本發(fā)明涉及來(lái)源于鼠尾草屬的種類(lèi)(salviaspp)的包含一種或多種丹參酮化合物的植物提取物或所述一種或多種丹參酮化合物，它們用于治療傷口，特別是慢性傷口或其它得益于抑制皮質(zhì)醇產(chǎn)生的病癥，特別是庫(kù)欣綜合征。

優(yōu)選的丹參酮化合物包括、但不限于二氫丹參酮(特別是15,16-二氫丹參酮(cas編號(hào)87205-99-0))和丹參酮i。

優(yōu)選的治療包括治療慢性傷口(通常定義為需要超過(guò)6周才能愈合的傷口)。這類(lèi)傷口在患有肥胖的患者和患有糖尿病的患者以及臥床不起的患者(褥瘡(decubitus)或褥瘡(bedsores))以及經(jīng)過(guò)外線(xiàn)束輻射療法的患者中尤其常見(jiàn)。

慢性傷口無(wú)法在有序組的階段中和可預(yù)測(cè)量的時(shí)間中(大多數(shù)傷口所經(jīng)歷的方式)來(lái)愈合。慢性傷口顯然被阻留在傷口愈合的一個(gè)或多個(gè)階段中。相反，在急性創(chuàng)傷中，分子如膠原蛋白的產(chǎn)生與降解之間存在精確的平衡；在慢性傷口中，這種平衡失去，且惡化所起的作用過(guò)大。

慢性傷口可能永遠(yuǎn)不會(huì)愈合，或者可能需要數(shù)年才能愈合。這些傷口導(dǎo)致患者嚴(yán)重的情緒和身體壓力，并對(duì)患者和整個(gè)衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成重大的財(cái)務(wù)負(fù)擔(dān)。

急性和慢性傷口處于以不同速率進(jìn)行愈合的傷口愈合類(lèi)型范圍的相對(duì)兩端。

絕大多數(shù)慢性傷口可以分為三類(lèi)：靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍和壓力性潰瘍。少數(shù)不屬于這些類(lèi)別的傷口可能是由于輻射或缺血等原因?qū)е隆?/p>

通常發(fā)生在腿部的靜脈潰瘍約占慢性傷口的70％-90％，且主要影響中老年人。它們被認(rèn)為是由于靜脈中存在的防止血液向后流動(dòng)的瓣膜功能不全引起的靜脈高壓導(dǎo)致。局部缺血因功能障礙導(dǎo)致，且合并再灌注損傷導(dǎo)致組織損傷，這種損傷產(chǎn)生傷口。

糖尿病性潰瘍是慢性傷口的另一個(gè)主要原因。由于慢性潰瘍，糖尿病患者具有高于一般人群15％的截肢風(fēng)險(xiǎn)率。糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)病變，其抑制傷害感受和疼痛感。因此，患者可能最初不會(huì)注意到腿部和足部的小傷口，且由此可能無(wú)法預(yù)防感染或反復(fù)受傷。此外，糖尿病導(dǎo)致免疫損害和對(duì)小血管的損害，從而阻止了組織充分氧合，這可能導(dǎo)致慢性傷口。壓力在糖尿病性潰瘍形成中也起作用。

壓力性潰瘍通常發(fā)生在具有例如癱瘓的病癥的人中，而癱瘓抑制通常受到壓力的身體部位(例如足跟，肩胛骨和骶骨)的運(yùn)動(dòng)。壓力性潰瘍是由組織上的壓力大于毛細(xì)血管中的壓力而發(fā)生的局部缺血導(dǎo)致，且由此限制血液流進(jìn)入所述區(qū)域。需要比皮膚更多的氧和營(yíng)養(yǎng)物的肌肉組織因延長(zhǎng)的壓力而表現(xiàn)出最壞的影響。正如在其它慢性潰瘍中所示，再灌注損傷會(huì)損害組織。

使用眾所周知的賦形劑，可以將制劑的提取物和活性化合物配制成藥物或化妝品，不過(guò)，噴霧制劑、霜?jiǎng)?、水凝膠和浸漬的載體材料例如敷料、紗布和繃帶是有利的。

由于本發(fā)明的化合物在抑制皮質(zhì)醇的產(chǎn)生中起作用，因此它們可應(yīng)用于治療由皮質(zhì)醇合成增加引起的疾病，例如庫(kù)欣綜合征。

