軟膏劑、可注射的溶液、酏劑、糖漿劑和胃腸外溶液，其包裝在適合細(xì)分成單個劑量的容器中。

胃腸外制劑包括用于其制備的藥學(xué)上可接受的水性或非水性溶液、分散體、混懸液、乳劑和無菌粉劑。載體的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇)、植物油和可注射的有機(jī)酯諸如油酸乙酯。通過使用涂層諸如卵磷脂、表面活性劑或維持適當(dāng)?shù)牧６?，可以維持流動性。示例性的胃腸外施用形式包括本發(fā)明的化合物在無菌水溶液（例如，丙二醇或右旋糖水溶液）中的溶液或混懸液。如果需要的話，可以適當(dāng)?shù)鼐彌_這樣的劑型。

另外，潤滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石經(jīng)?？捎糜趬浩康摹Ｒ部梢栽谲浐陀蔡畛涞拿髂z膠囊中使用類似類型的固體組合物。因此，優(yōu)選的材料包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇。當(dāng)水性混懸液或酏劑期望用于口服施用時，其中的活性化合物可以與以下物質(zhì)組合：各種甜味劑或矯味劑、著色劑或染料，和如果需要的話，乳化劑或助懸劑，以及稀釋劑諸如水、乙醇、丙二醇、甘油或它們的組合。

制備含有指定量的活性化合物的各種藥物組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白的。例如，參見remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easter,pa.,第15版(1975)。

根據(jù)本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可以提供與常規(guī)抗癌治療相比提高的抗癌活性抑制水平，所述常規(guī)抗癌治療包含單獨的化合物1a或其藥學(xué)上可接受的鹽或化合物1b或其藥學(xué)上可接受的鹽、或單獨的化合物2或其藥學(xué)上可接受的鹽。這樣，可能以在沒有其它抗癌劑存在下不足夠(即亞治療)的劑量利用本發(fā)明的抗癌劑，同時以更少的副作用維持相同或足夠的抗癌活性水平。

在本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒中，可以以每天1次約0.1至約20mg的劑量口服地(“po”)施用澳瑞他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽。例如，以每天1次約0.1至約20mg、每天1次約0.5至約15mg、每天1次約1至約10mg、或每天1次約2-8mg的劑量。在一個實施方案中，可以以每天1次約2-8mg、或每天1次1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg的劑量口服地(“po”)施用要求保護(hù)的治療性化合物。施用還可以更經(jīng)常地或更不經(jīng)常地發(fā)生，例如每天2次，每2、3、4、5或6天1次，每2周1次，每月1次，或按照處方。在另一個實施方案中，可以通過靜脈內(nèi)輸注施用治療性化合物。

在本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒中，可以每周1次歷時約15分鐘至約3小時通過靜脈內(nèi)輸注以約10至約500mg的劑量施用治療性化合物（包括其藥學(xué)上可接受的鹽），優(yōu)選地歷時約30分鐘通過靜脈內(nèi)輸注。施用還可以更經(jīng)常地或更不經(jīng)常地發(fā)生，例如每天1次，每2、3、4、5或6天1次，每2周1次，每月1次，或按照處方?？梢栽谑┯闷渌M合化合物之前、過程中或之后施用在要求保護(hù)的方法和組合中的澳瑞他汀化合物。這樣的并行施用(共同施用)可以是在單獨的劑型中或在相同劑型中。

在某些情況下，低于前述范圍的下限的劑量水平可以是超過足夠量，而在其它情況下可以采用還更大的劑量，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

通過多種施用方案可以完成本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒的實踐。在一個方面，可以以1-周、2-周、3-周、4-周、5-周、6-周、7-周或8-周循環(huán)施用化合物?？梢栽诒匾獣r進(jìn)行施用方案的重復(fù)以實現(xiàn)期望的癌細(xì)胞的減少或縮減。

