發(fā)明背景

癌癥是全球死亡的主要原因之一。在2015年，將在美國(guó)診斷出預(yù)計(jì)1,658,370例新癌癥病例，并且589,430人將死于所述疾病。僅在美國(guó)，每天就有1,500例死亡歸因于癌癥，這一數(shù)字為每天每4例死亡中大約1例。癌癥也是全球死亡的主要原因之一。在2012年，全世界有1400萬(wàn)診斷的新病例和820萬(wàn)例癌癥相關(guān)的死亡，并且到2030年所述數(shù)字預(yù)計(jì)為1300萬(wàn)。大多數(shù)癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移引起的，對(duì)于癌癥沒(méi)有有效的分子成像方法來(lái)檢測(cè)腫瘤及其轉(zhuǎn)移，也沒(méi)有治療來(lái)有效地消除局部和播散性腫瘤的生長(zhǎng)。

本發(fā)明涉及一類(lèi)近紅外(nir)含花青染料。與治療藥物化學(xué)綴合的nir染料(下文稱(chēng)為nir染料-藥物綴合物)引起nir染料-藥物綴合物在癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞中的有效攝取和保留。這一類(lèi)nir染料-藥物綴合物對(duì)癌癥而非正常細(xì)胞的特異性是基于與正常細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中膜載體蛋白，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽(oatp)的過(guò)度表達(dá)。oatp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制通過(guò)腫瘤缺氧進(jìn)一步增強(qiáng)。

支持oatp在介導(dǎo)nir染料-藥物綴合物在癌細(xì)胞中的攝取和保留中的作用的證據(jù)如下：1)與正常細(xì)胞相比，oatp在癌細(xì)胞中以較高水平表達(dá)；2)由于通過(guò)癌細(xì)胞中增強(qiáng)的缺氧誘導(dǎo)因子1(hif-1α)誘導(dǎo)oatp基因的轉(zhuǎn)錄，oatp的表達(dá)通過(guò)腫瘤缺氧進(jìn)一步增強(qiáng)；3)nir染料-藥物綴合物在腫瘤細(xì)胞中的攝取和保留可通過(guò)磺溴酞鈉(bsp)(一種已知的競(jìng)爭(zhēng)性oatp抑制劑)消除；4)因?yàn)閛atp在細(xì)胞中的功能是能量依賴(lài)性的，所以作為藥物、代謝物和激素的載體，在癌細(xì)胞中通過(guò)oatp對(duì)nir染料-藥物綴合物的攝取和保留也是能量依賴(lài)性的并且僅在活細(xì)胞中發(fā)生；5)在癌細(xì)胞中oatp的某些同種型的遺傳敲低防止nir染料-藥物綴合物在癌細(xì)胞中的攝取和保留，而癌細(xì)胞中oatp的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)nir染料-藥物綴合物在癌細(xì)胞中的攝取和保留；以及6)已知nir染料-藥物綴合物與核酸和蛋白質(zhì)非共價(jià)相互作用，并且因此一旦nir染料-藥物綴合物進(jìn)入癌細(xì)胞，它們就被捕獲在癌細(xì)胞的線(xiàn)粒體和溶酶體區(qū)室中。

這些結(jié)果為腫瘤細(xì)胞對(duì)這一類(lèi)nir染料-藥物綴合物的基于oatp的攝取和保留建立基礎(chǔ)。

發(fā)明概述

本發(fā)明是基于nir染料-藥物綴合物被癌細(xì)胞吸收且保留但不被正常細(xì)胞吸收且保留的能力，這種作用是由oatp介導(dǎo)的。nir染料-藥物綴合物的化學(xué)實(shí)體包括三個(gè)部分：1)nir染料，其作為靶向配體以用于通過(guò)癌細(xì)胞的上調(diào)的oatp進(jìn)入所述癌細(xì)胞。在將這種靶向配體(nir染料)與放射性核素(如cu-64、ga-68、f-18、tc-99、lu-177、zo-89、th-227和gd-157)進(jìn)一步綴合后，所述靶向配體可通過(guò)熒光以及pet(正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))或spect(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù))成像；2)潛在展現(xiàn)自限性毒性的治療劑，如吉西他濱和順鉑；以及3)接頭，其將所述靶向配體連接至所述治療劑以用于一旦在癌細(xì)胞中就有效遞送和/或有效釋放治療劑。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，nir染料-藥物綴合物可跨越癌細(xì)胞膜、血腦屏障、骨髓空間，以及由轉(zhuǎn)移引起的駐留在多個(gè)繼發(fā)器官部位(如肺、肝、腎、淋巴結(jié)、腦、骨、胃和消化系統(tǒng)、腹膜內(nèi)空間)中的轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤和駐留在原發(fā)器官中(如在前列腺、肺、乳腺、肝、結(jié)腸、腎、膀胱、胰腺、睪丸、卵巢、腦、骨髓、血液和消化系統(tǒng)中)的原發(fā)性腫瘤。由于與正常細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中nir染料-藥物綴合物攝取和保留的顯著更高水平，所以本發(fā)明的實(shí)施方案顯示nir染料-藥物綴合物作為治療和診斷小鼠中的人前列腺、胰腺和腦腫瘤的雙重癌癥成像和治療劑的有效性。

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及三個(gè)方面。第一，本發(fā)明人鑒定了用于由癌細(xì)胞有效攝取和保留的nir染料-藥物綴合物的重要結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)將化學(xué)綴合物連接在nir染料的不同位置，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了最有利的位置，在所述位置中相對(duì)于正常細(xì)胞，化學(xué)綴合不太可能影響n(yōu)ir染料-藥物綴合物轉(zhuǎn)運(yùn)到癌細(xì)胞中的特異性。第二，本發(fā)明人選擇了兩種因其自限性毒性而眾所周知的常用藥物(即吉西他濱和順鉑)以證明使用化學(xué)綴合的化學(xué)療法的功效。這顯著降低了這些藥物在小鼠中的毒性，增加了通過(guò)oatp介導(dǎo)的這些藥物有效轉(zhuǎn)運(yùn)到癌細(xì)胞中，并且減少了藥物的劑量但仍實(shí)現(xiàn)針對(duì)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的相同治療有效性。第三，本發(fā)明人證明了這些nir染料-藥物綴合物在已知導(dǎo)致男性中的顯著死亡率和發(fā)病率并且目前沒(méi)有有效療法的最致命的人腫瘤(即人前列腺癌和胰腺癌以及腦腫瘤)中的有效性。

附圖簡(jiǎn)述

圖1(a)描繪根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)用于靶向癌癥的花青-染料(dz-1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1(b)描繪根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)用于靶向癌癥療法的dz-1-吉西他濱綴合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1(c)描繪根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)用于靶向癌癥療法的dz-1-順鉑綴合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2.藥物-載體綴合物的概念設(shè)計(jì)。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的dz-1吉西他濱(左圖)和dz-1-順鉑(右圖)攝取至小鼠中的前列腺癌pc3腫瘤的的結(jié)果。

