本發(fā)明涉及環(huán)孢菌素與喹啉線粒體靶向基團(tuán)的偶聯(lián)物及其治療用途。
背景技術(shù)：
：：缺血性疾病，特別是心肌梗死和中風(fēng)是全世界死亡和殘疾的主要原因。在缺血發(fā)作后，早期恢復(fù)血流是限制組織損傷的關(guān)鍵。然而，當(dāng)血液供應(yīng)恢復(fù)到缺血細(xì)胞時(shí)，新返回的血液可能不利地影響受損組織。這被稱為再灌注損傷，并且通常在缺血發(fā)作后引起進(jìn)一步的損傷和細(xì)胞死亡。因此，它是緩解和避免缺血/再灌注(i/r)損傷的治療目標(biāo)。目前沒有有效的治療處理缺血/再灌注損傷。環(huán)孢菌素a(csa)是眾所周知的免疫抑制藥物。已經(jīng)提出用于治療缺血/再灌注損傷。然而，研究環(huán)孢菌素治療缺血/再灌注的效果的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮囼?yàn)性試驗(yàn)產(chǎn)生高度可變的和僅僅邊際效應(yīng)。此外，由于化合物的毒性，給患者施用環(huán)孢菌素可能導(dǎo)致不良副作用。隨后，wo2011/010084描述了通過(guò)使用與線粒體靶向基團(tuán)偶聯(lián)的環(huán)孢菌素選擇性抑制線粒體親環(huán)蛋白d(cyp-d)來(lái)治療缺血/再灌注損傷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明來(lái)自一項(xiàng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即同未偶聯(lián)的環(huán)孢菌素相比，或同與其它線粒體靶向基團(tuán)偶聯(lián)的環(huán)孢菌素相比，環(huán)孢菌素與喹啉線粒體靶向基團(tuán)的偶聯(lián)物與降低的毒性相關(guān)。環(huán)孢菌素與喹啉的偶聯(lián)物也是親環(huán)蛋白d的有效抑制劑，并在缺血/再灌注損傷的動(dòng)物模型中顯示神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)。還已發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素與喹啉的偶聯(lián)物在神經(jīng)變性病癥的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)。因此環(huán)孢菌素與喹啉的偶聯(lián)物是一種有望用于治療神經(jīng)變性病癥和局部缺血/再灌注損傷的治療方法的候選物。因此，本發(fā)明提供一種環(huán)孢菌素偶聯(lián)物，其為式(i)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：其中：-a代表-b代表甲基或乙基，-r2代表乙基或異丙基，-r4代表-ch2ch(ch3)ch3、-ch2ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)ch3或-ch(ch3)ch2ch3，-以下各項(xiàng)之一：(a)r1和r1*中的一個(gè)代表-l1z1且另一個(gè)代表氫，且r3代表氫、c1-c3烷基或c2-c4烯基；或(b)r1和r1*中的一個(gè)代表甲基且另一個(gè)代表氫，且r3代表-l3z3；或(c)r1和r1*中的一個(gè)代表-l1z1且另一個(gè)代表氫，且r3代表-l3z3，-l1和l3獨(dú)立代表c1-c6亞烷基部分、c2-c6亞烯基部分或-(ch2ch2o)n(ch2)m-部分，其中n代表1至3且m代表0至2，且-z1和z3獨(dú)立代表未取代或被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代的喹啉環(huán)：鹵素原子、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、-or'基團(tuán)、-coor'基團(tuán)、-conr’r”基團(tuán)和-nr'r”基團(tuán)，其中r'和r”相同或不同且表示氫或c1-c6烷基。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體本發(fā)明還提供本發(fā)明的偶聯(lián)物用于治療人體或動(dòng)物體的用途。本發(fā)明還提供本發(fā)明的偶聯(lián)物用于治療或預(yù)防可通過(guò)抑制環(huán)孢菌素d而改善的疾病或紊亂的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的偶聯(lián)物在制備用于治療易于通過(guò)抑制親環(huán)素d來(lái)改善的疾病或病癥的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了治療患有或易患能夠通過(guò)抑制親環(huán)蛋白d而改善的疾病或病癥的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用本發(fā)明的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的偶聯(lián)物作為實(shí)驗(yàn)測(cè)定試劑的非治療用途。附圖說(shuō)明圖1顯示來(lái)自實(shí)施例2的結(jié)果，其中在小鼠中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)。在預(yù)期的復(fù)發(fā)跡象發(fā)生之前不久，自第33天起以載體[乙醇?xì)浠吐橛停毫姿猁}緩沖鹽水(1：1：18)]或1mg/kg化合物1對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。圖1描繪了誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后的平均每日臨床評(píng)分，并顯示化合物1具有神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)。圖2顯示了實(shí)施例3的結(jié)果，其中進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)以下各項(xiàng)的毒性：(a)未修飾的環(huán)孢菌素a(csa)，(b)與喹啉部分偶聯(lián)的環(huán)孢菌素[化合物1]和(c)環(huán)孢菌素[參考化合物1]。圖2中的100％表示在測(cè)定中沒有效果。這些結(jié)果顯示喹啉部分與環(huán)孢菌素的偶聯(lián)顯著降低了環(huán)孢菌素的毒性。當(dāng)環(huán)孢菌素與其他線粒體靶向基團(tuán)(例如氟吡汀)偶聯(lián)時(shí)，沒有觀察到類似的毒性降低。圖3顯示了在wt和cypdko動(dòng)物分離的肝線粒體中，csa和化合物1對(duì)crc(pt)的劑量依賴性效應(yīng)的定量，如實(shí)施例4所述。抑制百分比表示相對(duì)于dmso處理的crc增加，歸一化為wt。*p<0.05(t檢驗(yàn))。圖4a至4f涉及實(shí)施例5中的線粒體毒性評(píng)估。在div8-9大鼠皮層神經(jīng)元(a，e)和分離的大鼠肝線粒體(b-d，f)中測(cè)量線粒體參數(shù)。a，b：(a)使用imagexpressmicroxl在裝載有四甲基羅丹明甲基酯(tmrm)的神經(jīng)元中和(b)使用熒光讀板儀在裝載羅丹明-123的分離線粒體中測(cè)量線粒體膜電位。將值歸一化為dmso(100％)和fccp(2μm，0％)處理的樣品。*p<0.05(單因素方差分析)。c，d：使用oroboros高分辨率氧合圖，在谷氨酸鹽和蘋果酸鹽存在下從大鼠肝臟分離的線粒體中測(cè)量o2消耗。與基礎(chǔ)的dmso對(duì)照為對(duì)比，化合物顯示了對(duì)基礎(chǔ)、滲漏(寡霉素，2.5μm)和最大解偶聯(lián)呼吸(fccp，滴定以產(chǎn)生最大效果)的影響。*p<0.05(配對(duì)t檢驗(yàn))。e，f：使用熒光素酶測(cè)定法測(cè)量皮質(zhì)神經(jīng)元中的atp水平(e)和在底物和adp存在下的分離線粒體的atp產(chǎn)量(f)。使用碘乙酸(iaa，1mm)和寡霉素(oligo，2.5μm)分別顯示糖酵解和線粒體atp合成的貢獻(xiàn)。*p<0.05(t檢驗(yàn))。圖5a和5b顯示了如實(shí)施例6所述的細(xì)胞內(nèi)cypa結(jié)合評(píng)估。用空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的crfk細(xì)胞(實(shí)心方形)或trim-cypa(空心圓形)，在dmso的存在或藥物濃度增加下以vsv-假型、gfp-表達(dá)的hiv-1載體進(jìn)行感染。a：csa，b：化合物1。在感染后48小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量病毒感染。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖6a至6d顯示實(shí)施例8的結(jié)果，化合物1顯示出比csa更低的免疫抑制活性。體外有絲分裂，將4x10-5個(gè)細(xì)胞的正常小鼠脾細(xì)胞與(a)5μg/ml刀豆蛋白；(b)有絲分裂cd3/cd28單克隆抗體；或(c)來(lái)自mog殘基35-55肽免疫的小鼠的脾細(xì)胞，在5μg/mlmog肽存在下與載體或化合物共同培養(yǎng)a、b2或4c天，然后加入1μci3h-胸苷，并在16-20小時(shí)后收獲，并通過(guò)β閃爍計(jì)數(shù)評(píng)估氚標(biāo)記的胸苷摻入。結(jié)果表示一式三份樣品的平均值±sem。d：低劑量的化合物1在體內(nèi)沒有表現(xiàn)出免疫抑制活性。在第0天將25μl的2.5％惡唑酮(ox)或丙酮：橄欖油(4:1)載體(aoo)施用于abh小鼠的耳朵皮膚。在第3天，取下3-4只小鼠/組的引流耳廓淋巴結(jié)，并在1μci3h-胸苷的存在下培養(yǎng)5x105個(gè)細(xì)胞過(guò)夜。用0.1ml載體或0.1-10mg/kg化合物1或50mg/kgcsa處理動(dòng)物。結(jié)果表示至少一式四份樣品的平均值±sem。圖7顯示了實(shí)施例9的結(jié)果。圖7a顯示了平均轉(zhuǎn)棒活動(dòng)性，其表示用載體(白色柱)或化合物1(灰色柱)處理之前(第27天)或之后(第45天)，在加速旋轉(zhuǎn)桿上掉落/不能停留之前的平均值±sem時(shí)間。