本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含澳瑞他汀和另一種治療性化合物(當(dāng)然包括之一或二者的藥學(xué)上可接受的鹽)和關(guān)于施用所述治療劑的說明書。在一個實施方案中，所述說明書詳細(xì)說明并確證治療劑的施用模式，例如，關(guān)于本發(fā)明的治療劑的同時或依次施用。在另一個實施方案中，所述試劑盒用于治療癌癥，包括、但不限于，間皮瘤、肝膽(肝和膽管)、原發(fā)性或繼發(fā)性cns腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性腦腫瘤、肺癌(nsclc和sclc)、鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸的癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、胃腸(胃、結(jié)腸直腸和十二指腸)癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、膽囊癌、多發(fā)性骨髓瘤、膽管上皮癌、纖維肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤或前述癌癥中的一種或多種的組合；或更具體地，肺癌(nsclc和sclc)、頭或頸的癌癥、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、乳腺癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱軸腫瘤或前述癌癥中的一種或多種的組合；或更具體地，肺癌(nsclc和sclc)、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥或前述癌癥中的一種或多種的組合；或更具體地，肺癌(nsclc和sclc)、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌或前述癌癥中的一種或多種的組合；或膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肺癌(nsclc和sclc)、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌或前述癌癥中的一種或多種的組合；或子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肺癌(nsclc和sclc)、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌或前述癌癥中的一種或多種的組合；或子宮內(nèi)膜癌、胃癌和肺癌(nsclc和sclc)或前述癌癥中的一種或多種的組合。

實施例

實施例1：細(xì)胞系和試劑

人腫瘤細(xì)胞系nci-h1975、calu-6、nci-h358、hcc2429、mda-mb-468、mda-mb-231、caov-3、tov-112d、ov-90、ovcar-3、skov-3、ht-29、nci-n87、raji、ramos購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)。mdamb361-dyt2細(xì)胞mdamb435/5t4是用人5t4穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。描述了37622a1nsclc患者-衍生的異種移植物(pdx)和從37622a1建立并表征原代無血清培養(yǎng)物tum622(6)。將每種細(xì)胞系在atcc推薦的它的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于體外研究，化療藥物得自siugma-aldrich。厄洛替尼和培美曲塞購自selleckchemicals。根據(jù)已知的技術(shù)用商購可得的試劑制備pf-05212384(pki-587)、pd-0325901(pd-901)、o-me-mmaf(mmaf)和澳瑞他汀101。以前在us20120251558a中描述了5t4-adc(a1mcmmaf)的制備。

實施例2：2d細(xì)胞增殖測定

將細(xì)胞鋪板在96-孔透明底平板(corning)中并用不同濃度的化合物處理4天。使用celltiterglo發(fā)光細(xì)胞生存力測定試劑盒(promega)確定，并使用victorx3平板讀數(shù)器(perkinelmer)測量。將數(shù)據(jù)歸一化至對照組(空載體或dmso)。將ic50值定義為造成50%生長抑制的濃度。使用邏輯非線性回歸（模型編號203，具有xlfitv4.2(idbs,guldford,surry,uk)）計算ic50值。所有實驗點在三個重復(fù)孔中建立并一式兩份地獨立執(zhí)行。

實施例3：3d細(xì)胞增殖球狀體測定

透明底96孔平板含有40μl/孔的100%bd基質(zhì)膠基質(zhì)（生長因子減少的）(#354230)。將3000/孔終濃度的mda-mb-468或h-1975在2%基質(zhì)膠中的細(xì)胞混懸液覆蓋在100%基質(zhì)膠基底的上面。使細(xì)胞生長和形成球狀體，并在球狀體達(dá)到約100um大小(通過光學(xué)顯微術(shù)測量)時開始藥物處理。對于單次劑量處理和ic50確定，用化合物或adc處理雙份孔的球狀體以得到7天的9點、2倍劑量-響應(yīng)曲線。在處理后第7天使用celltiterglo發(fā)光細(xì)胞生存力測定試劑盒(promega#g7570)測量增殖。