圖4示出dz-1-吉西他濱的表征的結(jié)果。(a)u87和cw22rv1細(xì)胞對(duì)dz-1-gem(5μm，10分鐘)的攝取。ir-783用作并行陽(yáng)性對(duì)照。比例尺表示50μm。(b)用媒介物、吉西他濱(200nm)或dz-1-gem(200nm)處理連續(xù)4天的u87細(xì)胞的增殖。將細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫染色，且測(cè)定在595nm波長(zhǎng)下的od值(對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組n＝5，平均值±sem))*p<0.05，**p<0.01。(c)用媒介物或dz-1-gem(10mg/kg，一周兩次)處理的攜帶顱內(nèi)u87腫瘤的小鼠的代表性bli圖像(d)來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的u87腫瘤生長(zhǎng)的bli曲線(xiàn)(n＝2，平均值±sem)在(c)中，**p<0.01。(e)攜帶cw22rv1前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移的小鼠的卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)存活曲線(xiàn)，所述小鼠用媒介物(n＝6)或dz-1-gem(10mg/kg，一周兩次)(n＝4)處理，p<0.001(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。

圖5示出胰腺miapaca皮下腫瘤對(duì)吲哚菁綠(icg)和dz-1-吉西他濱的攝取的結(jié)果。(a)在icg注射(7.2mg/kg，腹膜內(nèi))后兩天，攜帶miapaca皮下腫瘤的小鼠的代表性nir熒光成像(b)腫瘤和無(wú)腫瘤區(qū)域(n＝3)的總輻射效率的攝取強(qiáng)度的定量分析(c)在dz-1吉西他濱注射(10mg/kg，腹膜內(nèi))后兩天，攜帶miapaca皮下腫瘤的小鼠的代表性nir熒光成像(b)腫瘤和無(wú)腫瘤區(qū)域(n＝3)的總輻射效率的攝取強(qiáng)度的定量分析*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖6通過(guò)腫瘤體積示出ir-783(陰性對(duì)照)、吉西他濱(陽(yáng)性對(duì)照)和dz-1-吉西他濱對(duì)體內(nèi)前列腺和胰腺腫瘤生長(zhǎng)的影響。通過(guò)用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的小鼠中前列腺癌pc3細(xì)胞的腫瘤體積測(cè)量的皮下腫瘤生長(zhǎng)的(a)預(yù)防和(b)抑制研究。通過(guò)用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的小鼠中胰腺miapaca細(xì)胞的腫瘤體積測(cè)量的皮下腫瘤生長(zhǎng)的(c)預(yù)防和(d)抑制研究。箭頭表示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖7示出ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺和胰腺腫瘤的小鼠中的小鼠重量的影響。在用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的皮下pc3和miapaca腫瘤的(a，c)預(yù)防和(b，d)抑制研究中測(cè)量小鼠重量。箭頭指示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖8示出植入小鼠腎囊下中的前列腺pdx腫瘤對(duì)nir染料mhi-148的攝取。(a)無(wú)腫瘤的對(duì)照小鼠和在腎的腎囊下中具有假手術(shù)和pca植入的小鼠的代表性nir熒光成像。在783nm的激發(fā)和840nm的發(fā)射下熒光成像前48小時(shí)，將小鼠腹膜內(nèi)注射nir染料，mhi-148。僅植入右腎的腎囊下中的pca腫瘤顯示nir熒光信號(hào)，但是左側(cè)的假手術(shù)腎和對(duì)照小鼠都未顯示nir熒光信號(hào)。(b)具有假手術(shù)和pca腫瘤植入的腎的代表性離體nir熒光成像。僅在植入右腎的腎囊下中的生長(zhǎng)pca腫瘤中檢測(cè)到nir熒光信號(hào)。(c)來(lái)自腎下異種移植物模型的人pca腫瘤和小鼠腎的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查(200倍放大率)(d)植入小鼠腎囊中的pca腫瘤的代表性h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

圖9示出植入小鼠腎囊下中的胰腺pdx腫瘤對(duì)nir染料mhi-148的攝取。(a)在腎下囊中攜帶人胰腺pdx腫瘤的小鼠的nir熒光成像(激發(fā)：783nm；激發(fā)：840nm)(b)從小鼠收獲的腎囊和其他器官中的胰腺pdx腫瘤的離體明場(chǎng)和nir熒光成像以及(c)對(duì)于腫瘤和每個(gè)器官定量nir熒光強(qiáng)度(總輻射效率[p/s]/[μw/cm²])(d)腎囊中的胰腺pdx腫瘤的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查。白色虛線(xiàn)描畫(huà)小鼠腎的輪廓，并且紅色虛線(xiàn)描畫(huà)胰腺pdx腫瘤的輪廓。僅胰腺腫瘤攝取nir染料，但小鼠腎不攝取(200倍放大率)(d)小鼠腎囊中胰腺pdx腫瘤的h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

圖10示出植入小鼠腎囊下中的正常胰腺pdx組織對(duì)nir染料mhi-148的攝取。(a)在腎下囊中攜帶人胰腺pdx腫瘤的小鼠的nir熒光成像(激發(fā)：783nm；激發(fā)：840nm)(b)從小鼠收獲的腎囊和其他器官中的胰腺pdx腫瘤的離體明場(chǎng)和nir熒光成像以及(c)對(duì)于腫瘤和每個(gè)器官定量nir熒光強(qiáng)度(總輻射效率[p/s]/[μw/cm²])(d)腎囊中的胰腺pdx腫瘤的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查。白色虛線(xiàn)描畫(huà)小鼠腎的輪廓，并且紅色虛線(xiàn)描畫(huà)胰腺pdx腫瘤的輪廓。僅胰腺腫瘤攝取nir染料，但小鼠腎不攝取(200倍放大率)(d)小鼠腎囊中正常胰腺pdx組織的h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

圖11示出由小鼠中的前列腺和胰腺腫瘤而非正常器官特異性地?cái)z取dz-1-吉西他濱。(a)用dz-1-吉西他濱(10mg/kg)處理的攜帶皮下luc標(biāo)記的pc3腫瘤的小鼠的代表性生物發(fā)光和nir熒光(在783nm下激發(fā)和在840nm下發(fā)射)圖像(b)小鼠的pc3腫瘤和器官(心臟、肺、腎、肝和脾)的代表性離體生物發(fā)光和nir熒光成像。(c)用dz-1-吉西他濱(10mg/kg)處理的攜帶皮下luc標(biāo)記的miapaca腫瘤的小鼠的代表性生物發(fā)光和nir熒光(在783nm下激發(fā)和在840nm下發(fā)射)圖像(d)小鼠的miapaca腫瘤和器官(心臟、肺、腎、肝和脾)的代表性離體生物發(fā)光和nir熒光成像。