***與載體治療相比的p<0.001。圖7b顯示用化合物1mg/kg治療復(fù)發(fā)性eae后在脊髓中的軸突含量，測(cè)量為針對(duì)總蛋白質(zhì)含量調(diào)整的神經(jīng)絲水平。在第0天和第7天用含有脊髓勻漿的完全弗氏佐劑誘導(dǎo)eae，并在第28天用含有脊髓勻漿的完全弗氏佐劑再次進(jìn)行免疫誘導(dǎo)復(fù)發(fā)。在第27天根據(jù)rotarod性能評(píng)分將動(dòng)物隨機(jī)化，以從第33天開始，恰好在第35天發(fā)生復(fù)發(fā)之前，直到第47天，接受載體(cremophor(sigma，uk)，酒精，磷酸鹽緩沖鹽水1：1：18)或1mg/kgip化合物1。殺死動(dòng)物，使用靜水壓力除去脊髓，并使用定量神經(jīng)絲特異性elisa測(cè)量的軸索含量。未處理n＝11，化合物1處理n＝13。通過(guò)elisa測(cè)量來(lái)自未處理的未復(fù)發(fā)的未處理動(dòng)物的脊髓勻漿中，去磷酸化(smi-32反應(yīng)性)神經(jīng)絲與過(guò)度磷酸化(smi-35反應(yīng)性)神經(jīng)絲的比率；n＝11或化合物111mg/kg治療的動(dòng)物n＝13。***p<0.001，針對(duì)總蛋白水平進(jìn)行調(diào)整。圖8顯示了實(shí)施例10的結(jié)果，其中測(cè)量了化合物1、3和4以及參考化合物1對(duì)ca2+介導(dǎo)的pt孔形成的抑制。圖8a顯示當(dāng)使用40nm濃度時(shí)的結(jié)果。圖8b顯示當(dāng)使用8nm濃度時(shí)的結(jié)果。具體實(shí)施方式典型地，r1和r1*中的一個(gè)代表-l1z1且另一個(gè)代表氫，而r3代表氫、c1-c3烷基或c2-c4烯基?？蛇x地，r1和r1*中的一個(gè)代表甲基且另一個(gè)代表氫，而r3代表-l3z3。r1和r1*中的一個(gè)代表-l1z1且另一個(gè)代表氫，而r3代表-l3z3。典型地，r1代表甲基或-l1-z1且r1*代表氫。相應(yīng)地，優(yōu)選地，(i)r1代表-l1z1，r1*代表氫且r3代表氫、c1-c3烷基或c2-c4烯基，或(ii)r1代表甲基，r1*代表氫且r3代表-l3z3，或(iii)r1代表-l1z1和r1*代表氫且r3代表-l3z3。優(yōu)選的偶聯(lián)物包括一個(gè)喹啉部分。相應(yīng)地，尤其優(yōu)選地，r1代表-l1z1，r1*代表氫且r3代表氫、c1-c3烷基或c2-c4烯基。還尤其優(yōu)選地，r1代表甲基，r1*代表氫且r3代表-l3z3。典型地，當(dāng)r3不代表-l3z3時(shí)，其代表氫、甲基或-ch2ch＝ch2，優(yōu)選為氫或-ch2ch＝ch2。當(dāng)r3不代表氫時(shí)，其3’位置存在立體化學(xué)中心。本發(fā)明的偶聯(lián)物典型地在該位置上外消旋，但在某些情況下優(yōu)選為在3’位置(即r3部分的連接位置)上為(r)立體化學(xué)或(s)。典型地，a代表典型地，b代表甲基。典型地，r2代表乙基。典型地，r4代表-ch2ch(ch3)ch3。優(yōu)選為，a代表b代表甲基，r2代表乙基且r4代表-ch2ch(ch3)ch3。典型地，l1和l3獨(dú)立地代表的c1-c6亞烷基部分是c1-c3亞烷基部分。典型地，l1和l3可以獨(dú)立地代表的c2-c6亞烯基部分是c3-c5亞烯基部分。為了避免歧義，l1和l3可以獨(dú)立地代表的-(ch2ch2o)n(ch2)m-部分可以在-(ch2ch2o)n(ch2)m-部分的任一端連接到z1或z3，即z-(ch2ch2o)n(ch2)m-或-(ch2ch2o)n(ch2)m-z。典型地，n代表1或2。典型地，m代表0或2。優(yōu)選為，l1代表c1-c6亞烷基部分，優(yōu)選為c1-c3亞烷基部分，例如-ch2ch2-或-ch2ch2ch2-部分。優(yōu)選為，l3代表c2-c6亞烯基部分，優(yōu)選為c3-c5亞烯基部分，例如-ch＝chch2-，-ch＝chch2ch2-，或-ch＝chch2ch2ch2-部分。典型地，喹啉環(huán)未取代或由選自下列的一種至三種，例如一種或兩種取代物所取代：鹵素原子、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、-or'基團(tuán)、-coor'基團(tuán)、-conr’r”基團(tuán)和-nr'r”基團(tuán)，其中r'和r”相同或不同且表示氫或c1-c6烷基。典型地，r’和r”相同或不同且代表氫或甲基。喹啉環(huán)的優(yōu)選取代基為鹵素原子，c1-c6烷基基團(tuán)，ac1-c6鹵代烷基基團(tuán)，or’基團(tuán)，-nr’r”基團(tuán)，其中r’和r”的定義如上所述。尤為優(yōu)選的喹啉環(huán)取代基為：c1-c6鹵代烷基基團(tuán)(例如-cf3)，–or’基團(tuán)(例如–oh)，或-nr’r”基團(tuán)(例如–nme2)。為了避免歧義，z1和z3獨(dú)立地代表的喹啉環(huán)是式(ii)所示部分:其中q1至q7獨(dú)立代表與下列的直接鍵合：l1或l3、氫原子、鹵素原子、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、-or'基團(tuán)、-coor’基團(tuán)或-nr'r”基團(tuán)，其中r'和r”相同或不同且表示氫或c1-c6烷基，且q8代表與下列的直接鍵合：l1或l3、氫原子或c1-c6烷基，前提是q1至q8中僅有一個(gè)代表與l1或l3的直接鍵合。通常，喹啉環(huán)通過(guò)l1或l3與喹啉環(huán)的氮原子之間的直接鍵合連接至l1或l3。因此，z1和z3通常通過(guò)直接鍵合到氮原子(即，其中q8表示直接鍵合)而連接到l1和l3。因此，z1和z3通常獨(dú)立地表示式(ii*)部分：其中q1*至q7*獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、-or'基團(tuán)、-coor’基團(tuán)、-conr’r”基團(tuán)或-nr’r”基團(tuán)，其中r'和r”如上所定義。優(yōu)選地，q1*至q7*獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、-or'基團(tuán)或-nr’r”基團(tuán)、其中r'和r”如上所定義。更優(yōu)選地，q1*至q7*獨(dú)立地表示氫原子、c1-c6鹵代烷基(例如-r”)、-or'基團(tuán)(例如-oh)或-nr’r”基團(tuán)(例如-nme2)。如上所述，喹啉環(huán)通常是未取代的或被一至三個(gè)、例如一個(gè)或兩個(gè)取代基取代。因此，通常q1*至q7*中的四至七個(gè)表示氫，例如q1*至q7*中的五個(gè)表示氫(在這種情況下喹啉攜帶兩個(gè)取代基)，或q1*至q7*中的六個(gè)表示氫，此時(shí)喹啉攜帶一個(gè)取代基)，或q1*至q7*中的所有七個(gè)表示氫(在這種情況下喹啉是未取代的)。喹啉環(huán)的優(yōu)選實(shí)施例是式(ii*a)、(ii*b)和(ii*c)所示部分：可選地，喹啉環(huán)可以通過(guò)l1或l3與喹啉環(huán)的可用碳原子之間的直接鍵合連接至l1或l3。因此，z1和z3可以通過(guò)直接鍵合至喹啉環(huán)中可用的碳原子(即q1至q7中的一個(gè)為直接鍵合)而分別連接至l1和l3。在該情況下，q8表示氫原子或c1-c6烷基，優(yōu)選為氫原子或甲基或乙基。不是直接鍵合的q1至q7部分優(yōu)選為如上針對(duì)q1*至q7*的定義。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中：-r1表示-l1z1，r1*表示氫，r3表示氫或-ch2ch＝ch2，優(yōu)選為氫；a表示b表示甲基，r2表示乙基，r4表示-ch2ch(ch3)ch3；-l1表示c1-c6亞烷基部分，優(yōu)選為c1-c3亞烷基部分；和-z1表示如上定義的式(ii*)、(ii*a)、(ii*b)或(ii*c)部分。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中：-r1表示甲基，r1*表示氫，r3表示-l3z3；a表示b表示甲基，r2表示乙基，r4表示-ch2ch(ch3)ch3；-l3表示c2-c6亞烯基部分，優(yōu)選c3-c5亞烯基部分；和-z3表示如上定義的式(ii*)、(ii*a)、(ii*b)或(ii*c)的部分。本發(fā)明特別優(yōu)選的偶聯(lián)物是下述化合物1至6及其藥學(xué)上可接受的鹽：如本申請(qǐng)所使用的，c1-c6烷基是直鏈或支鏈的，并且通常是c1-c3烷基。優(yōu)選的c1-c6烷基包括例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。本申請(qǐng)所用的c1-c6亞烷基是所述的二價(jià)c1-c6烷基。如本申請(qǐng)所用，c2-c4烯基是直鏈或支鏈的，并且通常是c2-c3烯基。c2-c4烯基通常含有一個(gè)碳-碳雙鍵。碳-碳雙鍵可以具有順式或反式構(gòu)型，優(yōu)選為反式構(gòu)型。優(yōu)選的c2-c4烯基包括-ch＝ch2，-ch2ch＝ch2和-ch2ch2ch＝ch2。如本申請(qǐng)所使用的，c2-c6亞烯基是可以是直鏈或支鏈的二價(jià)部分，并且通常是c3-c5亞烯基。c2-c6亞烯基通常包含一個(gè)碳-碳雙鍵。碳-碳雙鍵可以具有順式或反式構(gòu)型，優(yōu)選為反式構(gòu)型。如本申請(qǐng)所用，鹵素通常為氯、氟、溴或碘，并且優(yōu)選為氯、溴或氟。本申請(qǐng)所用的c1-c6鹵代烷基是被一個(gè)或多個(gè)所述鹵素原子取代的所述c1-c6烷基。通常，其被1、2或3個(gè)所述鹵素原子取代。特別優(yōu)選的鹵代烷基是cf3和-ccl3。如本申請(qǐng)所用，藥學(xué)上可接受的鹽是與藥學(xué)上可接受的酸或堿的鹽。藥學(xué)上可接受的酸包括：無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氫溴酸或硝酸；和有機(jī)酸，例如檸檬酸、富馬酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、酒石酸、苯甲酸、乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或?qū)妆交撬帷Ｋ帉W(xué)上可接受的堿包括堿金屬(例如鈉或鉀)和堿土金屬(例如鈣或鎂)氫氧化物和有機(jī)堿，例如烷基胺、芳烷基胺或雜環(huán)胺。