背景技術(shù)：

已知鼠尾草屬的種類(lèi)(salviaspp)的提取物和從其中分離的許多丹參酮化合物具有藥用特性(參見(jiàn)，例如journalofmedicinalplantsresearch4,2813-2820,29decemberspecialreview,2010)，且申請(qǐng)人自己的專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)wo2009050451教導(dǎo)了從鼠尾草屬的種類(lèi)得到的包含確定的丹參酮的提取物的抗微生物活性。

西方世界中約2％的一般人群患有慢性創(chuàng)傷，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的不良影響。這也造成了重大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，近2％的衛(wèi)生預(yù)算用于護(hù)理慢性傷口和住院治療(schreml等人(2010)jamacaddermatol63,866-881；sgonc和gruber(2012)gerontology59,159-164)。盡管這種高發(fā)病率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但是慢性傷口的處置結(jié)果遠(yuǎn)不能令人滿(mǎn)意，且迫切需要新型療法改善患者的生活質(zhì)量和降低醫(yī)療成本。

對(duì)慢性傷口的發(fā)病機(jī)制具有特異性的活性成分是非常需要的。這類(lèi)活性化合物必須能夠使“錯(cuò)誤激活”的調(diào)節(jié)途徑正常化，并且必須沒(méi)有任何毒性和過(guò)敏可能性。

申請(qǐng)人目前已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)，包含丹參酮的鼠尾草屬的種類(lèi)的提取物和從其中分離的許多丹參酮化合物、特別是丹參酮i和二氫丹參酮是cyp11b1的有效抑制劑，且照此可以預(yù)期它們可用于治療病癥受益于抑制皮質(zhì)醇合成的病癥，例如治療傷口，特別是慢性傷口，其原因在于，cyp11b1的抑制有益于加速傷口愈合。

這種治療應(yīng)用的原理來(lái)自于cyp11b1是在人腎上腺和皮膚中表達(dá)的產(chǎn)生皮質(zhì)醇的酶這一事實(shí)(圖1)，并且已經(jīng)顯示cyp11b1的抑制促進(jìn)人皮膚外植體中和豬體內(nèi)的傷口愈合(vukelic等人(2011)jbiolchem286,10265-10275)。

重要地，在涉及皮質(zhì)醇生物合成的酶的表達(dá)方面，嚙齒動(dòng)物和其它低級(jí)哺乳動(dòng)物種類(lèi)的皮膚不同于人的皮膚。例如，在小鼠中，11β-hsd1在慢性傷口中得到上調(diào)。cyp11b1既沒(méi)有在小鼠和大鼠中的未受傷的皮膚中表達(dá)、也沒(méi)有在創(chuàng)傷后的皮膚中表達(dá)(tiganescu等人,jendocrinol221,51-61；dallavalle等人,jsteroidbiochemmolbiol43,1095-1098)。

顯著地，申請(qǐng)人已經(jīng)確定存在于乙醇鼠尾草屬提取物中的某些化合物抑制cyp11b。由于cyp11b1是人中的關(guān)鍵靶標(biāo)，所以它們能夠應(yīng)用于治療人的傷口，特別是慢性傷口和其它病癥。

對(duì)例如嚙齒類(lèi)動(dòng)物或其它低級(jí)哺乳動(dòng)物報(bào)告的數(shù)據(jù)不是用于預(yù)測(cè)人皮膚中的傷口愈合作用的適合的模型，并且不會(huì)導(dǎo)致得出它們具有用于治療例如慢性傷口或涉及皮質(zhì)醇產(chǎn)生的相關(guān)的病癥，例如庫(kù)欣綜合癥的用途的結(jié)論。

在這方面，皮質(zhì)醇合成中最重要的酶是cyp11b1。cyp11b1是將無(wú)活性糖皮質(zhì)激素11-脫氧皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為高活性皮質(zhì)醇的酶。cyp11b1在人體皮膚中的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格地調(diào)節(jié)，特別是在傷口愈合過(guò)程中。受傷后，cyp11b1的表達(dá)和活性得到顯著地上調(diào)，特別是在第二天期間，以便在檢查中保持炎癥應(yīng)答，但在受傷后第三天和第四天恢復(fù)到對(duì)照值，以保護(hù)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖/遷移的抑制和其它對(duì)傷口愈合必不可少的重要過(guò)程(vukelic等人(2011)jbiolchem286,10265-10275)。然而，在慢性傷口中，cyp11b1的表達(dá)保持持久性地升高(us8,802,660b2)。抑制皮質(zhì)醇的產(chǎn)生由此可能會(huì)逆轉(zhuǎn)延長(zhǎng)的皮質(zhì)醇暴露在慢性傷口中的有害作用。