圖12示出ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺和胰腺腫瘤的小鼠中的腫瘤重量的影響。在用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的皮下pc3和miapaca腫瘤的(a，c)預(yù)防和(b，d)抑制研究中測(cè)量腫瘤重量。箭頭表示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖13示出ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺pc3和胰腺miapaca腫瘤的小鼠的存活的影響。分別在前列腺癌和胰腺癌的(a，c)預(yù)防和(b，d)抑制研究中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝5)中的小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線(xiàn)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖14示出dz-1-吉西他濱染料-藥物綴合物(nirg)在顱內(nèi)u87腫瘤異種移植物中的攝取和保留。(a)如在染料注射后第1小時(shí)和第24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)體內(nèi)nirf成像測(cè)定的顱內(nèi)u87腫瘤異種移植物對(duì)nirg(50nmol/小鼠，腹膜內(nèi))的攝取。示出代表性圖像。(b)(a)中的攝取強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)**p<0.01。(c)如在染料注射后第24小時(shí)通過(guò)離體nirf成像測(cè)定的從(b)解剖的小鼠腦和其他指示器官對(duì)nirg的攝取和保留。(d)(d)中的器官特異性nirf信號(hào)強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)與腦相比*p<0.05，**p<0.01。

圖15示出ir-783-吉西他濱染料-藥物綴合物(nirg)在異種移植物前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的攝取和保留。(a，b)使攜帶cw22rv1前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移的小鼠在nirg(50nmol/小鼠，腹膜內(nèi))后第24小時(shí)進(jìn)行體內(nèi)bli和nirf成像(a)將小鼠腦和對(duì)照腎隨后切除并離體進(jìn)行兩種成像模態(tài)(b)(c)(b)中的bli和nirf信號(hào)強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)*p<0.05，**p<0.01。(d)攜帶腫瘤的小鼠腦的mrit2掃描。腫瘤區(qū)域以紅色虛線(xiàn)圓圈表示。(e)前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移(t)的h&e染色。黃色箭頭表示侵入性邊緣。原始放大率，400；比例尺：20mm。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及七甲川花青(heptamethinecyanine)染料，所述七甲川花青染料充當(dāng)載體分子來(lái)特異性地遞送藥物以提高癌癥化學(xué)療法的精確度，并且在nir染料-藥物綴合物的情況下，這些染料可充當(dāng)用于癌癥診斷和治療隨訪(fǎng)的可通過(guò)熒光和/或核成像檢測(cè)的雙重模態(tài)成像和治療劑。已經(jīng)證明，當(dāng)與其正常細(xì)胞對(duì)應(yīng)物相比時(shí)，某些類(lèi)型的七甲川花青染料具有靶向癌細(xì)胞的優(yōu)先能力，并且具有在腫瘤中積聚的能力。腫瘤中七甲川花青部分的優(yōu)先攝取顯示與多種癌細(xì)胞類(lèi)型中以及在腫瘤的缺氧微環(huán)境下某些類(lèi)型的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽(oatp)的表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。已經(jīng)證明了通過(guò)與七甲川花青染料綴合來(lái)將治療診斷劑的變體靶向遞送至腫瘤。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可包括：1)七甲川花青染料特異性地靶向廣譜癌細(xì)胞系和腫瘤模型，因此可通用用于與多種化學(xué)治療藥物綴合以治療各種癌癥，以及2)在單個(gè)小分子實(shí)體中成像和治療(即，治療診斷)的組合特征，其允許高細(xì)胞內(nèi)積聚以降低與化學(xué)療法相關(guān)的毒性。

本發(fā)明涉及載體-接頭-藥物綴合物體系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，一類(lèi)具有近紅外(nir)特性且可充當(dāng)靶向藥物遞送的載體分子的癌癥靶向七甲川花青染料。本發(fā)明的七甲川染料藥物綴合物由下式表示：

式i

r1和r2可各自獨(dú)立地選自由以下組成的組：-h、烷基、烷基磺酸酯、烷基羧酸、烷基氨基、芳基、-so3h、-po3h、-oh、-nh2和-鹵素，并且可獨(dú)立地連接在各種芳環(huán)位置如3、3'、4、4'、5、5'、6、6'；任何吸電子基團(tuán)(ewg)和供電子基團(tuán)(edg)可獨(dú)立地連接在各種芳環(huán)位置。

側(cè)鏈y(cè)1和y2可選自由以下組成的組：烷基、芳基、芳烷基、烷基磺酸酯、烷基羧酸、烷基氨基、ω-烷基銨、ω-炔基、peg基、peg基羧酸酯、ω-peg基銨、ω-?；?nh、ω-?；?賴(lài)氨?；?、ω-?；?三唑、ω-peg基羧基-nh-、ω-peg基羧基-賴(lài)氨?；ⅵ?peg基羧基-三唑。

x可選自由以下組成的組：氫、鹵素、cn、me、nh2、sh和oh。

七甲川花青染料分子可以是對(duì)稱(chēng)的(r1＝r2且y1＝y(tǒng)2)或不對(duì)稱(chēng)的(r1≠r2，y1＝y(tǒng)2；r1＝r2，y1≠y2；或r1≠r2，y1≠y2)

治療部分r3和r4可選自由以下組成的組：任何治療劑，包括基于鉑的藥劑、小分子、肽、蛋白質(zhì)、聚合物、sirna、微小rna和納米顆粒。治療劑可通過(guò)酰胺鍵、酯鍵、醚鍵、氨基甲酸酯鍵、二硫鍵、腙鍵或非共價(jià)相互作用與側(cè)鏈y(cè)連接，并且可在染料側(cè)鏈的一個(gè)單側(cè)(r4或r3＝h)或兩側(cè)綴合。

r3和r4分別還可以是成像部分和/或治療有效載荷。成像部分可以是以下中的任一種：(1)放射性同位素，包括f18、i-125、i-124、i-123、i-131，以及用這些同位素標(biāo)記的小分子部分；和(2)螯合劑絡(luò)合的放射性金屬同位素，包括cu-64、in-111、tc-99m和ga-68部分。

如本文所用，“成像和/或治療部分”是指所述部分可用作成像劑、治療劑、以及成像劑和治療劑兩者。成像和治療劑(雙重功能)的實(shí)例可包括放射性核素，其可通過(guò)其輻射成像，同時(shí)輻射也可殺死癌細(xì)胞。

