合成肽的制作方法
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領(lǐng)域
本文提供包含合成的脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血癥以及其他病狀和疾病的方法。具體地說(shuō)，提供展現(xiàn)出apoa-v的脂酶刺激活性或使其增強(qiáng)的合成肽(av-肽)和擬肽物(av-擬肽物)，以及其使用方法。
背景
在主要藥物市場(chǎng)上超過(guò)35000萬(wàn)人受高甘油三酯血癥(htg)(tg水平>150mg/dl；100mg/dl為正常)的影響，甘油三酯血癥為包括心血管疾病、胰腺炎、糖尿病以及肝性脂肪變性的若干疾病的重要危險(xiǎn)因素。所述群體中約1-2％具有基因遺傳性原發(fā)性htg(>500mg/dltg)，其可為與嚴(yán)重臨床罹病率和死亡率結(jié)果相關(guān)的單基因或多基因病癥。當(dāng)前對(duì)htg的治療具有許多脫靶效應(yīng)并且不足夠滿足患者所建議的目標(biāo)。
概述
本文提供包含合成的脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血癥以及其他病狀和疾病的方法。具體地說(shuō)，提供展現(xiàn)出apoa-v的脂酶刺激活性或使其增強(qiáng)的合成肽(av-肽)和擬肽物(av-擬肽物)，以及其使用方法。
本文提供包含肽或多肽的組合物，所述肽或多肽與seqidno:1(全長(zhǎng)apoa-v)具有低于100％的序列同一性，涵蓋與seqidno:8(av199-224)具有至少50％的序列同一性(例如>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)的部分，并且展現(xiàn)出脂酶刺激活性。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽包含與seqidno:8具有至少80％的序列相似性(例如>80％、>90％、>95％)的部分。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽與seqidno:3(av199-237)具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽與seqidno:3具有至少80％的序列相似性。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽與seqidno:5(av199-232)具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽與天然apoa-v序列(例如seqidno:1或其部分(例如seqidno:5))具有低于100％的序列同一性，但與seqidno:5(av199-232)、seqidno:12(av-h/k)、seqidno:23(av-h/k-2f)、seqidno:26(av-h/k-c6s)、seqidno:27(av-h/k-ac/nh2)以及/或者seqidno:28(av-h/k-2f/har)具有50％或更高的序列同一性(例如>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。
在一些實(shí)施方案中，組合物包含與seqidno:5(av199-232)具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如<100％，但>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)的肽。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:5具有至少50％的序列相似性(例如>50％、>55％、>60％、>65％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:10具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如<100％，但>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:10具有至少80％的序列相似性(例如>80％、>85％、>90％、>95％、100％)。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽具有與seqidno:10具有100％序列同一性的部分。在一些實(shí)施方案中，肽為seqidno:10。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:11具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如<100％，但>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:11具有至少80％的序列相似性(例如>80％、>85％、>90％、>95％、100％)。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽具有與seqidno:11具有100％序列同一性的部分。在一些實(shí)施方案中，肽為seqidno:11。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:12具有低于100％的序列同一性但超過(guò)50％的序列同一性(例如<100％，但>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)。在一些實(shí)施方案中，肽與seqidno:12具有至少80％的序列相似性(例如>80％、>85％、>90％、>95％、100％)。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽具有與seqidno:12具有100％序列同一性的部分。在一些實(shí)施方案中，肽為seqidno:12。
在一些實(shí)施方案中，合成av-肽的長(zhǎng)度為10-50個(gè)氨基酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50以及其中的任何范圍(例如20-48、22-46、24-44、26-42、28-40、30-38、32-36))。在一些實(shí)施方案中，合成av-肽相對(duì)于野生型或天然apoa-v序列在肽的長(zhǎng)度上包含至少1個(gè)突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多以及其中的任何范圍)。在一些實(shí)施方案中，合成av-肽相對(duì)于野生型或天然apoa-v序列在肽的長(zhǎng)度上包含至少1個(gè)非保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多以及其中的任何范圍)。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于野生型或天然apoa-v序列在肽的長(zhǎng)度上包含至少1個(gè)保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多以及其中的任何范圍)。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于野生型或天然apoa-v序列在肽的長(zhǎng)度上包含至少1個(gè)半保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多以及其中的任何范圍)。在一些實(shí)施方案中，提供包含合成av-肽序列的肽或多肽。
在一些實(shí)施方案中，肽與apoa-v中長(zhǎng)度至少為5個(gè)氨基酸(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50以及其中的任何范圍)的部分(例如seqidno:5)具有低于100％但高于50％(例如55％、60％、70％、80％、90％、95％以及其中的任何范圍)的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，肽與apoa-v中長(zhǎng)度至少為10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個(gè)氨基酸的部分(例seqidno:5)具有低于100％但高于50％(例如55％、60％、70％、80％、90％、95％以及其中的任何范圍)的序列同一性。
在一些實(shí)施方案中，提供包含肽和/或多肽的組合物，例如在分別闡述于實(shí)施例1、圖3a-c的描述、圖4a-d的描述以及圖8的描述中的一種或多種分析中，所述肽和/或多肽相對(duì)于seqidno:1(全長(zhǎng)apoa-v)展現(xiàn)出增強(qiáng)的脂酶刺激活性。在一些實(shí)施方案中，肽和/或多肽相對(duì)于seqidno:1展現(xiàn)出增加>10％、增加>20％、增加>30％、增加>40％、增加>50％、增加>60％、增加>70％、增加>80％、增加>90％、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>8倍、>10倍或>20倍的脂酶刺激活性。在一些實(shí)施方案中，提供包含肽和/或多肽的組合物，所述肽和/或多肽相對(duì)于seqidno:5(av199-232)展現(xiàn)出增強(qiáng)的脂酶刺激活性。在一些實(shí)施方案中，例如在分別闡述于實(shí)施例1、圖3a-c的描述、圖4a-d的描述以及圖的描述中的一種或多種分析中，肽和/或多肽相對(duì)于seqidno:5中的一者或兩者展現(xiàn)出增加>10％、增加>20％、增加>30％、增加>40％、增加>50％、增加>60％、增加>70％、增加>80％、增加>90％、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>8倍、>10倍或>20倍的脂酶刺激活性。在一些實(shí)施方案中，肽展現(xiàn)出α-螺旋特性。在一些實(shí)施方案中，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)確定所述肽大體上或完全為α螺旋的。
在一些實(shí)施方案中，本文中的肽和/或多肽包含兩親性α-螺旋。在一些實(shí)施方案中，本文中的兩親性α-螺旋展現(xiàn)出av-199-232肽的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造(參見(jiàn)例如圖11)。在展開本文中的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的3d結(jié)構(gòu)模型化、生物信息和生物化學(xué)以及生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，av199-232肽和其活性變體(以及包含此類肽的多肽)包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述四個(gè)結(jié)構(gòu)是根據(jù)氨基酸類別和α螺旋上的周圍位置(例如在α螺旋的螺旋輪表示中的空間位置)而非根據(jù)一級(jí)序列加以定義。av-199-232以及相關(guān)肽和多肽的結(jié)構(gòu)域?yàn)椋?u>結(jié)構(gòu)域1：a1、r5、r12、l16、k19、23a、30d以及34e；結(jié)構(gòu)域2：r2、c6、k13、k17、a20、r24以及q31；結(jié)構(gòu)域h：s4、t15、h22以及r33；以及結(jié)構(gòu)域l：l3、v7、l10、s11、l14、a18、l21、i25、n28、l29以及l(fā)32。在展開本文中的實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)以及結(jié)構(gòu)域內(nèi)殘基的身份與以下相符合：結(jié)構(gòu)域1和h(以及結(jié)構(gòu)域2)在刺激脂酶活性中起作用，結(jié)構(gòu)域l在脂質(zhì)結(jié)合或相互作用中起作用，并且結(jié)構(gòu)域2在肝素結(jié)合中起作用；然而，本文中的實(shí)施方案不限于任何特定作用機(jī)制并且實(shí)踐此類實(shí)施方案無(wú)需理解所述作用機(jī)制。在一些實(shí)施方案中，本文提供包含合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含具有一定氨基酸序列的大體上α螺旋區(qū)域，所述氨基酸序列中至少24個(gè)氨基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32以及其間的任何范圍)并且不超過(guò)33個(gè)氨基酸與seqidno:5同一或?yàn)樵谄淝闆r下的保守或半保守取代。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽能夠結(jié)合于脂蛋白脂酶(lpl)和/或刺激lpl的脂酶活性。在一些實(shí)施方案中，至少24個(gè)氨基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32以及其間的任何范圍)與seqidno:5同一或?yàn)樵谄淝闆r下的保守取代。在一些實(shí)施方案中，至少24個(gè)氨基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32以及其間的任何范圍)與seqidno:5同一。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽能夠在體外結(jié)合于和/或刺激lpl。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽能夠在體內(nèi)結(jié)合于和/或刺激lpl。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽能夠結(jié)合肝素。
在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的氨基酸：(i)與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一，(ii)為相對(duì)于seqidno:5中對(duì)應(yīng)位置的保守取代，(iii)為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的半保守取代，以及/或者(iv)為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的非保守取代。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的氨基酸：(i)與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一，(ii)為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的保守取代，以及/或者(iii)為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的半保守取代。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的氨基酸：(i)與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一，以及/或者(ii)為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的保守取代。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的氨基酸：(i)與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的不與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一并且除非另外說(shuō)明否則不為特定氨基酸或選自一組氨基酸的任何氨基酸為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的保守取代或半保守取代。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置的不與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一并且除非另外說(shuō)明否則不為特定氨基酸或選自一組氨基酸的任何氨基酸為相對(duì)于seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的保守取代。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含具有成組殘基的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域2)并且包含對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置2、6、13、17、20、24以及31的殘基。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域2能夠結(jié)合于肝素。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基不為半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基為結(jié)構(gòu)域2中僅有的不與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置同一的殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基選自由以下組成的群組：s、t、n以及q。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基為s。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基為t。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置6的殘基選自由y和h組成的群組。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置13和17的一個(gè)或兩個(gè)殘基選自由以下組成的群組：高賴氨酸(hlys)、r、高精氨酸(harg)以及鳥氨酸。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置17的殘基選自由以下組成的群組：q、n以及s。