實施例4：協(xié)同作用測定

使用chou-talalay中效分析(28)評價藥物組合的效應(yīng)。在兩個獨立96-孔平板中以對角矩陣形式用單獨的和組合的每種藥物處理細(xì)胞，并通過使用celltiterglo試劑盒(promega)測量增殖。將結(jié)果表達(dá)為存活分?jǐn)?shù)(受影響分?jǐn)?shù)，fa)，其基于經(jīng)處理的樣品的測量的發(fā)光計數(shù)與未經(jīng)處理的對照的發(fā)光計數(shù)之比。用calcusyn軟件(biosoft,ferguson,mo)使用7條代表具有固定藥物比率的不同劑量-效應(yīng)曲線的對角線來測量每種組合的聯(lián)合指數(shù)(ci)。在每個實驗中，針對3條具有7-8個數(shù)據(jù)點的劑量-效應(yīng)曲線取在ed50水平的ci指數(shù)的平均值。參見圖1。

實施例5：阻抗測定

使用96e-平板使用xcelligencertcamp系統(tǒng)(aceabiosciencesinc,sandiego,ca)實時監(jiān)測細(xì)胞生長。xcelligence系統(tǒng)通過測量電阻抗來檢測細(xì)胞數(shù)目的變化并產(chǎn)生細(xì)胞指數(shù)值，其與附著于孔底的細(xì)胞數(shù)目直接相關(guān)(29)。在細(xì)胞接種之前得到基線平板細(xì)胞指數(shù)。將細(xì)胞以4,000個細(xì)胞/孔接種在50ml體積中并溫育過夜。在給藥當(dāng)天(第1天)，將化合物以指示的濃度加入，并監(jiān)測阻抗讀數(shù)約250小時?？梢栽趯嶒灲Y(jié)束時或相對于時間繪制藥物或媒介物處理組的阻抗指數(shù)值。

實施例6：天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7細(xì)胞凋亡測定

在處理前一天將mda-468和h-1975細(xì)胞以15,000/孔接種在96-孔平板中。16、24或48小時處理以后，根據(jù)生產(chǎn)商的方案使用caspase-glo3/7assay(promegag8092,madison,usa)測量天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活性。在副本平板中，通過celltiter-glo發(fā)光細(xì)胞生存力測定(promegag7573,madison,usa)確定細(xì)胞的生存力。將藥物處理過的樣品中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活性的增加首先相對于媒介物處理過的對照進(jìn)行表達(dá)，關(guān)于生存力歸一化，并表達(dá)為相對于媒介物處理過的對照的誘導(dǎo)倍數(shù)。

實施例7：細(xì)胞周期分析

根據(jù)生產(chǎn)商的方案，使用flowcellectbivariate細(xì)胞周期試劑盒(millipore,目錄號fcch025103)，制備用于組合的細(xì)胞周期和磷酸-組蛋白h3分析的細(xì)胞。使用facscalibur儀器(bdbiosciences)和flowjo軟件(treestar,ashlandor)通過流式細(xì)胞計量術(shù)分析樣品。

實施例8：異種移植物效力

雌性無胸腺nu/nu小鼠(18-23g)得自charlesriverlaboratories,wilmington,ma。給小鼠皮下地注射腫瘤細(xì)胞，并給具有不同階段的腫瘤的動物靜脈內(nèi)地施用鹽水(媒介物)、5t4-adc、pf-384、紫杉醇或組合5t4-adc+pf-384、5t4-adc+紫杉醇。基于mab蛋白質(zhì)含量（2或3mgab/kg）以q4dx4(每4天)計劃來施用adc，每組8-10只小鼠。以臨床上有關(guān)的劑量(crd)施用5t4-adc、pf-384和紫杉醇，所述劑量從這些藥物在人類中實現(xiàn)的暴露外推得到。根據(jù)確立的指南，所有使用小鼠的操作被pfizerinstitutionalanimalcareandusecommittee批準(zhǔn)。將達(dá)到端點的時間(達(dá)到無腫瘤或腫瘤增至三倍的速率的時間)用于藥物處理過的組的對比。使用t-檢驗來對比各個腫瘤體積，如在圖例中所指示的那樣。