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。環(huán)孢菌素是可商購(gòu)的已知化合物，然后可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如在下面的實(shí)施例中描述的那些，將其連接到線粒體靶向基團(tuán)。本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于治療或預(yù)防能夠通過(guò)抑制親環(huán)蛋白d(特別是人類)來(lái)改善的疾病或病癥。因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物可優(yōu)選用于改善已經(jīng)患有、正在患上或?qū)⒂谢既毖?再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)的患者的病狀。特別地，本發(fā)明的化合物可用于治療腦或心肌局部缺血/再灌注損傷。神經(jīng)變性疾病，例如阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化，也可以通過(guò)抑制親環(huán)素d來(lái)治療。優(yōu)選地，所述易于通過(guò)抑制親環(huán)蛋白d來(lái)改善的疾病或病癥是缺血/再灌注損傷或神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病的示例包括阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化。然而，最優(yōu)選地，所述易于通過(guò)抑制親環(huán)蛋白d來(lái)改善的疾病或病癥是缺血/再灌注損傷。多發(fā)性硬化也是特別優(yōu)選的。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以以各種方式向人類給藥，例如通過(guò)口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻、頰或舌下給藥方式。具體的給藥方式和給藥方案將由主治醫(yī)師選擇，并考慮到許多因素，包括患者的年齡、體重和狀況。含有本發(fā)明的偶聯(lián)物為活性成分的藥物組合物，通常根據(jù)所使用的具體給藥方式，與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑一起配制。例如，胃腸外制劑通常是使用藥學(xué)和生理學(xué)上可接受的流體例如生理鹽水、平衡鹽溶液等作為載體的可注射流體。另一方面，口服制劑可以是固體(例如片劑或膠囊)或液體溶液或懸浮液。組合物可以配制成單位劑型，即以包含一個(gè)或多個(gè)單位劑量或單位劑量的亞單位的離散部分形式。本發(fā)明的偶聯(lián)物向患者的給藥量，取決于所討論的特定偶聯(lián)物的活性。其它因素包括所治療的病癥、所治療的患者性質(zhì)和所治療的病癥嚴(yán)重性。偶聯(lián)物的給藥時(shí)間，應(yīng)由醫(yī)務(wù)人員根據(jù)其用途是用于預(yù)防還是用于治療缺血/再灌注損傷來(lái)確定。熟練的醫(yī)生能夠理解，與任何藥物一樣，偶聯(lián)物在非常高的劑量下可能是有毒的。例如，所述藥劑可以以0.01至30mg/kg體重，例如0.1至10mg/kg，更優(yōu)選0.1至5mg/kg體重的劑量給藥。優(yōu)選的劑量為約1mg/kg。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以單獨(dú)給藥或與一種或多種另外的活性劑組合給藥，所述活性劑用于治療能夠通過(guò)抑制親環(huán)蛋白d來(lái)改善的疾病或病癥，例如局部缺血/再灌注損傷或神經(jīng)變性疾病。兩種或更多種活性劑通常同時(shí)、分別或依序施用?；钚猿煞滞ǔＷ鳛榻M合制劑施用。本發(fā)明的偶聯(lián)物也可以用作試劑。例如，它們可用于需要選擇性抑制親環(huán)蛋白d的非治療性實(shí)驗(yàn)程序。因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物可用作評(píng)估親環(huán)蛋白d參與細(xì)胞過(guò)程(例如細(xì)胞死亡)的實(shí)驗(yàn)室試劑。目前尚無(wú)這樣的試劑。通常，所述非治療性實(shí)驗(yàn)程序是測(cè)定。以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例材料和方法除非另有說(shuō)明，所有市售的溶劑和試劑均直接使用而無(wú)需進(jìn)一步處理。nmr譜用brukerdrx500或600mhz光譜儀測(cè)量；化學(xué)位移相對(duì)于作為內(nèi)標(biāo)的tms來(lái)表示，單位為ppm，偶合常數(shù)(j)以hz為單位來(lái)表示。使用具有電噴霧離子化(esi)的waterszq2000單四極桿質(zhì)譜儀，使用分析c4柱(phenomenexgemini，50×3.6mm，5μm)和對(duì)于b為50-95％的ab梯度，獲得lc-ms光譜，其中流速為1ml/分鐘，洗脫液a為0.1:5:95甲酸/甲醇/水，洗脫液b為0.1:5:95甲酸/水/甲醇。在具有電噴霧電離(esi)或化學(xué)電離(ci)的waterslct飛行時(shí)間質(zhì)譜儀上獲得高分辨率質(zhì)譜。中間體1的合成：1-(戊-4-烯基)喹啉向含喹啉(1g，7.74mmol)的etoac溶液中加入5-溴-戊-1-烯(1.27g，8.51mmol)，將該混合物加熱并回流過(guò)夜。將混合物冷卻，然后減壓濃縮。分離出中間體1，為淺棕色油狀物(1.54g，99％)。lcms(m/z):c14h16n+,[mh]+計(jì)算值198.29；實(shí)測(cè)值198.10?；衔?的合成：[gly-(1s，2r，e)-8-喹啉-1-羥基-2-甲基辛-4-烯]1csa向含環(huán)孢菌素a(75mg，0.06mmol)的dcm(2ml)溶液中加入中間體1,1-(戊-4-烯-1-基)喹啉(23mg，0.072mmol)和hoveyda-grubbs二代催化劑(7mg，0.01mmol，17mol％)。將反應(yīng)物在微波中90℃下攪拌30分鐘，然后使其冷卻。將三乙胺加入到混合物中，然后與過(guò)量的p(ch2oh)3攪拌過(guò)夜以配位釕催化劑。將其用鹽水和水洗滌，然后使混合物通過(guò)stratospheresplthiolmpspe柱(polymerlab，varianinc)以除去任何殘留的催化劑。粗產(chǎn)物通過(guò)快速反相色譜法(meoh：h2o：甲酸)純化，得到化合物1，為棕色固體(15mg，17％)。hrms(m/z):c65h115n11o12,[mh]+計(jì)算值1358.84；實(shí)測(cè)值1357.95。中間體2的合成：[sar-烯丙基]3csa在-10℃向攪拌的1.8m二異丙基氨基鋰(39ml，70mmol)的無(wú)水thf溶液中滴加冷卻的含環(huán)孢菌素a(6g，5mmol)和氯化鋰(3.81g，89mmol)的thf。將混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)，然后滴加含烯丙基溴(0.755ml，8.7mmol)的thf溶液。在-5℃下再攪拌3小時(shí)后，通過(guò)加入含5％乙酸的甲醇溶液淬滅反應(yīng)。將混合物減壓濃縮，然后溶于dcm和水。分離dcm層，水層用dcm萃取兩次。合并有機(jī)部分，用硫酸鎂干燥，減壓濃縮。產(chǎn)物通過(guò)快速硅膠色譜(0-20％丙酮：dcm梯度)純化，得到中間體2，為灰白色固體(1.144g，18％)。hrms(m/z):c65h115n11o12,[mh]+計(jì)算值1242.88；實(shí)測(cè)值1242.89?；衔?的合成：[sar-(e)-己烯-2-基-6-喹啉]3csa使用上述用于合成化合物1的方法，由中間體1和中間體2制備化合物2。粗產(chǎn)物通過(guò)快速反相色譜法(meoh：h2o:：甲酸)純化，得到化合物2，為暗棕色固體(1.144g，18％)。hrms(m/z):c65h115n11o12,[mh]+計(jì)算值1412.93；實(shí)測(cè)值411.82。中間體3的合成：4-(二甲基氨基)-1-(戊-4-烯-1-基)-7-(三氟甲基)喹啉向含4-二甲基氨基-7-(三氟甲基)喹啉(1.98g，6.4mmol)的etoac溶液中加入5-溴-戊-1-烯(1.6g，10.7mmol)，將該混合物加熱并回流過(guò)夜。將混合物冷卻，然后減壓濃縮。分離出中間體3，為棕色油狀物(2.41g，94％)。lcms(m/z):c17h20f3n2+,[mh]+計(jì)算值309.36；實(shí)測(cè)值309.10.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ9.52–9.44(m,1h),8.50(d,j＝8.9hz,1h),8.03(s,1h),7.84(dd,j＝8.9,1.3hz,1h),7.33(dd,j＝11.8,7.6hz,1h),5.83(ddt,j＝17.0,10.2,6.7hz,1h),5.20–5.03(m,2h),4.86–4.63(m,2h),3.60(s,6h),2.33–2.19(m,2h),2.15–2.00(m,2h)?；衔?的合成：[gly(1s，2r，e)-10-(4-二甲基氨基-7-三氟甲基喹啉)1-羥基-2-甲基癸-4-烯酸]1csa使用上述用于合成化合物1的方法，從環(huán)孢菌素a和中間體3制備化合物3。粗產(chǎn)物通過(guò)快速反相色譜(meoh：h2o：甲酸)純化，得到化合物3，為棕色固體(32mg，26％)。hrms(m/z):c76h125f3n13o12+,[mh]+計(jì)算值1469.91；實(shí)測(cè)值1468.89?；衔?的合成使用與上述類似的方法制備化合物4。粗產(chǎn)物通過(guò)快速反相色譜法(meoh：h2o：甲酸)純化，得到化合物4，為棕色固體(15mg，17％)。hrms(m/z):c79h129f3n13o12+,[mh]+計(jì)算值1509.94；實(shí)測(cè)值1510.04。中間體4的合成：4-羥基-1-(戊-4-烯基)喹啉向4-甲氧基喹啉(550mg，3.45mmol)的etoac溶液中加入5-溴-戊-1-烯(1.55g，10.35mmol)，將該混合物加熱并回流過(guò)夜。將混合物冷卻，然后減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)快速硅膠色譜(100:8:1dcm:meoh:nh3)純化。