使用七甲川花青染料-藥物綴合物作為用于癌癥成像和治療的治療診斷劑的本發(fā)明的實(shí)施方案具有若干優(yōu)點(diǎn)，所述優(yōu)點(diǎn)可包括以下中的一個(gè)或多個(gè)：1)與納米材料、聚合物和生物大分子(抗體)不同，具有低分子量的明確定義的小分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有高再現(xiàn)性和一致性；2)僅需要兩種化學(xué)組分來(lái)提供多功能治療診斷劑以用于同時(shí)檢測(cè)、成像和治療，而無(wú)需額外的化學(xué)組分；3)作為載體的花青染料可靶向各種腫瘤類(lèi)型且因此所述染料-藥物綴合物可對(duì)于各種癌癥盡可能的通用；4)單一花青染料可與多種等效的藥物綴合以進(jìn)一步擴(kuò)大化學(xué)療法的有效性；和5)不同的花青染料-藥物綴合物可以順序的方式用于患者或臨床前模型中，并且當(dāng)對(duì)于一種染色-藥物綴合物發(fā)展抗性時(shí)可通過(guò)轉(zhuǎn)換至第二染料-藥物綴合物來(lái)使用。一個(gè)實(shí)例可以是初始使用dz-1-吉西他濱綴合物，然后在對(duì)dz-1-吉西他濱綴合物發(fā)展抗性時(shí)使用dz-1-順鉑。這種順序治療由于它們的不同作用機(jī)制和抗性機(jī)制而應(yīng)該更有效。

本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于靶向癌癥治療的基于七甲川花青的藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的染料-藥物綴合物包含三種組分：載體配體、成像和/或治療劑、以及將所述配體連接至所述成像和/或治療劑的接頭。圖1示出此類(lèi)化合物的一些實(shí)例：七甲川花青染料(dz-1)，和兩種染料-藥物綴合物。

基于七甲川花青染料的靶向配體通常包含連接多烯體系的兩端上的兩種吲哚類(lèi)似物的多烯橋/體系。吸電子基團(tuán)或供電子基團(tuán)可添加至靶向配體。這些靶向配體是花青染料類(lèi)似物和近紅外發(fā)射染料。這些靶向配體具有650-900nm范圍內(nèi)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。所述靶向配體可包含2至4個(gè)綴合雙鍵(即，多烯體系)和兩種吲哚類(lèi)似物結(jié)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，治療藥物可經(jīng)由合適的接頭綴合至七甲川花青載體部分。接頭模塊可包含烷基、芳香族基團(tuán)、與單個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽鍵聯(lián)和/或親水性聚乙二醇(peg)部分，以?xún)?yōu)化溶解性和清除性質(zhì)。藥物可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)與接頭的末端綴合。配體或藥物上的官能團(tuán)例如可包括鹵素原子、cooh、nh2、oh、sh琥珀酸酯、腈、炔、肼、疊氮化物、醛、酮、磺酸、磷酸、烷基、芳香族基團(tuán)、酯、酰胺、脲、硫脲、咪唑、硫酯、丙烯酸酯、硫醇醚、二硫代酸酯、硒化物和苯基硒化物、二烯、二酮、嘧啶、嘌呤和其他雜環(huán)結(jié)構(gòu)以及那些原子的任何放射性原子或螯合劑(例如，對(duì)于pet/spect/mri成像應(yīng)用)。

可用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的綴合物中的治療藥物可以是可與靶向配體連接的任何治療劑，如基于鉑的藥劑(順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、沙鉑、吡鉑以及其衍生物)、小分子、光敏劑、肽、蛋白質(zhì)、聚合物、核酸(sirna、微小rna)或納米顆粒。

用于治療和/或診斷的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的多功能藥劑可由以下式i表示：

式i

其中r1和r2各自選自由以下組成的組：-h、烷基、烷基磺酸酯、烷基羧酸、烷基氨基、芳基、-so3h、-po3h、-oh、-nh2和-鹵素，并且可獨(dú)立地連接在各種芳環(huán)位置如3、3'、4、4'、5、5'、6、6'；任何吸電子基團(tuán)(ewg)和供電子基團(tuán)(edg)可獨(dú)立地連接在各種芳環(huán)位置。

其中側(cè)鏈y(cè)1和y2可選自由以下組成的組：烷基、芳基、芳烷基、烷基磺酸酯、烷基羧酸、烷基氨基、ω-烷基銨、ω-炔基、peg基、peg基羧酸酯、ω-peg基銨、ω-?；?nh、ω-?；?賴(lài)氨?；?、ω-?；?三唑、ω-peg基羧基-nh-、ω-peg基羧基-賴(lài)氨?；约唉?peg基羧基-三唑。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”、“烯基”和前綴“alk-”包括直鏈和支鏈基團(tuán)以及環(huán)狀基團(tuán)，如環(huán)烷基和環(huán)烯基。除非另外說(shuō)明，否則這些基團(tuán)可含有1至20個(gè)碳原子，其中烯基含有2至20個(gè)碳原子。優(yōu)選的基團(tuán)可具有總計(jì)至多10個(gè)碳原子。烷基的實(shí)例可包括c1-c6烷基(即，具有1-6個(gè)碳的烷基)，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。烯基的實(shí)例可包括c2-c6烯基(即，具有2-6個(gè)碳的烯基)，如乙烯基、丙烯基、丁烯基等。

“peg基”是指包含(-ch2-ch2-o-)n的重復(fù)部分的聚乙二醇(peg)鏈，其中n是2至20范圍內(nèi)的整數(shù)。

其中x選自由以下組成的組：氫、鹵素、cn、me、nh2、sh和oh。

其中r3和r4中的一個(gè)可以是治療部分，并且另一個(gè)是h，或者可替代地r3和r4兩者均是治療部分，其中所述治療部分可選自由以下組成的組：基于鉑的藥劑、小分子、肽、蛋白質(zhì)、聚合物、sirna、微小rna和納米顆粒。治療劑可經(jīng)由任何合適的基團(tuán)如酰胺鍵、酯鍵、醚鍵、氨基甲酸酯鍵、二硫鍵、腙鍵或非共價(jià)相互作用與接頭y1或y2連接。在一些實(shí)施方案中(r4或r3＝h)，治療部分經(jīng)由接頭偶聯(lián)至吲哚類(lèi)似物中的一種，而在其他實(shí)施方案中，治療部分經(jīng)由兩個(gè)接頭偶聯(lián)至兩種吲哚類(lèi)似物。

在一些實(shí)施方案中，y1和/或y2可通過(guò)形成順鉑腈復(fù)合物的金屬介導(dǎo)的胺至腈加成或經(jīng)由形成順鉑(caisplatin)前藥的酯或酰胺鍵與基于鉑的治療劑連接。

