本發(fā)明涉及一種包含大花馬齒莧(portulacagrandiflorahook.)提取物或其餾分作為活性成分的用于預防、治療或者減輕神經(jīng)炎癥或者神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物和食品組合物。

背景技術(shù)：

當組織(細胞)受到侵入物(細菌、真菌、病毒、不同類型的過敏原等)損壞或感染的時候，炎癥反應與局部血管和體液內(nèi)不同的炎癥介質(zhì)以及免疫細胞相關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)出一系列復雜的生理反應，例如酶的活化、炎癥介質(zhì)的分泌、體液的滲透、細胞遷移、組織破壞等，以及外部癥狀，例如紅斑、水腫、發(fā)燒、疼痛等。在正常情況中，炎癥反應用于通過去除侵入物并再生損傷的組織來恢復生物體的功能，但是如果抗原未被去除，或者如果由于體內(nèi)物質(zhì)炎癥反應過度或者持續(xù)，其反而會促使黏膜損傷，并由此部分地發(fā)展成例如癌癥等的疾病。

近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)炎癥反應為引起神經(jīng)退化的主要機制之一。也就是說，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的免疫細胞，即小神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以由不同的外因和內(nèi)因物質(zhì)而被活化，并且已活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞生成并釋放例如炎癥細胞因子tnf-α和il-1β、一氧化氮、前列腺素、過氧化物等的物質(zhì)(gao等,jneurochem,81,1285-97,2002；nelson,pt.等,annmed,34,491-500,2002；griffin,w.s.等,jneuroinflammation,3,5,2006)。此類物質(zhì)的產(chǎn)生在短期內(nèi)會引起免疫反應，但是所述物質(zhì)過量或者持續(xù)的產(chǎn)生會引起相鄰神經(jīng)細胞的死亡，從而導致神經(jīng)退化。而且，因為由死亡的神經(jīng)細胞所釋放的物質(zhì)會誘導小神經(jīng)膠質(zhì)細胞再次活化，所以神經(jīng)退化會陷入持續(xù)的惡性循環(huán)。事實上，已經(jīng)報道小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化是與不同的退行性神經(jīng)疾病相關(guān)的，例如阿爾茨海默癥、帕金森病、亨廷頓病、盧·格里克病、克雅二氏病(cjd)、多發(fā)性硬化癥等。

因此，考慮到神經(jīng)炎癥反應在神經(jīng)退行性疾病中的重要性，通過降低促炎介質(zhì)在所述小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的表達水平，使治療可能由此引發(fā)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病成為可能。

同時，大花馬齒莧是馬齒莧屬的一年生草本植物，原產(chǎn)地為南美洲，并由在全世界分布的約40個品種構(gòu)成。大花馬齒莧的完整植株被稱為向天盞(scutellariarivularis)，其已被用作藥物。已經(jīng)報道大花馬齒莧的主要組分黃曲霉素b1和環(huán)磷酰胺對嚙齒動物具有抗突變作用(liu等,中國中藥雜志,1990,640,617-622)。然而，大花馬齒莧在預防或治療神經(jīng)炎癥或者神經(jīng)退行性疾病方面并不存在已知的應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明人為了開發(fā)能夠防止或者治療癡呆的方法已經(jīng)努力進行了大量的研究工作，并且發(fā)現(xiàn)大花馬齒莧提取物或其餾分抑制了神經(jīng)炎癥反應，并且還具有提高和改善記憶力以及學習能力的作用。因此，基于這樣的事實完成本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的一個目的在于提供一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的藥物組合物，用于預防或治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的食品組合物，用于預防或減輕神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病。

本發(fā)明的另一個方面在于提供一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的組合物，用于提高和改善記憶力以及學習能力。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分抑制炎癥相關(guān)因子(例如no，pge2，inos和/或cox-2基因或蛋白)的表達，而不會產(chǎn)生任何副作用，因為提取物或者餾分源自被用作天然醫(yī)藥成分的天然產(chǎn)物。而且，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分可被用于預防或治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病，因為提取物或者餾分在提高和改善記憶力以及學習能力方面具有良好效果。

附圖說明

圖1為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對sh-sy5y神經(jīng)細胞系中大腦神經(jīng)細胞的保護作用的示意圖。

圖2為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中no生成的抑制作用的示意圖。

圖3為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中pge2生成的抑制作用的示意圖。

圖4a和4b為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中inos蛋白和mrna表達的抑制作用的示意圖。

圖5a和5b為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中cox-2蛋白和mrna表達的抑制作用的示意圖。

圖6為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對sh-sy5y神經(jīng)細胞系中β-ctf表達的抑制作用的示意圖。

圖7a和7b為當使用大花馬齒莧甲醇提取物進行處理時，對sh-sy5y神經(jīng)細胞系中bace1表達的抑制作用的示意圖。

圖8a至8d為通過使用y型迷宮試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對工作記憶力的改善作用的示意圖。

圖9a至9d為在東莨菪堿誘導的記憶損傷模型中，使用y型迷宮試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對工作記憶力的改善作用的示意圖。

圖10a至10d為使用避暗試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對記憶力以及學習能力的改善作用的示意圖。

圖11a至11d為在東莨菪堿誘導的記憶損傷模型中，使用避暗試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對記憶力以及學習能力的改善作用的示意圖。

圖12為在aβ25-35誘導癡呆模型中，使用y型迷宮試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對工作記憶力的改善作用的示意圖。

圖13為在aβ25-35誘導癡呆模型中，使用避暗試驗示出大花馬齒莧提取物或其餾分對記憶力和學習能力的改善作用的示意圖。

最佳實施方式

為了實現(xiàn)上述的目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的藥物組合物，用于預防或者治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病。

特別地，根據(jù)本發(fā)明用于預防或者治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物可以包括大花馬齒莧提取物和/或其餾分。