分離出中間體4，為淡黃色油狀物(420mg，53％)。1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.48(d,j＝8.1hz,1h),7.67(dd,j＝8.4,7.2hz,1h),7.52(d,j＝7.5hz,1h),7.47–7.35(m,2h),6.27(d,j＝7.7hz,1h),5.99–5.72(m,2h),5.10(dd,j＝14.4,5.4hz,2h),4.12(t,j＝7.3hz,2h),2.16(q,j＝7.0hz,2h),2.02–1.92(m,2h).化合物5的合成：[gly-(1s，2r，e)-8-(4-羥基喹啉)-1-羥基-2-甲基辛-4-烯]1csa使用上述用于合成化合物1的方法，從環(huán)孢菌素a和中間體4制備化合物5。粗產(chǎn)物通過(guò)快速硅膠色譜(200:8:1dcm:meoh:nh3)純化，得到化合物5，為棕色固體(23mg，20％)。hrms(m/z):c73h121n12o13+,[mh]+計(jì)算值1374.84；實(shí)測(cè)值1373.83.化合物6的合成：[sar-(e)-己烯-2-基-6-(4-羥基)喹啉]3csa使用上述用于合成化合物1的方法，從中間體2和中間體4制備化合物6。粗產(chǎn)物通過(guò)快速硅膠色譜(200:8:1dcm:meoh:nh3))純化，得到化合物6，為深棕色固體(11mg，13％)。hrms(m/z):c77h127n12o13+,[mh]+計(jì)算值1428.93；實(shí)測(cè)值1428.01。中間體5的合成：6-氯-3-硝基-2-氨基吡啶向裝有2,6-二氯-3-硝基吡啶(3g，15.5mmol)的燒瓶中加入含2m氨的異丙醇溶液(18ml，36mmol)，將該混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。通過(guò)加入氨溶液(水溶液)使反應(yīng)完全。濾出所得沉淀，用水洗滌，然后真空干燥1小時(shí)。分離出中間體5，為蓬松黃色粉末(1.38g，51％)。lcms(m/z)：c5h4cln3o2[mh]+計(jì)算值153.56，實(shí)測(cè)值174.00。中間體6的合成：n2-(4-氟芐基)-5-硝基吡啶-2,6-二胺向含中間體5(500mg，2.9mmol)的異丙醇溶液中加入4-氟芐胺(463μl，4.06mmol)和三乙胺(805μl，5.8mmol)。將該混合物在微波中90℃下攪拌40分鐘。向混合物中加入水，濾出所得沉淀，用水洗滌，然后真空干燥1小時(shí)。分離出中間體6，為亮黃色固體(661mg，88％)。lcms(m/z)：c12h11fn4o2[mh]+計(jì)算值262.24，實(shí)測(cè)值263.00。中間體7的合成：n6-(4-氟芐基)吡啶-2,3,6-三胺向含中間體6(300mg，1.15mmol)的乙醇溶液中加入氯化錫(ii)二水合物(1.29g，5.72mmol)。將該混合物加熱至回流，然后滴加含硼氫化鈉(216mg，5.72mmol)的乙醇溶液。將所得混合物回流90分鐘，使其冷卻，然后通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并在減壓下濃縮。分離出中間體7，為橙色殘余物(230mg，86％)。lcms(m/z)：c12h13fn4[mh]+計(jì)算值232.26，實(shí)測(cè)值233.10。中間體8的合成：n-(2-氨基-6-((4-氟芐基)氨基)吡啶-3-基)戊-4-烯酰胺在0℃下向含中間體7(300mg，1.14mmol)的dcm溶液中加入三乙胺(240μl，1.71mmol)，然后滴加4-戊烯酰氯(140μl，1.25mmol)。將該混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，然后將溶液用2mhcl溶液和鹽水洗滌，然后用mgso4干燥并在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)快速硅膠色譜(5％meoh的dcm溶液)純化，得到中間體8，為淺黃色固體(195mg，54％)。lcms(m/z)：c17h19fn4o[mh]+計(jì)算值：314.36，實(shí)測(cè)值315.10。參考化合物1的合成：[gly-(1s，2r，e)-7-(氟吡汀)-1-羥基-2-甲基辛-4-烯酰胺]1csa使用上述合成化合物1的方法，從環(huán)孢菌素a和中間體7制備參考化合物1。粗產(chǎn)物通過(guò)快速反相色譜法(meoh:h2o:甲酸)純化，得到暗色的參考化合物1深藍(lán)色固體(26mg，21％)。hrms(m/z)：c76h124fn15o13[mh]+計(jì)算值1474.92，實(shí)測(cè)值1474.95。實(shí)施例1-親環(huán)蛋白d酶測(cè)定使用競(jìng)爭(zhēng)性熒光偏振測(cè)定(fp-測(cè)定)。該測(cè)定使用熒光素標(biāo)記的csa，其合成如下所述，其與未標(biāo)記抑制劑競(jìng)爭(zhēng)與親信蛋白d(cypd)的結(jié)合。通過(guò)測(cè)量平行偏振光和垂直偏振光之間的比率來(lái)確定偏振，并如roehrletal2004所述計(jì)算。使用針對(duì)不同酶濃度的單個(gè)探針濃度的滴定來(lái)測(cè)定解離常數(shù)(kd)(nikolovskaetal.,2004)。用如下公式a中所示公式計(jì)算抑制劑常數(shù)(ki)(nikolovskaetal.,2004)。公式a：ki是抑制劑常數(shù)，l50是ic50，l*50是在50％抑制時(shí)的游離標(biāo)記配體濃度，r0是在0％抑制時(shí)的蛋白質(zhì)濃度，kd解離常數(shù)?；衔?至6的ki測(cè)量在384-黑色低緣非結(jié)合微量滴定板(corninginc.，tewksbury，maryland，usa)中進(jìn)行測(cè)定。使用由3種組分、熒光環(huán)孢菌素探針(fp-csa)45nm、酶40nm、測(cè)試化合物(10-10000nm)組成的80μl總?cè)芤?。本?shí)驗(yàn)使用三個(gè)重復(fù)試樣。在該實(shí)驗(yàn)中使用的對(duì)照是：具有hepes緩沖液的空白，僅具有探針的對(duì)照，具有探針和酶的陽(yáng)性對(duì)照，以及fp-csa對(duì)csa和酶的參照對(duì)照。dmso溶液中的dmso％應(yīng)保持低于1％。測(cè)得的化合物1至6的ki值列于下表1中。測(cè)試化合物親環(huán)蛋白d結(jié)合ki(nm)化合物128化合物2125化合物324化合物473化合物564化合物646表1制備熒光素標(biāo)記的環(huán)孢菌素(fp-csa)根據(jù)下面闡述的方案制備熒光素標(biāo)記的環(huán)孢菌素(fp-csa)。從環(huán)孢菌素a(1)形成乙烯基甲酯衍生物(2)。將環(huán)孢菌素a(1.00g，0.832mmol)、4-乙烯基苯甲酸甲酯(270mg，1.665mmol)和含hoveyda-grubbs第二代催化劑(20mg，0.032,4％)的二氯甲烷(4ml)溶液在氮?dú)庀禄亓?60℃)48小時(shí)。對(duì)反應(yīng)混合物的t.l.c.分析(丙酮：環(huán)己烷，1:1)顯示存在產(chǎn)物(rf0.63)并環(huán)孢菌素a起始材料完全耗盡(rf0.65)。lcms分析也證實(shí)了產(chǎn)物的存在。將反應(yīng)混合物預(yù)吸附在硅膠上，通過(guò)快速柱色譜法(乙酸乙酯：環(huán)己烷1:1至乙酸乙酯至乙酸乙酯：甲醇，10％)純化，真空除去溶劑，得到灰色固體。然后使其通過(guò)spe-硫醇柱(洗脫劑：甲醇)除去grubbs-hoveida催化劑，進(jìn)一步純化灰色固體。真空除去溶劑，得到相應(yīng)的甲酯，為白色結(jié)晶固體(950mg，86.4％)。hrms(tofmses+)：實(shí)測(cè)值1344.8726[m+na]+c69h115n11o14na，理論值1344.8523。乙烯基酸衍生物(3)的形成將甲酯2(260mg，0.196mmol)在丙酮(4ml)和氫氧化鈉水溶液(2m，2ml)中攪拌。19小時(shí)后，形成白色沉淀，t.l.c.分析(丙酮：環(huán)己烷，1:1)顯示存在一種產(chǎn)物(rf0.17)和一些殘余初始材料/雜質(zhì)(rf0.31)。從反應(yīng)混合物中除去丙酮，留下的水層用乙酸乙酯洗滌。水層用鹽酸水溶液(1m)酸化，再次用乙酸乙酯洗滌。將收集的乙酸乙酯層干燥(硫酸鎂)、過(guò)濾并真空濃縮，得到白色/淺棕色吸濕性固體，然后將其在乙腈中稀釋并再次過(guò)濾(洗脫液乙腈)。最后真空濃縮濾液，得到酸性衍生物3(220mg，86％)，為白色/淺棕色吸濕性固體。hrms(tofmses+):實(shí)測(cè)值1330.8366[m+na]+c68h113n11o14na，理論值1330.8173。fmoc保護(hù)中間體(4)的合成在室溫、氮?dú)夥諊孪驍嚢?分鐘的csa酸3衍生物(395mg，0.3018mmol)、氯仿(10ml)和三乙胺(168μl)的溶液中加入hatu偶聯(lián)試劑(230mg，0.6037mmol)的氮?dú)?。再過(guò)5分鐘后，向攪拌中的反應(yīng)混合物加入2-[2-(fmoc-氨基)乙氧基乙胺鹽酸鹽(257mg，0.7083mmol)，并使其反應(yīng)22.5小時(shí)。lcms分析顯示反應(yīng)混合物中存在產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物真空濃縮，并相繼用乙酸乙酯稀釋，用鹽酸水溶液(1m)洗滌。將收集的有機(jī)層用硫酸鎂干燥、過(guò)濾并真空濃縮，得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法(氯仿至氯仿：甲醇，3％)純化，得到fmoc衍生物4(406mg，83％)白色吸濕固體。hrms(tofmses+):實(shí)測(cè)值1638.9775[m+na]+c87h133n13o16na，理論值1638.9891。合成環(huán)孢菌素-peg-胺衍生物(5)向fmoc保護(hù)的csa類似物4(97mg，0.06mmol)中加入哌啶(0.5ml)，并在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去哌啶，殘余物通過(guò)色譜法純化，使用包含含有2％880氨的ch2cl2的5-10％meoh。得到中間體胺5(26mg，0.019mmol，31％)，為黃色膠狀物。