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含具有成組殘基的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域h)，所述結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置4、15、22以及33的殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置22的殘基不為組氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置22的殘基選自由以下組成的群組：k、hlys、r、harg以及鳥氨酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置22的殘基為k。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置22的殘基為hlys。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置4的殘基為s。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置4的殘基選自由以下組成的群組：t、n以及g。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置15和33的殘基分別為t和r。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含具有成組殘基的疏水性結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域l)，所述結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置3、7、10、11、14、18、21、25、28、29以及32的殘基。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)殘基不與seqidno:5的對(duì)應(yīng)位置同一。在一些實(shí)施方案中，將疏水性結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的非極性脂族殘基的一個(gè)或多個(gè)殘基用選自由以下組成的群組的非極性芳族殘基取代：f、y以及w。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置10的殘基為非極性芳族殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置10的殘基為f。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置29的殘基為非極性芳族殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽中對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置29的殘基為f。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽在疏水性結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)于seqidno:5中的位置包含不與在seqidno:5中的對(duì)應(yīng)位置的殘基同一的一個(gè)或多個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少一者為y。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少兩者為y。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少兩者選自由以下組成的群組：f、y以及w。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少一者為f。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少兩者為f。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的兩者為l10f和l29f。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少一者為w。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一位置中的至少兩者為w。在一些實(shí)施方案中，將疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一氨基酸中的至少三者為將非極性脂族氯基酸用選自由以下組成的群組的非極性芳族氨基酸取代：f、y以及w。在一些實(shí)施方案中，疏水性結(jié)構(gòu)域中的非同一氨基酸中的至少一者為將非極性脂族氨基酸用不同的非極性脂族氨基酸取代。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含具有成組殘基的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1)，所述結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)于seqidno:5的位置1、5、12、16、19、23、30以及34的殘基。在一些實(shí)施方案中，將結(jié)構(gòu)域1內(nèi)的對(duì)應(yīng)于seqidno:5的賴氨酸殘基的一個(gè)或多個(gè)殘基用選自由以下組成的群組的殘基取代：r、harg以及hlys。在一些實(shí)施方案中，將結(jié)構(gòu)域1內(nèi)的對(duì)應(yīng)于seqidno:5的精氨酸殘基的一個(gè)或多個(gè)殘基用選自由以下組成的群組的殘基取代：k、hakg以及hlys。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1中的所有殘基與seqidno:5中的對(duì)應(yīng)殘基同一，將除了seqidno:5的一個(gè)或多個(gè)精氨酸或賴氨酸殘基用選自由以下組成的群組的殘基取代：r、k、harg以及hlys。在一些實(shí)施方案中，非同一氨基酸中的至少一者為精氨酸以harg或hlys取代。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含一定序列的肽和多肽，所述序列相對(duì)于以下序列具有10個(gè)或更少(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0或其間的范圍)個(gè)取代(例如保守取代、半保守取代、非保守取代)：ar(l/f/y/w)(s/t/n/g)(r/k/hlys/harg)(c/s/t/n/q/y/h)(v/f/y/w)qv(l/f/y/w)s(r/k/hlys/harg)(k/r/harg/hlys/orn)(l/f/y/w)tl(k/r/harg/hlys/orn)(a/f/y/w)(r/k/hlys/harg)a(l/f/y/w)(h/k/hlys/r/harg/orn)ar(i/f/y/w)qqn(l/f/y/w)dq(l/f/y/w)re(seqidno:29)，但與seqidno:5具有低于100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，本文提供包含一定序列的肽和多肽，所述序列相對(duì)于以下序列具有10個(gè)或更少(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0或其間的范圍)個(gè)取代(例如保守取代、半保守取代、非保守取代)：arx3x4x5x6x7qvx10sx12x13x14tlx17x18x19ax21x22arx25qqnx29dqx32re，其中：x3為l、f、y或w；x4為s、t、n或g；x5為r、k、hlys或harg；x6為c、s、t、n、q、y或h；x7為v、f、y或w；x10為l、f、y或w；x12為r、k、hlys或harg；x13為k、r、harg、hlys或orn；x14為l、f、y或w；x17為k、r、harg、hlys或orn；x18為a、f、y或w；x19為r、k、hlys或harg；x21為l、f、y或w；x22為h、k、hlys、r、harg或orn；x25為i、f、y或w；x29為l、f、y或w；并且x32為l、f、y或w(seqidno:29)，但與seqidno:5具有低于100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，本文提供包含一定序列的肽和多肽，所述序列與seqidno:29具有100％序列同一性，但與seqidno:5具有低于100％的序列同一性。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的合成肽或多肽的組合物，所述合成肽或多肽包含選自由以下組成的群組的n端修飾：脫氨基、n-低碳烷基、n-二低碳烷基、受約束烷基以及n-酰基修飾。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽的c端包含選自由以下組成的群組的修飾：酰胺、低碳烷基酰胺、受約束烷基、二烷基酰胺以及低碳烷基酯修飾。
在一些實(shí)施方案中，本文提供藥物制劑，其包含：(a)本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽；以及(b)生理學(xué)上可接受的緩沖液或載體。在一些實(shí)施方案中，藥物制劑進(jìn)一步包含額外的治療劑(例如用于治療htg、關(guān)節(jié)硬化、膽固醇升高、心臟病等)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供融合肽或多肽，其包含：(a)本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽，以及(b)官能性肽或多肽片段。在一些實(shí)施方案中，官能性肽或多肽片段包含信號(hào)傳導(dǎo)部分、治療性部分、定位部分(例如細(xì)胞引入信號(hào)、核定位信號(hào)等)、可檢測(cè)部分(例如熒光部分、對(duì)比劑)或分離/純化部分(例如鏈霉親和素、his6等)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供編碼本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽的聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本文提供核酸載體(例如質(zhì)粒、桿粒、病毒載體(例如aav))，所述核酸載體包含編碼本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽的聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，載體進(jìn)一步包含啟動(dòng)子和/或一個(gè)或多個(gè)表達(dá)元件(例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯起始位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等)。在一些實(shí)施方案中，提供以下方法，其包括向受試者或樣品施用本文所描述的聚核苷酸或載體(例如用于治療高甘油三酯血癥、用于降低甘油三酯的濃度等)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供治療高甘油三酯血癥或相關(guān)病狀或疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)的方法，所述方法包括向罹患高甘油三酯血癥或所述相關(guān)病狀或疾病的受試者施用本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽。
在一些實(shí)施方案中，本文提供預(yù)防高甘油三酯血癥或相關(guān)病狀或疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)的方法，所述方法包括向(例如家族史、遺傳易感性、升高的甘油三酯、生活方式、年齡、性別等)處于高甘油三酯血癥或所述相關(guān)病狀或疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽。
在一些實(shí)施方案中，本文提供治療或預(yù)防受試者的動(dòng)脈粥樣硬化和/或心血管疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，施用包括共施用：(a)所述肽或多肽，以及(b)用于治療和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和/或心血管疾病的治療和/或治療劑。在一些實(shí)施方案中，同時(shí)和/或以單一藥物制劑的形式施用(a)和(b)。在一些實(shí)施方案中，并行和/或以分開的藥物制劑的形式施用(a)和(b)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供降低樣品中的甘油三酯濃度的方法，所述方法包括：(a)向包含(i)甘油三酯和(ii)甘油三酯水解脂酶的樣品施用本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽；或(b)向包含甘油三酯的樣品施用：(i)本文(例如在前述段落中)所描述的av-肽或多肽，以及(ii)甘油三酯水解脂酶。在一些實(shí)施方案中，甘油三酯水解脂酶選自由以下組成的群組：脂蛋白脂酶(lpl)、內(nèi)皮脂酶(el)以及肝脂酶(hl)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供本文所描述的av-肽或多肽的用途，其用于治療高甘油三酯血癥或相關(guān)病狀或疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)。在一些實(shí)施方案中，本文提供用于用作藥劑的本文所描述的av-肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，本文提供用于治療高甘油三酯血癥或相關(guān)病狀或疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)的av-肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，本文提供本文所描述的av-肽或多肽的用途，其用于制造用于治療高甘油三酯血癥或相關(guān)病狀或疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)的藥劑。
圖式簡(jiǎn)單說(shuō)明
圖1a-d.(a)人類apoa-v蛋白質(zhì)序列(成熟蛋白；uniprot/q6q788；seqidno:1)，突出顯示缺失以及在各種群體中已確定并且與高甘油三酯血癥(htg)相關(guān)的若干突變；(b)殘基199-259內(nèi)的apoa-v功能喪失型突變/缺失簇，其表明此區(qū)域可具有潛在lpl刺激結(jié)構(gòu)域。繪制apoa-v的在殘基199-259內(nèi)成簇的與高甘油三酯血癥和/或cad有關(guān)的所有已知序列變體，突變豎線和星號(hào)表示先前被報(bào)導(dǎo)為降低apoa-v的lpl刺激活性的突變；(c)apoa-v的3d模型(phyre2)預(yù)示結(jié)構(gòu)富含α-螺旋；并且(d)測(cè)試肽av199-237含有推定亮氨酸拉鏈基序(seqidno:20)。
圖2a-b.通過(guò)phyre2預(yù)測(cè)的apoa-v3d結(jié)構(gòu)，突出顯示(ser232_leu235)del和leu253prosnps的位置(a)。由富含作為已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞者(α-螺旋打斷者)的p和a的序列圍住的所示蛋白質(zhì)序列(seqidno:2)(b)。通過(guò)視覺(jué)檢驗(yàn)來(lái)選擇合成肽av199-237(seqidno:3)的范本?；诔墒斓鞍?信號(hào)肽得以移除)來(lái)進(jìn)行肽編號(hào)。
圖3a-c.使用熒光tg類似物enzchek(invitrogen)進(jìn)行的脂蛋白脂酶(lpl)活性分析。酶反應(yīng)混合物由增加濃度的含于100μltris緩沖生理鹽水(tbs)中的lpl、1％bsa(ph7.8)、0.015％zwittergent3-14以及1μmenzchek底物組成。通過(guò)熒光(λex＝482nm，λem＝515nm)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，并且針對(duì)時(shí)間繪制相對(duì)熒光單位(rfu)(a)。使用bodipy標(biāo)記的脂肪酸(bodipy-fa)來(lái)確定在脂酶情況下產(chǎn)生的產(chǎn)物濃度(b)。購(gòu)自invitrogeninc.的enzchek底物(e33955)的結(jié)構(gòu)(c)。
圖4.在肝細(xì)胞(hepg2)和單核細(xì)胞(raw267.4)細(xì)胞系中的脂酶活性分析。在hepg2培養(yǎng)物中，反應(yīng)依賴于tg-底物的細(xì)胞表面接觸。從細(xì)胞中移除反應(yīng)介質(zhì)使產(chǎn)物的進(jìn)一步產(chǎn)生停止，并且使其返回細(xì)胞中使反應(yīng)再起始(a)。用已知從細(xì)胞表面移除脂酶的肝素預(yù)洗滌hepg2細(xì)胞也降低tg-底物的水解速率(b)。細(xì)胞(c)與純lpl(d)均對(duì)不同脂蛋白(vldl、ldl以及hdl)的脫輔基蛋白含量敏感。
圖5.av199-237肽刺激lpl活性，但僅在富tg脂蛋白存在下如此。添加至lpl中的肽(10μm)不增加酶活性(圖片a)，除非首先將肽與vldl或ldl一起孵育(b)。添加vldl或ldl歸因于apoc-iii含量而引起lpl活性降低。將av199-237lpl刺激活性與lpl的另一活化劑apoc-ii肽(c-ii50-79)相比較(c)。雖然av199-237肽在vldl存在下刺激lpl活性，但av250-288并不如此(d、e)。
圖6.av199-237肽有效刺激培養(yǎng)物中活肝細(xì)胞中的肝脂酶(hl)的活性(a)。向細(xì)胞中添加av199-237(10μm)使hl活性增加約2.8倍，并且在監(jiān)測(cè)反應(yīng)的整個(gè)75min時(shí)間段中得以持續(xù)(b)。