在本發(fā)明中，“大花馬齒莧”為馬齒莧屬的一年生草本植物，原產(chǎn)地為南美洲，并由在全世界分布的約40個品種構(gòu)成。大花馬齒莧的莖為肉質(zhì)的，呈圓柱形并且是紅色的，朝外生長，通常在底部分支，并且對于大的莖來說會延伸至高達30cm的長度。葉為肉質(zhì)的并且是線性的，不具有絨毛，大量的白色絨毛由葉腋長出。一個或兩個或更多個花通常聚集在莖的末端。紅色或者白色的花在夏季開放，并且具有兩個呈寬橢圓形的花杯以及五個具有尖端呈倒卵球形的花瓣。而且，大花馬齒莧的整個植株被稱為向天盞，其已被用作藥物。

在本發(fā)明中，術(shù)語“大花馬齒莧提取物”涉及通過提取大花馬齒莧獲得的提取物。大花馬齒莧提取物為通過使用極性溶劑例如水、具有1(c1)至4(c4)個碳原子的低級醇(例如甲醇、乙醇和丁醇)或者其混合比為約1:0.1至1:10的混合溶劑作為洗脫溶劑，在20至100℃、優(yōu)選室溫的提取溫度下提取大花馬齒莧的地面部分約12小時至4天、優(yōu)選3天的提取周期而獲得的。在本文中，極性溶劑或者混合溶劑的體積為地面部分干重的約2至20倍、優(yōu)選約3至5倍，并且提取使用例如熱水提取、冷提取、回流冷卻提取、或者超聲提取等的提取方法來進行。例如，提取對預防或治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病具有活性的物質(zhì)的任何方法都可以不加限制地使用。優(yōu)選地，大花馬齒莧提取物可以是通過使用冷提取來提取大花馬齒莧1至5次，在真空下過濾所獲得的提取物，并在20至100℃、優(yōu)選室溫下于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下濃縮過濾后的提取物獲得的產(chǎn)物，從而獲得溶解于水、低級醇或者其混合溶劑中的大花馬齒莧粗提取物。提取物的類型可能是有限的，只要根據(jù)本發(fā)明，提取物對預防或治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病具有活性。例如，提取物可以包括所有的提取物，稀釋的或者濃縮的提取物溶液，通過干燥提取物而獲得的干燥物質(zhì)，或者其粗提純產(chǎn)物或提純產(chǎn)物。大花馬齒莧提取物可以從天然的、雜交的和改良的植物的任何部分提取出，并且例如可以由根部、地上部分、莖、花、枝、葉、果實或者植物組織培養(yǎng)物等提取出。

在本發(fā)明中，術(shù)語“餾分”是指通過從包括不同組分的混合物中分離出特定組分或者特定組合的分餾方法所獲得的產(chǎn)物。本發(fā)明的大花馬齒莧餾分可以通過使大花馬齒莧提取物懸浮，并使用極性溶劑(例如水、甲醇、乙醇等)或非極性溶劑(例如己烷、乙酸乙酯等)將提取物分餾至極性溶劑餾分和非極性溶劑餾分中而獲得。特別地，大花馬齒莧餾分可以通過使大花馬齒莧粗制提取物懸浮于蒸餾水等中，以懸浮液體積的約1至100倍、優(yōu)選約1至5倍添加極性或非極性溶劑(例如水、具有1(c1)至4(c4)個碳原子的醇、氯仿、乙酸乙酯、己烷、丁醇或其混合溶劑)，并提取和分離極性或非極性溶劑-可溶層1至10次、優(yōu)選2至5次而獲得。

而且，本發(fā)明的餾分可以通過進一步進行常規(guī)分餾方法來獲得(harbornej.b.plantpathology,1998,3rded.p6-7)。例如，通過使根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物經(jīng)過具有特定截留分子量的超濾膜而獲得的餾分，以及通過進一步進行不同的提純方法、例如通過不同類型的層析法(設計用于根據(jù)大小、電荷、疏水性或親合力的分離)的分離而獲得的活性餾分也被包括在根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧餾分中。

活性餾分為具有更高生理活性的餾分，其為由所述餾分分離出的，并由此稱為活性部分或者有效餾分。具有更高活性的特定活性餾分可以通過由餾分分離出活性組分來制備，其中根據(jù)活性組分的性質(zhì)，使用濃度梯度柱層析法等，通過常規(guī)分餾方法(例如系統(tǒng)分餾)獲得不同的組分。通過使用填料的柱層析法來分離并提純活性餾分，所述填料選自由硅膠、sephadex、lh-20、ods凝膠、rp-18、聚酰胺、toyopearl和xad樹脂組成的組。根據(jù)需要，柱層析法可以使用適當?shù)奶盍线M行數(shù)次，但是本發(fā)明并不限于此。在相關(guān)領(lǐng)域中常用的溶劑、速率或時間適用于在層析法中使用的洗脫溶劑、洗脫速率和洗脫時間。

在本發(fā)明的一種示例性實施方式中，所獲得的大花馬齒莧甲醇提取物通過添加蒸餾水而被懸浮，并添加乙酸乙酯、丁醇或水以分別獲得乙酸乙酯餾分、丁醇餾分或水餾分(實施例1和實施例2)。

根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分可被用于預防或治療由抑制已知為炎癥相關(guān)因子的一氧化氮(no)、前列腺素(pge2)、inos和/或cox-2基因或蛋白的表達引發(fā)的神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的目的。

在本發(fā)明中，術(shù)語“神經(jīng)炎癥”通常是指在神經(jīng)系統(tǒng)(即神經(jīng)細胞、神經(jīng)組織等)中，引起的所有類型的炎癥反應。該術(shù)語包括如下情況：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的免疫細胞，即小神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以由不同的外因和內(nèi)因物質(zhì)活化，從而生成并釋放例如炎癥因子tnf-α和il-1β、一氧化氮、前列腺素、過氧化物等的物質(zhì)。已知的是，所述物質(zhì)的產(chǎn)生在短期內(nèi)引發(fā)免疫反應，但是過量或持續(xù)產(chǎn)生的物質(zhì)會引起相鄰神經(jīng)細胞的死亡，從而導致神經(jīng)退化。