在與vukelic等人(2011)jbiolchem286,10265-10275)使用的相同的離體人皮膚傷口模型中，使用沒(méi)有11β-hsd1抑制活性的高效cyp11b1抑制劑，申請(qǐng)人已經(jīng)證實(shí)了cyp11b1作為傷口愈合的靶標(biāo)。與媒介物對(duì)照組相比，使用這種cyp11b1抑制劑作為化學(xué)探針，他們觀(guān)察到顯著地更快的愈合過(guò)程和歸因于表皮細(xì)胞再生的完全傷口閉合。

因此，cyp11b1的抑制可以被認(rèn)為是治療特別是慢性傷口的新穎的、非常富有希望的療法。此外，環(huán)境干燥(也誘導(dǎo)皮膚屏障功能障礙)顯著地增加皮膚等效模型中的cyp11b1表達(dá)和活性(takei等人(2013)expdermatol22,662-664)。

短波長(zhǎng)的uv光(uvb和uvc)是刺激哺乳動(dòng)物皮膚中皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮合成的另一重要環(huán)境應(yīng)激物。顯示增加的合成速率是由人皮膚中幾種類(lèi)固醇生成酶的上調(diào)介導(dǎo)，包括cyp11b1和11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(hsd)1(skobowiat等人(2011)brjdermatol168,595–601；skobowiat等人(2011)amjphysiolendocrinolmetab301,e484–e493)。雖然推定這種生物化學(xué)反應(yīng)在年輕皮膚中是保護(hù)性的，但是皮質(zhì)醇生產(chǎn)的上調(diào)仍然存在于老化皮膚中，并且被認(rèn)為有助于與實(shí)足年齡老化和光老化相關(guān)的皮膚形態(tài)和功能的不良改變(tiganescu等人(2011)jinvestdermatol131,30–36)。因此，預(yù)期特別是老化皮膚中的皮質(zhì)醇合成抑制將減弱不良的年齡依賴(lài)性作用，例如失去色調(diào)和彈性、脆性增加、干燥度增加、厚度減少以及胞外基質(zhì)成分例如透明質(zhì)酸和膠原蛋白的合成減少(tiganescu等人(2011)jinvestdermatol131,30–36)。

cyp11b1也在腸(taves等人(2011)amjphysiolendocrinolmetabol301,e11–e24；fernandez-marcos等人(2011)biochimbiophysacta,1812,947–955)和口腔(peng等人(2011)plosone6:e23452,datawereanalyzedusingtheoncominewebportal(www.oncomine.org))中表達(dá)。因此，通過(guò)抑制相應(yīng)上皮細(xì)胞中的cyp11b1也可以加速上皮組織和非皮膚的空腔中的損害愈合。

還報(bào)道，在與應(yīng)激相關(guān)的抑郁和疲憊的女性中，牙齦的溝槽液中存在顯著增加的皮質(zhì)醇水平，這與更多量的牙菌斑和局部炎癥相關(guān)(johannsen等人(2006)jperiodontology77,1403-1409)。盡管不知曉何種百分比的皮質(zhì)醇可能也具有全身來(lái)源，但是使用cyp11b1抑制劑可以有效地阻斷局部產(chǎn)生，導(dǎo)致牙周健康改善。

鑒定的現(xiàn)有技術(shù)包括以下內(nèi)容：

chinesejournalofclinicalrehabilitation,第9卷,第6期,2005,156-7頁(yè)。該文件公開(kāi)了丹參(radixsalviaemilitiorrhizae)在大鼠皮膚上的傷口愈合中的用途。然而，在皮質(zhì)醇生產(chǎn)中大鼠皮膚表達(dá)與人不同的酶，且由此不能認(rèn)為它可以用于治療人的傷口。

cn102988370公開(kāi)了丹參酮i在治療銀屑病中的用途。

cn10282340公開(kāi)了丹參酮iia在治療銀屑病中的用途。

cn12973575公開(kāi)了隱丹參酮在治療銀屑病中的用途。

journalofthepharmaceuticalsocietyofjapan,第131卷,第4期,2011581-586頁(yè)公開(kāi)了使用鼠尾草(salviaofficinalisl)在治療小鼠模型中的特應(yīng)性皮炎中的用途。

chinesejournalofreparativeandreconstructivesurgery,第12卷,第4期,1998,205-208頁(yè)公開(kāi)了丹參在具有燒傷皮膚的家兔中的用途。家兔是低級(jí)哺乳動(dòng)物且并不能認(rèn)為它可以用于治療人中的傷口。