實施例9：體外5t4-adc或澳瑞他汀凈荷組合

在肺癌、乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞系中針對與不同護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(soc)藥劑或選擇的信號傳遞抑制劑組合的5t4-adc或澳瑞他汀凈荷評價體外細(xì)胞毒性活性?；谌缫郧懊枋龅?t4狀態(tài)(sapra等人,2013)，為每種腫瘤適應(yīng)癥選擇細(xì)胞系。在開始藥物組合研究之前，確定每種藥劑在常規(guī)2d增殖測定中的ic50值。采用chou-talalay方法來計算在不同劑量-效應(yīng)水平的ci值。來自獨立實驗的平均ci值呈現(xiàn)在表2-5以及圖1a和1b中。將<0.9的ci值視作協(xié)同作用的證據(jù)；0.9-1.1，累加作用；ci>1.1，拮抗作用。當(dāng)將5t4-adc與pf-384、pd-901、培美曲塞、厄洛替尼或紫杉烷組合時，存在一致的強(qiáng)協(xié)同作用。盡管大多數(shù)細(xì)胞系對單獨的pd-901或厄洛替尼相對不敏感，但是敏感的和不敏感的細(xì)胞都已經(jīng)表現(xiàn)出協(xié)同相互作用(表2-5)。當(dāng)將5t4-adc與鉑化合物組合時通常觀察到累加作用，而在5t4-adc和阿霉素、表柔比星或吉西他濱之間觀察到適度的累加作用或拮抗作用。在組合測定中還包括澳瑞他汀或另外的微管-抑制劑藥物。在凈荷mmaf-ome或澳瑞他汀-101與上述藥劑的細(xì)胞可滲透形式之間也觀察到協(xié)同或累加相互作用模式。當(dāng)在細(xì)胞系的更小子集中與pf-384組合時，紫杉醇或長春瑞濱也表現(xiàn)出協(xié)同或累加關(guān)系。高選擇性的mtor激酶抑制劑wye-132(表5)會增強(qiáng)澳瑞他汀-101在ht-29、n87細(xì)胞中的抗增殖作用，該發(fā)現(xiàn)支持以下觀點：全面降低mtor功能可能至少部分地引起在澳瑞他汀和pf-384之間觀察到的寬協(xié)同作用。在更寬范圍的細(xì)胞系和腫瘤類型之中鑒別出基于澳瑞他汀的藥劑與pf-384或紫杉醇之間的更穩(wěn)健協(xié)同作用的事實提示這些組合可能提供潛在的臨床益處。

為了理解協(xié)同相互作用的動力學(xué)，使用xcelligence系統(tǒng)對細(xì)胞生長進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，這會實時提供增殖和粘附的電阻抗測量。用單獨的各種藥物5t4-adc、pf-384或用5t4-adc/pf-384組合以預(yù)定的次優(yōu)劑量的藥物處理mda-468細(xì)胞以允許在長時間段內(nèi)更準(zhǔn)確的觀察增強(qiáng)的效應(yīng)。在大約11天的進(jìn)程中，觀察到5t4-adc或pf-384在試驗的濃度對細(xì)胞生長的最小抑制(圖2a,b)。但是，由5t4-adc/pf-384組合造成的增殖的抑制遠(yuǎn)遠(yuǎn)比單獨每種藥劑中的任一種的效應(yīng)更顯著。在加入組合混合物以后立即觀察到增強(qiáng)，該效應(yīng)在整個實驗時程中持續(xù)。當(dāng)將游離的未綴合的凈荷mmaf-ome與pf-384組合時，得到類似的結(jié)果(圖2c,d)。因而，這些結(jié)果證實了我們使用常規(guī)增殖測定的先前發(fā)現(xiàn)，并提供了對體外協(xié)同效應(yīng)的時間依賴性的另外洞察。