圖7.針對(duì)脂酶刺激活性對(duì)av殘基199-288進(jìn)行篩選以確定為刺激lpl活性所必需的最小肽序列。相對(duì)活性以++、+以及-指示。
圖8.確定具有完全脂酶刺激活性(b、d)的最小肽序列(a)。將av199-237縮短5個(gè)殘基成為av199-232產(chǎn)生活性增強(qiáng)，同時(shí)減小長(zhǎng)度另外對(duì)活性具有副作用。通過(guò)添加10μm肽至體外lpl分析物(b)或肝細(xì)胞(hepg2)細(xì)胞培養(yǎng)物(d)中來(lái)進(jìn)行分析。在24孔組織培養(yǎng)板中，將細(xì)胞在37℃下在200μltbs、1.5％bsa、0.2％zwittergent3-14、1μmenzchek底物中孵育1h。av199-232還在已知表達(dá)lpl的活thp-1巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物中具活性(c)。
圖9.av199-232通過(guò)改善lpl對(duì)底物的親和力來(lái)刺激lpl活性。以不同底物濃度(0-25μm)進(jìn)行脂酶反應(yīng)(a、c、d)，以確定在+/-vldl(10μg/ml)和+/-av199-232(2.5μm)情況下的lpl酶活性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。(b)添加vldl將酶對(duì)底物的親和力降低5.3倍，這與由apoc-iii產(chǎn)生的抑制一致。av199-232在v最大和km方面僅顯示邊際變化。av199-232+vldl使lpl的明顯底物親和力增加7.8倍。使用graphpadprism軟件米氏酶動(dòng)力學(xué)方程(michaelis-mentenenzymekineticequation)曲線擬合來(lái)確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
圖10.av199-232為結(jié)合肝素的α-螺旋肽。通過(guò)圓二色性光譜學(xué)以實(shí)驗(yàn)方式分析肽折疊和構(gòu)象(a)并且經(jīng)過(guò)計(jì)算為約42％α-螺旋，其在結(jié)合肝素后增加至約76％。使用phyre2經(jīng)由計(jì)算機(jī)模擬的3d模型化也指示肽可積極地折疊成α-螺旋(b)。
圖11.av199-232的結(jié)構(gòu)表示：(a)3d結(jié)構(gòu)模型，經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)為>88％α-螺旋狀(predictprotein.org)，其與圓二色性分析一致；(b)使用heliquest2從由軟件產(chǎn)生的螺旋輪表示揭示四個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(1、2、h以及l(fā))；以及(c)av199-232的一級(jí)序列，突出顯示在各個(gè)單個(gè)的結(jié)構(gòu)域中的一些所關(guān)注的關(guān)鍵殘基。
圖12.為研究結(jié)構(gòu)域的重要性，合成具有所選殘基取代的肽以單個(gè)地“敲出”結(jié)構(gòu)域。
圖13.在結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2中具有敲出取代的av199-232肽的脂酶刺激(a)和肝素結(jié)合(b)潛能。脂酶活性似乎高度依賴于結(jié)構(gòu)域1與結(jié)構(gòu)域2，同時(shí)肝素結(jié)合需要結(jié)構(gòu)域2。
圖14.將結(jié)構(gòu)域-h中的h殘基用k(av-h/k)取代大體上改善av199-232的脂酶刺激潛能。在不存在vldl的情況下，av-h/k刺激lpl活性達(dá)1.6倍(a/c)。當(dāng)在添加至lpl之前與vldl一起孵育時(shí)，av-h/k刺激lpl活性達(dá)8倍，相對(duì)于av199-232增加44％(b/d)。所有肽均在10μm濃度下進(jìn)行比較。
圖15.av199-232結(jié)合vldl(a)并且肽-脂蛋白復(fù)合物刺激lpl活性(b)。
圖16.調(diào)整脂質(zhì)-結(jié)合面改善脂酶刺激性能。
圖17.對(duì)進(jìn)行脂酶刺激活性測(cè)試的示例性av-肽的概述。序列被顯示對(duì)脂酶活性具有相對(duì)影響。
圖18.用于評(píng)估av-199-232(seqidno:5)殘基對(duì)脂酶刺激活性的相對(duì)影響的丙氨酸掃描。
圖19.通過(guò)使用phyre2的基于同源性的模型化繼之以在galaxyweb進(jìn)行的分子改進(jìn)來(lái)產(chǎn)生lpl和av-199-232的3d結(jié)構(gòu)。
圖20.使用cluspro2.0進(jìn)行的apoc-iii與lpl的分子對(duì)接(b)。
圖21.使用cluspro2.0進(jìn)行的av199-232與lpl的分子對(duì)接。
圖22.對(duì)穩(wěn)定lpl:av199-232相互作用的接觸殘基的分子模型化預(yù)測(cè)。
圖23.(a-c)白細(xì)胞-lpl活性為可檢測(cè)的并且對(duì)av199-232肽刺激有反應(yīng)。(d)在正常和脂代謝異常血漿存在下，av199-232刺激lpl活性。
定義
如本文所用，除非另外明確陳述，否則將以下術(shù)語(yǔ)定義為具有以下含義。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸類似物，除非另外指出，否則所有均呈其d和l立體異構(gòu)體形式(如果其結(jié)構(gòu)允許此類立體異構(gòu)形式)。
天然氨基酸包括丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷酰胺(gln或q)、谷氨酸(glu或e)、甘氨酸(gly或g)、組氨酸(his或h)、異亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、賴氨酸(lys或k)、甲硫氨酸(met或m)、苯基丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、絲氨酸(ser或s)、蘇氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)以及纈氨酸(val或v)。
非天然氨基酸包括但不限于吖丁啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸，叔丁基甘氨酸(“tbug”)、2,4-二氨基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、高脯氨酸(“hpro”或“homop”)、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸(”3hyp”)、4-羥基脯氨酸(“4hyp”)、異鎖鏈素、別異亮氨酸、n-甲基丙氨酸(“meala”或“nime”)、n-烷基甘氨酸(“nag”)(包括n-甲基甘氨酸、n-甲基異亮氨酸)、n-烷基戊基甘氨酸(“napg”)(包括n-甲基戊基甘氨酸)、n-甲基纈氨酸、萘基丙氨酸、正纈氨酸(“norval”)、正亮氨酸(“norleu”)、辛基甘氨酸(“octg”)、鳥氨酸(“orn”)、戊基甘氨酸(“pg”或“pgly”)、哌啶酸、硫代脯氨酸(“thiop”或“tpro”)、高賴氨酸(“hlys”)以及高精氨酸(“harg”)。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸類似物”是指其中c端羧基、n端氨基以及側(cè)鏈官能團(tuán)中的一者或多者已被可逆或不可逆化學(xué)阻斷或以其他方式加以修飾成為另一官能團(tuán)的天然或非天然氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，天冬氨酸-(β-甲酯)為天冬氨酸的氨基酸類似物；n-乙基甘氨酸為甘氨酸的氨基酸類似物；或丙氨酸甲酰胺為丙氨酸的氨基酸類似物。其他氨基酸類似物包括甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、s-(羧甲基)-半胱氨酸、s-(羧甲基)-半胱氨酸亞砜以及s-(羧甲基)-半胱氨酸砜。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽”涉及通過(guò)肽鍵鍵聯(lián)在一起的氨基酸的短聚合物。與其他氨基酸聚合物(例如蛋白質(zhì)、多肽等)相比之下，肽的長(zhǎng)度為約50個(gè)氨基酸或更短。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸類似物以及/或者修飾過(guò)的氨基酸。肽可為天然存在的蛋白質(zhì)的子序列或非天然(合成)序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“突變肽”是指肽的變體，所述肽的變體具有不同于自然界中存在的稱為“野生型”序列的大多數(shù)常見(jiàn)變體的氨基酸序列。突變肽可為突變蛋白質(zhì)或多肽的子序列(例如天然存在的蛋白質(zhì)的不為自然界中的最常見(jiàn)序列的子序列)，或可為不為天然存在的蛋白質(zhì)或多肽的子序列的肽。舉例來(lái)說(shuō)，“突變apoa-v肽”可為apoa-v的突變型式的子序列或可為在天然存在的apoa-v蛋白中未發(fā)現(xiàn)的不同序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“合成肽”是指具有與在天然肽和/或蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不同的氨基酸序列的肽。合成蛋白不為天然存在的蛋白質(zhì)的子序列，既非野生型(即最豐富者)也非其突變型式。舉例來(lái)說(shuō)，“合成apo-v肽”(“sav肽”)不為天然存在的apoa-v的子序列?？赏ㄟ^(guò)任何適合的方法(例如重組表達(dá)、化學(xué)合成、酶促合成等)來(lái)制備或合成如本文所用的“合成肽”。
術(shù)語(yǔ)“肽擬似物”或“擬肽物”是指仿效衍生自蛋白質(zhì)或肽的序列的肽樣分子。肽擬似物或擬肽物可含有氨基酸和/或非氨基酸組分。擬肽物的實(shí)例包括化學(xué)修飾肽、類肽(側(cè)鏈附加至肽主鏈的氮原子，而非α-碳)、β-肽(氨基鍵合至β碳，而非α碳)等。
如本文所用，“保守”氨基酸取代是指將肽或多肽中的氨基酸用具有類似化學(xué)性質(zhì)(諸如尺寸或電荷)的另一氨基酸取代。出于本公開的目的，以下八種基團(tuán)各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(a)與甘氨酸(g)；
2)天冬氨酸(d)與谷氨酸(e)；
3)天冬酰胺(n)與谷酰胺(q)；
4)精氨酸(r)與賴氨酸(k)；
5)異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)以及纈氨酸(v)；
6)苯基丙氨酸(f)、酪氨酸(y)以及色氨酸(w)；
7)絲氨酸(s)與蘇氨酸(t)；以及
8)半胱氨酸(c)與甲硫氨酸(m)。
天然存在的殘基可基于共同側(cè)鏈性質(zhì)劃分成多個(gè)類別，例如：正極性(組氨酸(h)、賴氨酸(k)以及精氨酸(r))；負(fù)極性(天冬氨酸(d)、谷氨酸(e))；中性極性(絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、天冬酰胺(n)、谷酰胺(q))；非極性脂族(丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)、異亮氨酸(i)、甲硫氨酸(m))；非極性芳族(苯基丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w))；脯氨酸和甘氨酸；以及半胱氨酸。如本文所用，“半保守”氨基酸取代是指將肽或多肽中的氨基酸用同一類別內(nèi)的另一氨基酸取代。
在一些實(shí)施方案中，除非另作說(shuō)明，否則保守或半保守氨基酸取代還可涵蓋具有與天然殘基類似的化學(xué)性質(zhì)的非天然存在的氨基酸殘基。典型地通過(guò)化學(xué)肽合成而非通過(guò)在生物系統(tǒng)中合成來(lái)合并這些非天然殘基。這些包括但不限于擬肽物和其他反向或顛倒形式的氨基酸部分。在一些實(shí)施方案中，本文中的實(shí)施方案可限于天然氨基酸、非天然氨基酸以及/或者氨基酸類似物。
非保守取代可涉及一個(gè)類別的成員換成另一類別的成員。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”是指兩個(gè)聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)具有單體相同的連續(xù)亞單位組合物所達(dá)到的程度。術(shù)語(yǔ)“序列相似性”是指兩個(gè)聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)僅因保守和/或半保守氨基酸取代而不同的程度。如下計(jì)算“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)：(1)在比較視窗(例如較長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度、較短序列的長(zhǎng)度、指定視窗等)上比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列，(2)確定含有同一(或相似)的單體(例如在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同氨基酸、在兩個(gè)序列出現(xiàn)相似氨基酸)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，(3)將匹配位置的數(shù)目除以比較視窗(例如較長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度、較短序列的長(zhǎng)度、指定視窗)中的位置的總數(shù)目，并且(4)將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比或序列相似性百分比。舉例來(lái)說(shuō)，如果肽a與b的長(zhǎng)度均為20個(gè)氨基酸并且在除1處以外的所有位置具有同一的氨基酸，那么肽a與肽b具有95％序列同一性。如果在非同一位置的氨基酸共有相同生物物理特性(例如兩者均為酸性)，那么肽a與肽b將具有100％序列相似性。作為另一實(shí)例，如果肽c的長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸并且肽d的長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸，并且肽d中的15個(gè)氨基酸中有14個(gè)與肽c的一部分的那些氨基酸同一，那么肽c與d具有70％序列同一性，但肽d與最佳比較窗口的肽c具有93.3％序列同一性。出于本文中計(jì)算“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)的目的，將比對(duì)序列中的任何空位視為在所述位置處失配。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“成組殘基”是指肽、多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)在三維空間中物理地安置在一起的一組氨基酸。成組殘基在肽、多肽或蛋白質(zhì)的一級(jí)序列中可能為或可能不為連續(xù)的。殘基可在球形結(jié)構(gòu)域中成組，可存在于相同表面上，或可存在于肽、多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如α螺旋)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的相同末端或側(cè)。在一些實(shí)施方案中，除物理地安置在一起之外，成組殘基還在殘基特性(例如尺寸、極性電荷等)方面展現(xiàn)出一定程度的相似性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受試者”泛指任何動(dòng)物，包括但不限于人類和非人類動(dòng)物(例如犬、貓、牛、馬、羊、家禽、魚、甲殼動(dòng)物等)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“患者”典型地指正進(jìn)行疾病或病狀治療的受試者。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指組合物(例如合成肽)足以實(shí)現(xiàn)有益或所需結(jié)果的量?？梢砸淮位蚨啻问┯?、施加或劑量施用有效量并且不旨在限于特定配制品或施用途徑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“施用(administration/administering)”是指向受試者或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織以及器官給予藥物、前藥或其他藥劑或治療性治療(例如合成肽)的動(dòng)作。示例性人體施用途徑可為通過(guò)在腦或脊髓的蛛網(wǎng)膜下的間隙(鞘內(nèi))、眼睛(眼部)、口腔(經(jīng)口)、皮膚(局部或經(jīng)皮)、鼻(鼻內(nèi))、肺(吸入)、口腔粘膜(頰內(nèi))、耳、直腸、陰道；通過(guò)注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)等)等。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共施用(co-administration/co-administering)”是指向受試者施用至少兩種藥劑(例如多種合成肽或合成肽與另一治療劑)或治療。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種藥劑或治療的共施用為并行的。在其他實(shí)施方案中，第一藥劑/治療是在第二藥劑/治療之前施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，所用的各種藥劑或治療的配制品和/或施用途徑可變化。用于共施用的適當(dāng)劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共施用藥劑或治療時(shí)，以低于適合其單獨(dú)施用的劑量施用相應(yīng)藥劑或治療。因此，在共施用藥劑或治療使?jié)撛谟泻?例如毒性)藥劑的必需劑量降低的實(shí)施方案中，以及/或者當(dāng)共施用兩種或更多種藥劑使得受試者對(duì)所述藥劑中的一者經(jīng)由共施用另一藥劑而得到的有益作用敏感時(shí)，尤其需要共施用。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”意謂獲得有益或預(yù)期臨床結(jié)果的方法。有益或預(yù)期臨床結(jié)果可包括癥狀減輕、疾病嚴(yán)重程度降低、抑制疾病或病狀的潛在病因、使處于非晚期狀態(tài)的疾病穩(wěn)定、延遲疾病進(jìn)展以及/或者改善或減輕疾病病狀。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指活性劑(例如合成av肽)與惰性或活性載體的組合，所述組合使得組合物尤其適合用于體外、體內(nèi)或離體診斷或治療用途。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受”或“藥理學(xué)上可接受”是指組合物當(dāng)向受試者施用時(shí)不大體上產(chǎn)生有害反應(yīng)，例如毒性、過(guò)敏或免疫反應(yīng)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指標(biāo)準(zhǔn)藥物載體中的任一者，包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如諸如油/水或水/油乳液)以及各種類型的潤(rùn)濕劑、任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、月桂基硫酸鈉、等滲和吸收延遲劑、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)等。組合物還可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。關(guān)于載體、穩(wěn)定劑以及助劑的實(shí)例，參見(jiàn)例如martin,remington'spharmaceuticalsciences,第15版,mackpubl.co.,easton,pa.(1975)，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受約束烷基”是指分枝鏈、環(huán)狀、稠合烷基以及金剛烷基。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低碳烷基”是指c1至c4烷基(例如甲基、乙基、丙基以及丁基)。