基于鉑的藥劑(例如)可以是順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、沙鉑、吡鉑或其衍生物。

在一些實(shí)施方案中，r3和r4中的一個(gè)可以是成像部分，并且r3和r4中的另一個(gè)是治療有效載荷。成像部分(例如)可以是以下中的任一種：(1)放射性同位素，包括f-18、i-125、i-124、i-123、i-131，或用這些同位素中的任一種標(biāo)記的小分子部分；和(2)螯合劑絡(luò)合的cu-64、in-111、tc-99m、ga-68、lu-177、zo-89、th-227和gd-157部分。

在一些實(shí)施方案中，用于cu-64的螯合劑可選自由以下組成的組：dota、nota、cbte-2a、diamsar、teta、cyclen、cyclam以及cbte-2p。

在一些實(shí)施方案中，用于tc-99m的螯合劑可選自由以下組成的組：hynic、mag3、mas3和ce-dts。

在一些實(shí)施方案中，用于in-111的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在一些實(shí)施方案中，用于ga-68的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在一些實(shí)施方案中，用于lu-177的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在一些實(shí)施方案中，用于zo-89的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在一些實(shí)施方案中，用于th-227的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在一些實(shí)施方案中，用于gd-157的螯合劑可選自由以下組成的組：dtpa、dota、nota和edta。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基于七甲川花青的治療診斷(即，治療和診斷)劑可選自由以下組成的組：

基于sirna的治療劑可經(jīng)由酯或酰胺鍵在有義鏈的3′-和/或5′-末端或反義鏈的3'末端綴合。小干擾rna(sirna)(也稱(chēng)為短干擾rna或沉默rna)是通常為20-25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的一類(lèi)雙鏈rna分子。然而，為了與本發(fā)明的實(shí)施方案一起使用，sirna可更長(zhǎng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道較長(zhǎng)的序列可用作前體，所述前體可在體內(nèi)裂解以形成適當(dāng)長(zhǎng)度的sirna。

本發(fā)明人合成了若干七甲川花青染料衍生物(表1)，并且使用核/nir成像評(píng)估了腫瘤特異性攝取。出人意料地發(fā)現(xiàn)，僅某些類(lèi)型的在環(huán)己基環(huán)的中心中位處具有鹵素(例如，氯)原子的七甲川花青染料在癌細(xì)胞靶向中出人意料地有效。

表1.已經(jīng)針對(duì)體內(nèi)癌癥靶向進(jìn)行了測(cè)試的七甲川花青染料衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征

配體-藥物綴合物的合成

方案1(下文)示出用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的染料-吉西他濱綴合物的合成方法中的一般步驟。

方案2(下文)示出用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的染料-順鉑綴合物的合成方法中的一般步驟。

實(shí)施例

吉西他濱購(gòu)自arkpharm,inc.(libertyville,il)。順鉑購(gòu)自arcosorganics(morrisplains,nj)。n-boc-n-甲基乙二胺購(gòu)自arkpharm,inc.(libertyville,il)。n-((2-氯-3-((苯基亞氨基)甲基)環(huán)己-2-烯-1-亞基)甲基)苯胺購(gòu)自oxchemcorporation(irwindale,ca)。所有其他化學(xué)品均購(gòu)自sigma-aldrichchemicalco(st.louis,mo)。使用alltechapolloc18分析柱(5μm，150×4.6mm)在agilent1260系統(tǒng)上進(jìn)行分析型hplc，所述系統(tǒng)配備有泵、級(jí)分收集器、1260infinity二極管陣列檢測(cè)器。兩種流動(dòng)相用于hplc：溶劑a(水中的0.1％tfa)和溶劑b(80％乙腈水溶液中的0.1％tfa)。流動(dòng)相梯度在20分鐘時(shí)間段內(nèi)從40％的b變化為100％的b，并且在254nm下監(jiān)測(cè)洗脫液(流速為1ml/分鐘)。使用waterslctpremier質(zhì)譜儀對(duì)化合物進(jìn)行esi-tof-ms分析。在brukerav400ftnmr光譜儀(400mhz)上記錄質(zhì)子核磁共振(¹hnmr)光譜。

方案1.試劑和條件：(i)1a，naoac，etoh，回流，3小時(shí)；(ii)1b，naoac，etoh，回流，3小時(shí)；(iii)吉西他濱，edc，hobt，dmf，15小時(shí)。

實(shí)施例1

ir-783-吉西他濱(nirg)合成：

化合物5的合成：向etoh(50ml)中的1a(2g，6.78mmol)和維爾斯邁爾-哈克(vilsmeier-haack)試劑4(3g，8.36mmol)的混合物添加ch3coona(0.56g，6.78mmol)。將所得混合物在回流下加熱3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，且將殘余物從甲醇-醚中重結(jié)晶以得到呈深藍(lán)色固體的所需產(chǎn)物5(2g，產(chǎn)率56％)。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ10.20(s,1h),8.43(d,1h,j＝16hz),8.19(s,1h),7.71(m,2h),7.53-7.39(m,6h),7.16(m,1h),6.62(d,1h,j＝12hz),4.38(m,2h),2.71(m,4h),2.52(m,2h),1.87(m,4h),1.75(m,2h),1.69(s,6h)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:525.1979。

七甲川花青染料6的合成：向etoh(20ml)中的3b(0.5g，1.4mmol)和化合物5(1g，1.9mmol)的混合物添加ch3coona(128mg，1.5mmol)。將所得溶液在回流下加熱3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，且將殘余物用c18-rp二氧化硅色譜法用甲醇-水洗脫進(jìn)行純化以得到呈深綠色固體的所需產(chǎn)物6(0.8g，產(chǎn)率73％)。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ11.99(s,1h),8.26(m,2h),7.61-7.22(m,8h),6.43(d,1h,j＝16hz),6.23(d,1h,j＝16hz),4.23(m,4h),2.72(m,4h),2.21(m,2h),1.86(m,4h),1.73(m,6h),1.67(s,6h),1.66(s,6h),1.57(m,2h),1.40(m,2h)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:705.3122。

ir-783-吉西他濱(nirg)2的合成：將6(761mg，1.1mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(310mg，1.6mmol)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(175mg，1.3mmol)的混合物溶解于5.0mldmf中。將混合物攪拌15分鐘，且然后添加吉西他濱(340mg，1.3mmol)。將所得混合物再攪拌15小時(shí)。添加乙醚(50ml)。將沉淀物收集且通過(guò)c18-rp二氧化硅色譜法純化，用甲醇-水洗脫以得到呈深綠色固體的所需產(chǎn)物2509mg(41％)。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ10.97(s,1h),8.26(m,3h),7.65-7.23(m,9h),6.40(d,1h,j＝12hz),6.34(d,1h,j＝8hz),6.22(d,1h,j＝12hz),5.31(m,1h),4.23(m,5h),3.90(m,1h),3.82(d,1h,j＝12),3.67(d,1h,j＝12),2.70(m,4h),2.42(m,2h),1.84(m,4h),1.74(m,6h),1.67(s,6h),1.66(s,6h),1.61(m,2h),1.39(m,2h)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:950.3768。