bmcbiotechnology,第14卷,第1期,2014,74:1-10頁(yè)公開(kāi)了表達(dá)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子i的轉(zhuǎn)基因丹參(salviamiltiorrhiza)植物在傷口愈合中的用途。數(shù)據(jù)(段落連接第3和4頁(yè)的段落)顯示野生型植物提取物無(wú)法促進(jìn)大鼠皮膚的傷口愈合。

biomaterial,第23卷,2002,4459-4462頁(yè)公開(kāi)了使用脫乙酰殼聚糖的草藥提取物的緩釋植入物。還對(duì)大鼠測(cè)試了體內(nèi)生物降解。

evidencebasedcomplementaryandalternativemedicine,第2012卷,論文編號(hào)927658公開(kāi)了丹參酮11a抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)，這是它可用于治療銀屑病的機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了來(lái)源于鼠尾草屬的種類(lèi)的植物提取物(其包含一種或多種丹參酮化合物)，或者一種或多種丹參酮化合物，所述丹參酮化合物包含cyp11b1抑制量的丹參酮i和/或二氫丹參酮，它們用于治療傷口或庫(kù)欣綜合征。

最優(yōu)選地，治療的傷口是慢性傷口。

優(yōu)選地，雖然不是主要的，但是鼠尾草屬的種類(lèi)的植物提取物是描述在wo2009050451中并且表征的一種，該對(duì)比文件通過(guò)引用并入本文。

表現(xiàn)出這些有益特性的提取物可以來(lái)源于唇形科(labiatae)的多年生草本丹參(salviamiltiorrhizabunge)的根和根莖。在中藥(tcm)中，它也稱(chēng)作丹參。

丹參的化學(xué)成分可分為兩大類(lèi)化學(xué)物質(zhì)：

●脂溶性成分；和

●水溶性成分。

對(duì)丹參的“活性”化合物的早期研究主要集中在脂溶性化合物上，其中迄今已發(fā)現(xiàn)了約40種化合物。

可以將這些化合物進(jìn)一步分成兩組：

●丹參酮(o-醌結(jié)構(gòu))；和

●羅格列酮(o-羥基羅格列酮，對(duì)醌型結(jié)構(gòu))。

丹參酮化合物的大部分是二萜類(lèi)，其中它們主要是二萜醌類(lèi)。

已經(jīng)鑒定了超過(guò)40種不同的化合物，包括，例如：丹參酮，隱丹參酮，丹參酮iia，丹參酮iib，甲基丹參酮，羥基丹參酮iia，異丹參酮i，異丹參酮ii，異隱丹參酮，次丹參酮，l-二氫丹參酮i，新丹參酮a、b、c和丹參酚(salviol)。

這些化合物中的四種的結(jié)構(gòu)如下所示，因?yàn)樗鼈冊(cè)趙o2009050451(本文圖2)中公開(kāi)的提取物中已經(jīng)以大量(通過(guò)hplc色譜法)被特別地鑒定。

優(yōu)選地，所述提取物包含cyp11b1抑制量的丹參酮i和/或二氫丹參酮(更具體地為15,16-二氫丹參酮i)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，鼠尾草屬的種類(lèi)的植物提取物或一種或多種丹參酮化合物用于治療慢性傷口，其中這類(lèi)傷口在糖尿病或肥胖患者群體中是普遍的。

受益于治療的另外的傷口可以來(lái)自褥瘡(decubitus)(褥瘡(bedsores))、磨損、輻射、燒傷、潰瘍或手術(shù)干預(yù)以及其中免疫系統(tǒng)受損的患者群體。

受益于抑制皮質(zhì)醇的另一種病癥是庫(kù)欣綜合征。

一種示例性的提取物公開(kāi)在wo2009050451中，其包含

○隱丹參酮；

○二氫丹參酮；

○丹參酮i；和

○丹參酮iia，

其特征在于上述鑒定的丹參酮化合物占選擇性純化的提取物的至少15重量％，且隱丹參酮占選擇性純化的提取物的至少4重量％。

顯而易見(jiàn)，可以使用包含可選丹參酮的提取物，或者可以使用包含抑制cyp11b1的一種或多種o-醌類(lèi)或丹參酮或由它們組成的制劑。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了包含或基本上由下述組成的藥物或化妝品：丹參酮i和/或二氫丹參酮，或者包含下述量的丹參酮i和/或二氫丹參酮的鼠尾草屬的種類(lèi)的提取物，所述量將抑制cyp11b1至少64％、更優(yōu)選抑制至少81％且仍然更優(yōu)選抑制至少94％。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，優(yōu)選將抑制在于最大化且典型地抑制大于75％一直到(through)80％、85％、90％-95％，一直到96％、97％、98％和99％-100％。