將其直接用于下一步驟。熒光素-peg-csa衍生物(6)向含胺5(22mg，18.6mmol)、5-羧基熒光素(7mg，0.0187mmol)和pybop(10mg，19mmol)的ch2cl2(1ml)中加入二異丙基乙胺(9mg，13μl，76mmol)并將反應(yīng)物攪拌過(guò)夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去揮發(fā)物，并使用反相色譜法(c18,5％meoh至95％meoh/水)純化殘余物。得到產(chǎn)物6(10mg，0.0057mmol，48％)。lcms(es+)1775(m+na+),1752(m+h+)。實(shí)施例2-化合物1的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)對(duì)復(fù)發(fā)-進(jìn)行性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)的誘導(dǎo)如al-izkietal.2014,brain,137(pt1):92-108所述進(jìn)行。abh小鼠在誘導(dǎo)后第0天和第7天，注射含1mg小鼠脊髓勻漿物的弗氏佐劑以誘導(dǎo)eae，并且在誘導(dǎo)后第28天重復(fù)，以誘導(dǎo)復(fù)發(fā)。預(yù)期的復(fù)發(fā)跡象快發(fā)生之前，在第33天，每天向動(dòng)物腹膜內(nèi)注射載體[乙醇?xì)浠吐橛停毫姿猁}緩沖鹽水(1:1:18)]或1mg/kg化合物1。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的臨床疾病進(jìn)程，圖1中的結(jié)果表示誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后的平均每日臨床評(píng)分。這些結(jié)果表明化合物1抑制了eae期間、跡象發(fā)生后的神經(jīng)缺陷累積。實(shí)施例3-評(píng)價(jià)環(huán)孢菌素結(jié)合物的毒性進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)(a)未修飾的環(huán)孢菌素a(csa)，(b)與喹啉部分偶聯(lián)的環(huán)孢菌素[化合物1]，和(c)與氟吡汀部分偶聯(lián)的環(huán)孢菌素[參考化合物1]的毒性。將hepg2細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)物處理的黑壁透明有底聚苯乙烯板上，每孔100μl(3000細(xì)胞)。24小時(shí)后，將一定濃度范圍的測(cè)試化合物施用于細(xì)胞。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，令細(xì)胞帶上下面列出的每種細(xì)胞健康標(biāo)記物的相關(guān)染料/抗體。然后使用自動(dòng)熒光細(xì)胞成像儀[arrayscanvti(thermoscientificcellomics)]掃描平板。測(cè)量以下細(xì)胞健康標(biāo)志物：a.細(xì)胞計(jì)數(shù)-每孔細(xì)胞數(shù)目的減少，表示由壞死、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞增殖降低引起的毒性。b.核面積-核大小的增加表明壞死或g2細(xì)胞周期停滯，減少則表示凋亡。c.dna結(jié)構(gòu)-dna結(jié)構(gòu)的增加，表明染色體的不穩(wěn)定性和dna片段化。d.細(xì)胞膜通透性-細(xì)胞膜通透性的增加是細(xì)胞死亡的一般指標(biāo)。e.線粒體質(zhì)量-線粒體質(zhì)量的減少表示總線粒體的損失，而增加則意味著線粒體腫脹或?qū)?xì)胞能量需求的適應(yīng)性反應(yīng)。f.線粒體膜電位(δψm)-其減少表示線粒體膜電位和線粒體毒性的損失，以及在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中的潛在作用；線粒體膜電位的增加表明對(duì)細(xì)胞能量需求的適應(yīng)性反應(yīng)。g.細(xì)胞色素c釋放-細(xì)胞色素c釋放的增加是凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)的標(biāo)志之一。結(jié)果示于圖2中，其中100％表示測(cè)定為沒有影響。該結(jié)果顯示，喹啉部分與環(huán)孢菌素的偶聯(lián)顯著降低了環(huán)孢菌素的毒性。當(dāng)環(huán)孢菌素與其他線粒體靶向基團(tuán)(例如氟吡汀)偶聯(lián)時(shí)，沒有觀察到類似的毒性降低。實(shí)施例4-抑制ca2+介導(dǎo)的pt孔形成為了評(píng)估化合物對(duì)ca2+介導(dǎo)的pt孔形成的功效，我們測(cè)量了分離的小鼠肝線粒體的鈣保留能力(crc)。在重復(fù)添加ca2+推注(10μm)后，使用膜不可滲透的低親和力熒光ca2+敏感染料fluo-5n，測(cè)量線粒體外溶液中的ca2+濃度。激活的線粒體攝取ca2+，導(dǎo)致熒光信號(hào)在ca2+推注誘導(dǎo)峰后下降。當(dāng)線粒體內(nèi)的[ca2+]達(dá)到閾值時(shí)，線粒體攝取并緩沖ca2+達(dá)閾值以誘導(dǎo)pt。這導(dǎo)致線粒體膜電位損失，阻止進(jìn)一步的ca2+攝取，導(dǎo)致缺乏ca2+緩沖，表現(xiàn)為每次ca2+添加時(shí)線粒體外的[ca2+]的逐步增加。誘導(dǎo)pt所需的ca2+量表征其ca2+敏感性，并定義線粒體crc。因此，抑制cypd(pt的ca2+傳感器)導(dǎo)致crc的增加。與csa和非免疫抑制劑smbzcsa相比，化合物1抑制ca2+誘導(dǎo)的pt(即增加的crc)的效率顯著更高。與在crc測(cè)定中csa的～40nm相比，化合物1在～10nm顯示出半最大抑制。這些結(jié)果表明，化合物1是一種比csa效力高約4倍的ca2+介導(dǎo)的pt孔開放抑制劑。為了證實(shí)化合物1選擇性地靶向cypd以降低ptp形成的ca2+敏感性，在分離自cypd敲除小鼠的線粒體上測(cè)試化合物的效力。csa和化合物1對(duì)來(lái)自cypdko小鼠的crc均沒有任何影響(參見圖3)，而來(lái)自wt小鼠的線粒體中的crc則因兩種化合物而顯著增加，證明化合物1通過(guò)結(jié)合cypd抑制pt孔開放。實(shí)施例5-對(duì)線粒體膜電位或氧化磷酸化的影響為了評(píng)估化合物的潛在不利影響，我們?cè)赿iv8-9大鼠培養(yǎng)神經(jīng)元和分離線粒體中測(cè)量基本線粒體功能參數(shù)，并在導(dǎo)致pt孔最大抑制濃度之上比較csa和化合物1(分別為>200和40nm)。無(wú)論哪一模型中，線粒體膜電位(圖4a、b)、耗氧量(圖4c、d)和atp產(chǎn)量(圖4e、f)都不受超最大濃度的化合物1(多至200nm)或csa(多至1μm)影響。與其在pt孔上的最大抑制作用(40nm)相比，化合物1僅在高約25倍的濃度(1μm)下抑制神經(jīng)元線粒體膜電位。實(shí)施例6-使用基于hiv的細(xì)胞測(cè)定估計(jì)細(xì)胞cypa活性為了測(cè)試本發(fā)明化合物的細(xì)胞親環(huán)蛋白選擇性，我們進(jìn)行了響應(yīng)于cypa抑制的基于人免疫缺陷病毒(hiv-1)的細(xì)胞測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)表達(dá)包含與人cypa(trim-cypa)融合的含有梟猴三元基序蛋白5(trim5)的rbcc結(jié)構(gòu)域的人工抗病毒蛋白，來(lái)抑制細(xì)胞系的hiv-1感染。在不存在藥物的情況下，trim-cypa抑制病毒感染32倍(圖5a)。csa通過(guò)cypa抑制拯救感染，而化合物1僅在>10μm的濃度下勉強(qiáng)拯救感染(圖5b)。在非限制性細(xì)胞中的感染性降低來(lái)源于5μm及以上的csa的藥物毒性?；衔?在任何測(cè)試濃度下都沒有毒性跡象。實(shí)施例7-藥代動(dòng)力學(xué)在10mg/kgi.p.下的正常abh小鼠中，測(cè)定第2和4小時(shí)的化合物1的藥代動(dòng)力學(xué)。結(jié)果列于下表2中。表2化合物1在第2小時(shí)顯示了10.1μm的高血漿水平和可感知的腦水平(13.2nm)。這與嚙齒動(dòng)物中的csa大體相當(dāng)(schinkeletal,1995)。實(shí)施例8-免疫抑制性質(zhì)在體外檢測(cè)化合物1對(duì)t細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。伴刀豆球蛋白a和促有絲分裂cd3/cd28單克隆抗體誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖反應(yīng)，其通常被在1-10nm范圍內(nèi)的csa抑制(圖6a至c)?；衔?僅在1-10μm范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的免疫調(diào)節(jié)，在100μm下可引起細(xì)胞病變。類似地，在髓磷脂肽(髓磷脂寡糖蛋白殘基35-55)抗原誘導(dǎo)的t細(xì)胞增殖中，與csa相比，化合物1顯示出顯著更低的免疫抑制活性。為了鑒定用于ms模型中的潛在神經(jīng)保護(hù)化合物的非免疫抑制劑量(al-izkietal,2014)，我們采用的模型中，使用耳皮膚致敏物惡唑酮賴在引流耳郭淋巴結(jié)中誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖反應(yīng)，其3天后達(dá)到峰值(bakeretal,2011)?；衔?在該接觸性超敏反應(yīng)模型中的劑量反應(yīng)顯示：每日注射1mg/kg和0.1mg/kgi.p.沒有效果，而10mg/kgi.p.抑制t細(xì)胞應(yīng)答。csa在已知抑制t細(xì)胞增殖和eae的劑量下具有免疫抑制性(圖6d)(o'neilletal,1992)。每日給藥1mg/kgi.p。因此選擇化合物1作為用于體內(nèi)研究的非免疫抑制劑量。實(shí)施例9-化合物1神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)的進(jìn)一步研究為了支持上面在實(shí)施例2中討論的結(jié)果所進(jìn)行的進(jìn)一步研究，支持了來(lái)自實(shí)施例2的結(jié)論。