方案2.試劑和條件：(i)hcl，ph4，丙腈(ii)1.n-boc-n-甲基乙二胺，edc，hobt，dmf，15小時(shí)；2.tfa；(iii)順鉑腈復(fù)合物2，dmf，4℃，5天。

實(shí)施例2

順鉑腈復(fù)合物8：將30mlhcl(ph4)中的順鉑7(0.6g，2.0mmol)和丙腈(8.2ml，118.2mmol)的混合物在回流下加熱2小時(shí)。在減壓下除去溶劑，且將淡黃色殘余物溶解于15ml甲醇中。將溶液過(guò)濾，且將濾液添加至200ml醚中。收集沉淀物并在真空下干燥以得到373mg8(產(chǎn)率：57％)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:320.0271。

ir-783-n1-甲基乙二胺9的合成：將6(850mg，1.2mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(346mg，1.8mmol)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(195mg，1.4mmol)的混合物溶解于10.0mldmf中。將混合物攪拌30分鐘，且然后添加n-boc-n-甲基乙二胺(231mg，1.7mmol)。將混合物再攪拌18小時(shí)。添加乙醚(50ml)。將沉淀物收集且通過(guò)c18-rp二氧化硅色譜法純化，用甲醇-水洗脫以得到呈深綠色固體的純產(chǎn)物。

將產(chǎn)物溶解于20ml的二氯甲烷中的40％tfa中，并將溶液在室溫下攪拌3小時(shí)。添加醚100ml。收集沉淀物并用醚洗滌，且然后在真空下干燥以得到所需產(chǎn)物9，395mg(43％)。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ8.38(br,2h),8.21(m,2h),7.97(t,1h),7.60(m,2h),7.49(d,1h),7.40(m,1h),7.36(s,2h),7.26(m,2h),6.41(d,1h),6.23(d,1h),4.19(m,4h),3.25(t,2h),2.88(m,2h),2.68(m,4h),2.52(m,4h),2.05(t,2h),1.81(m,4h),1.70(m,4h),1.63(s,6h),1.62(s,6h),1.54(m,2h),1.32(m,2h)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:761.3868。

ir-783-n1-甲基乙二胺-順鉑10的合成：將順鉑腈復(fù)合物8(355mg，1.0mmol)通過(guò)與10ml無(wú)水dmf中的agno3(169mg，1.0mmol)反應(yīng)1小時(shí)而轉(zhuǎn)化成其硝酸鹽。將混合物離心10分鐘。將沉淀物丟棄并將上清液冷卻至-10℃。將ir-783-n1-甲基乙二胺9(200mg，0.26mmol)添加至所述溶液，且將懸浮液在4℃下攪拌5天。將反應(yīng)混合物添加至300ml二乙醚中。收集沉淀物并在真空下干燥。將固體溶解于二氯甲烷中，且通過(guò)0.45μ玻璃纖維過(guò)濾器過(guò)濾。在減壓下除去溶劑，且將產(chǎn)物溶解于水中并過(guò)濾。將水溶液在-20℃下冷凍，且然后凍干以得到深綠色固體205mg(產(chǎn)率：72％)。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ8.21(m,2h),8.04(t,1h),7.60(m,2h),7.48(d,1h),7.41(d,1h),7.38(d,2h),7.25(m,2h),6.39(d,1h),6.24(d,1h),4.20(m,4h),3.25(m,2h),2.94(q,2h),2.87(m,2h),2.69(m,4h),2.50(m,4h),2.06(t,2h),1.81(m,4h),1.70(m,4h),1.63(s,6h),1.62(s,6h),1.54(m,2h),1.32(m,2h),1.18(t,3h)。ms(esi-tof)[m+h]⁺:1078.4177。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶向配體可包含吲哚類(lèi)似物部分、多烯部分和側(cè)鏈部分。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，靶向配體可包含吲哚類(lèi)似物或多烯部分上的吸電子基團(tuán)或供電子基團(tuán)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，吲哚部分、多烯部分和/或側(cè)鏈部分可包含適合綴合的官能團(tuán)。適合綴合的官能團(tuán)是本領(lǐng)域中熟知的，并且可包括例如氨基、羧基、硫醇、-oh等。在一些實(shí)施方案中，適合綴合的官能團(tuán)可選自由以下組成的組：羥基、胺、sh和cooh。

在一些實(shí)施方案中，治療劑可選自由以下組成的組：能夠靶向細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、血管生成、粘附、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期進(jìn)展，干細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的表型且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的抗癌藥物。用于化學(xué)綴合的所選擇治療劑可包括已知對(duì)納摩爾濃度的癌細(xì)胞具有高毒性的藥物，對(duì)正常細(xì)胞具有自限性毒性的藥物和/或具有由患者良好耐受的治療有效劑量的藥物以及其組合。

在一些實(shí)施方案中，抗癌藥物可選自由以下組成的組：順鉑、吉西他濱、肽、sirna和微小rna。

在一些實(shí)施方案中，治療劑可以是放射性核素，所述放射性核素可以是α、β或γ發(fā)射體。放射性核素也可用作成像劑。

在一些實(shí)施方案中，核成像劑可通過(guò)pet(正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))或spect(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù))檢測(cè)。此外，此類(lèi)成像劑可包含磁共振成像(mri)活性核素以增加腫瘤檢測(cè)的靈敏度和特異性。

本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于治療患者的癌癥的方法。本發(fā)明的方法可包括：提供本發(fā)明的小分子綴合物化合物，并且向需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的所述化合物。

本發(fā)明的實(shí)施方案還可涉及消除有需要的患者中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法可包括：提供本發(fā)明的小分子綴合物化合物，并且向患者施用有效量的所述化合物，其中最小化或預(yù)防形成轉(zhuǎn)移沉積的癌細(xì)胞的隨后粘附或外滲。

如本文所用，“消除循環(huán)腫瘤細(xì)胞”是指消除或最小化腫瘤細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移沉積的能力。

本發(fā)明的實(shí)施方案還可涉及對(duì)播散至遠(yuǎn)處器官的原發(fā)癌中的癌細(xì)胞進(jìn)行成像的方法。本發(fā)明的方法可包括：提供本發(fā)明的小分子綴合物化合物，并且向有需要的患者或組織施用有效量的所述化合物，其中成像劑是熒光劑或放射性核素，所述熒光劑或放射性核素可通過(guò)駐留在其組織中的患者的實(shí)體腫瘤的電磁譜的近紅外區(qū)域(約700nm至2500nm)、通過(guò)pet、spect和/或mri進(jìn)行的核成像來(lái)檢測(cè)。