治療有益性的抑制量是能夠?qū)yp11b1的活性抑制至少60％、更優(yōu)選至少75％或更多的抑制量。

所述藥物或化妝品還包含一種或多種賦形劑。

在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，活性成分被裝載(carried)在敷料、繃帶、紗布或其它載體材料上。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，將活性成分并入用于牙周病應(yīng)用的產(chǎn)品中，例如漱口劑和牙膏。

根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了治療傷口或庫(kù)欣綜合征的方法，包括向患者提供治療有效量的鼠尾草屬的種類(lèi)的植物提取物，或者一種或多種丹參酮化合物(包括丹參酮i和二氫丹參酮)。

優(yōu)選地，治療的傷口為慢性傷口。

最優(yōu)選地，所述丹參酮化合物是丹參酮i和/或15,16-二氫丹參酮i。

僅通過(guò)實(shí)施例并且參考以下附圖和詳細(xì)描述進(jìn)一步描述本發(fā)明。

附圖說(shuō)明

圖1是示例人中類(lèi)固醇激素的生物合成途徑的示意圖；和

圖2是本發(fā)明提取物的hplc色譜圖。

發(fā)明詳述

申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丹參提取物(如wo2009050451中所公開(kāi)的)以劑量依賴(lài)性方式抑制完整細(xì)胞中cyp11b1活性。

wo2009050451中公開(kāi)的提取物是包含選擇性純化的丹參酮化合物的來(lái)自鼠尾草屬的種類(lèi)的根的提取物，包含：

○隱丹參酮；

○二氫丹參酮；

○丹參酮i；和

○丹參酮iia，

其特征在于上述鑒定的丹參酮化合物占選擇性純化的提取物的至少15重量％，且隱丹參酮占選擇性純化的提取物的至少4重量％。

然而，盡管wo2009050451的鼠尾草屬的種類(lèi)是丹參(salviamiltiorrhizabunge)，但是可以使用另外的鼠尾草屬的種類(lèi)得到包含丹參酮的提取物，例如：白鼠尾草(salviaapiana)、salviaargentea、salviaarizonica、salviaazurea、salviacarnosa、salviaclevelandii、朱唇(salviacoccinea)、墨西哥鼠尾草(salviadivinorum)、salviadorrii、粉萼鼠尾草(salviafarinacea)、salviaforreri、salviafulgens、salviafunerea、膠質(zhì)鼠尾草(salviaglutinosa)、櫻桃鼠尾草(salviagreggii)、深藍(lán)鼠尾草(salviaguaranitica)、西班牙鼠尾草(salviahispanica)、紫絨鼠尾草(salvialeucantha)、灌木鼠尾草(salvialeucophylla)、salvialibanotica、salvialongistyla、琴葉鼠尾草(salvialyrata)、salviamexicana、藥用鼠尾草(salviaofficinalis)、龍膽鼠尾草(salviapatens)、salviapolystachya、salviapotus、草地鼠尾草(salviapratensis)、猩紅鼠尾草(salviaroemeriana)、南歐丹參(salviasclarea)、苞葉鼠尾草(salviaspathacea)、一串紅(salviasplendens)、salviaverticillata、彩苞鼠尾草(salviaviridis)。

因此，wo2009050451中公開(kāi)的提取物包含至少35重量％的鑒定的丹參酮化合物，其中隱丹參酮至少15重量％(占選擇性純化的提取物)。

實(shí)際上，優(yōu)選地，鑒定的丹參酮化合物占選擇性純化的提取物的至少45重量％，且隱丹參酮占選擇性純化的提取物的至少25重量％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，隱丹參酮占四種所鑒定的丹參酮化合物的至少20％，更優(yōu)選至少25％，仍然更優(yōu)選至少40％，且可以高至60％。

類(lèi)似地，丹參酮iia優(yōu)選地占四種所鑒定的丹參酮化合物低于55％，仍然更優(yōu)選低于50％，仍然更優(yōu)選低于40％，且可以占四種所鑒定的丹參酮化合物的低至20％或更低。