在本發(fā)明的一個試驗實施方式中，發(fā)現(xiàn)大花馬齒莧提取物或其餾分對于預防或治療神經(jīng)炎癥是有效的，通過確認所述提取物或餾分抑制已知為炎癥相關(guān)因子的no，pge2，inos和cox-2蛋白或mrna的表達水平，而不會導致對神經(jīng)細胞的毒性(試驗實施例2)。

而且，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分可用于預防或治療神經(jīng)退行性疾病的目的，通過抑制已知為阿爾茨海默癥相關(guān)酶的β-ctf和β-分泌酶(bace1)的表達。

在本發(fā)明中，術(shù)語“神經(jīng)退行性疾病”通常是指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞中產(chǎn)生不同的退行性變化癥狀的所有類型的疾病，并且特別地包括減退的認知功能、學習能力或者記憶力、或者伴有神經(jīng)炎癥反應的神經(jīng)退行性疾病。根據(jù)本發(fā)明的代表性的神經(jīng)退行性疾病包括癡呆、阿爾茨海默癥、帕金森病、亨廷頓病、盧·格里克病(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥，als)、克雅二氏病(cjd)、中風、多發(fā)性硬化病、認知障礙、學習困難、記憶損傷等。

其中，阿爾茨海默癥(ad)已成為老年性癡呆病中最重要的疾病，并且被認為是由于淀粉樣蛋白β(aβ)的大腦內(nèi)聚集并產(chǎn)生神經(jīng)毒性所導致的。aβ被認為是由于淀粉樣前蛋白(app)與膜蛋白酶(例如β-分泌酶1(bace1)和γ-分泌酶)的連續(xù)作用而形成的。因此，顯然地，阿爾茨海默癥可以通過抑制bace1蛋白的表達而被預防或治療。

在本發(fā)明的一個試驗實施方式中，發(fā)現(xiàn)大花馬齒莧提取物或其餾分具有預防或治療神經(jīng)退行性疾病的作用，通過確認所述提取物或餾分抑制已知為阿爾茨海默癥相關(guān)基因的β-分泌酶-裂解的羧基終端片段(β-ctf)和β-分泌酶1，β-部位app-裂解酶1(bace1)的蛋白或mrna的表達水平(試驗實施例3)。

在本發(fā)明中，術(shù)語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”是指在給藥所述組合物時，所有類型的抑制或延遲神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病發(fā)作的作用，并且術(shù)語“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指在使用所述組合物時，所有類型的改善或減輕由神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病所產(chǎn)生的癥狀的作用。

包括根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分的藥物組合物可以進一步包括適用于在制備藥物組合物時常用的載體、輔料或稀釋液。在這種情況中，在組合物中包括的大花馬齒莧提取物或其餾分并未被特別地限制，但是它們的含量可以是0.001wt％至99wt％，優(yōu)選0.01wt％至50wt％，基于組合物總重量計。

藥物組合物可被制成任意一種選自由片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊、懸浮液、內(nèi)服液體、乳液、糖漿、無菌水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液、凍干試劑、和栓劑組成的組的劑型，并且還可被制成用于口服或者非腸道給藥的不同劑型。當配制的時候，組合物可以使用在相關(guān)領(lǐng)域中常用的稀釋液或輔料來制備，例如填料、疏松劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等。用于口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊等。這樣的固體制劑可以通過混合至少一種輔料(例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、凝膠等)和一種或多種化合物來制備。而且，除了簡單的輔料，還可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石等。用于口服給藥的液體制劑包括懸浮液、內(nèi)服液體、乳液、糖漿等。在這種情況中，液體制劑包括不同的輔料，例如潤濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、防腐劑等，除了常用的簡單稀釋液，例如水、液體石蠟等。用于非腸道給藥的制劑包括無菌水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液、凍干制劑、栓劑等。丙二醇、聚乙二醇和植物油(例如橄欖油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等可被用作為非水性溶劑和懸浮劑。witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可脂、三月桂酸甘油酯脂狀物、甘油明膠等可被用作為栓劑的基底。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了一種預防或治療神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括將藥物組合物給藥至可能患有神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的受試者。

在本發(fā)明中，可能患有神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的受試者涉及所有動物類型，包括已經(jīng)患有所述疾病或者可能患有所述疾病的人類。可以通過將本發(fā)明的藥物組合物給藥至可能患有神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的受試者而對受試者進行有效地治療。所述藥物組合物以及神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病為如上所述的。

在本發(fā)明中，術(shù)語“給藥(administering)”或者“給藥(administration)”是指使用任意合適的方法將本發(fā)明的藥物組合物給藥至可能患有神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的受試者。在這種情況中，所述組合物可以通過口服或者非腸道給藥的不同途徑來給藥，只要使用這些給藥途徑所述組合物可以到達目標組織。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以以藥學上的有效量而被給藥。