本文中的許多實(shí)施方案是使用開放性“包含”措辭加以描述。此類實(shí)施方案涵蓋多個(gè)封閉性的“由……組成”和/或“基本上由……組成”實(shí)施方案，這些實(shí)施方案可替代地使用此類措辭來(lái)進(jìn)行要求或描述。
詳細(xì)說(shuō)明
本文提供包含合成的脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血癥以及其他病狀和疾病的方法。具體地說(shuō)，提供展現(xiàn)出apoa-v的脂酶刺激活性或使其增強(qiáng)的合成肽(av-肽)和擬肽物(av-擬肽物)，以及其使用方法。
本文提供合成肽(apoa-v肽或同義詞av-肽)，在本文所描述的分析中的一者或多者中，所述合成肽刺激包括以下各項(xiàng)的脂酶子集的甘油三酯(tg)水解活性：脂蛋白脂酶(lpl)、內(nèi)皮脂酶(el)以及肝脂酶(hl)(例如相對(duì)于seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5等達(dá)到至少2倍(例如>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍或更多倍，或其中的范圍))。這些脂酶為細(xì)胞表面酶，其例如降低血漿中的循環(huán)tg的濃度。這些脂酶(例如lpl、el、hl等)對(duì)酶活性的刺激使得血漿tg水平降低并且為稱為高甘油三酯血癥(htg)的臨床上升高的tg提供高度特異性治療性治療。
甘油三酯(也為三酰甘油，tg)為由通過(guò)酯鍵鍵聯(lián)的甘油和3-脂肪酸組成的一類脂質(zhì)。tg為植物油和動(dòng)物脂肪的主要成分，并且在所有大量營(yíng)養(yǎng)素中脂肪酸的能量密度最大，與碳水化合物(例如葡萄糖和糖原)相比含有約2.2倍多的卡路里能量。在人類中，血漿tg濃度通常維持在約100-150mg/dl。然而，在最近30年以來(lái)，tg水平已穩(wěn)定上升，并且目前據(jù)估計(jì)在工業(yè)化世界中約三分之一的人口具有長(zhǎng)期升高的血漿tg(>150mg/dl)。這種稱為高甘油三酯血癥(htg)的病狀可具有許多病因，包括生活方式/飲食、藥物以及遺傳，并且它是以下疾病的被認(rèn)可的危險(xiǎn)因子：冠狀動(dòng)脈疾病(cad)(包括缺血性中風(fēng)、心臟病)、代謝綜合征以及胰腺炎(>500mg/dl)(do,r.等人,(2013)nat.genet.45,1345-1352；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。還充分表明高甘油三酯血癥(htg)為發(fā)展以下疾病的危險(xiǎn)因子：胰島素抗性和糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)以及癌癥。雖然不清楚確切機(jī)制，但高甘油三酯血癥(htg)與ldl-膽固醇增加和hdl-膽固醇降低有關(guān)，這還促成促粥樣硬化血脂異常并且可能是歸因于削弱的脂蛋白加工。可將htg患者劃分成具有不同嚴(yán)重程度的類別，并且在許多臨床研究中已估計(jì)了所述群體中歸入這些類別中的百分比(do,r.等人,(2013)nat.genet.45,1345-1352；ford等人(2009)arch.intern.med.169,572-578；christian等人(2011)am.j.cardiol.107,891-897；這些文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。
tg主要是通過(guò)脂酶家族(脂蛋白脂酶(lpl)、內(nèi)皮脂酶(el)以及肝脂酶(hl))的酶促作用從循環(huán)中清除，所述脂酶是通過(guò)與硫酸乙酰肝素的高親和力相互作用而拴系至細(xì)胞表面。這些脂酶又在循環(huán)中結(jié)合富tg脂蛋白(乳糜微粒、vldl、ldl以及hdl)并且將其tg水解成游離脂肪酸和單?；视?，這些物質(zhì)容易由細(xì)胞吸收并代謝。脂酶活性受許多與脂蛋白締合的可交換脫輔基脂蛋白(apo)的影響?；蛟S最佳表征者為apoc-ii和apoc-iii，apoc-ii和apoc-iii分別刺激和抑制脂酶活性。
在一些實(shí)施方案中，本文提供用于治療或預(yù)防以下中的一者或多者的組合物、試劑盒、系統(tǒng)以及/或者方法：高甘油三酯血癥、甘油三酯水平增加、心血管疾病、關(guān)節(jié)硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性以及/或者相關(guān)疾病和病狀。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)本文所描述的組合物和方法來(lái)活化甘油三酯的水解。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)本文所描述的組合物和方法來(lái)活化甘油三酯水解蛋白(例如脂蛋白脂酶(lpl)、內(nèi)皮脂酶(el)以及肝脂酶(hl))以及/或者通道。在一些實(shí)施方案中，組合物和方法是用于治療和/或預(yù)防：高甘油三酯血癥、甘油三酯水平增加、心血管疾病、關(guān)節(jié)硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性以及/或者相關(guān)疾病和病狀。在一些實(shí)施方案中，組合物和方法是用于篩選適合用于治療和/或預(yù)防以下疾病的肽和多肽：高甘油三酯血癥、甘油三酯水平增加、心血管疾病、關(guān)節(jié)硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性以及/或者相關(guān)疾病和病狀。
在一些實(shí)施方案中，本文提供用于治療或預(yù)防高甘油三酯血癥、甘油三酯水平增加以及/或者相關(guān)疾病和病狀的藥物組合物、肽、蛋白質(zhì)、多肽、編碼肽的核酸、蛋白質(zhì)和多肽、前述物質(zhì)的分子復(fù)合物等。在一些實(shí)施方案中，本文提供av-肽和多肽(例如包含低于100％序列同一性的全長(zhǎng)apoa-v(seqidno:1)，或全長(zhǎng)apoa-v的片段(例如seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8或其截短型式)等)。在一些實(shí)施方案中，肽為合成肽。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備本文所描述的多肽或肽。舉例來(lái)說(shuō)，可使用固相多肽合成技術(shù)(例如fmoc或boc化學(xué))來(lái)合成肽或多肽?；蛘撸墒褂弥亟Mdna技術(shù)(例如使用細(xì)菌或真核表達(dá)系統(tǒng))來(lái)制備肽或多肽。另外，肽或多肽可在受試者內(nèi)(例如在施用適當(dāng)載體之后)得到表達(dá)。因此，為促進(jìn)此類方法，本文提供包含編碼多肽的序列的遺傳載體(例如質(zhì)粒、病毒載體(例如aav)等)，以及包含此類載體的宿主細(xì)胞。此外，本文提供經(jīng)由此類方法制備的肽和多肽。
在一些實(shí)施方案中，提供基于apoa-v的肽和多肽以及與其相關(guān)的組合物(例如基于apoa-v的肽和多肽的擬似物、編碼基于apoa-v的肽和多肽的核酸等)的施用。在一些實(shí)施方案中，本文提供肽和多肽的施用，所述肽和多肽增強(qiáng)三酰甘油降解(例如水解等)或?yàn)楸疚闹辛硗馑枋觥４祟愲暮投嚯牡膶?shí)例包括選自由以下組成的群組的那些：seqidno.2-seqidno.29。在一些實(shí)施方案中，提供包含以下序列或由其組成的肽或多肽：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29。在一些實(shí)施方案中，提供與以下中的一者具有至少50％的序列同一性(例如至少60％的序列同一性、至少70％的序列同一性、至少80％的序列同一性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性等)的肽或多肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29。在一些實(shí)施方案中，肽和多肽相對(duì)于野生型序列(例如seqidno:1-seqidno:8)包含至少一種突變。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽包含：arlsrcvqvlsr(x1)ltl(x2)akal(x3)ariqqnldqlre，其中x1、x2以及x3獨(dú)立地為任何氨基酸(seqidno:15)；arlsrcvqvlsr(b1)ltl(b2)akal(b3)ariqqnldqlre，其中b1、b2以及b3獨(dú)立地為任何酸性和/或帶電荷氨基酸(seqidno:16)；arlsrcvqvlsr(k/q)ltl(k/q)akal(h/k/q)ariqqnldqlre，(seqidno:17)。在一些實(shí)施方案中，本文提供如下方法，所述方法包括施用(例如向受試者、向細(xì)胞、向樣品等)以上所提到的apoa-v肽或多肽中的一者或多者。
在展開本文中的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)av199-232(seqidno:5)為用于最佳誘導(dǎo)lpl活性的apoa-v的最小部分(seqidno:1)。包括生物化學(xué)突變分析、計(jì)算機(jī)研究、分子模型化以及丙氨酸掃描的實(shí)驗(yàn)指示av199-232的(1)與脂酶刺激最低程度相關(guān)、(2)與脂酶刺激適度相關(guān)以及(3)與脂酶刺激高度相關(guān)的各種殘基。實(shí)驗(yàn)還指示其中相對(duì)于天然av199-232序列的取代提供(或可提供)av-肽的一個(gè)或多個(gè)特性(例如lpl活化、溶解度、脂質(zhì)結(jié)合、肝素結(jié)合等)的增強(qiáng)的某些殘基。在一些實(shí)施方案中，提供包含具有一個(gè)或多個(gè)非天然取代的av199-232序列(例如seqidno:5)的av-肽。
在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激最低程度相關(guān)的位置包含保守、半保守以及/或者非保守取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激最低程度相關(guān)的位置包含保守和/或半保守取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激最低程度相關(guān)的位置包含保守取代。
在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激適度相關(guān)的位置包含保守、半保守以及/或者某些非保守取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激適度相關(guān)的位置包含保守和/或半保守取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激適度相關(guān)的位置包含保守取代。
在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激高度相關(guān)的位置包含保守、半保守取代以及/或者不包含取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激高度相關(guān)的位置包含保守取代以及/或者不包含取代。在一些實(shí)施方案中，av-肽相對(duì)于seqidno:5在本文中的數(shù)據(jù)指示與脂酶活性刺激高度相關(guān)的位置不包含取代。
在一些實(shí)施方案中，在展開本文中的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的各種實(shí)驗(yàn)指示對(duì)特定殘基或殘基類別的取代(例如保守、半保守、非保守)增強(qiáng)對(duì)脂酶活性的刺激的殘基(例如與脂酶活性刺激最低限度、適度或高度相關(guān))。由本文所描述的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)來(lái)看，av199-232肽內(nèi)的各種此類位置為顯而易見(jiàn)的。由以下seqidno:29來(lái)看可尤其有益的某些取代為顯而易見(jiàn)的：
ar(l/f/y/w)(s/t/n/g)(r/k/hlys/harg)(c/s/t/n/q/y/h)(v/f/y/w)qv(l/f/y/w)s(r/k/hlys/harg)(k/r/harg/hlys/orn)(l/f/y/w)tl(k/r/harg/hlys/orn)(a/f/y/w)(r/k/hlys/harg)a(l/f/y/w)(h/k/hlys/r/harg/orn)ar(i/f/y/w)qqn(l/f/y/w)dq(l/f/y/w)re；或
arx3x4x5x6x7qvx10sx12x13x14tlx17x18x19ax21x22arx25qqnx29dqx32re，其中：x3為l、f、y或w；x4為s、t、n或g；x5為r、k、hlys或harg；x6為c、s、t、n、q、y或h；x7為v、f、y或w；x10為l、f、y或w；x12為r、k、hlys或harg；x13為k、r、harg、hlys或orn；x14為l、f、y或w；x17為k、r、harg、hlys或orn；x18為a、f、y或w；x19為r、k、hlys或harg；x21為l、f、y或w；x22為h、k、hlys、r、harg或orn；x25為i、f、y或w；x29為l、f、y或w；并且x32為l、f、y或w。
在一些實(shí)施方案中，本文所描述的實(shí)驗(yàn)和分析表明seqidno:29中允許進(jìn)行的各種取代增強(qiáng)或不顯著削弱肽的脂酶刺激活性。本文所描述的數(shù)據(jù)還可指示其他取代，并且它們?cè)诒疚牡膶?shí)施方案的范圍內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，表1(實(shí)施例8)提供在本文的實(shí)施方案范圍內(nèi)的相對(duì)于seqidno:5的取代。
實(shí)施方案不受本文所描述的特定取代的限制。在一些實(shí)施方案中，滿足本文所描述的限制(例如脂族螺旋、lpl刺激、類似結(jié)構(gòu)域構(gòu)造等)并且具有未明確描述的取代的肽在此處的實(shí)施方案范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)本文所描述的肽進(jìn)行進(jìn)一步修飾(例如取代、缺失或添加標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；化學(xué)修飾；等)。本領(lǐng)域中所理解的修飾包括n端修飾、c端修飾(其使肽不發(fā)生蛋白降解)、酰胺基的烷基化、烴“釘合(stapling)”(例如用于穩(wěn)定α-螺旋構(gòu)象)。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)例如帶電荷殘基的保守殘基取代(k至r、r至k、d至e以及e至d)對(duì)本文所描述的肽進(jìn)行修飾。在一些實(shí)施方案中，此類保守取代提供例如脂酶和肝素結(jié)合位點(diǎn)的微小變化，目標(biāo)為改善特異性和/或脂酶刺激性能。舉例來(lái)說(shuō)，富含r殘基的肽傾向于以比富含k的肽高的親和力結(jié)合肝素。未端羧基的修飾包括但不限于酰胺、低碳烷基酰胺、受約束烷基(例如分枝鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)烷基、二烷基酰胺以及低碳烷基酯修飾。低碳烷基為c1-c4烷基。此外，一或多個(gè)側(cè)基或末端基團(tuán)可受到一般熟練的肽化學(xué)工作者已知的保護(hù)基的保護(hù)。氨基酸的α-碳可為單甲基化或雙甲基化的。
在一些實(shí)施方案中，在肽內(nèi)引入一個(gè)或多個(gè)肽內(nèi)二硫鍵(例如在兩個(gè)半胱氨酸(例如c6與被取代的半胱氨酸、兩個(gè)被取代的半胱氨酸、在av肽序列外部的一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸等之間)。在一些實(shí)施方案中，肽內(nèi)二硫鍵的存在使肽穩(wěn)定。