最優(yōu)選地，所述提取物包含至少1％、仍然更優(yōu)選至少2％且仍然更優(yōu)選至少3％或更多的丹參酮i和/或二氫丹參酮。實(shí)際上，該提取物可以是高度選擇性的提取物，其包含至少5％、更優(yōu)選至少10％一直到20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的一種或多種優(yōu)選的化合物丹參酮i和/或二氫丹參酮。

在實(shí)施例1中示例的實(shí)施方案中，包含選擇性純化的丹參酮化合物的提取物的特征在于它包含四種鑒定的丹參酮化合物，其量為42.89％(±40％，一直到30％-20％)：

●隱丹參酮含量為18.95％(±40％，一直到30％-20％)；

●二氫丹參酮含量為3.65％(±40％，一直到30％-20％)；

●丹參酮i含量為3.82％(±40％，一直到30％-20％)；和

●丹參酮iia含量為16.47％(±40％，一直到30％-20％)。

這種包含選擇性純化的丹參酮化合物的提取物的特征在于，它具有基本上圖2中所示例的hplc指紋與所示的特征峰。

然而，從實(shí)施例3(本文)中顯而易見(jiàn)，盡管所述提取物是有效的cyp11b1抑制劑，但是目前較少存在的丹參酮的兩種15,16-二氫丹參酮和丹參酮i比目前存在的主要丹參酮，即隱丹參酮和丹參酮iia的活性明顯更高，且由此優(yōu)選使用具有較高含量的15,16-二氫丹參酮或丹參酮i的一種或多種的替代提取物，或者實(shí)際上單獨(dú)或彼此結(jié)合地使用分離的化合物(或合成制造的化合物或衍生物)。

類(lèi)似地，當(dāng)上述提取物由鼠尾草屬的種類(lèi)的根制備時(shí)，包含以下步驟：

●將原料浸入濃乙醇(strongethanol)中足以溶解丹參酮化合物的時(shí)間；

●使用滲濾法提取包含丹參酮化合物的級(jí)分；和

●真空濃縮期望的級(jí)分，并回收乙醇，

可以?xún)?yōu)選改變?cè)摲椒ㄒ詽饪s或優(yōu)選15,16-二氫丹參酮或丹參酮i。

因此，可以使用wo2009050451中公開(kāi)的方法的可替代方法學(xué)，即使用第一純化步驟，其包括：

a.將提取物溶于足量水；

b.使期望的部分沉淀出來(lái)；

c.棄去水溶液；和

d.采集沉淀。

類(lèi)似地，當(dāng)wo2009050451公開(kāi)第二純化時(shí)，其包括：

e.可以期望在大孔樹(shù)脂柱(lioayuannewmaterialsltd制造的ab8大孔樹(shù)脂柱或另一種適合的柱)上的可替代方法學(xué)進(jìn)行分離，該方法學(xué)對(duì)所述優(yōu)選化合物具有特異性。

支持權(quán)利要求的實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)內(nèi)容如下所述：

實(shí)施例1

1.1.提取物溶液的制備

申請(qǐng)人將～10mg的丹參提取物(salviam.bungeextract)(如wo2009050451中所公開(kāi)的)溶于所需體積的100％乙醇或100％dmso中以獲得1％(w/v)的提取物溶液。他們?cè)?00μl測(cè)定溫育體積中測(cè)試5μl該溶液(最終乙醇或dmso濃度為1％)。從這種1％的丹參提取物溶液中，他們還用100％乙醇或100％dmso中制備1:10和1:100的稀釋液。從這些溶液中，他們?cè)?00μl測(cè)定溫育體積中測(cè)試了5μl。

1.2.cyp11b1測(cè)定

將表達(dá)重組人cyp11b1的v79mzh11b1細(xì)胞系在補(bǔ)充有5％胎牛血清(fcs；sigma)、青霉素g(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、谷氨酰胺(2mm)和丙酮酸鈉(1mm)的dulbecco改進(jìn)eagle(dme，sigma))中在37℃、5％co2空氣中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(每孔8×10⁵個(gè)細(xì)胞)，并在每孔1mldme培養(yǎng)基中培養(yǎng)至匯合。在測(cè)試當(dāng)天，除去dme培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入包含在100％乙醇或100％dmso中的5μl提取物溶液的450μl新鮮dmem。在dmso或乙醇作為溶劑之間在cyp11b1抑制作用方面無(wú)顯著性差異。以相同的方式、但不使用提取物溶液處理對(duì)照孔(接受媒介物或酮康唑(終濃度為50nm)作為參比化合物以驗(yàn)證每次實(shí)驗(yàn))。在co2培養(yǎng)箱中在37℃下60min后，通過(guò)加入包含100nm的11-脫氧皮質(zhì)酮(+0.15μci的[1,2-³h]11-脫氧皮質(zhì)酮)的50μldmem作為底物啟動(dòng)反應(yīng)。所有測(cè)量一式兩份進(jìn)行。25min后，通過(guò)用乙酸乙酯萃取上清液終止酶反應(yīng)。將樣品離心(10,000×g,10min)，并將上層相移入新鮮杯中。蒸發(fā)乙酸乙酯溶劑，并且將殘余物溶于40μl甲醇，且用hplc分析。使用以下公式來(lái)確定轉(zhuǎn)化水平和酶抑制百分比。