具體地，該結(jié)果受到了客觀的轉(zhuǎn)棒活動(dòng)性結(jié)果支持(圖7a)。動(dòng)物在第27天在第一次緩解期間(168.8±21.8s化合物1對(duì)比161.1±16.0s載體)表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)棒活動(dòng)性，但是在用化合物1處理后，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損失顯著(p<0.001)(圖7a)。在復(fù)發(fā)后的第二次緩解期間，化合物1治療的動(dòng)物在加速的轉(zhuǎn)子上維持了135.0±42.9秒的活動(dòng)性，而以載體處理的動(dòng)物僅為46.3±10.1秒。在該測(cè)定中，該活動(dòng)性與脊髓神經(jīng)含量密切相關(guān)(al-izkietal,2012b)，且發(fā)現(xiàn)化合物1處理的動(dòng)物的脊髓內(nèi)的神經(jīng)(圖7b)和軸突(圖7c)損失明顯少于(p<0.01)載體處理的動(dòng)物。因此，化合物1表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)潛能，并且可以抑制由eae期間的炎癥半暗帶引起的神經(jīng)損失。實(shí)施例10-抑制ca2+介導(dǎo)的pt孔形成的進(jìn)一步研究使用實(shí)施例4中討論的技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。特別地，在兩種不同濃度(40nm和8nm)下測(cè)定化合物1、3和4以及參考化合物1對(duì)ca2+介導(dǎo)的pt孔形成的抑制。40nm的結(jié)果描繪于圖8a中。8nm的結(jié)果描繪于圖8b中。從圖8a顯而易見，在40nm濃度下，化合物1、3和4對(duì)的ca2+介導(dǎo)的pt孔形成顯示出類似水平的抑制。當(dāng)測(cè)試化合物的濃度降至8nm時(shí)，化合物3和4對(duì)ca2+介導(dǎo)的pt孔形成保持高水平抑制，而化合物1在該濃度下顯示了可忽略的抑制。生物方法線粒體分離如先前所述進(jìn)行亞細(xì)胞分離(astinetal,2013)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)頸脫位處死3-6個(gè)月的c57bl/6jwt或cypd(limetal,2011)-/-雄性小鼠，取出肝臟并立即置于冰冷的分離緩沖液(250mm甘露醇，5mmhepes，0.5mmegta，ph7.4)中。在4℃下，以pbs沖洗肝臟以除去過(guò)量血液，并除去任何脂肪和結(jié)締組織。然后用含有1mmpmsf的分離緩沖液替換pbs，將肝臟切成片(長(zhǎng)度約2mm)。然后將組織在該溶液中勻漿，直到不再有固體物質(zhì)，然后在4℃下以800g離心10分鐘。棄去細(xì)胞核核沉淀，保留核后上清液，并在4℃下以10300g再離心10分鐘。棄去線粒體上清液，將線粒體沉淀重懸于分離緩沖液和pmsf中，并保存在冰上。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用thermoscientificbca蛋白質(zhì)定量測(cè)定法定量蛋白質(zhì)水平。鈣保留能力測(cè)定以補(bǔ)充有10mm琥珀酸鹽、1μm魚藤酮和1μmfluo5n的msk緩沖液(75mm甘露醇，25mm蔗糖，5mm磷酸二氫鉀，20mmtris-hcl，100mmkcl和0.1％牛血清白蛋白，ph7.4)將分離的線粒體重懸浮(500μg蛋白/ml)。在96孔微量培養(yǎng)板中使用每孔200μl線粒體懸浮液。將化合物培養(yǎng)10分鐘，然后在fluostaroptima讀板儀中使用480/520nm的ex/em濾光片測(cè)定該板；大約每6.5分鐘注射cacl2，持續(xù)80分鐘(總共12次注射，終濃度為75μm)。為了計(jì)算對(duì)ca2+誘導(dǎo)的孔開放的抑制百分比，計(jì)算每條曲線下的第一面積，并減去作為背景的不含cacl2的對(duì)照。然后將背景校正值表示為無(wú)線粒體對(duì)照的分?jǐn)?shù)，代表未被線粒體緩沖的ca2+的添加總量。然后將每個(gè)[化合物]的抑制百分比計(jì)算為未處理?xiàng)l件的相應(yīng)值的百分比(％)。與csa對(duì)照為對(duì)比通過(guò)單因素方差來(lái)分析評(píng)估顯著性。對(duì)于使用cypd-/-小鼠的實(shí)驗(yàn)，使用每孔100μl線粒體懸浮液。大約每6.5分鐘注射cacl2，持續(xù)135分鐘(總共20次注射，最終濃度為266μm)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正并表示為無(wú)線粒體對(duì)照的分?jǐn)?shù)，然后相對(duì)于野生型無(wú)藥物條件進(jìn)行歸一化。通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。重量測(cè)定如前所述，使用oroborosoxygraph-2k測(cè)量氧消耗(astinetal,2013)。在測(cè)定之前，用miro5緩沖液(0.5mmegta,3mmmgcl2.6h2o,60mmk-乳糖酸鹽，20mm?；撬?，10mmkh2po4,20mmhepes,110mm蔗糖，1g/lbsa(基本上不含脂肪酸))對(duì)oxygraph室進(jìn)行校準(zhǔn)。將分離的線粒體懸浮于miro5(100-200μg/ml)中，與底物(蘋果酸鹽，2mm；谷氨酸鹽，10mm)一起加載到室中，并允許o2流量信號(hào)穩(wěn)定到基礎(chǔ)呼吸速率(約10分鐘)。將化合物以下列濃度和順序加入到室中：dmso/csa/化合物1(指定濃度)，以產(chǎn)生化合物之后的基礎(chǔ)速率(基礎(chǔ)ac)；adp(2.5mm)，以產(chǎn)生狀態(tài)3呼吸；寡霉素(2.5μm)，以產(chǎn)生滲漏呼吸；fccp(滴定以產(chǎn)生最大呼吸容量)；和抗霉素a(2.5μm)，以得到非線粒體呼吸。線粒體膜電位的測(cè)量div8-9大鼠皮層神經(jīng)元與細(xì)胞滲透性陽(yáng)離子染料四甲基羅丹明甲酯(tmrm，25nm)在37℃下培養(yǎng)40分鐘，并使用imagexpressmicroxl系統(tǒng)(moleculardevices)測(cè)量熒光。在加入dmso、csa或化合物1(均為40nm和1μm)之前測(cè)量熒光7分鐘，然后再測(cè)量50分鐘后，加入線粒體解偶聯(lián)劑羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙fccp，5μm)作為陽(yáng)性對(duì)照。記錄加入化合物之后(加入fccp之前)的最小值，并且將其表示為％(使用基線作為100％且fccp作為0％)，然后相對(duì)于dmso(100％)歸一化。以dmso對(duì)照為對(duì)比，通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。線粒體膜電位的測(cè)量(離體)將新鮮分離的小鼠肝線粒體懸浮在含有10μg/ml若丹明123(脫氫模式)的msk緩沖液中，濃度為500μg/ml，并接種在不透明的黑色96孔板中。以fluostaroptima(ex480/em520)每60秒測(cè)量基線熒光5分鐘，然后手動(dòng)添加化合物(指定濃度)。繼續(xù)測(cè)量熒光45分鐘，直到加入2μmfccp，然后再進(jìn)行10分鐘的熒光讀數(shù)。atp生產(chǎn)將新鮮分離的線粒體重懸于1mg/ml的msk緩沖液(含有10mm谷氨酸和2mm蘋果酸)中，并鋪在不透明的白色96孔板中，或者，為了進(jìn)行神經(jīng)元測(cè)定，在以15000個(gè)細(xì)胞/孔鋪板后9天使用神經(jīng)元。以指定濃度加入藥物，且對(duì)于線粒體測(cè)定，培養(yǎng)10分鐘后加入adp(5mm)，然后再培養(yǎng)45分鐘。對(duì)于神經(jīng)元測(cè)定，將藥物加入神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)60分鐘。然后加入celltiterglo試劑，將板在黑暗中搖動(dòng)2分鐘以裂解細(xì)胞/線粒體并釋放atp。將板再培養(yǎng)10分鐘，然后使用optimafluostar讀取發(fā)光值。高含量篩選將hepg2細(xì)胞以每孔3000個(gè)細(xì)胞的密度接種在黑色透明底96孔組織培養(yǎng)板中。將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后暴露于劑量增加的測(cè)試化合物或載體對(duì)照(0.5％dmso)(三個(gè)重復(fù)試樣)下。在進(jìn)行高含量篩選(hcs)測(cè)定之前，將細(xì)胞暴露72小時(shí)。進(jìn)行hcs多重測(cè)定，以確定線粒體膜電位和線粒體質(zhì)量(使用(lifetechnologies))、細(xì)胞色素c釋放(抗體，abcam)、膜通透性、yo-protm-1(lifetechnologies)。還以hoechst33342(lifetechnologies)測(cè)量細(xì)胞計(jì)數(shù)，核大小和dna結(jié)構(gòu)。在hepg2細(xì)胞染色后，通過(guò)使用thermofisherarrayscanvtihighcontentscreeningreader(thermofisherscientificinc.,waltham,ma)和vhcstmview軟件(thermofisherscientificinc.)的圖像采集來(lái)分析熒光。使用10x寬視場(chǎng)物鏡對(duì)每孔20個(gè)場(chǎng)成像。將圖像采集數(shù)據(jù)相對(duì)于載體對(duì)照值歸一化。定義并用下列方程評(píng)估劑量-反應(yīng)曲線：(1)ξ(c；c；ω)≡(ln(c)–c)/ω；(2)t(ξ)≡(1+tanh(ξ))/2；(3)r(t；r0；r∞)≡r0(1-t)+r∞t；其中c表示試驗(yàn)化合物濃度，且r0、r∞、c和ω是擬合參數(shù)。在給定濃度c下的最終響應(yīng)表示為r(t(ξ(c；c；ω))；r0；r∞)。對(duì)其進(jìn)行限制以使得ω>0，這意味著隨著c→0，有r→r0，且隨著c→∞，有r→r∞。計(jì)算每種化合物的測(cè)定系數(shù)(r2)和劑量-反應(yīng)曲線。