在一些實(shí)施方案中，本文所描述的任何實(shí)施方案可包含對(duì)應(yīng)于本文所描述的av-肽的av-擬肽物，其具有本領(lǐng)域中了解的各種修飾。在一些實(shí)施方案中，可將本文所描述的肽序列中的殘基用具有類似特性(例如疏水性至疏水性、中性至中性等)或具有其他所需特性(例如更酸、更疏水、更不龐大、更龐大等)的氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，將非天然氨基酸(或除20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以外的天然存在的氨基酸)加以取代以實(shí)現(xiàn)所需性質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，將具有在生理?xiàng)l件下帶正電荷的側(cè)鏈的殘基或需要帶正電荷的側(cè)鏈的殘基用包括但不限于以下的殘基取代：賴氨酸、高賴氨酸、δ-羥基賴氨酸、高精氨酸、2,4-二氨基丁酸、3-高精氨酸、d-精氨酸、精胺醛(精氨酸中的-cooh由-cho置換)、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸(n(g)-硝基精氨酸)、亞硝基精氨酸(n(g)-亞硝基精氨酸)、甲基精氨酸(n-甲基-精氨酸)、ε-n-甲基賴氨酸、別羥基賴氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,2'-二氨基庚二酸、鳥氨酸、對(duì)稱二甲基精氨酸、不對(duì)稱二甲基精氨酸、2,6-二氨基已炔酸、對(duì)氨基苯甲酸和3-氨基酪氨酸以及組氨酸、1-甲基組氨酸和3-甲基組氨酸。
中性殘基為具有在生理?xiàng)l件下不帶電荷的側(cè)鏈的殘基。極性殘基優(yōu)選在側(cè)鏈中具有至少一個(gè)極性基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，極性基團(tuán)選自羥基、硫氫基、胺、酰胺以及酯基或允許形成氫橋的其他基團(tuán)。
在一些實(shí)施方案中，將具有在生理?xiàng)l件下為中性/極性的側(cè)鏈的殘基或需要中性側(cè)鏈的殘基用包括但不限于以下的殘基取代：天冬酰胺、半胱氨酸、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、n-甲基絲氨酸、高絲氨酸、別蘇氨酸和3,5-二硝基-酪氨酸以及β-高絲氨酸。
具有非極性、疏水性側(cè)鏈的殘基為在生理?xiàng)l件下不帶電荷的殘基，優(yōu)選具有超過(guò)0、尤其超過(guò)3的親水性指數(shù)。在一些實(shí)施方案中，非極性、疏水性側(cè)鏈選自具有1至10個(gè)、優(yōu)選2至6個(gè)碳原子的烷基、亞烷基、烷氧基、烯氧基、烷基磺?；约版溝┗酋；鶜埢蚓哂?至12個(gè)碳原子的芳基。在一些實(shí)施方案中，將具有非極性、疏水性側(cè)鏈的殘基或需要非極性、疏水性側(cè)鏈的殘基用包括但不限于以下的殘基取代：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、n-甲基亮氨酸、叔丁基甘氨酸、辛基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、1-氨基環(huán)己基羧酸、n-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸以及n-甲基纈氨酸。
在一些實(shí)施方案中，將肽和多肽分離并且/或者純化(或大體上分離并且/或者大體上純化)。因此，在此類實(shí)施方案中，以大體上分離形式提供肽和/或多肽。在一些實(shí)施方案中，肽和/或多肽是由于例如固相肽合成而與其他肽和/或多肽分離?；蛘撸稍谥亟M制備的細(xì)胞溶解之后從其他蛋白質(zhì)大體上分離肽和/或多肽?？墒褂玫鞍踪|(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如hplc)來(lái)大體上純化肽和/或多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種肽和/或多肽的制劑，所述肽和/或多肽的制劑視所需用途而定呈許多配制品形式。舉例來(lái)說(shuō)，在將多肽大體上分離(或甚至與其他蛋白質(zhì)幾乎完全分離)的情況下，可將它在適合用于儲(chǔ)存(例如在冷藏條件下或在冷凍條件下)的介質(zhì)溶液中進(jìn)行配制。此類制劑可含有防護(hù)劑(諸如緩沖液)、防腐劑、低溫防護(hù)劑(例如糖，諸如海藻糖)等。此類制劑的形式可為溶液、凝膠等。在一些實(shí)施方案中，將apoa-v肽和/或多肽制備成凍干形式。此外，此類制劑可包括其他所需藥劑，諸如小分子或其他肽、多肽或蛋白質(zhì)。實(shí)際上，可提供包含在此所描述的肽和/或多肽的不同實(shí)施方案的混合物的此類制劑。
在一些實(shí)施方案中，本文提供本文所描述的肽序列的擬肽物型式或其變體。在一些實(shí)施方案中，擬肽物的特征在于實(shí)體保留其肽等效物的極性(或無(wú)極性、疏水性等)、三維尺寸以及官能性(生物活性)，但其中所有或一部分肽鍵已被置換(例如由更穩(wěn)定的鍵聯(lián)置換)。在一些實(shí)施方案中，‘穩(wěn)定’是指對(duì)化學(xué)降解或由水解酶進(jìn)行酶促降解更具抵抗力。在一些實(shí)施方案中，置換酰胺鍵(例如酰胺鍵代用物)的鍵保留酰胺鍵的一些性質(zhì)(例如構(gòu)象、空間體積、靜電特性、氫鍵合能力等)?！癲rugdesignanddevelopment”,krogsgaard,larsen,liljefors以及madsen(編)1996,horwoodacad.publishers的第14章提供對(duì)設(shè)計(jì)和合成擬肽物的技術(shù)的一般論述并且以全文引用的方式并入本文中。適合的酰胺鍵代用物包括但不限于：n-烷基化(schmidt,r.等人,int.j.peptideproteinres.,1995,46,47；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、逆翻轉(zhuǎn)酰胺(chorev,m.和goodman,m.,acc.chem.res,1993,26,266；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、硫酰胺(shermand.b.和spatola,a.f.j.am.chem.soc.,1990,112,433；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、硫酯、膦酸酯、酮基亞甲基(hoffman,r.v.和kim,h.o.j.org.chem.,1995,60,5107；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、羥基亞甲基、氟乙烯基(allmendinger,t.等人,tetrahydronlett.,1990,31,7297；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)，乙烯基、亞甲基胺(sasaki,y和abe,j.chem.pharm.bull.199745,13；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、亞甲基硫基(spatola,a.f.,methodsneurosci,1993,13,19；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)、鏈烷(lavielle,s.等人,int.j.peptideproteinres.,1993,42,270；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)以及磺酰胺基(luisi,g.等人tetrahedronlett.1993,34,2391；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。
像酰胺鍵的置換一樣，擬肽物可涉及用二擬肽或三擬肽結(jié)構(gòu)置換較大結(jié)構(gòu)部分，并且在此情況下，可以二肽置換形式使用涉及肽鍵的擬似物部分(諸如唑衍生的擬似物)。適合的擬肽物包括還原肽，其中已通過(guò)用還原劑(例如硼烷或氫化物試劑，諸如氫化鋰鋁)處理將酰胺鍵還原為亞甲基胺；此類還原具有增加的優(yōu)點(diǎn)，即增加分子的總陽(yáng)離子度。
其他擬肽物包括例如通過(guò)分步合成酰胺官能化聚甘氨酸形成的類肽。一些擬肽物主鏈將可輕易獲自其肽前體，諸如已全甲基化的肽，適合的的方法由ostresh,j.m.等人描述于proc.natl.acad.sci.usa(1994)91,11138-11142中；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。
在一些實(shí)施方案中，在使用之前將肽加以處理或調(diào)節(jié)。舉例來(lái)說(shuō)，可將apoa-v肽與極低密度脂蛋白(vldl)一起孵育。在一些實(shí)施方案中，可將av-肽與肝素、合成脂蛋白、脂質(zhì)體或患者自己的脂蛋白一起孵育以增強(qiáng)生物可用性和治療功效。
在一些實(shí)施方案中，以與其他肽或多肽融合的形式提供本文所描述的肽。此類融合物可由編碼apoa-v肽和額外的肽/多肽的重組dna表達(dá)或可通過(guò)化學(xué)合成來(lái)形成。舉例來(lái)說(shuō)，融合物可包含apoa-v肽和所關(guān)注的酶、熒光素酶、核糖核酸酶抑制劑(rnasin)或核糖核酸酶和/或通道蛋白(例如離子通道蛋白)、受體、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、核蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、磷蛋白、激酶、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關(guān)蛋白、熒光蛋白、酶底物、轉(zhuǎn)錄因子、可選標(biāo)記蛋白、核酸結(jié)合蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、所分泌蛋白質(zhì)、受體配體、血清蛋白、具有反應(yīng)性半胱氨酸的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、靶向序列(例如肉豆蔻基化序列)、線粒體定位序列或核定位序列?？蓪㈩~外的肽/多肽融合至apoa-v肽的n端和/或c端。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含位于apoa-v肽的n端的第一肽/多肽以及位于c端的另一(不同)肽/多肽。任選地，融合物中的元件由連接序列隔開，所述連接序列為例如優(yōu)選具有至少2個(gè)氨基酸殘基的連接序列，諸如具有13個(gè)并且多達(dá)40或50個(gè)氨基酸殘基的連接序列。在本發(fā)明的融合蛋白中存在連接序列并不相對(duì)于每個(gè)單個(gè)元件的功能大體上改變?nèi)诤衔镏械娜我辉?例如apoa-v肽)的功能，這可能歸因于連接序列為融合物中的每個(gè)元件提供可撓性(自主性)。在某些實(shí)施方案中，連接序列為由酶識(shí)別的序列或?yàn)榭晒饬呀獾?。舉例來(lái)說(shuō)，連接序列可包括蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。
在一些實(shí)施方案中，本文提供包含本文所描述的一種或多種av-肽和多肽(例如與seqidno:5具有低于100％的序列同一性、展現(xiàn)出增強(qiáng)的甘油三酯水解脂酶活化等)以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物?？晒?yīng)活性肽或多肽(例如在不破壞載體內(nèi)的肽或多肽的情況下)的任何載體均為適合的載體，并且此類載體為本領(lǐng)域中熟知的。在一些實(shí)施方案中，將組合物配制成用于通過(guò)包括但不限于以下的任何適合的途徑進(jìn)行施用：經(jīng)口(例如諸如以片劑、膠囊、顆粒或粉末形式)、舌下、經(jīng)頰、腸胃外(諸如通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或胸骨內(nèi)注射或輸注(例如以無(wú)菌可注射水溶液或非水溶液或懸浮液等形式))、經(jīng)鼻(包括向鼻膜施用，諸如通過(guò)吸入噴霧)、表面(諸如以乳膏或軟膏形式)、經(jīng)皮(諸如通過(guò)經(jīng)皮貼片)、經(jīng)直腸(諸如以栓劑形式)等。
在一些實(shí)施方案中，本文提供用于治療罹患高甘油三酯血癥(或處于其風(fēng)險(xiǎn)中)和/或需要治療(或預(yù)防性治療)的患者的方法。在一些實(shí)施方案中，以足以治療病狀的量并且在足以治療病狀的位置向此類患者遞送包含至少一種本文所描述的av-肽或多肽的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，可將肽和/或多肽(或包含此類物質(zhì)的藥物組合物)全身或局部遞送至患者，并且確定用于治療的最適當(dāng)遞送途徑、時(shí)程以及劑量將在治療此類患者的醫(yī)療專業(yè)人員的一般技術(shù)之內(nèi)。應(yīng)了解，治療患者的施用方法最優(yōu)選大體上緩解或甚至消除此類癥狀；然而，如許多醫(yī)學(xué)治療一般，如果在本發(fā)明方法期間、在其之后或以其他方式作為其結(jié)果，患者的疾病或病癥的癥狀減退至可查明的程度，那么認(rèn)為本發(fā)明方法的應(yīng)用為成功的。
可以與藥學(xué)上可接受的載體和任選的賦形劑、助劑等一起根據(jù)良好藥物實(shí)踐加以配制的形式來(lái)施用藥物組合物?；赼v-肽的藥物組合物可呈諸如以下的固體、半固體或液體劑型形式：粉末、溶液、酏劑、糖漿、懸浮液、乳膏、滴劑、糊劑以及噴霧。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，視所選施用途徑(例如丸劑、注射等)而定，確定組合物形式。一般來(lái)說(shuō)，為實(shí)現(xiàn)容易并且準(zhǔn)確的活性藥物肽或多肽施用，優(yōu)選使用單位劑型。一般來(lái)說(shuō)，治療有效性藥物化合物以在以總組合物的重量計(jì)約0.5％至約99％范圍內(nèi)的濃度水平(例如以足以提供所需單位劑量的量)存在于此類劑型中。在一些實(shí)施方案中，可以單劑量或多劑量施用藥物組合物。技術(shù)人員將按照所要治療的個(gè)體的病狀以及所述受試者對(duì)治療的反應(yīng)來(lái)確定特定施用途徑和給藥方案。在一些實(shí)施方案中，以用于向受試者施用的單位劑型形式提供基于av-肽的藥物組合物，包含av-肽或多肽(例如與seqidno:2的部分具有低于100％的序列同一性等)以及一種或多種無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的載體、助劑或媒介物。可與此類物質(zhì)組合以制備單一劑型的活性成分的量將視如以上所指出的各種因素而不同。如在藥物技術(shù)中可用，在本發(fā)明的組合物中可使用多種材料作為載體、助劑以及媒介物?？砂葱枰褂眠m合的分散或潤(rùn)濕劑以及懸浮劑將可注射制劑(諸如油性溶液、懸浮液或乳液)配制成本領(lǐng)域中已知的形式。無(wú)菌可注射制劑可使用無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，諸如無(wú)菌無(wú)熱原水或1,3-丁二醇。在其他可接受的媒介物和溶劑之中，可使用的是5％葡萄糖注射液、林格氏注射液(ringer'sinjection)以及等滲氯化鈉注射液(如usp/nf中所描述)。此外，常規(guī)地可使用無(wú)菌、固定油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。出于此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。在可注射組合物的制備中還可使用脂肪酸，諸如油酸。
可進(jìn)一步通過(guò)諸如以下化學(xué)變化來(lái)衍生出本文所公開的涵蓋大體上α螺旋肽區(qū)域的肽和多肽：酰胺化、糖基化、?；?、硫酸鹽化、磷?；⒁阴；约碍h(huán)化?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方法以及通過(guò)體內(nèi)方法或其任何組合來(lái)獲得此類化學(xué)變化。
在某些實(shí)施方案中，通過(guò)修飾末端氨基來(lái)衍生出本文所描述的肽和多肽。此類修飾包括但不限于脫氨基、n-低碳烷基、n-二低碳烷基、受約束烷基(例如分枝鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)以及n-?；揎棧渲絮；糠譃閏6-c20烷基。
在某些實(shí)施方案中，通過(guò)修飾末端羧基來(lái)衍生出本文所描述的肽和多肽。此類修飾包括但不限于酰胺、低碳烷基酰胺、受約束烷基(例如分枝鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)烷基、二烷基酰胺以及低碳烷基酯修飾，其中低碳烷基為c1-c4烷基。此外，一個(gè)或多個(gè)側(cè)基或末端基團(tuán)可受到一般熟練的肽化學(xué)工作者已知的保護(hù)基的保護(hù)。氨基酸的α-碳可為單甲基化或雙甲基化的。
在各個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)綴合至一種或多種聚合物或小分子取代基來(lái)衍生出本文所公開的肽和多肽。
在這些實(shí)施方案中的某些中，通過(guò)偶聯(lián)至聚乙二醇(peg)來(lái)衍生出本文所描述的合成肽和多肽?？墒褂靡阎椒ㄟM(jìn)行偶聯(lián)。參見(jiàn)int.j.hematology,68:1(1998)；bioconjugatechem.,6:150(1995)；以及crit.rev.therap.drugcarriersys.,9:249(1992)，所述文獻(xiàn)全部以全文引用的方式并入本文中。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用此類熟知用于使一種或多種聚乙二醇聚合物鍵聯(lián)至本文所描述的肽和多肽的技術(shù)。典型地可商購(gòu)獲得或可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)制備適合的聚乙二醇聚合物。聚乙二醇聚合物優(yōu)選具有500與20,000之間的分子量并且可為分枝鏈或直鏈聚合物。