cyp11b1

結(jié)果

結(jié)果示于表1中，其顯示了丹參提取物在v79mzh11b1細(xì)胞中對(duì)cyp11b1活性的抑制。提取物溶液在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天由干提取物新鮮制成。

表1.

表1.使用丹參提取物對(duì)cyp11b1抑制的測(cè)定。在100％乙醇或100％dmso中的實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，由干提取物新鮮制備提取物溶液。n表示獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的次數(shù)。

如上所示的，用100％乙醇和100％dmso制備的終濃度為0.01％的丹參提取物分別將人cyp11b1抑制95.6％和100.0％。從1％提取物溶液中，申請(qǐng)人分別用100％乙醇或100％dmso制備1:10稀釋液。從后者這些溶液中，他們?cè)?00μl測(cè)定體積中測(cè)試了5μl。這些提取物溶液(測(cè)定中最終提取物濃度為0.001％)將人cyp11b1分別抑制了79.1％和83.1％。從1％提取物溶液中，申請(qǐng)人還分別用100％乙醇或100％dmso制備了1:100稀釋液。從后者溶液中，他們?cè)?00μl測(cè)定體積中測(cè)試了5μl。該提取物溶液(測(cè)定中最終提取物濃度為0.0001％)分別將人cyp11b1抑制22.6％和16.8％。

來(lái)自這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是，丹參提取物以0.0001％、0.001％和0.01％的稀釋度抑制cyp11b1。

為了檢查這種抑制作用不是因毒性引起，在如實(shí)施例2所示的用于在cyp11b1篩選測(cè)定中使用的溫育條件下在相同的細(xì)胞系中，進(jìn)行mtt[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物]細(xì)胞存活率測(cè)定。

實(shí)施例2

mtt細(xì)胞存活率測(cè)定

將v79mzh11b1細(xì)胞在24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的1mldme培養(yǎng)基上(每孔8×10⁵個(gè)細(xì)胞)培養(yǎng)至匯合。在測(cè)試當(dāng)天，除去dme培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入包含5％fcs的450μl新鮮dme培養(yǎng)基(包含在100％乙醇中的5μl丹參提取物溶液)。將乙醇(1％)和tritonx-100(0.0006％)分別用作媒介物和陽(yáng)性對(duì)照(全部為終濃度)。所有測(cè)量一式四份進(jìn)行。在37℃、5％co2中60min后，向每個(gè)孔中加入50μl新鮮dme培養(yǎng)基(+5％fcs)。25min后，用500μl新鮮dme培養(yǎng)基(+5％fcs)替代培養(yǎng)基，即刻向其中加入25μlmtt溶液(5mg/mlpbs，ph7.2)。30min后，除去所有培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在250μl的0.5％乙酸(v/v)、10％sds(w/v)的dmso溶液中裂解。通過(guò)分光光度法在570nm波長(zhǎng)處測(cè)量甲(formazan)的吸光度。

結(jié)果

0.01％和0.0001％丹參提取物溶液對(duì)v79mzh11b1細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響的測(cè)定

在用于cyp11b1篩選測(cè)定的(預(yù)-)溫育條件下，測(cè)定了丹參提取物對(duì)v79mzh11b1細(xì)胞存活率的影響。如表2中所示，0.01％和0.0001％丹參提取物溶液對(duì)mtt轉(zhuǎn)化成甲沒(méi)有影響(而陽(yáng)性對(duì)照x-100幾乎完全阻斷了甲形成)。因此，得出結(jié)論，丹參提取物對(duì)cyp11b1的抑制作用并非因細(xì)胞毒性效應(yīng)導(dǎo)致。

表2.