在本發(fā)明中，術(shù)語“藥學上的有效量”是指以適用于任何醫(yī)藥治療的合理的利益/風險比足夠治療疾病的量。在這種情況中，有效量的水平可以根據(jù)受試者的類型、嚴重程度、年齡和性別，疾病種類、藥物活性、對藥物的敏感性、給藥時間、給藥途徑、以及分泌速率、治療周期、包括聯(lián)合用藥的因素、和醫(yī)藥領(lǐng)域中已知的其它因素而確定。本發(fā)明的組合物可以作為單獨治療試劑給藥，或者可以與其它治療試劑聯(lián)合給藥。在這種情況中，組合物可以與常規(guī)治療試劑順序或者同時給藥。并且，本發(fā)明的組合物可以單次劑量或者多次劑量給藥?？紤]到所有上述的因素，重要的是，以最小劑量給藥時，以實現(xiàn)最大效果且不產(chǎn)生任何副作用的劑量來給藥組合物。由此，組合物的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物適用于不存在任何特別限制的任何受試者，只要藥物組合物用于神經(jīng)炎癥或者神經(jīng)退行性疾病。例如，任何非人類的動物，例如猴、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、綿羊、豬、山羊等，人類，鳥類和魚類可被使用。藥物組合物可以是非腸道、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，并且根據(jù)需要可以使用包括病灶內(nèi)給藥的適當方法來給藥以用于局部治療。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選劑量可以根據(jù)受試者的狀況和體重、疾病的嚴重程度、藥物形狀、給藥途徑、和給藥周期而不同，但是可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當?shù)剡x擇。例如，藥物組合物可被口服、直腸內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥，或者可以通過肌肉、皮下、子宮頸內(nèi)或者腦血管內(nèi)注射而給藥，但是本發(fā)明并不限于此。

合適的使用組合物的每日總劑量可以通過醫(yī)學判斷范圍內(nèi)的處方來確定。在這種情況中，組合物通常的給藥劑量為0.001至1,000mg/kg，優(yōu)選為0.05至200mg/kg，更優(yōu)選為0.1至100mg/kg，每天一次或數(shù)次。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的食物組合物，用于預防或減輕神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病。

大花馬齒莧提取物和其餾分，以及神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病為如上所述的。

在本發(fā)明中，術(shù)語“減輕(ameliorating)”或者“減輕(amelioration)”是指所有類型的用于改善或者有益于已經(jīng)發(fā)展成的或可能具有如神經(jīng)炎癥的疾病或者神經(jīng)退行性疾病的受試者癥狀的作用，其使用包括大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的組合物來預防或治療。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分可被添加至食物組合物，用于預防或減輕神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的目的。

根據(jù)本發(fā)明的食品組合物可以包括丸劑、粉末、顆粒、浸劑、片劑、膠囊或溶液的形式?？梢蕴砑痈鶕?jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分的食品種類并未被特別地限定，包括例如各種飲料、口香糖、茶、維生素復合物、保健食品等。

除了大花馬齒莧提取物或其餾分，食品組合物還可以添加其它組分，并且其它組分的種類并未被特別地限定。例如，與常規(guī)食品一樣，可以包括各種草本植物提取物、營養(yǎng)學可接受的輔助性食品添加劑、或者天然碳水化合物作為附加組分，但是本發(fā)明并不限于此。

術(shù)語“輔助性食品添加劑”是指可以輔助添加至食物的組分，并由此可被添加以制備用于單獨制劑的健康功能性食物，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當?shù)剡x擇和使用。輔助性食品添加劑的例子包括各種營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))、調(diào)味劑(例如合成和天然調(diào)味劑)、著色劑和填料、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、用于碳酸飲料的碳酸化試劑等，但是根據(jù)本發(fā)明的輔助性食品添加劑的種類并不限于如上所列的輔助性食品添加劑的例子。

天然碳水化合物的例子包括單糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麥芽糖、蔗糖等；多糖，例如糊精、環(huán)糊精等；以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等。除了如上所列的調(diào)味劑，天然調(diào)味劑(奇異果甜蛋白等)、甜葉菊提取物(甜菊雙糖苷a，甘草甜素等)，以及合成調(diào)味劑(糖精、阿斯巴甜等)可被用作為調(diào)味劑。

根據(jù)本發(fā)明的食品組合物可以包括健康功能性食物?！敖】倒δ苄允澄铩笔侵敢云瑒?、膠囊、粉末、顆粒、液體和丸劑的形式制備和加工的食物，其使用功能上對人體有益的原材料或組分。在本文中，術(shù)語“功能性”是指相對于人體的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)營養(yǎng)素的情況，或者實現(xiàn)對健康護理有用的效果，例如生理作用。根據(jù)本發(fā)明的健康功能性食物可以使用在相關(guān)領(lǐng)域中常用的方法來制備，并且可以通過添加在健康功能性食物的制備相關(guān)領(lǐng)域中通常添加的原材料和組分來制備。而且，健康功能性食物具有這樣的優(yōu)點，與常見的藥物不同，因為以食物為原材料，因此健康功能性食物不具有在長期使用藥物時可能會出現(xiàn)的副作用，并且可以是高度便攜的。

可以根據(jù)使用目的(預防疾病、健康療法或者治療性治療)適當?shù)卮_定混合活性成分的量。一般來說，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分的添加量可以是1至50wt％，優(yōu)選5至10wt％，基于制備食物的原材料組合物的總量計，但是本發(fā)明并不限于此。然而，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分用于健康或者衛(wèi)生的目的或者調(diào)節(jié)健康的目的而長期使用時可以使用小于或等于所述量的含量。

食物的種類并未被特別地限定。可添加上述材料的食物的實例可以包括肉、香腸、面包、巧克力、糖果、快餐、糕點、披薩、拉面、其它面條、口香糖、包括冰激凌的乳制品、各種湯、飲料、茶、飲品、酒精飲料和維生素復合物，并且可以包括所有種類的常規(guī)健康功能性食物。

根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供了一種包含大花馬齒莧提取物或其餾分作為活性成分的組合物，用于提高或者改善記憶力和學習能力。

大花馬齒莧及其提取物或餾分為如上所述的。

根據(jù)本發(fā)明的一種試驗實施方式，大花馬齒莧提取物或其餾分在小鼠模型中施用。結(jié)果證實大花馬齒莧提取物或其餾分在y型迷宮試驗中具有提高工作記憶力的作用，并且在避暗試驗中具有提高記憶力的作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的大花馬齒莧提取物或其餾分可被用于提高記憶力和學習能力。在這種情況中，組合物可以是藥物組合物、衛(wèi)生輔助組合物或者食品組合物。

而且，本發(fā)明提供了大花馬齒莧提取物或其餾分用以制備用于預防、治療或減輕神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物或食品組合物的應用。