可通過(guò)偶聯(lián)至氨基、羧基或硫醇基來(lái)實(shí)現(xiàn)peg附接至本文所描述的肽或多肽。這些基團(tuán)將典型地為n端和c端以及如賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及半胱氨酸一般位于此類天然存在的氨基酸的側(cè)鏈上。因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)固相肽化學(xué)技術(shù)來(lái)制備本公開的肽和多肽，所以可引入含有具有正交保護(hù)基的二氨基和二羧基的多個(gè)部分以與peg綴合。
本公開還提供本文所描述的肽和多肽與一種或多種不為聚乙二醇的聚合物的綴合。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)綴合或鍵聯(lián)至聚氨基酸(例如聚his、聚arg、聚lys等)和/或各種長(zhǎng)度的脂肪酸鏈或?qū)⒕郯被岷?或各種長(zhǎng)度的脂肪酸鏈附接至n端或c端或氨基酸殘基側(cè)鏈來(lái)衍生出本文所描述的肽和多肽。在某些實(shí)施方案中，如以全文引用的方式并入本文中的美國(guó)專利號(hào)6,552,167中所描述，通過(guò)添加精確長(zhǎng)度的聚酰胺鏈、尤其聚酰胺鏈來(lái)衍生出本文所描述的肽和多肽。在其他實(shí)施方案中，如以全文引用的方式并入本文中的美國(guó)專利號(hào)5,359,030和5,681,811中所描述，通過(guò)添加烷基peg部分來(lái)修飾肽和多肽。
在所選實(shí)施方案中，通過(guò)結(jié)合至包括白蛋白和明膠的聚合物來(lái)衍生出本文所公開的肽和多肽。參見(jiàn)gombotzandpettit,bioconjugatechem.,6:332-351,1995，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。
在其他實(shí)施方案中，使本文所公開的肽和多肽綴合或融合至免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，諸如抗體fc區(qū)。
在各個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)附接小分子取代基來(lái)衍生出本文所描述的肽和多肽，所述小分子取代基包括短鏈烷基和受約束烷基(例如分枝鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)以及芳族基。
在某些實(shí)施方案中，本文所描述的肽和多肽包含含有c5-c9直鏈或分枝鏈烷基側(cè)鏈的烷基甘氨酸氨基酸類似物或環(huán)烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽或多肽包含烷基甘氨酸，所述烷基甘氨酸包含c6-c8直鏈或分枝鏈烷基側(cè)鏈。在另一實(shí)施方案中，多肽包含辛基甘氨酸，所述辛基甘氨酸包含c8直鏈烷基側(cè)鏈(辛基-甘氨酸)。
可用各種無(wú)機(jī)和有機(jī)酸以及堿將本文所描述的肽和多肽制備成鹽。此類鹽包括用有機(jī)和無(wú)機(jī)酸，例如用hcl、hbr、h2so4、h3po4、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸以及樟腦磺酸制備的鹽。用堿制備的鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)、堿土鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)以及鋅鹽。可通過(guò)常規(guī)手段來(lái)形成所述鹽，諸如通過(guò)使產(chǎn)物的游離酸或堿形式與適當(dāng)?shù)膲A或酸的一種或多種等效物在不溶解鹽的溶劑或介質(zhì)中或在隨后在真空下或通過(guò)冷凍干燥移除的溶劑(諸如水)中反應(yīng)，或通過(guò)在適合的離子交換樹脂上將現(xiàn)有鹽的離子交換為另一離子。
可將本文所描述的肽和多肽配制成藥學(xué)上可接受的鹽和/或其復(fù)合物的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，諸如那些含有以下物質(zhì)的酸加成鹽：硫酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽以及奎尼酸鹽(quinate)。藥學(xué)上可接受的鹽可從酸獲得，諸如鹽酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、環(huán)己基氨基磺酸以及奎尼酸。可如下制備此類鹽，例如通過(guò)使產(chǎn)物的游離酸或堿形式與適當(dāng)?shù)膲A或酸的一種或多種等效物在不溶解鹽的溶劑或介質(zhì)中或在隨后在真空下或通過(guò)冷凍干燥移除的溶劑(諸如水)中反應(yīng)，或通過(guò)在適合的離子交換樹脂上將現(xiàn)有鹽的離子交換為另一離子。
可將本文所描述的肽和多肽配制成用于結(jié)合本公開的方法使用的藥物組合物的形式?？蛇m宜地以適合用于包括以下的腸胃外施用的配制品的形式提供本文所公開的組合物：皮下、肌肉內(nèi)以及靜脈內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、經(jīng)肺施用或經(jīng)口施用。標(biāo)準(zhǔn)配制品專著(例如e.w.martin的remington'spharmaceuticalsciences)中描述了肽和多肽的適合用于各種此類施用途徑的配制品。還參見(jiàn)wang,y.j.和hanson,m.a.“parenteralformulationsofproteinsandpeptides:stabilityandstabilizers”,journalofparenteralscienceandtechnology,technicalreport第10期,增刊42:2s(1988)。
某些本文所描述的肽和多肽可大體上不溶于水且微溶于大多數(shù)藥學(xué)上可接受的質(zhì)子溶劑和植物油。在某些實(shí)施方案中，可添加環(huán)糊精作為水溶性增強(qiáng)劑。環(huán)糊精包括α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精以及γ-環(huán)糊精的甲基、二甲基、羥丙基、羥乙基、葡糖基、麥芽糖基以及麥芽三糖基衍生物。示例性環(huán)糊精溶解度增強(qiáng)劑為羥丙基-β-環(huán)糊精(hpbcd)，所述羥丙基-β-環(huán)糊精可被添加至以上所描述的組合物中的任一者中以進(jìn)一步改善肽或多肽的水溶性特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含0.1％至20％hpbcd、1％至15％hpbcd或2.5％至10％hpbcd。所用溶解度增強(qiáng)劑的量將取決于組合物中本公開的肽或多肽的量。在某些實(shí)施方案中，可在諸如以下的非水性極性非質(zhì)子溶劑中對(duì)肽加以配制：dmso、二甲基甲酰胺(dmf)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)。
在一些情況下，提供呈單一組合物或溶液形式以便將一起施用的肽或多肽和另一活性劑將為適宜的。在其他情況下，將額外的藥劑與所述多肽分開施用可為更有利的。
關(guān)于使用，可以單位劑型形式提供本文所描述的肽和多肽的藥物組合物，所述單位劑型含有在單次施用中有效的量的肽或多肽。適合用于皮下施用的單位劑型包括預(yù)裝填注射器和注入器。
在一些實(shí)施方案中，av-肽/多肽是以藥物組合物形式提供和/或與一種或多種額外的治療劑共施用(并行或串聯(lián))。此類額外的藥劑可用于進(jìn)一步降低甘油三酯水平或用于治療相關(guān)問(wèn)題(例如膽固醇水平升高、高血壓等)病狀或疾病。額外的藥劑可包括但不限于：纖維酸衍生物、煙堿酸、ω-3脂肪酸、激素藥物(例如美曲普汀(metreleptin)(myalept))、他汀(例如辛伐他汀(simvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)，羅伐他汀(rosuvastatin)等)、抗血小板劑(例如阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)等)、抗凝劑(例如殺鼠靈(warfarin)(coumadin)和肝素)、用于治療糖尿病的藥物(例如磺酰脲、雙胍、美格替奈(meglitinide)、噻唑啶二酮、dpp-4抑制劑、sglt2抑制劑、α-葡糖苷酶抑制劑、膽汁酸鉗合劑等)、胰島素、glp-1肽(例如victoza)等。
在一些實(shí)施方案中，提供本文所描述的基于av-肽的組合物是作為試劑盒的一部分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含一種或多種基于apoa-v的肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含被配置成與一種或多種額外的組合物(例如藥物組合物)共施用的基于av-肽的組合物。在一些實(shí)施方案中，將一種或多種基于av-肽的組合物與用于使降低甘油三酯或治療或預(yù)防高甘油三酯血癥或相關(guān)疾病或病狀有效增強(qiáng)的一種或多種其他藥劑共施用。
在一些實(shí)施方案中，為降低甘油三酯濃度、增強(qiáng)降解(例如水解)和/或治療或預(yù)防高甘油三酯血癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性和/或相關(guān)疾病和病狀而提供基于av-肽的組合物。對(duì)所描述的特征和實(shí)施方案的各種修改、重組以及變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將為清楚的，而不會(huì)背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然已描述特定實(shí)施方案，但應(yīng)了解如所要求的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度受限于此類特定實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)所描述的模式和實(shí)施方案的對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的熟練人員來(lái)說(shuō)明顯的各種修改旨在在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
如本文所陳述，在一些實(shí)施方案中，提供治療高甘油三酯血癥的方法。所述方法包括以足以降低血液甘油三酯水平的量、按足以實(shí)現(xiàn)此目的的時(shí)程向高甘油三酯血癥患者施用如本文所描述的肽或多肽并且持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)此目的的持續(xù)時(shí)間。
在某些實(shí)施方案中，患者具有極限高甘油三酯血癥，極限高甘油三酯血癥被定義為在本文所提供的治療之前非空腹血漿甘油三酯(“tg”)水平≥885mg/dl。在一些實(shí)施方案中，患者具有嚴(yán)重高甘油三酯血癥，嚴(yán)重高甘油三酯血癥被定義為治療前tg水平在500與885mg/dl之間。在一些實(shí)施方案中，在治療之前患者具有難治性高甘油三酯血癥，難治性高甘油三酯血癥被定義為tg水平在200mg/dl與500mg/dl之間。在其他實(shí)施方案中，患者在治療之前具有在150mg/dl與200mg/dl之間的邊界高甘油三酯血癥。在常規(guī)實(shí)施方案中，患者將具有高甘油三酯血癥，不過(guò)在起始本文所提供的治療之前已用一種或多種其他治療劑進(jìn)行了治療。
在某些實(shí)施方案中，患者將具有乳糜微粒血癥。在一些實(shí)施方案中，患者將具有超過(guò)正常值的ldl-c水平。在一些實(shí)施方案中，患者將具有低于正常水平的hdl-c。
在一些實(shí)施方案中，患者將具有胰腺炎。在一些實(shí)施方案中，患者將具有糖尿病。在某些實(shí)施方案中，患者將具有代謝綜合征。一些患者將具有肝脾腫大。一些患者將具有非酒精性脂肪性肝炎(“nash”)。一些患者將具有脂肪代謝障礙(例如先天性、后天性、全身性、部分性等)。
在某些實(shí)施方案中，患者為成人。在其他實(shí)施方案中，患者為兒童。
在多個(gè)實(shí)施方案中，以足以使甘油三酯水平與即將起始治療前的水平相比降低至少5％、10％、15％、20％或25％或更多的量、按足以實(shí)現(xiàn)此目的的時(shí)程施用多肽并且持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)此目的的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，以足以使甘油三酯水平降低至少30％、35％、40％、45％或50％的量、按足以實(shí)現(xiàn)此目的的給藥時(shí)程施用多肽并且持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)此目的的持續(xù)時(shí)間。在特定實(shí)施方案中，以足以使甘油三酯水平降低至少55％、60％、65％、甚至至少約70％或更多的量、按足以實(shí)現(xiàn)此目的的時(shí)程施用多肽并且持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)此目的的時(shí)間。
在某些實(shí)施方案中，以不管給藥頻率如何均表述為日等效劑量的量施用多肽，所述量為每天50微克(“mcg”)、每天60mcg、每天70mcg、每天75mcg、每天100mcg、每天150mcg、每天200mcg或每天250mcg。在一些實(shí)施方案中，以每天500mcg、每天750mcg或每天1毫克(“mg”)的量施用多肽。在其他實(shí)施方案中，以不管給藥頻率如何均表述為日等效劑量的量施用多肽，所述量為每天1-10mg，包括每天1mg、每天1.5mg、每天1.75mg、每天2mg、每天2.5mg、每天3mg、每天3.5mg、每天4mg、每天4.5mg、每天5mg、每天5.5mg、每天6mg、每天6.5mg、每天7mg、每天7.5mg、每天8mg、每天8.5mg、每天9mg、每天9.5mg或每天10mg。
在多個(gè)實(shí)施方案中，按每月給藥時(shí)程施用多肽系。在其他實(shí)施方案中，每?jī)芍苁┯枚嚯?。在其他?shí)施方案中，每周施用多肽。在某些實(shí)施方案中，每天(“每天一次”)施用多肽。在所選實(shí)施方案中，一天施用兩次(“每天兩次”)多肽。
在典型實(shí)施方案中，施用多肽至少3個(gè)月、至少6個(gè)月、至少12個(gè)月或更久。在一些實(shí)施方案中，施用多肽至少18個(gè)月、2年、3年或更久。
在典型實(shí)施方案中，腸胃外施用多肽。在一些腸胃外實(shí)施方案中，皮下施用多肽。在一些腸胃外實(shí)施方案中，肌肉內(nèi)施用多肽。在其他實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用多肽。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)皮下植入滲透性微型泵(intarcia)來(lái)施用多肽。
在其他實(shí)施方案中，鼻內(nèi)施用多肽。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)吸入施用多肽。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)頰內(nèi)施用或通過(guò)舌下施用而經(jīng)口施用多肽。
在其他實(shí)施方案中，經(jīng)皮施用多肽。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)皮下注射以0.5-5.0mg的量每天施用一次多肽，持續(xù)至少6個(gè)月。
在典型實(shí)施方案中，施用多肽作為設(shè)計(jì)成降低甘油三酯水平的膳食的輔助物。
在多個(gè)實(shí)施方案中，將多肽與至少一種額外的治療劑組合施用。典型地，在此類實(shí)施方案中，以單獨(dú)的組合物形式施用額外的治療劑。在這些實(shí)施方案中的某些中，通過(guò)與本文所描述的多肽不同的施用途徑和/或按不同的給藥時(shí)程來(lái)施用額外的治療劑。
在組合實(shí)施方案中的某些中，至少一種額外的藥劑中的至少一者選自由以下組成的群組：煙堿酸、ω-3多不飽和脂肪酸；貝特(fibrate)；米泊美生(mipomersen)；以及阿利潑金(alipogenetiparvovec)。在特定實(shí)施方案中，ω-3多不飽和脂肪酸選自由以下組成的群組：乙基二十碳五烯酸(icosapentethyl)；ω-3羧酸；以及ω-3-酸乙酯。在某些實(shí)施方案中，至少一種額外的藥劑為他汀。在某些實(shí)施方案中，他汀選自由以下組成的群組：普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀(fluvastatin)，羅伐他汀、替伐他汀(tenivastatin)以及匹伐他汀(pitavastatin)。
實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例1
apoa-v中的脂酶刺激結(jié)構(gòu)域
apoa-v為343個(gè)氨基酸的相對(duì)大的蛋白質(zhì)并且已被認(rèn)為具有三種活性：脂質(zhì)結(jié)合、肝素/受體結(jié)合以及脂酶活化(圖1)。我們特別關(guān)注的是apoa-v中刺激脂酶活性的結(jié)構(gòu)域，并且在人類群體中已確定的許多突變已幫助闡明其位置。近來(lái)由mendoza-barberá和同事進(jìn)行的描繪在htg患者中的三種不相關(guān)apoa5突變的重要研究(sharma等人(2014)arterioscler.thromb.vasc.biol.34,2254-2260；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)識(shí)別了顯著削弱apoa-v的脂酶刺激活性的(ser232-leu235)del和leu253pro。此缺失對(duì)應(yīng)于先前報(bào)導(dǎo)的富含帶正電荷殘基的42氨基酸序列，其具有強(qiáng)硫酸乙酰肝素結(jié)合潛能，并且被顯示為細(xì)胞表面結(jié)合所必需的(nilsson等人(2007)biochemistry46,3896-3904；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。pro殘基(在leu253pro中)當(dāng)僅置換一個(gè)殘基位置時(shí)被視為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞者，并且將可能在蛋白質(zhì)構(gòu)象中引入顯著變化從而影響周圍區(qū)域。此區(qū)域也與一項(xiàng)更早的報(bào)導(dǎo)一致，所述報(bào)導(dǎo)顯示缺失殘基192-238的重組apoa-v具有削弱的結(jié)合脂質(zhì)和活化脂酶活性的能力(sun等人(2006)chem.phys.lipids143,22-28；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。