在有細(xì)胞外基質(zhì)存在下產(chǎn)生的多細(xì)胞3d球狀體與生長中的實體瘤具有更多的相似性：與2d培養(yǎng)物相比，在3d條件下的細(xì)胞以更慢的速率增殖且含有休眠細(xì)胞。為了提供在3d條件下對藥物組合效應(yīng)的生物學(xué)洞察，研究了mda-468球狀體對5t4-adc、mmaf-ome、pf-384和紫杉醇處理的應(yīng)答以確定每種單獨藥劑的ic50。然后通過與固定劑量的第二種藥劑組合的5t4-adc或兩種藥物的相互組合的系列稀釋來評價組合。還在與單一藥劑相同的實驗中包括組合的藥劑以提供單獨一種藥物對照。對于5t4-adc/pf-384、mmaf-ome/pf-384或5t4-adc/紫杉醇的組合，觀察到3d球狀體細(xì)胞毒性的顯著增強(qiáng)(圖3a-f)。對于用5t4-adc/pf-384、mmaf-ome/pf-384或5t4-adc/ptx的組合處理過的肺癌h-1975球狀體，觀察到類似的情況(圖3g-j且數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例10：pf-384或紫杉醇對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

為了評價由5t4-adc和pf384或紫杉醇組合誘導(dǎo)的協(xié)同生長抑制是否是由于細(xì)胞凋亡，確定了h-1975或mda-468細(xì)胞中的促凋亡信號天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活化。在溫育后24小時測得，單獨的5t4-adc或pf-384導(dǎo)致兩種細(xì)胞系中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7的適度的活化(圖4)。但是，組合治療表明天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7的顯著增強(qiáng)的誘導(dǎo)(圖4a,e)。當(dāng)用mmaf-ome+pf-384處理相同細(xì)胞時，得到類似的結(jié)果，從而提示，5t4-adc/pf-384組合中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)在機(jī)理上與親本凈荷mmaf-ome的作用相關(guān)聯(lián)(圖4b,f)。關(guān)于切割的parp的免疫印跡分析(未顯示)進(jìn)一步支持了5t4-adc/pf384或mmaf-ome/pf384的組合對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。此外，與用單獨的單一藥劑處理過的細(xì)胞相比，還在用5t4-adc或mmaf-ome+紫杉醇處理48小時的mda-468細(xì)胞中觀察到增強(qiáng)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7活化(圖4c,d)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證實了用組合觀察到的抗增殖作用可以至少部分地通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/7介導(dǎo)的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡應(yīng)答來解釋。

另外，評估了細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)節(jié)是否可以提供5t4-adc和pf-384（預(yù)期對細(xì)胞周期具有不同作用的試劑）之間的協(xié)同作用的解釋。在等于或高于細(xì)胞增殖的ic50的濃度藥物暴露24或36小時以后，對mda-468和h-1975細(xì)胞二者執(zhí)行細(xì)胞周期分析(圖5a-c且數(shù)據(jù)未顯示)。如預(yù)期的，pf-384誘導(dǎo)處于細(xì)胞周期的g0/g1期的細(xì)胞的積累，處于g2/m期的細(xì)胞的比例下降。在藥物處理以后24和36小時，該效應(yīng)是明顯的。相反，5t4-adc造成處于細(xì)胞周期的g2/m期的細(xì)胞的劑量依賴性的積累和在暴露的24-36小時內(nèi)g0/g1細(xì)胞的同時發(fā)生的損失。使用5t4-adc和pf-384的組合的處理導(dǎo)致處于g1的細(xì)胞的最初積累和在暴露24小時之前接近正常百分比的在g2/m期的細(xì)胞(圖5a,b)。不同于單獨的5t4-adc，對于組合在任何時間點沒有觀察到g2/m峰的增加，且在36小時之前看到g2/m的減少。這伴隨著亞-g1的大幅增加，從而提示，g2/m的較短持續(xù)時間可以由在該細(xì)胞周期階段增強(qiáng)的細(xì)胞死亡來解釋(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，與10-或100nm-pf-384組合的未綴合的mmaf-ome對g0/g1和g2/m的效應(yīng)在總體上類似于單獨的mmaf-ome，至少在試驗的濃度如此(數(shù)據(jù)未顯示)。與關(guān)于組合檢測到的總g2/m峰的減少相一致，觀察到用5t4-adc/pf-384組合處理24或36小時的細(xì)胞的磷酸-組蛋白h3水平相對于單獨5t4-adc而言的下降(24小時，5t4-adc+pf-384(4.9%)相對于5t4-adc(7.7%)；36小時，5t4-adc+pf-384(6.2%)相對于5t4-adc(10.8%))，發(fā)現(xiàn)可能提示藥物組合處理過的細(xì)胞從有絲分裂停止?fàn)顟B(tài)更快地退出(圖5c)。