另外，本發(fā)明提供了大花馬齒莧提取物或其餾分用以制備用于提高或改善記憶力和學習能力的食品組合物的應用。

此外，本發(fā)明提供了一種提高或改善受試者記憶力和學習能力的方法，包括給藥大花馬齒莧提取物或其餾分至需要的受試者。

具體實施方式

在下文，將參考實施例更加詳細地描述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和效用。然而，應當理解的是，下文的實施例僅僅是優(yōu)選實施例，其僅用于說明性的目的，并不意圖限制或限定本發(fā)明的范圍。

1.藥物和試劑

淀粉樣蛋白β25-35(aβ25-35)，二甲基亞砜(dmso)，30％過氧化氫(h2o2)，脂多糖，磷酸，聚-d-賴氨酸，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)，n-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽，磺胺，吐溫-20,東莨菪堿和抗-β-肌動蛋白抗體購自西格瑪化學公司(sigmachemicalco.)(st.louis,mo,美國)。dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)購自hyclone(logan,ut,美國)。胎牛血清(fbs)，0.25％胰蛋白酶-edta和盤尼西林/鏈霉素混合物購自gibco-brl(grandisland,na,美國)。兔抗-兔辣根過氧化物酶連接的igg抗體購自cellsignaling(boston,ma,美國)。兔抗-app，兔抗-bace1，兔抗-cox-2和兔抗-inos抗體購自epitomics(burlingame,ca,美國)，并且trizol，cdna合成試劑盒購自invitrogen(molecularprobes,or,美國)。本發(fā)明使用pge2elisa試劑盒(cayman,mi,美國)。此外，購買最優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品并用作在試驗中使用的試劑。

2.實驗室動物的準備

四周大的icr雄鼠(25至30g)由koatech(gyeonggi-do,韓國)提供，并在成均館大學的藥學院動物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)并適應至少一周，隨后使用。自由供給水和飼料，并且自動控制溫度(23±2℃)、濕度(55±10％)和光/暗周期(12小時)。

<aβ25-35誘導的癡呆模型的制備>

aβ25-35被溶解于最終濃度為1mm的鹽水中，并在37℃下活化5天。其后，使用entobar麻醉4周大的icr雄鼠(25至30g)，并使用立體定位器將6nmol/3μl的aβ25-35注射至左心室內(nèi)。注射后，實驗室動物在37℃或更高的恒定溫度下穩(wěn)定，以恢復。

3.細胞培養(yǎng)

人的成神經(jīng)細胞瘤sh-sy5y細胞，瑞典sh-sy5y(sh-sy5yswedish)轉(zhuǎn)化株細胞和鼠bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞在dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem,hyclone,thermo,美國)中培養(yǎng)，補充滅活的10％胎牛血清(fbs)和抗生素。培養(yǎng)箱被維持在37℃的溫度下，并且95％空氣和5％co2的混合氣體被持續(xù)供給以產(chǎn)生合適的細胞培養(yǎng)條件。在試驗24小時前，于6、24和96孔板中以2.5×10⁴，5×10⁵和1×10⁶個細胞的密度培養(yǎng)細胞。過氧化氫的濃度被設定為400μm，并且lps的濃度被設定為100ng/ml。大花馬齒莧甲醇粗制提取物被溶解于100％dmso中，并以0.1％或更小的最終濃度來使用。

4.統(tǒng)計處理

所有的試驗結(jié)果使用單向方差分析(anova)進行統(tǒng)計處理，并且當測試顯著性時，使用newman-keuls試驗以p<0.05或更小的水平進行顯著性試驗。

實施例1.大花馬齒莧甲醇提取物的制備

收集自中國云南并在陰涼處干燥的大花馬齒莧(分配號：fbm016-068)由韓國生物科學和生物技術(shù)研究所的國際生物材料研究中心分發(fā)和使用。300g干燥的大花馬齒莧被完全干燥并研磨。隨后，300g的大花馬齒莧于3l95％甲醇中在85℃的溫度下反復提取三次，使用真空蒸發(fā)器(eyela,n-1000,日本)在減壓下濃縮，并經(jīng)冷凍干燥以獲得90g大花馬齒莧甲醇粗制提取物。

實施例2.大花馬齒莧餾分的制備

實施例2-1：大花馬齒莧乙酸乙酯餾分的制備

以與實施例1相同的方式由300g的大花馬齒莧獲得的36.3g的大花馬齒莧甲醇粗制提取物懸浮于1l水中，并隨后使用1l乙酸乙酯(etac)提取兩次以獲得8g乙酸乙酯可溶餾分。

實施例2-2：大花馬齒莧丁醇餾分的制備

使用1l丁醇(buoh)再次提取實施例2-1中分餾之后剩余的水層兩次，獲得5.79g的丁醇可溶餾分。

實施例2-3：大花馬齒莧水餾分的制備

在實施例2-2中獲得的大花馬齒莧丁醇可溶餾分的分餾之后剩余的水層被濃縮，以獲得20.55g的水餾分。

每個大花馬齒莧提取物和餾分均使用熱水處理，在減壓下濃縮，并隨后用于試驗。

試驗實施例1：大花馬齒莧提取物對神經(jīng)細胞的保護作用

為了檢查通過大花馬齒莧提取物進行處理后神經(jīng)細胞(sh-sy5y)的活性，使用mtt還原試驗。mtt溶液被添加至96孔板的每個孔，以0.5mg/ml的最終濃度進行試驗。所獲得的混合物在培養(yǎng)箱中反應2小時，并去除培養(yǎng)基和mtt溶液。加入dmso，并攪拌。當dmso完全溶解時，使用酶標儀(moleculardevice,美國)在540nm下測量uv光密度。

細胞活性通過將測得的光密度值代入如下的數(shù)學公式1計算得出。

[數(shù)學公式1]