對(duì)apoa-v的與高甘油三酯血癥和/或cad有關(guān)的所有已知序列變體進(jìn)行映射揭示殘基199-259內(nèi)的突變簇(圖1b)。用富含α-螺旋的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出apoa-v的3d模型并且預(yù)示結(jié)構(gòu)富含α-螺旋(圖1c)。殘基199-259似乎構(gòu)造成由短環(huán)連接的兩個(gè)分開的α-螺旋。部分基于構(gòu)造(例如合成)和測(cè)試跨越殘基199-237(av199-237)與殘基250-288(av250-288)的兩個(gè)肽來(lái)設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
apoa-v的3d結(jié)構(gòu)尚未得到解決，因此在展開本文所描述的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用基于網(wǎng)絡(luò)的服務(wù)器(phyre2)來(lái)預(yù)測(cè)3d結(jié)構(gòu)，此表明殘基200-245似乎折疊成α-螺旋，而不是隨機(jī)未折疊結(jié)構(gòu)(圖2)。對(duì)序列的檢驗(yàn)揭示螺旋打斷者殘基(p、g)將此結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)序列的其余部分分開并且將α-螺旋的末端區(qū)別開。
為尋找脂酶刺激物，采用了脂酶分析，所述脂酶分析使用由molecularprobes供應(yīng)的可商購(gòu)獲得的熒光-tg底物(enzchek)(圖3)。所述方案是由basu等人(basu等人(2011)j.lipidres.52,826-832；該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)改變而來(lái)，其中在ph值和洗滌劑方面有微小的修改。對(duì)于體外分析，將lpl(sigma)在制備于96孔黑色微量滴定板中的20mmtris-hcl、150mmnacl、1％bsa、0.015％zwittergent3-14(ph7.8)、1μmenzchek底物中稀釋至0.12μg/ml。對(duì)于一些分析，將板在37℃下孵育10min。在synergyh1多模式讀數(shù)器中使用分別為482nm和515nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。分析表明分析物對(duì)nmol/llpl敏感并且在逐漸增加的酶濃度情況下的直線表明底物濃度不具限制性。此外，可使用bodipy-c12脂肪酸來(lái)定量所制備的產(chǎn)物以確定酶反應(yīng)的摩爾速率。因?yàn)樗龇治鍪褂脽o(wú)毒底物和低量的中性洗滌劑，所以有可能在活細(xì)胞情況下使用此分析(圖4)。所分析的脂酶活性對(duì)從肝細(xì)胞表面移除脂酶(hl)(通過(guò)肝素預(yù)洗滌)以及在分離的脂蛋白、vldl、ldl以及hdl制劑中存在脫輔基脂蛋白兩者均敏感。
實(shí)施例2
合成肽
合成(圖2b)并測(cè)試了對(duì)lpl活性的影響(圖5a-b)的第一種肽為av199-237。起初，當(dāng)將肽添加至lpl中時(shí)，未觀測(cè)到活性變化；然而，在將肽與極低密度脂蛋白(vldl)一起孵育然后添加至lpl中后，水解活性增加約4倍。對(duì)于av250-288，在存在(圖5e)或不存在(圖5d)vldl的情況下，觀測(cè)到極小刺激活性或未觀測(cè)到刺激活性。然而，在活細(xì)胞分析中，av-肽的脂酶刺激活性不需要vldl，表明所述肽直接作用于脂酶(圖6和8)。在av199-237情況下的此活性增加超過(guò)了先前被報(bào)導(dǎo)也增加lpl活性的apoc-ii肽(c-ii50-79)情況下所見(jiàn)的結(jié)果。還已報(bào)導(dǎo)在高濃度下apoc-ii抑制脂酶活性。
av199-237在細(xì)胞培養(yǎng)物中也極有效地刺激脂酶活性(圖6)。肝脂酶(hl)增加約3倍并且所述作用為可飽和的，這與肽作用于特定且有限集合的脂酶一致。此觀測(cè)結(jié)果也為獨(dú)特的，因?yàn)閘pl和hl為不同的脂酶，表明與未曾對(duì)hl有影響的apoc-ii不同，apoa-v和其擬肽物可刺激lpl與hl兩者。還值得注意的是，在細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)hl的刺激持續(xù)至少75min(分析停止)。
為確定脂酶刺激功能是否可定位至更短的肽序列，產(chǎn)生一系列縮短的肽以在脂酶分析中進(jìn)行測(cè)試(圖7b、7d)。在體外lpl與細(xì)胞培養(yǎng)物分析兩者中進(jìn)行的測(cè)試均揭示av199-237可縮短5個(gè)殘基并且所得av199-232肽具有完全活性并且實(shí)際上稍微更有效(圖8)。
實(shí)施例3
lpl酶動(dòng)力學(xué)和av199-232
研究了av199-232對(duì)lpl活性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(例如v最大和km)的影響(圖9a-b)。觀測(cè)到添加vldl使lpl對(duì)底物的親和力降低(km增加)約5倍。這是歸因于vldl的apoc-iii含量。然而，添加av199-232(2.5μm)使km大體上提高幾乎8倍，表明av199-232可能結(jié)合于lpl并且以變構(gòu)方式刺激其活性位點(diǎn)。在vldl中存在apoc-iii的情況下av199-232也具功能性。比較了不同脂蛋白對(duì)lpl動(dòng)力學(xué)的影響(圖9d)。hdl或ldl兩者均對(duì)km無(wú)顯著影響。
鑒于在av199-232的由交替的極性和非極性殘基組成的序列中似乎存在周期性，研究了肽折疊成兩親性α-螺旋的可能性(圖10)。通過(guò)圓二色性光譜學(xué)對(duì)av199-232與av199-237兩者進(jìn)行分析，并且發(fā)現(xiàn)av199-232含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，其螺旋性質(zhì)在添加肝素后有所增加證實(shí)肝素結(jié)合活性。經(jīng)由計(jì)算機(jī)模擬分析也預(yù)測(cè)到高α-螺旋含量。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了av-肽的螺旋輪狀呈現(xiàn)的用途，所述螺旋輪狀表示是用于輔助脫輔基脂蛋白中的功能性結(jié)構(gòu)域組織的可視化的常用工具。將av199-232呈現(xiàn)為螺旋輪形式揭示3或4個(gè)離散結(jié)構(gòu)域(圖11)。在極性殘基和非極性殘基(結(jié)構(gòu)域-l)被組織到螺旋的相對(duì)側(cè)的情況下，肽的兩親性質(zhì)為明顯的。結(jié)構(gòu)域-l負(fù)責(zé)結(jié)合于vldl。在極性側(cè)還確定了結(jié)構(gòu)域-1、結(jié)構(gòu)域-2以及結(jié)構(gòu)域-h。
為研究這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥富罨臐撛谥匾裕O(shè)計(jì)了一系列肽，其中將有限集合的帶電荷殘基用與α-螺旋結(jié)構(gòu)相容的極性不帶電荷殘基置換(圖12)。結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2與av199-232活性高度相關(guān)。dom1(dom1ko；r12q/d30s)和dom2(dom2ko；k13q/k17q)中的取代使得lpl刺激活性顯著降低(圖13)。dom1(e34k)不影響av199-232活性，表明e34不發(fā)揮功能性作用(圖13a)。doml(domlko；l10q/l21q/l29q)內(nèi)的取代使得活性適度降低(圖13a)。通過(guò)將增加濃度的肽施加至肝素-瓊脂糖4b柱(0.2ml)來(lái)比較av199-232、dom1ko以及dom2ko的肝素結(jié)合活性(圖13b)。測(cè)試這些突變肽證實(shí)結(jié)構(gòu)域-1為lpl活化所必需的，并且結(jié)構(gòu)域-2具有肝素結(jié)合位點(diǎn)并且也與lpl的活化高度相關(guān)(圖13)。
結(jié)構(gòu)域-h也為所關(guān)注的，因?yàn)榕c其他氨基酸不同，它為僅有的可在接近于細(xì)胞表面錨定脂酶處可發(fā)現(xiàn)的微酸性ph值下自中性變成正電荷的殘基。合成將h用k置換的av199-232肽(av-h/k)并且評(píng)估其對(duì)脂酶刺激的影響(圖14)。av-h/k能夠在不存在vldl的情況下使lpl活性增加約1.6倍并且在vldl存在下增加約8倍，這對(duì)應(yīng)于相較于av199-232活性增強(qiáng)44％。
圖17中列出了對(duì)已設(shè)計(jì)并且針對(duì)脂酶刺激進(jìn)行了測(cè)試的主要肽的概述。cd分析與經(jīng)由計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)均有力地支持了本文所描述的av-肽的高度組織化的α-螺旋結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)信息已允許確定先前在av199-232中未識(shí)別的4個(gè)結(jié)構(gòu)域，這與在展開本文所描述的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)一致，所述結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)(結(jié)構(gòu)域-1和結(jié)構(gòu)域-h)對(duì)于直接刺激脂酶活性來(lái)說(shuō)為重要的。此外，如由在包括vldl的情況下的活性改善所證實(shí)，脂質(zhì)結(jié)合域-l對(duì)活性來(lái)說(shuō)也為重要的。此后一觀測(cè)結(jié)果具有許多關(guān)于研制av-肽作為治療劑的積極暗示。首先，tg通常被包裝并且在vldl和其他富tg脂蛋白中循環(huán)，并且我的數(shù)據(jù)表明av-肽與這些脂蛋白締合。其次，此脂蛋白親和力可顯著改善其體內(nèi)生物可用性。最后，av-肽能夠克服vldl中的apoc-iii的抑制作用并且極接近于apoc-iii可能對(duì)此活性來(lái)說(shuō)為關(guān)鍵的。av-肽也位于活細(xì)胞系統(tǒng)中，并且在存在不同脂酶家族成員(例如lpl和hl)的情況下起作用的能力還指示av-肽可具有強(qiáng)體內(nèi)存在度，并且對(duì)htg具有治療性影響。最后，在結(jié)構(gòu)域-h中將h用k取代已大體上改善av199-232肽的性能?；谠谡归_本文所描述的實(shí)施方案期間所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，在本文所描述的范圍內(nèi)的其他修飾預(yù)期可具有類似改善的性能。
實(shí)施例4
在展開本文中的實(shí)施方案期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)av199-232結(jié)合vldl并且肽-脂蛋白復(fù)合物刺激lpl活性。將vldl(100μg)與av199-232(50μg)一起孵育并且在瓊脂糖cl-4b柱上通過(guò)凝膠過(guò)濾將復(fù)合物與游離肽分離(圖15a)。含有vldl:av199-232復(fù)合物的空隙部分(vo)在刺激lpl活性方面為有效的(圖15b)。
在展開本文中的實(shí)施方案期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定在av-h/k肽的結(jié)構(gòu)域l中的突變關(guān)鍵殘基的作用，并且結(jié)果表明調(diào)整本文中的av肽的脂質(zhì)結(jié)合階段的取代適合用于改善脂酶刺激性能。av-h/k中的l10f和l29f取代(seqidno:23)使得脂酶刺激活性提高約2倍，而l10q、l21q以及l(fā)29q取代(seqidno:22)降低脂酶刺激活性(圖16a,b)。預(yù)期l結(jié)構(gòu)域中的l至f以及l(fā)至q取代分別使得與vldl的結(jié)合增加和降低。將肽(80μg/ml)與vldl(20μg/ml)一起預(yù)孵育，然后添加lpl和底物。在室溫下連續(xù)監(jiān)測(cè)脂酶反應(yīng)持續(xù)16min(a)，或者在37℃下孵育10min(b)。
實(shí)施例5
av199-232的丙氨酸掃描
在展開本文中的實(shí)施方案期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定av199-232的單個(gè)的殘基的側(cè)鏈身份的相對(duì)重要性。為此，對(duì)av199-232肽進(jìn)行丙氨酸掃描，將每個(gè)殘基單個(gè)地以丙氨酸殘基加以置換(除了位置1、18、20以及23，這些位置已為丙氨酸)，并且評(píng)估所得肽的脂酶刺激活性(圖18)。脂酶刺激活性顯著降低確定一個(gè)位置對(duì)于直接結(jié)合于lpl來(lái)說(shuō)為重要的或者在幫助正確安置av199-232中的lpl刺激殘基中發(fā)揮間接結(jié)構(gòu)性作用?；谶@些數(shù)據(jù)，殘基大致分為三個(gè)類別：(1)用丙氨酸置換產(chǎn)生av199-232的>75％脂酶刺激活性的殘基，(2)用丙氨酸置換產(chǎn)生av199-232的25-75％脂酶刺激活性的殘基，以及(3)用丙氨酸置換產(chǎn)生av199-232的<25％脂酶刺激活性的殘基。丙氨酸掃描的結(jié)果表明歸入這三個(gè)類別的殘基的側(cè)鏈(1)與脂酶刺激最低程度相關(guān)，(2)與脂酶刺激適度相關(guān)，以及(3)與脂酶刺激高度相關(guān)。在圖18中將在av199-232序列中的大多數(shù)高度相關(guān)的殘基加下劃線。這些結(jié)果與本文所呈現(xiàn)的生物化學(xué)研究(實(shí)施例2和3)、分子模型化研究(實(shí)施例6)以及生物信息學(xué)(實(shí)施例8)數(shù)據(jù)一致。
實(shí)施例6
分子模型化和3d對(duì)接
通過(guò)使用phyre2的基于同源性的模型化繼之以在galaxyweb進(jìn)行的模型改進(jìn)來(lái)產(chǎn)生lpl(左)和av199-232(右)的3d結(jié)構(gòu)(圖19)。以兩種姿態(tài)示出lpl，突出顯示不同功能區(qū)域。催化三元體(s132、d156、h241)位于具有充當(dāng)覆蓋催化袋的蓋子的相關(guān)聯(lián)22殘基環(huán)的”袋”中，并且在底物識(shí)別中起作用(圖19，左/上)。av199-232模型被示出具有結(jié)構(gòu)域l(面向下的疏水性脂質(zhì)結(jié)合域)(圖19，右)。
使用cluspro2.0(cluspro.bu.edu/login.php)進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)以評(píng)估apoc-iii與lpl的結(jié)合(圖20)。以條帶狀視圖示出lpl，并且apoc-iii被示出具有呈球形形式的側(cè)鏈。對(duì)于apoc-iii(pdbid：2jq3)，預(yù)測(cè)對(duì)接在脂酶催化位點(diǎn)附近，并且apoc-iii的n端序列連接至蓋序列的近端邊緣。
使用cluspro2.0(cluspro.bu.edu/login.php)進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)以評(píng)估av199-232與lpl的結(jié)合。呈現(xiàn)排在頂部的姿態(tài)(最高成簇?cái)?shù)(highestclusternumber))(圖21和22)，示出lpl(條帶(圖21)或主鏈(圖22)):av199-232(側(cè)鏈球)復(fù)合物(左側(cè)圖片)。相互作用可因側(cè)鏈隔開約
實(shí)施例7
體內(nèi)lpl活性刺激
在展開本文中的實(shí)施方案期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)av-肽在刺激人類血液樣品中的lpl活性中具活性，并且因此預(yù)期在體內(nèi)起刺激作用。圖23a證實(shí)在從新鮮人類血液分離的活白細(xì)胞中的lpl對(duì)av199-232治療作出反應(yīng)。用肝素移除細(xì)胞表面lpl使活性降低。在人類血漿存在下av-h/k也刺激lpl(圖23b)。
血漿含有具有作為lpl活性的已知抑制劑的apoc-iii和angpt4的脂蛋白。然而，av199-232刺激活白細(xì)胞中的lpl活性(圖23c)。在正常和脂代謝異常血漿存在下，av199-232刺激lpl活性(圖23d)。將av199-232與來(lái)自正常和糖尿病/脂代謝異常血漿的全血漿一起孵育，并且然后通過(guò)peg-8000沉淀分離富tg脂蛋白(lp)，并且添加至lpl分析物中(30μg/ml)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)av199-232與血漿中的lpl締合并且將其活化。
實(shí)施例8
av199-232同源性分析
由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，以確定av199-232肽序列的直系同源物，并且確定在類似序列之間不變或可允許取代的殘基。使用在ncbiblastp網(wǎng)站上的缺省參數(shù)。表1中對(duì)結(jié)果進(jìn)行了整理，以確定一組對(duì)av199-232肽中的殘基適合的氨基酸取代。
表1.