表2(下文)示出nir染料-吉西他濱對(duì)體外前列腺癌和胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞毒性(作為ic50評(píng)估的)。此表顯示與體外親本吉西他濱(未綴合的藥物充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照)和裸染料ir-783(陰性對(duì)照)相比，nir染料-吉西他濱綴合物(或dz-1-吉西他濱綴合物)對(duì)在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的人前列腺癌(lncap、c4-2、c4-2b、pc3)和胰腺癌(miapaca和bxpc-3))細(xì)胞施加的細(xì)胞毒性的結(jié)果。還將dz-1-吉西他濱綴合物的有效性與nir染料-多西他賽和nir染料-氯吉蘭綴合物的有效性進(jìn)行了比較，希望確定能夠限制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的最佳nir染料-藥物綴合物。

表2.染料-多西他賽綴合物和染料-吉西他濱綴合物在抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)方面比染料-氯吉蘭綴合物更有效。

注意：25μm下的染料部分ir783對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)未顯示抑制作用(未示出)。

研究了小鼠中的前列腺癌pc3腫瘤細(xì)胞對(duì)dz-1-吉西他濱和dz-1-順鉑的攝取。簡(jiǎn)言之，將攜帶pc3腫瘤的小鼠經(jīng)由腹膜內(nèi)注射分別施用100納摩爾的dz-1-吉西他濱和dz-1-順鉑，且在48小時(shí)后成像。發(fā)現(xiàn)兩種化合物僅在腫瘤細(xì)胞中積聚，而不在正常器官中積聚，如圖3中所示。

還研究了在各種癌細(xì)胞中dz-1-吉西他濱(“dz-1-gem”)的攝取。如圖4(a)中所示，dz-1-gem(5μm，10分鐘)容易地被u87和cw22rv1細(xì)胞吸收。ir-783用作并行陽(yáng)性對(duì)照。比例尺表示50μm。

如圖4(b)中所示，在用媒介物、吉西他濱(200nm)或dz-1-gem(200nm)連續(xù)4天處理的u87細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)中，據(jù)發(fā)現(xiàn)dz-1-gem在抑制u87細(xì)胞增殖方面與gem一樣有效。在這些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫染色，且測(cè)定在595nm波長(zhǎng)下的od值(對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組n＝5，平均值±sem))*p<0.05，**p<0.01。

如圖4(c)中所示，示出用媒介物或dz-1-gem(10mg/kg，一周兩次)處理的攜帶顱內(nèi)u87腫瘤的小鼠的代表性生物發(fā)光成像(bli圖像)。很明顯，用dz-1-gem處理有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致無(wú)生物發(fā)光。

圖4(d)示出來(lái)自圖4(c)中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝2，平均值±sem)的u87腫瘤生長(zhǎng)的bli曲線(xiàn)。**p<0.01。用dz-1-gem處理的小鼠具有顯著提高的存活率，如由用媒介物(n＝6)或dz-1-gem(10mg/kg，一周兩次(n＝4)，p<0.001(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))))處理的攜帶cw22rv1前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移的小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線(xiàn)所證明，如圖4(e)中所示。

除了dz-1-gem之外，本發(fā)明的一些藥劑可包括其他抗腫瘤活性部分，如順鉑。例如，將與順鉑連接的dz-1(“dz-1-順鉑”)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性與單獨(dú)順鉑在各種腫瘤細(xì)胞(包括前列腺癌、乳腺癌、腎癌(renal)、腎癌(kidney)和肺癌細(xì)胞系)中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性進(jìn)行比較。如表3中所示，dz-1-順鉑在體外抑制若干腫瘤細(xì)胞(包括lncap、c4-2和h358腫瘤細(xì)胞)方面比順鉑更有效。

表3.順鉑和dz-1-順鉑對(duì)前列腺癌、乳腺癌、腎癌、腎癌和肺癌細(xì)胞系的ic50。

還研究了胰腺miapaca皮下腫瘤對(duì)吲哚菁綠(icg)和dz-1-吉西他濱的攝取。圖5(a)示出在icg注射(7.2mg/kg，腹膜內(nèi))后兩天攜帶miapaca皮下腫瘤的小鼠的代表性nir熒光成像。圖5(b)示出腫瘤和無(wú)腫瘤區(qū)域(n＝3)的總輻射效率的icg攝取強(qiáng)度的定量分析。圖5(c)示出在dz-1-吉西他濱(dz-1-gem)注射(10mg/kg，腹膜內(nèi))后兩天，攜帶miapaca皮下腫瘤的小鼠的代表性nir熒光成像。圖5(d)示出腫瘤和無(wú)腫瘤區(qū)域(n＝3)的總輻射效率的攝取強(qiáng)度的定量分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

通過(guò)腫瘤體積研究了ir-783(陰性對(duì)照)、吉西他濱(陽(yáng)性對(duì)照)和dz-1-吉西他濱(dz-1-gem)對(duì)體內(nèi)前列腺和胰腺腫瘤生長(zhǎng)的影響。圖6(a)示出皮下腫瘤生長(zhǎng)的預(yù)防且圖6(b)示出皮下腫瘤生長(zhǎng)的抑制，如通過(guò)用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的小鼠中前列腺癌pc3細(xì)胞的腫瘤體積所測(cè)量。圖6(c)示出皮下腫瘤生長(zhǎng)的預(yù)防且圖6(d)示出皮下腫瘤生長(zhǎng)的抑制，如通過(guò)用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的小鼠中胰腺miapaca細(xì)胞的腫瘤體積所測(cè)量。箭頭表示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

如可從圖6(a)–6(d)中的結(jié)果看出，在這些研究中，dz-1-gem在預(yù)防和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面比吉西他濱更有效。

還研究了ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺和胰腺腫瘤的小鼠中的小鼠重量的影響。在用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的皮下pc3和miapaca腫瘤的預(yù)防(圖7(a)和圖7(c))和抑制(圖7(b)和圖7(d))研究中測(cè)量小鼠重量。箭頭表示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

如可從圖7(a)–7(d)中的結(jié)果看出，與吉西他濱相比，dz-1-gem在預(yù)防和抑制研究中對(duì)小鼠體重的影響較小。

研究了植入小鼠腎囊下的前列腺pdx腫瘤對(duì)nir染料mhi-148的攝取。圖8(a)示出無(wú)腫瘤的對(duì)照小鼠和在腎的腎囊下中具有假手術(shù)和前列腺癌植入的小鼠的代表性nir熒光成像。將小鼠腹膜內(nèi)注射nir染料，mhi-148。在48小時(shí)后，用783nm的激發(fā)和840nm的發(fā)射進(jìn)行熒光成像。僅植入右腎的腎囊下中的前列腺癌腫瘤顯示nir熒光信號(hào)，而左側(cè)的假手術(shù)腎和對(duì)照小鼠均未顯示任何信號(hào)。圖8(b)示出具有假手術(shù)和前列腺癌腫瘤植入的腎的代表性離體nir熒光成像。僅在植入右腎的腎囊下中的生長(zhǎng)前列腺癌腫瘤中檢測(cè)到nir熒光信號(hào)。圖8(c)示出來(lái)自腎下異種移植物模型的人前列腺癌腫瘤和小鼠腎的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查(200倍放大率)。圖8(d)示出植入小鼠腎囊中的前列腺癌標(biāo)本的代表性h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