細胞活性(％)＝(對照組光密度-試驗組光密度)/對照組光密度×100

結(jié)果證實，當單獨使用過氧化氫處理、而不使用大花馬齒莧提取物處理細胞時，細胞活性顯著降低至48％，但使用大花馬齒莧處理細胞時，細胞活性以提取物劑量依賴性方式提高，表明大花馬齒莧提取物具有顯著的神經(jīng)保護作用(圖1)。

試驗實施例2：大花馬齒莧提取物的抗炎癥作用

試驗實施例2-1：大花馬齒莧提取物對一氧化氮(no)生成的抑制作用

為了檢查大花馬齒莧提取物的抗炎作用，對作為炎癥介質(zhì)的no的生成量進行定量測量。具體地，在試驗開始24小時之前，將2.5×10⁵bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞接種在24孔板的每個孔中，并添加100ng/ml的神經(jīng)炎癥誘導物、lps和在實施例1中制備的不同濃度大花馬齒莧提取物，在培養(yǎng)箱中反應24小時。隨后，將50μlgriess試劑(1％磺胺/0.1％n-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽/5％磷酸鹽)添加至每個孔中，并隨后反應15分鐘。然后，使用酶標儀(moleculardevice,美國)在540nm的波長下測量對神經(jīng)炎癥反應的抑制作用。

結(jié)果證實，當使用lps處理細胞時，在bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的no生成量顯著增加，并且通過lps處理而顯著增加的no生成量被大花馬齒莧提取物以劑量依賴性方式抑制(圖2)。

試驗實施例2-2：大花馬齒莧提取物對前列腺素e2(pge2)生成的抑制作用

為了檢查大花馬齒莧提取物的抗炎作用，對作為炎癥介質(zhì)的pge2的生成量進行定量測量。特別地，在試驗24小時前，bv-2小神經(jīng)膠體細胞在24孔板的每個孔中以2.5×10⁵細胞/ml的密度接種，添加100ng/ml的神經(jīng)炎癥誘導物、lps和在實施例1中制備的遞增濃度的大花馬齒莧提取物，并隨后在培養(yǎng)箱中反應24小時。24小時之后，叢每個濃度處理的孔收集上層清液，并且使用離心機使收集的細胞以400g沉淀3分鐘。隨后，使用pge2elisa試劑盒確定細胞濃度，并使用酶標儀(moleculardevice,美國)在490nm下測量uv光密度。使用所測量光密度值繪制的標準曲線定量圖計算pge2產(chǎn)物。

結(jié)果證實，當使用lps處理細胞時，bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中pge2的生成量顯著增加，并且通過lps處理而顯著增加的no生成量被大花馬齒莧提取物以劑量依賴性方式抑制(圖3)。

試驗實施例2-3：大花馬齒莧提取物對inos和cox-2蛋白以及mrna表達的抑制作用

對于通過大花馬齒莧提取物對bv-2小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中神經(jīng)炎癥相關(guān)蛋白和mrna的表達的鑒定試驗，進行western雜交和rt-pcr試驗。進行試驗的6孔板使用大花馬齒莧提取物預處理30分鐘，使用lps處理，并隨后在培養(yǎng)箱中反應6小時或24小時。在6小時或24小時后，從每個濃度處理的孔收集上層清液，并使用離心機使已收集的細胞在400g下沉淀3分鐘，并使用冷pbs沖洗。之后，添加100μl的tper細胞裂解緩沖溶液(thermo,美國)，并裂解細胞30分鐘。使用離心機使溶解產(chǎn)物以10,000g在4℃離心15分鐘。在離心之后，于70℃下儲存上層清液，直至用作試驗樣品。使用bca定量分析試劑盒(thermo,美國)定量分析蛋白，使用8％至12％sds凝膠洗脫，并轉(zhuǎn)移至pvdf膜。為了檢查蛋白的表達，使用增強化學發(fā)光(ecl)進行熒光顯影。首先，所述膜使用5％脫脂奶粉反應1小時，利用一級抗體inos，cox-2和β-肌動蛋白于4℃標記過夜，使用ttbs沖洗五次，并隨后使用辣根過氧化物酶(hrp)共軛的抗兔和抗鼠抗體作為二級抗體在室溫下標記1小時。在標記之后，所述膜使用ttbs沖洗五次，持續(xù)10分鐘。之后，經(jīng)沖洗的膜在x光片上使用ecl顯影。根據(jù)定量分析方法使用定量分析程序(fujifilm,日本)分析濃度。而且，為了檢查mrna表達，使用trizol(invitrogen)提取全長度rna，并使用cdna合成試劑盒(invitrogen)進行rt-pcr。用于inos,cox-2和β-肌動蛋白的引物在rt-pcr中使用。引物的序列在下文的表1中列出。

[表1]

結(jié)果證實，inos和cox-2蛋白以及mrna的表達水平通過lps處理而顯著增加，但是當施用大花馬齒莧提取物時，蛋白和mrna的表達水平會顯著下降(圖4和5)。

試驗實施例3：大花馬齒莧提取物對阿爾茨海默癥相關(guān)基因和蛋白表達的抑制作用

對于通過大花馬齒莧提取物在瑞典sh-sy5y轉(zhuǎn)化株神經(jīng)細胞系中癡呆(阿爾茨海默癥)相關(guān)蛋白和mrna表達的鑒定試驗，對β-ctf和bace1分別進行western雜交和rt-pcr試驗。進行試驗的6孔板使用大花馬齒莧提取物預處理24小時，并隨后在培養(yǎng)箱中進行反應。在24小時后，從每個濃度處理的孔收集上層清液，并使用離心機在400g下沉淀所收集的細胞3分鐘，并使用冷pbs沖洗。隨后，添加100μl的tper細胞裂解緩沖溶液(thermo,美國)，并裂解細胞30分鐘。使用離心機使溶解產(chǎn)物以10,000g在4℃離心15分鐘。在離心之后，于70℃下儲存上層清液，直至用作試驗樣品。