表2.mtt毒性測(cè)定中丹參提取物對(duì)v79mzh11b1細(xì)胞存活沒(méi)有影響。每次實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，由干提取物新鮮制備提取物溶液。將在僅1％乙醇存在下轉(zhuǎn)化成甲的mtt轉(zhuǎn)化率設(shè)置為100％(數(shù)據(jù)為平均值±sd)。

實(shí)施例3

考慮到所述提取物的活性，所以申請(qǐng)人使用實(shí)施例1中所述的方法學(xué)觀(guān)察所述丹參酮的一些的活性。

v79mzh11b1細(xì)胞中測(cè)試的丹參酮為：

●丹參酮iia；

●丹參酮i；

●二氫丹參酮i；和

●隱丹參酮。

結(jié)果如下表3中所示：

表3.

表3.丹參酮iia、丹參酮i、二氫丹參酮i和隱丹參酮的cyp11b1抑制作用。結(jié)果為2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。

從結(jié)果中顯而易見(jiàn)，每種丹參酮顯示出抑制活性，其中兩種最有效的是二氫丹參酮(在10μm下94％抑制)，且丹參酮i(10μm時(shí)64％抑制)。

這本身是預(yù)料不到的，因?yàn)檫@兩種化合物在wo2009050451中公開(kāi)的提取物中的存在量(分別為3.65％和3.82％)比隱丹參酮和丹參酮iia(分別為18.95％和16.47％)更低。

觀(guān)察結(jié)構(gòu)，可能的情況是，二氫丹參酮(在10μm下94％抑制)和丹參酮i(在10μm下64％抑制)的增強(qiáng)的活性可以歸因于在c4位置上存在甲基(與二甲基相對(duì))基團(tuán)(grouping)。

考慮到這些結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物的活性，很可能丹參酮家族化合物的其它成員(或其衍生物)可以表現(xiàn)出相似(或更好)的cyp11b1抑制活性。

實(shí)施例4

在70℃、80℃和90℃下丹參提取物的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

一般地，傷口硬膏(plaster)成分通常短暫地保持在升高的溫度(70℃-90℃)下，以減少潛在的殘留病菌的數(shù)量。因此，重要的是所述提取物/丹參酮的cyp11b1抑制活性應(yīng)在這些升高的溫度下穩(wěn)定，條件是它們用于術(shù)后在傷口周?chē)蠓庞哺嗟那闆r。

在70℃、80℃或90℃下處理5min和15min后測(cè)定丹參提取物的cyp11b1抑制效力。將丹參提取物溶于100％dmso溶液(濃度為0.05％和0.025％)，并在70℃、80℃和90℃下溫育5或15min，然后在cyp11b1測(cè)定中在0.0005％和0.00025％終濃度下測(cè)試。這些濃度選自抑制cyp11b1的提取物的ic50附近。

結(jié)果示例在下表4中，其顯示了丹參提取物的熱穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)是4次(對(duì)照)或2次測(cè)量的平均值±sd：

表4.

表4.丹參提取物的熱穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)是4次(對(duì)照)或2次測(cè)量的平均值±sd。

與對(duì)照值(使用在25℃用0.05％和0.025％濃度預(yù)處理15min的丹參提取物測(cè)定)相比，在70℃、80℃和90℃下的任何預(yù)處理中都沒(méi)有觀(guān)察到對(duì)cyp11b1抑制活性的影響。因此，這些提取物/化合物可以用于其中將傷口置于硬膏中的情況。

實(shí)施例5

丹參提取物的變應(yīng)原性試驗(yàn)

在3位志愿者中，以在100％中0.5％的丹參濃度(重量/體積)在完整的人皮膚(上臂內(nèi)側(cè))上測(cè)試提取物的潛在變應(yīng)原性。在皮膚暴露5天期間，在任意個(gè)體中均未見(jiàn)變應(yīng)原性征兆(即，膚色或紋理變化)。

從上述實(shí)施例可以得出結(jié)論，來(lái)源于鼠尾草屬的種類(lèi)的包含一種或多種丹參酮化合物的植物提取物或所述一種或多種丹參酮化合物顯然是用于治療受益于皮質(zhì)醇合成抑制的傷口或其它病癥的富有希望的候選物。

另外，申請(qǐng)人已經(jīng)確定兩種具體的活性組分是相當(dāng)親脂性的(對(duì)于二氫丹參酮i而言，使用acd/logpgalas計(jì)算的log為3.57)，這啟示對(duì)表皮的良好穿透性(它對(duì)有效抑制表皮表達(dá)的靶酶必不可少)。