以下所列和/或本文提供的所有出版物和專利是以全文引用的方式并入本文中。所描述的本發(fā)明組合物和方法的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將顯而易見(jiàn)，而不會(huì)背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然已結(jié)合特定優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)了解如所要求的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度受限于此類特定實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)所描述的用于進(jìn)行本發(fā)明的模式所進(jìn)行的對(duì)相關(guān)領(lǐng)域熟練人員來(lái)說(shuō)明顯的各種修改旨在在本發(fā)明范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)
以下參考文獻(xiàn)(其中一些也在上文中通過(guò)名稱和/或編號(hào)進(jìn)行引用)是以全文引用的方式并入本文中。
1.do，r.，etal.，(2013)commonvariantsassociatedwithplasmatriglyceridesandriskforcoronaryarterydiseasenat.genet.45，1345-1352
2.ford，e.s.，li，c.，zhao，g.，pearson，w.s.，mokdad，a.h.(2009)hypertriglyceridemiaanditspharmacologictreatmentamongusadults.arch.intern.med.169，572-578
3.christian，j.b.，bourgeois，n.，snipes，r.，lowe，k.a.(2011)prevalenceofsevere(500to2,000mg/dl)hypertriglyceridemiainunitedstatesadults.am.j.cardiol.107，891-897
4.pennacchio，l.a.，olivier，m.，hubacek，j.a.，cohen，j.c.，cox，d.r.，fruchart，j.c.，krauss，r.m.，rubin，e.m.(2001)anapolipoproteininfluencingtriglyceridesinhumansandmicerevealedbycomparativesequencing.science294，169-173
5.vandervliet，h.n.，sammels，m.g.，leegwater，a.c.，levels，j.h.，reitsma，p.h.，boers，w.，chamuleau，r.a.(2001)apolipoproteina-v：anovelapolipoproteinassociatedwithanearlyphaseofliverregeneration.j.biol.chem.276，44512-44520
6.o′brien，p.j.，alborn，w.e.，sloan，j.h.，ulmer，m.，boodhoo，a.，knierman，m.d.，schultze，a.e.，konrad，r.j.(2005)thenovelapolipoproteina5ispresentinhumanserum，isassociatedwithvldl，hdl，andchylomicrons，andcirculatesatverylowconcentrationscomparedwithotherapolipoproteins.clin.chem.51，351-359
7.olofsson，s.o.(2005)apoa-v：theregulationofaregulatorofplasmatriglycerides.arterioscler.thromb.vasc.biol.25，1097-1099
8.fruchart-najib，j.，bauge，e.，niculescu，l.s.，pham，t.，thomas，b.，rommens，c.，majd，z.，brewer，b.，pennacchio，l.a.，fruchart，j.c.(2004)mechanismoftriglycerideloweringinmiceexpressinghumanapolipoproteina5.biochem.biophys.res.commun.319，397-404
9.schaap，f.g.，rensen，p.c.，voshol，p.j.，vrins，c.，vandervliet，h.n.，chamuleau，r.a.，havekes，l.m.，groen，a.k.，vandijk，k.w.(2004)apoavreducesplasmatriglyceridesbyinhibitingverylowdensitylipoprotein-triglyceride(vldl-tg)productionandstimulatinglipoproteinlipase-mediatedvldl-tghydrolysis.j.biol.chem.279，27941-27947
10.sarwar，n.，sandhu，m.s.，ricketts，s.l.，butterworth，a.s.，di，a.e.，boekholdt，s.m.，ouwehand，w.，watkins，h.，samani，n.j.，saleheen，d.，lawlor，d.，reilly，m.p.，hingorani，a.d.，talmud，p.j.，danesh，j.(2010)triglyceride-mediatedpathwaysandcoronarydisease：collaborativeanalysisof101studies.lancet375，1634-1639
11.nilsson，s.k.，heeren，j.，olivecrona，g.，merkel，m.(2011)apolipoproteina-v，apotenttriglyceridereducer.atherosclerosis219，15-21
12.pennacchio，l.a.，olivier，m.，hubacek，j.a.，krauss，r.m.，rubin，e.m.，cohen，j.c.(2002)twoindependentapolipoproteina5haplotypesinfluencehumanplasmatriglyceridelevels.hum.mol.genet.11，3031-3038
13.charriere，s.，bernard，s.，aqallal，m.，merlin，m.，billon，s.，perrot，l.，le，c.e.，sassolas，a.，moulin，p.，marcais，c.(2008)associationofapoa5-1131t＞cands19wgenepolymorphismswithbothmildhypertriglyceridemiaandhyperchylomicronemiaintype2diabeticpatients.clin.chim.acta394，99-103
14.talmud，p.j.，martin，s.，taskinen，m.r.，frick，m.h.，nieminen，m.s.，kesaniemi，y.a.，pasternack，a.，humphries，s.e.，syvanne，m.(2004)apoa5genevariants，lipoproteinparticledistribution，andprogressionofcoronaryheartdisease：resultsfromthelocatstudy.j.lipidres.45，750-756
15.priore，o.c.，pisciotta，l.，li，v.g.，sambataro，m.p.，cantafora，a.，bellocchio，a.，catapano，a.，tarugi，p.，bertolini，s.，calandra，s.(2005)inheritedapolipoproteina-vdeficiencyinseverehypertriglyceridemia.arterioscler.thromb.vasc.biol.25，411-417
16.priore，o.c.，carubbi，f.，schaap，f.g.，bertolini，s.，calandra，s.(2008)hypertriglyceridaemiaandlowplasmahdlinapatientwithapolipoproteina-vdeficiencyduetoanovelmutationintheapoa5gene.j.intern.med.263，450-458
17.tang，y.，sun，p.，guo，d.，ferro，a.，ji，y.，chen，q.，fan，l.(2006)ageneticvariantc.553g＞tintheapolipoproteina5geneisassociatedwithanincreasedriskofcoronaryarterydiseaseandalteredtriglyceridelevelsinachinesepopulation.atherosclerosis185，433-437
18.pullinger，c.r.，aouizerat，b.e.，movsesyan，i.，durlach，v.，sijbrands，e.j.，nakajima，k.，poon，a.，dallinga-thie，g.m.，hattori，h.，green，l.l.，kwok，p.y.，havel，r.j.，frost，p.h.，malloy，m.j.，kane，j.p.(2008)anapolipoproteina-vgenesnpisassociatedwithmarkedhypertriglyceridemiaamongasian-americanpatients.j.lipidres.49，1846-1854
19.sharma，v.，witkowski，a.，witkowska，h.e.，dykstra，a.，simonsen，j.b.，nelbach，l.，beckstead，j.a.，pullinger，c.r.，kane，j.p.，malloy，m.j.，watson，g.，forte，t.m.，ryan，r.o.(2014)aberranthetero-disulfidebondformationbythehypertriglyceridemia-associatedp.gly185cysapoa5variant(rs2075291).arterioscler.thromb.vasc.biol.34，2254-2260
20.nilsson，s.k.，lookene，a.，beckstead，j.a.，gliemann，j.，ryan，r.o.，olivecrona，g.(2007)apolipoproteina-vinteractionwithmembersofthelowdensitylipoproteinreceptorgenefamily.biochemistry46，3896-3904
21.sun，g.，bi，n.，li，g.，zhu，x.，zeng，w.，wu，g.，xue，h.，chen，b.(2006)identificationoflipidbindingandlipoproteinlipaseactivationdomainsofhumanapoav.chem.phys.lipids143，22-28
22.basu，d.，manjur，j.，jin，w.(2011)determinationoflipoproteinlipaseactivityusinganovelfluorescentlipaseassay.j.lipidres.52，826-832
序列表
<110>芝加哥大學(xué)
<120>合成肽
<130>uchi-34207/tw-1/ord
<150>us62/082,902
<151>2014-11-21
<160>29
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>343
<212>prt
<213>智人
<400>1
arglysglyphetrpasptyrpheserglnthrserglyasplysgly
151015
argvalgluglnilehisglnglnlysmetalaarggluproalathr
202530
leulysaspserleugluglnaspleuasnasnmetasnlyspheleu
354045
glulysleuargproleuserglyserglualaproargleuprogln
505560
aspprovalglymetargargglnleuglnglugluleuglugluval
65707580
lysalaargleuglnprotyrmetalaglualahisgluleuvalgly
859095
trpasnleugluglyleuargglnglnleulysprotyrthrmetasp
100105110
leumetgluglnvalalaleuargvalglngluleuglngluglnleu
115120125
argvalvalglygluaspthrlysalaglnleuleuglyglyvalasp
130135140
glualatrpalaleuleuglnglyleuglnserargvalvalhishis
145150155160
thrglyargphelysgluleuphehisprotyralagluserleuval
165170175
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180185190
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195200205
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325330335
hisserhisleuglyasppro
340
<210>2
<211>60
<212>prt
<213>智人
<400>2
prohisalaproalaserproalaargleuserargcysvalglnval
151015
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354045
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505560
<210>3
<211>39
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<400>3
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151015
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202530
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35
<210>4
<211>29
<212>prt
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<400>4
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151015
glnasnleuaspglnleuargglugluleuserargala
2025
<210>5
<211>34
<212>prt
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<400>5
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<210>6
<211>32
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<400>6
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<210>7
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<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(13)..(13)
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<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(17)..(17)
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<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(22)..(22)
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<221>雜項(xiàng)特征
<222>(17)..(17)
<223>xaa=k或q
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(22)..(22)
<223>xaa=h、k或q
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35
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<212>prt
<213>智人
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<400>23
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>突變野生型肽
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(3)..(3)
<223>xaa=l、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(4)..(4)
<223>xaa=s、t、n或g
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(5)..(5)
<223>xaa=r、k、高賴氨酸或高精氨酸
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(6)..(6)
<223>xaa=c、s、t、n、q、y或h
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(7)..(7)
<223>xaa=v、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(10)..(10)
<223>xaa=l、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(12)..(12)
<223>xaa=r、k、hlys或harg
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(13)..(13)
<223>xaa=k、r、harg、hlys或orn
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(14)..(14)
<223>xaa=l、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(17)..(17)
<223>xaa=k、r、harg、hlys或orn
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(18)..(18)
<223>xaa=a、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(19)..(19)
<223>xaa=r、k、hlys或harg
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(21)..(21)
<223>xaa=l、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(22)..(22)
<223>xaa=h、k、hlys、r、harg或orn
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(25)..(25)
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<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(29)..(29)
<223>xaa=l、f、y或w
<220>
<221>雜項(xiàng)特征
<222>(32)..(32)
<223>xaa=l、f、y或w
<400>29
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151015
xaaxaaxaaalaxaaxaaalaargxaaglnglnasnxaaaspglnxaa
202530
argglu
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