使用bca定量分析試劑盒(thermo,美國)定量分析蛋白，使用12.5％sds凝膠洗脫，并轉(zhuǎn)移至pvdf膜。為了檢查蛋白的表達，使用增強化學發(fā)光(ecl)進行熒光顯影。首先，所述膜使用5％脫脂奶粉反應1小時，利用一級抗體app，β-ctf，bace1和β-肌動蛋白于4℃標記過夜，使用ttbs沖洗五次，并隨后使用辣根過氧化物酶(hrp)共軛的抗兔和抗鼠抗體作為二級抗體在室溫下標記1小時。在標記之后，所述膜使用ttbs沖洗五次，持續(xù)10分鐘。然后，經(jīng)沖洗的膜在x光片上使用ecl顯影。根據(jù)定量分析方法使用定量分析程序(fujifilm,日本)分析濃度。

同時，為了檢查mrna表達，使用trizol(invitrogen)提取全長度rna，并使用cdna合成試劑盒(invitrogen)進行rt-pcr。用于bace1和β-肌動蛋白的引物在rt-pcr中使用。引物的序列在下文的表2中列出。

[表2]

結(jié)果證實，β-分泌酶-裂解的羧基末端片段(β-ctf)蛋白的表達水平被已處理的大花馬齒莧提取物以劑量依賴性方式抑制(圖6)。

已證實，bace1蛋白和mrna的表達水平也被已處理的大花馬齒莧提取物以劑量依賴性方式抑制(圖7a和7b)。

試驗實施例4：大花馬齒莧提取物或其餾分對提高工作記憶力的作用

試驗實施例4-1：使用y型迷宮試驗確認大花馬齒莧提取物或其餾分對提高工作記憶力的作用

將小鼠分為四組，每組由14只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，并且第二至第四組為分別以劑量6.25,12.5和25mg/kg給藥大花馬齒莧提取物或其丁醇、乙酸乙酯和水溶性餾分的組(試驗組)。

將每種大花馬齒莧提取物或其餾分均溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。1小時后，將小鼠置于y型迷宮內(nèi)，并確定小鼠是否自由地進入每個a、b和c臂。在這種情況中，當鼠進入新的臂時會給出一點，并且根據(jù)如下的數(shù)學公式2計算得出交叉行為(crossoverbehavior)(％)。

[數(shù)學公式2]

交叉行為(％)＝[小鼠進入三個臂的次數(shù)/(小鼠進入每個臂的總次數(shù)-2)]×100

結(jié)果證實，與未給藥大花馬齒莧提取物或其餾分的第一組(對照組)鼠相比，給藥大花馬齒莧提取物或其餾分的第二至第四組(試驗組)小鼠中，交叉行為(％)通過大花馬齒莧提取物或其餾分以濃度依賴性方式提高。

這些結(jié)果顯示大花馬齒莧提取物或其餾分在y型迷宮試驗中具有提高工作記憶力的作用。根據(jù)試驗結(jié)果，已證實大花馬齒莧提取物或其餾分顯著地提高了每只小鼠的工作記憶力(圖8a至8d)。

試驗實施例4-2：在東莨菪堿誘導的記憶損傷模型中，使用y型迷宮試驗確認大花馬齒莧提取物或其餾分對改善工作記憶力的作用

將小鼠分為五組，每組由14只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，第二組為給藥東莨菪堿和包含10％吐溫20的蒸餾水的組(陽性對照組)，并且第三至第五組為給藥大花馬齒莧提取物或其丁醇、乙酸乙酯和水溶性餾分的組(試驗組)。

將每種大花馬齒莧提取物或其餾分均溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。30分鐘后，將0.5mg/kg東莨菪堿皮下注射至鼠。

1小時后，將小鼠置于y型迷宮內(nèi)，并確定鼠是否自由地進入每個a、b和c臂。在這種情況中，當小鼠進入新的臂時會給出一點，并且根據(jù)如下的數(shù)學公式2計算得出交叉行為(％)。

[數(shù)學公式2]

交叉行為(％)＝[小鼠進入三個臂的次數(shù)/(小鼠進入每個臂的總次數(shù)-2)]×100

結(jié)果證實，與未給藥東莨菪堿的第一組(對照組)小鼠相比，在給藥東莨菪堿的第二組(陽性對照組)小鼠中，交叉行為(％)有所下降，表明健忘被誘發(fā)。

同時，已證實的是在給藥大花馬齒莧提取物或其餾分的第三至第五組(試驗組)鼠中，交叉行為(％)有所提高。根據(jù)試驗結(jié)果，已證實的是大花馬齒莧提取物或其餾分有效地防止了記憶損傷(圖9a至9d)。

試驗實施例4-3：在aβ25-35誘導的癡呆模型中，使用y型迷宮試驗確認大花馬齒莧提取物對改善工作記憶力的作用

將小鼠分為五組，每組由11至12只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，第二組為給藥aβ25-35和包含10％吐溫20的蒸餾水的組(陽性對照組)，并且第三至第五組為給藥不同濃度的大花馬齒莧提取物的組(試驗組)。

將大花馬齒莧提取物溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。1小時后，使用立體定位器將6nmol的aβ25-35注射至左心室內(nèi)。大花馬齒莧提取物以6.25，12.5和25mg/kg的劑量與包含10％吐溫20的蒸餾水一起給藥每個組的小鼠，持續(xù)5天。

在第五天，于給藥大花馬齒莧提取物1小時后，將鼠置于y型迷宮內(nèi)，并確定小鼠是否自由地進入每個a、b和c臂。在這種情況中，當鼠進入新的臂時會給出一點，并且根據(jù)如下的數(shù)學公式2計算得出交叉行為(％)。

[數(shù)學公式2]