研究了植入小鼠腎囊下的胰腺患者來(lái)源的異種移植物(pdx)腫瘤對(duì)nir染料mhi-148的攝取。圖9(a)示出腎囊下中攜帶人胰腺pdx腫瘤的小鼠的nir熒光成像(激發(fā)：783nm；激發(fā)：840nm)。圖9(b)示出從小鼠收獲的腎囊和其他器官中的胰腺pdx腫瘤的離體明場(chǎng)和nir熒光成像，并且圖9(c)示出對(duì)于腫瘤和每個(gè)器官定量nir熒光強(qiáng)度(總輻射效率[p/s]/[μw/cm²])。圖9(d)示出腎囊中的胰腺pdx腫瘤的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查。白色虛線(xiàn)描畫(huà)小鼠腎的輪廓，并且紅色虛線(xiàn)描畫(huà)胰腺pdx腫瘤的輪廓。僅胰腺腫瘤攝取nir染料，但小鼠腎腫瘤不攝取(200倍放大率)。圖9(d)示出小鼠腎囊中胰腺pdx腫瘤的h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

研究了植入小鼠腎囊下的正常胰腺pdx組織對(duì)nir染料mhi-148的攝取。圖10(a)示出腎囊下中攜帶人胰腺pdx腫瘤的小鼠的nir熒光成像(激發(fā)：783nm；激發(fā)：840nm)。圖10(b)示出從小鼠收獲的腎囊和其他器官中的胰腺pdx腫瘤的離體明場(chǎng)和nir熒光成像，并且圖10(c)示出對(duì)于腫瘤和每個(gè)器官定量的nir熒光強(qiáng)度(總輻射效率[p/s]/[μw/cm²])。圖10(d)示出腎囊中的胰腺pdx腫瘤的冷凍切片的dapi圖像、nir圖像和合并圖像的熒光顯微鏡檢查。白色虛線(xiàn)描畫(huà)小鼠腎的輪廓，并且紅色虛線(xiàn)描畫(huà)胰腺pdx腫瘤的輪廓。僅胰腺腫瘤攝取nir染料，但小鼠腎腫瘤不攝取(200倍放大率)。圖10(d)示出小鼠腎囊中正常胰腺pdx組織的h&e染色(40倍放大率；插圖：400倍放大率)。

研究了由小鼠中的前列腺和胰腺腫瘤而非正常器官特異性地?cái)z取dz-1-吉西他濱。圖11(a)示出用dz-1-吉西他濱(10mg/kg)處理的攜帶皮下luc標(biāo)記的pc3腫瘤的小鼠的代表性生物發(fā)光和nir熒光(在783nm下激發(fā)和在840nm下發(fā)射)圖像。圖11(b)示出小鼠的pc3腫瘤和器官(心臟、肺、腎、肝和脾)的代表性離體生物發(fā)光和nir熒光成像。圖11(c)示出用dz-1-吉西他濱(10mg/kg)處理的攜帶皮下luc標(biāo)記的miapaca腫瘤的小鼠的代表性生物發(fā)光和nir熒光(在783nm下激發(fā)和在840nm下發(fā)射)圖像。圖11(d)示出小鼠的miapaca腫瘤和器官(心臟、肺、腎、肝和脾)的代表性離體生物發(fā)光和nir熒光成像。

研究了ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺和胰腺腫瘤的小鼠中的腫瘤重量的影響。在用ir-783(7.5mg/kg；n＝10)、吉西他濱(2.5mg/kg；n＝10)和dz-1-吉西他濱(10mg/kg；n＝10)一周兩次經(jīng)由腹膜內(nèi)注射處理的皮下pc3和miapaca腫瘤的預(yù)防(圖12a和圖12c)和抑制(圖12b和圖12d)研究中測(cè)量腫瘤重量。箭頭表示處理的開(kāi)始。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

研究了ir-783、吉西他濱和dz-1-吉西他濱對(duì)攜帶前列腺pc3和胰腺miapaca腫瘤的小鼠的存活的影響。分別在前列腺癌和胰腺癌的預(yù)防(圖13a和圖13c)和抑制(圖13b和圖13d)研究中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝5)中的小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線(xiàn)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

研究了dz-1-吉西他濱染料-藥物綴合物(nirg)在顱內(nèi)u87腫瘤異種移植物中的攝取和保留。圖14(a)示出如在染料注射后第1小時(shí)和第24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)體內(nèi)nirf成像測(cè)定的顱內(nèi)u87腫瘤異種移植物對(duì)nirg(50nmol/小鼠，腹膜內(nèi))的攝取。示出代表性圖像。圖14(b)示出圖14(a)中的攝取強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)**p<0.01。圖14(c)示出如在染料注射后第24小時(shí)通過(guò)離體nirf成像測(cè)定的從圖14(b)解剖的小鼠腦和其他指示器官對(duì)nirg的攝取和保留。圖14(d)示出圖14(d)中的器官特異性nirf信號(hào)強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)。與腦相比，*p<0.05，**p<0.01。

研究了ir-783-吉西他濱染料-藥物綴合物(nirg)在異種移植物前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的攝取和保留。圖15a示出攜帶cw22rv1前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移的小鼠并且已經(jīng)在nirg(50nmol/小鼠，腹膜內(nèi))后第24小時(shí)進(jìn)行體內(nèi)bli和nirf成像。圖15(b)示出將小鼠腦和對(duì)照腎隨后切除并離體進(jìn)行兩種成像模態(tài)。圖15(c)示出圖15(b)中的bli和nirf信號(hào)強(qiáng)度的定量分析(n1/43，平均值±sem)*p<0.05，**p<0.01。。圖15(d)示出攜帶腫瘤的小鼠腦的mrit2掃描。腫瘤區(qū)域以紅色虛線(xiàn)圓圈表示。圖15(e)示出前列腺腫瘤腦轉(zhuǎn)移的h&e染色(t)。黃色箭頭表示侵入性邊緣原始放大率，400；比例尺：20mm。

上述實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案的各種方面和實(shí)用性。雖然本發(fā)明已相對(duì)于數(shù)量有限的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但享有本公開(kāi)權(quán)益的本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解到，可設(shè)計(jì)不脫離如本文所公開(kāi)的本發(fā)明的范圍的其他實(shí)施方案。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅由所附權(quán)利要求書(shū)限制。