實施例11：使用5t4-adc和pf-384或紫杉醇的體內(nèi)組合治療

為了確定在體外使用5t4-adc/pf-384或5t4-adc/紫杉醇實現(xiàn)的細(xì)胞增殖的優(yōu)先減少和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是否可以轉(zhuǎn)移至體內(nèi)場合，在兩種先前表征的腫瘤異種移植物模型中評價了各種單一藥劑和所述組合的效力。mda-468三重陰性的乳腺癌和h-1975肺腺癌模型是具有寬范圍的5t4表達(dá)水平的5t4+腫瘤異種移植物，如通過流式細(xì)胞計量術(shù)和ihc染色所證實的(3)。盡管在該研究中使用的藥劑在以較高劑量使用時可能導(dǎo)致較高效力，臨床上有關(guān)劑量的這些藥物的施用是確保我們的數(shù)據(jù)向臨床實踐的更好轉(zhuǎn)移的焦點。關(guān)于mda-468乳腺癌模型（與h-1975異種移植物相比，其經(jīng)常對5t4-adc更敏感），執(zhí)行達(dá)到無腫瘤(腫瘤消退)的時間的到端點時間(time-to-endpoint，tte)分析。tte圖表明，用pf-384(7.5mg/kg)處理過的所有動物仍然含有腫瘤，而5t4-adc(2mg/kg)和5t4-adc/pf-384組在研究進(jìn)程中實現(xiàn)腫瘤消退(圖6a)。相對于單獨的5t4-adc(p<0.0001，通過時序檢驗)，在組合組中達(dá)到完全腫瘤消退需要短得多的時間，且在5t4-adc/pf-384組中的所有動物在第36天之前變得無腫瘤。此外，在初次給藥后第53天在單一處理組和5t4-adc/pf-384組合之間觀察到平均腫瘤體積的顯著差異(通過t-檢驗，pf-384相對于5t4-adc/pf-384，p<0.0001；5t4-adc相對于5t4-adc/pf-384，p=0.02)(圖6b)。值得注意的是，在第53天，5t4-adc/pf-384組合組具有10/10完全緩解(cr)，與此相比，單獨的5t4-adc僅為3/8cr，且在pf-384組中無cr(圖6b)。將具有小于3倍的腫瘤體積增加的動物的百分比用作h-1975模型的分析的存活端點，所述h-1975模型通常對5t4-adc的敏感性低于mda-468。tte分析指示組合組的腫瘤增至三倍速率相對于單獨的5t4-adc(3mg/kg；p=0.0356，時序檢驗)或pf-384(7.5mg/kg，p<0.0001，時序檢驗，圖6c)的統(tǒng)計上顯著的延遲。使用5t4-adc+pf384的處理也導(dǎo)致腫瘤生長的更完全抑制，在治療開始以后第21天具有統(tǒng)計上顯著的腫瘤體積差異(p=0.006)(圖6c)。