交叉行為(％)＝[小鼠進入三個臂的次數(shù)/(小鼠進入每個臂的總次數(shù)-2)]×100

結(jié)果證實，與未給藥aβ25-35的第一組(對照組)小鼠的交叉行為(67％)相比，給藥aβ25-35的第二組(陽性對照組)小鼠中，交叉行為(52％)有所下降，表明癡呆被誘發(fā)(p<0.01)。

同時，已證實的是與aβ25-35誘導的癡呆模型組(陽性對照組)的小鼠相比，以6.25mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，以12.5mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，和以25mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，交叉行為分別為58％、67％和62％，其數(shù)值顯著地提高。

根據(jù)試驗結(jié)果，已證實的是大花馬齒莧提取物有效地防止了阿爾茨海默癥的記憶損傷(圖12)。

試驗實施例5：大花馬齒莧提取物或其餾分對提高記憶力和學習能力的作用

試驗實施例5-1：使用避暗試驗確認大花馬齒莧提取物或其餾分對提高記憶力和學習能力的作用

將小鼠分為四組，每組由11至12只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，并且第二至第四組為分別以劑量6.25，12.5和25mg/kg給藥大花馬齒莧提取物或其可溶餾分(乙酸乙酯、丁醇和水)的組(試驗組)。

每個大花馬齒莧提取物或其可溶餾分(乙酸乙酯、丁醇和水)均被溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。1小時后，將小鼠置于避暗裝置中，并且在小鼠進入暗箱內(nèi)的時候，通過施加0.25ma電擊3秒來訓練。24小時后，從小鼠被置于燈箱內(nèi)的時間到小鼠返回至暗箱內(nèi)的時間之間的停留時間被測量，并被用作記憶力和學習能力的指標。在這種情況中，小鼠的截止時間被設定為300秒，并隨后與對照組進行比較。

結(jié)果證實，與未給藥大花馬齒莧提取物或其餾分的第一組(對照組)小鼠相比，在給藥大花馬齒莧提取物或其餾分的第二至第四組(試驗組)小鼠的停留時間有所提高。

根據(jù)試驗結(jié)果，已證實的是大花馬齒莧甲醇粗制提取物或其餾分顯著地提高了記憶力和學習能力(圖10a至10d)。

試驗實施例5-2：在東莨菪堿誘導的記憶損傷模型中，使用避暗試驗確認大花馬齒莧提取物或其餾分對改善記憶力和學習能力的作用

將小鼠分為五組，每組由14只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，第二組為給藥東莨菪堿和包含10％吐溫20的蒸餾水的組(陽性對照組)，并且第三至第五組為給藥大花馬齒莧提取物或其可溶餾分(乙酸乙酯、丁醇和水)的組(試驗組)。

將每種大花馬齒莧提取物或其餾分均溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。30分鐘后，將0.5mg/kg的東莨菪堿皮下注射至小鼠。

30分鐘后，將小鼠置于避暗裝置中，并且在小鼠進入暗箱內(nèi)時，通過施加0.25ma電擊3秒來訓練。對于東莨菪堿誘導的健忘，24小時后，從小鼠被置于燈箱內(nèi)的時間到小鼠返回至暗箱內(nèi)的時間之間的停留時間被測量，并被用作記憶力和學習能力的指標。在這種情況中，小鼠的截止時間被設定為300秒，并隨后與對照組進行比較。

結(jié)果證實，與未給藥東莨菪堿的第一組(對照組)小鼠相比，給藥東莨菪堿的第二組(陽性對照組)小鼠的停留時間有所減短，表明健忘被誘發(fā)。

同時，已證實的是給藥大花馬齒莧提取物或其乙酸乙酯、丁醇和水溶性餾分的第三至第五組(試驗組)小鼠的停留時間有所增加。根據(jù)試驗結(jié)果，已證實的是大花馬齒莧甲醇提取物或其餾分有效地防止記憶損傷(圖11a至11d)。

試驗實施例5-3：在aβ25-35誘導的記憶損傷模型中，使用避暗試驗確認大花馬齒莧提取物對改善記憶力和學習能力的作用

將小鼠分為五組，每組由11至12只組成。第一組為給藥包含10％吐溫20的蒸餾水的組(對照組)，第二組為給藥aβ25-35和包含10％吐溫20的蒸餾水的組(陽性對照組)，并且第三至第五組為給藥不同濃度的大花馬齒莧甲醇提取物的組(試驗組)。

將大花馬齒莧提取物溶解于包含10％吐溫20的蒸餾水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的劑量口服給藥小鼠。1小時后，使用立體定位器將6nmol的aβ25-35注射至左心室。大花馬齒莧提取物以6.25，12.5和25mg/kg的劑量與包含10％吐溫20的蒸餾水一起給藥至每個組的小鼠，持續(xù)5天。

1小時后，將小鼠置于避暗裝置中，并且在小鼠進入暗箱內(nèi)時，通過施加0.3ma電擊3秒來訓練。對于aβ25-35誘導的癡呆，24小時后，從小鼠被置于燈箱內(nèi)的時間到小鼠返回至暗箱內(nèi)的時間之間的停留時間被測量，并被用作記憶力和學習能力的指標。在這種情況中，小鼠的截止時間被設定為300秒，并隨后與對照組進行比較。

結(jié)果證實，與未給藥aβ25-35的第一組(對照組)小鼠的停留時間(218秒)相比，給藥aβ25-35的第二組(陽性對照組)小鼠的停留時間(73秒)有所減短，表明健忘被顯著誘發(fā)(p＜0.001)。

同時，已證實的是與aβ25-35誘導的癡呆模型組(陽性對照組)的小鼠相比，以6.25mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，以12.5mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，和以25mg/kg的劑量給藥大花馬齒莧甲醇提取物的組中，停留時間分別為97秒、163秒和153秒，其數(shù)值顯著提高。

根據(jù)試驗結(jié)果，再次證實的是大花馬齒莧提取物有效地防止了阿爾茨海默癥的記憶損傷(圖13)。