將大于0.65的r2值用作qc標(biāo)準(zhǔn)，并且在所有響應(yīng)曲線中都需要?；诩?xì)胞的cypa活性測(cè)定如下使用fugene6(roche)對(duì)293t細(xì)胞進(jìn)行三重質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以制備vsv-g假型、gfp編碼的hiv-1載體。用含10μlfugene-6的200μloptimem(gibco)、1μgpmdgvsv-g表達(dá)載體(naldinietal,1996)，1μgp8.91hiv-1的gag-pol表達(dá)載體(zuffereyetal,1997)和1.5μg編碼增強(qiáng)gfp蛋白質(zhì)的慢病毒表達(dá)載體csgw(bainbridgeetal,2001)轉(zhuǎn)染10cm培養(yǎng)皿中的匯合293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集病毒上清液，保存于-80℃下。為了產(chǎn)生從基于exn的載體穩(wěn)定表達(dá)n端ha標(biāo)記trim-cypa的crfk細(xì)胞，使用pmdg、cmvimlvgag-pol表達(dá)載體和編碼包含居于梟猴trim5rbcc(exn-trim-cypa下游的人cypa的融合蛋白的γ轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(ylinenetal,2010)。然后用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于trim5a活性為零的crfk細(xì)胞(mcewanetal,2009)，隨后以1mg/mlg418(invitrogen)選擇細(xì)胞。為了測(cè)試藥物在trim-cypa存在下拯救hiv-1感染的能力，在dmso、csa(0.3-10μm)或化合物1(0.6-20μm)的存在下，用感染約20％細(xì)胞的單劑量病毒感染crfk細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，在感染后48小時(shí)測(cè)量感染性。體外有絲分裂t細(xì)胞刺激從abh小鼠分離脾臟，并通過(guò)細(xì)胞濾器(bdbiosciences，oxford，uk)將組織勻漿到含有10％胎牛血清(fcs，gibco，invitrogen)、2mml-谷氨酰胺(invitrogen，uk)、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(invitrogen)和50μm2-巰基乙醇(invitrogen)的dulbecco's改良eagle培養(yǎng)基(dmem；invitrogen，paisley，uk)中。將細(xì)胞以500g離心5分鐘，并在37℃下培養(yǎng)5分鐘，然后使用0.87％氯化銨裂解紅細(xì)胞。洗滌細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)(sigmaaldrich，poole，uk)排除計(jì)數(shù)活細(xì)胞。將4×10-5細(xì)胞/孔以200μldmem培養(yǎng)基的終體積在96孔微量測(cè)試u底板(falconbd，oxforduk)中培養(yǎng)。將細(xì)胞與csa(sandoz，basel，ch)的十倍稀釋液(范圍為10nm-10μm)或從二甲基亞砜中的50mm儲(chǔ)備液以dmem培養(yǎng)基稀釋的化合物1一起培養(yǎng)。細(xì)胞與以下之一共培養(yǎng)：5μg/ml刀豆蛋白a(cona.misrichaldrich)促分裂原；0.5μg/ml促有絲分裂小鼠cd3和小鼠cd28特異性抗體(pharmingen，oxford，uk)。將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18-22小時(shí)，然后每孔加入1μci3h-胸苷(perkinelmer，ma，usa)。再培養(yǎng)16-20小時(shí)后，將96孔板(microtestu-bottom,falconbd)收獲(harvester96，machiiim，tomtec)到玻璃纖維過(guò)濾器(perkinelmer)上。干燥后，使用熱板(retbasic，ika，germany)將閃爍片(meltilexa；perkinelmer)熔化到過(guò)濾器上。使用閃爍計(jì)數(shù)(microbetaplus，liquidscintillationcounter，perkinelmer，wallacoy，finland)分析樣品，并在至少三個(gè)重復(fù)試樣中評(píng)估3h-胸苷摻入。髓磷脂抗原誘導(dǎo)的t細(xì)胞增殖abh小鼠在第0和7天于側(cè)腹皮下注射在含有200μg結(jié)核分枝桿菌h37ra(difcobacto，mi，usa)的弗氏佐劑中乳化的100μg髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(mog)肽殘基35-55(cambridgeresearchbiochemicalsltd，billingham，uk)(amoretal,1994)。收集脾并如上所述進(jìn)行制備和分析，但使用5μg/mlmog35-55肽代替有絲分裂原，并且在加入氚標(biāo)記胸苷之前將細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)。藥代動(dòng)力學(xué)分析用0.1ml的10mg/kg化合物1對(duì)abh小鼠(n＝4)腹膜內(nèi)注射。在2小時(shí)和4小時(shí)后用過(guò)量co2殺死動(dòng)物，并在死亡后立即從心臟收集血液，并加入microtainer(bd，oxford，uk)管，使用eppindorf微量離心管離心，收集血漿。在去除血液后，從顱骨中快速(<30s)解剖取出大腦，并儲(chǔ)存在-80℃下直到合同研究組織(contractresearchorganisation，cro)進(jìn)行液晶質(zhì)譜分析。體內(nèi)t細(xì)胞增殖將接觸敏化劑4-乙氧基亞甲基-2-苯基-2-惡唑啉-5-酮(惡唑酮，ox，sigma)溶解(25mg/ml)在4:1丙酮：橄欖油(aoo)中。在第0天，小鼠(每組n＝3)耳廓表皮上接受25μl2.5％ox或aoo的應(yīng)用(o'neilletal,1992)。三天后獲取引流耳郭淋巴結(jié)，并如前所述地評(píng)估誘導(dǎo)增殖反應(yīng)。簡(jiǎn)而言之，在補(bǔ)充有0.5mm鈉的谷氨酸rpmi-1640培養(yǎng)基(gibco，invitrogenltd，paisleyuk)中，在37℃、5％co2的加濕氣氛中，在圓底96孔板中以5×105個(gè)細(xì)胞/孔培養(yǎng)過(guò)夜。在每孔中存在1μci3h-thymidine(perkinelmer,ma,usa)。使用如上所述的β閃爍計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)dna合成。從第0天至第3天，動(dòng)物每天腹膜內(nèi)接受載體或化合物1的(o'neilletal,1992)；(al-izkietal,2012a)。結(jié)果表示為平均值±sem胸苷摻入計(jì)數(shù)/分鐘(cpm)。復(fù)發(fā)-進(jìn)行性eae的誘導(dǎo)如前所述(al-izkietal,2012a)，在第0天和第7天用含1mg冷凍干燥小鼠脊髓勻漿物(sch)的弗氏佐劑對(duì)小鼠皮下(s.c.)注射。在最初的麻痹性疾病和隨后的緩解后，通過(guò)在第28天進(jìn)一步注射含sch的弗氏不完全佐劑誘導(dǎo)復(fù)發(fā)，以誘導(dǎo)7天后的復(fù)發(fā)(al-izkietal,2012a)。研究如先前所述地隨機(jī)化、盲化和進(jìn)行(al-izkietal,2012a)。神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分為0＝正常；1＝弱尾，2＝正反射受損，3＝后肢輕癱，4＝后肢完全麻痹，5＝瀕死/死亡(al-izkietal,2012a)。結(jié)果表示為平均值±sem最大或最小神經(jīng)學(xué)評(píng)分和平均開始日±sd。使用mannwhitneyu統(tǒng)計(jì)方法(al-izkietal,2012a)評(píng)估組間差異。在加速(4-40rpm，以6rpm/25s加速)轉(zhuǎn)棒(rotarod，env-575m,medassociatesinc,st.albans,vt,usa)(al-izkietal,2012a))上評(píng)估運(yùn)動(dòng)控制和協(xié)調(diào)性。這在復(fù)發(fā)誘導(dǎo)前一天和在第45天實(shí)驗(yàn)終止時(shí)進(jìn)行。在對(duì)處理不知情的情況下進(jìn)行rotarod評(píng)估?；趓otarod評(píng)分將動(dòng)物隨機(jī)分入載體或處理組。將結(jié)果表示為動(dòng)物保持轉(zhuǎn)棒活動(dòng)性的時(shí)間的平均值±sem。使用studentst檢驗(yàn)評(píng)估組間差異，包括方差和正態(tài)性相等檢驗(yàn)((al-izkietal,2012a)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取出脊髓，并且對(duì)脊髓上的重鏈神經(jīng)絲進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，并且如先前所述地，在對(duì)神經(jīng)絲蛋白標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)后，估計(jì)每個(gè)脊髓的總神經(jīng)含量(jacksonetal,2005)；(al-izkietal,2012a)。神經(jīng)絲elisa如下測(cè)定與脊髓軸索含量相關(guān)的神經(jīng)絲水平。在疾病誘導(dǎo)后第45天，在疾病復(fù)發(fā)后第二緩解期，從未處理(n＝11)和化合物11mg/kg處理(n＝13)的動(dòng)物脊柱收集脊髓。將組織快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃下，然后進(jìn)行勻漿。