鑒于在體外在5t4-adc和紫杉烷之間觀察到的有利相互作用，研究了該組合在體內(nèi)的潛在抗腫瘤活性。用5t4-adc(2mg/kg)+紫杉醇(22.5mg/kg)的組合試驗了mda-468異種移植物。這些組合的tte分析揭示了組合組達(dá)到完全腫瘤消退需要與單獨的單一藥物相比顯著更短的時間(圖7a,c)。如在圖7b中所示，5t4-adc單一療法在2mg/kg表現(xiàn)出強(qiáng)抗腫瘤活性，在第53天之前導(dǎo)致8個腫瘤中的3個的腫瘤消退，而單獨的紫杉醇在10mg/kg對腫瘤生長不具有顯著作用。5t4-adc/ptx組合組表現(xiàn)出勝過單一療法治療的治療益處，如10個腫瘤中的9個的腫瘤消退和平均腫瘤體積的顯著差異和(5t4-adc/ptx相對于5t4-adc，t-檢驗p=0.037；5t4-adc/ptx相對于ptx，p<0.0001)所證實的。與22.5mg/kg紫杉醇組合的5t4-adc在第53天之前表現(xiàn)出9個腫瘤中的9個的深遠(yuǎn)持久消退，而單獨的單一處理表現(xiàn)出更適中的抗腫瘤活性(對于5t4-adc為3/9cr；對于ptx為6/10cr；平均腫瘤體積：5t4-adc/ptx相對于5t4-adc，p=0.037；5t4-adc/ptx相對于ptx，p<0.0001)(圖6d)。還用類似的單一藥劑(3mg/kg5t4-adc，10mg/kg紫杉醇)或組合治療處理了h-1975肺癌異種移植物(圖7)。使用5t4-adc+紫杉醇的雙重處理產(chǎn)生了與單一療法治療相比抗腫瘤活性的顯著增強(qiáng)，如組合組相對于單獨5t4-adc或ptx處理組而言腫瘤增至三倍速率的顯著延遲所證實的(圖7a)。此外，在初次給藥后第46天在5t4-adc/ptx組中的平均腫瘤體積相對于單獨單一藥物處理組強(qiáng)烈減小(圖7f；p<0.0001，t-檢驗)。

進(jìn)行研究以包括肺癌aa37622的pdx模型，即最近在我們的組中建立的k-ras突變體模型(3,4)。驚人的是，3mg/kg的5t4-adc和22.5mg/kg的紫杉醇的類似組合導(dǎo)致與單一療法治療相比更顯著的腫瘤生長抑制(5t4-adc/ptx相對于5t4-adc，p<0.001；5t4-adc/ptx相對于ptx，p<0.0001；雙因素方差分析，在第56天；圖7g)。

生物學(xué)數(shù)據(jù)

表1.癌細(xì)胞系

表2.在肺癌細(xì)胞系中的藥物組合

表3.在乳腺癌細(xì)胞系中的藥物組合

表4.在卵巢癌細(xì)胞系中的藥物組合

表5.在ht-29和n-87細(xì)胞系中的藥物組合

表1列出了在研究中使用的癌細(xì)胞系?；诳晒_得到的來源，總結(jié)了每個細(xì)胞系的細(xì)胞系名稱、組織起源、選擇的突變或分子狀態(tài)。

表2-5列出了每個確定的組合在ed50水平的平均聯(lián)合指數(shù)(ci)值。已經(jīng)如下解釋ci：非常強(qiáng)的協(xié)同作用(<0.1)，強(qiáng)協(xié)同作用(0.1-0.3)，協(xié)同作用(0.3-0.7)，中等協(xié)同作用(0.7-0.85)，輕微協(xié)同作用(0.85-0.9)，接近累加(0.9-1.1)，輕微拮抗作用(1.1-1.2)和中等拮抗作用(1.2-1.45)。結(jié)果是至少三個獨立實驗的平均值。