在玻璃勻漿器中將組織勻漿在加有1:100halt蛋白酶抑制劑混合物(thermofisher，uk)的1ml/100mg脊髓組織濕重勻漿緩沖液(0.2mmpmsf，1mmedta，1mmegta，4m尿素，10mmtris-hclsigmauk，ph7.2)中，并進(jìn)一步通過(guò)超聲處理兩次勻漿各10秒(cole-parmerinstruments，usa)。在臺(tái)式離心機(jī)(eppendorf，uk)中以13000rpm離心樣品，收集上清液并在神經(jīng)絲測(cè)定之前儲(chǔ)存在-80℃下。將樣品在冰上解凍，進(jìn)行重鏈神經(jīng)絲的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。簡(jiǎn)言之，在4℃下將96孔板用涂覆緩沖液(0.15mna2co3,0.35mnahco3,sigma,uk,ph9.6)中的捕獲抗體(1:5000smi-35抗神經(jīng)絲h.covanceinc.cambridgebioscience,cambridge,uk)涂覆過(guò)夜。用洗滌緩沖液(150mmnacl，10mmtris-hcl，0.1％tween20，sigma，ukph7.5)洗滌一次后，通過(guò)與含5％牛血清白蛋白(sigma)的洗滌緩沖液共培養(yǎng)1小時(shí)來(lái)阻斷非特異性結(jié)合。在洗滌步驟后，將樣品和標(biāo)樣(豬神經(jīng)絲重鏈，chemiconinternational，uk)在含有1％牛血清白蛋白的洗滌緩沖液中稀釋，并在室溫下再培養(yǎng)1小時(shí)。在5個(gè)洗滌步驟之后，應(yīng)用檢測(cè)抗體(1:1000兔抗nf200，sigma，uk)，并在室溫下再培養(yǎng)1小時(shí)。將板洗滌5次，并應(yīng)用報(bào)告抗體(1:1000豬抗兔hrp偶聯(lián)物，dako，uk)。在最后5次洗滌之后，應(yīng)用四甲基聯(lián)苯胺底物(sigma，uk)，并在bioteksynergyht(usa)讀板儀上測(cè)量450nm下的顏色產(chǎn)生。過(guò)micro-bca測(cè)定(pierce，thermofisher，uk)測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量，并且每個(gè)樣品中的軸突神經(jīng)絲水平計(jì)算為每個(gè)樣品中每mg總蛋白的μg神經(jīng)絲。smi32/smi35比率如上所述地，用smi35抗磷酸化nf-h或smi32抗非磷酸化nf-h(其為軸索損傷/營(yíng)養(yǎng)不良的標(biāo)志物)(covanceinc.carborbioscience，cambridge，uk)抗體的1：5000稀釋液涂覆96孔板。由于表位的性質(zhì)，無(wú)法獲得smi32反應(yīng)性神經(jīng)絲的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。因此，將nf-hsmi32表示為在以吸光度水平測(cè)量的總神經(jīng)絲中所占的比例，并相對(duì)于每個(gè)樣品中的總蛋白水平進(jìn)行校正。統(tǒng)計(jì)臨床評(píng)分表示為平均每日神經(jīng)學(xué)評(píng)分±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。使用非參數(shù)性mannwhitneyu統(tǒng)計(jì)方法來(lái)評(píng)估臨床得分的差異。使用sigmaplot，通過(guò)包含方差相等檢驗(yàn)的studentst檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)棒活動(dòng)性的差異和定量神經(jīng)絲elisa(systatsoftware,inc.,sanjose,usa)(al-izkietal,2012a)。鈣保留試驗(yàn)：對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正，并將其表示為無(wú)線粒體對(duì)照的分?jǐn)?shù)，然后相對(duì)于野生型無(wú)藥物條件進(jìn)行歸一化為。通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。重量測(cè)定：通過(guò)減去抗霉素a呼吸速率來(lái)分析數(shù)據(jù)，以得到線粒體特異性o2流量，然后表示為基礎(chǔ)o2流量的百分比。以dmso對(duì)照為對(duì)比，通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。線粒體膜電位測(cè)量：將數(shù)據(jù)歸一化，其中以基線為100％、fccp值為0％并相對(duì)于dmso進(jìn)行歸一化。以dmso對(duì)照為對(duì)比，通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。atp產(chǎn)量：相對(duì)于dmso對(duì)照將數(shù)據(jù)歸一化，并通過(guò)單因素方差分析評(píng)估顯著性。參考文獻(xiàn)al-izkis,pryce,o'neillj.k,butterc,giovannonig,amors,bakerd(2012a)practicalguidetotheinductionofrelapsingprogressiveexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinthebiozziabhmouse.multsclerreldis1:29-38al-izkis,pryceg,hankeydj,lidsterk,vonkutzlebensm,brownel,clutterbuckl,posadac,edithchanaw,amorsetal(2014)lesional-targetingofneuroprotectiontotheinflammatorypenumbrainexperimentalmultiplesclerosis.brain:ajournalofneurology137:92-108al-izkis,pryceg,o'neilljk,butterc,giovannonig,amors,bakerd(2012b)practicalguidetotheinductionofrelapsingprogressiveexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinthebiozziabhmouse.multiplesclerosisandrelateddisorders1:29-38amors,groomen,liningtonc,morrismm,dornmairk,gardiniermv,matthieujm,bakerd(1994)identificationofepitopesofmyelinoligodendrocyteglycoproteinfortheinductionofexperimentalallergicencephalomyelitisinsjlandbiozziab/hmice.jimmunol153:4349-4356astinr,benthamr,djafarzadehs,horscroftja,kucre,leungps,skipworthjr,vicenciojm,davenportap,murrayajetal(2013)noevidenceforalocalrenin-angiotensinsysteminlivermitochondria.scientificreports3:2467bainbridgejw,stephensc,parsleyk,demaisonc,halfyarda,thrasheraj,alirr(2001)invivogenetransfertothemouseeyeusinganhiv-basedlentiviralvector；efficientlong-termtransductionofcornealendotheliumandretinalpigmentepithelium.genetherapy8:1665-1668.bakerd,gerritsenw,rundlej,amors(2011)criticalappraisalofanimalmodelsofmultiplesclerosis.multscler17:647-657jacksonsj,pryceg,diemellt,cuznerml,bakerd(2005)cannabinoid-receptor1nullmicearesusceptibletoneurofilamentdamageandcaspase3activation.neuroscience134:261-268limsy,hausenloydj,arjuns,pricean,davidsonsm,lythgoemf,yellondm(2011)mitochondrialcyclophilin-dasapotentialtherapeutictargetforpost-myocardialinfarctionheartfailure.journalofcellularandmolecularmedicine15:2443-2451mcewanwa,schallert,ylinenlm,hosiemj,towersgj,willettbj(2009)truncationoftrim5inthefeliformiaexplainstheabsenceofretroviralrestrictionincellsofthedomesticcat.journalofvirology83:8270-827naldinil,u,gallayp,oryd,mulliganr,gagefh,vermaim,tronod(1996)invivogenedeliveryandstabletransductionofnon-dividingcellsbyalentiviralvector.science272:263-26nikolovskaetal,2004,developmentandoptimizationofabindingassayforthexiapbir3domainusingfluorescencepolarization.analbiochem.332(2):261-73.o'neilljk,bakerd,davisonan,maggonkk,jaffeebd,turkjl(1992)therapyofchronicrelapsingexperimentalallergicencephalomyelitisandtheroleoftheblood-brainbarrier:elu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