本發(fā)明涉及醫(yī)療評價、檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備腸道粘膜損傷動物模型的方法及其用途。

背景技術(shù)：

資料顯示，炎癥性腸病(inflammatoryboweldiseases，ibd)是一種病因不明的慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，uc)和克羅恩病(crohn’sdiseases，cd)兩種。研究顯示，ibd好發(fā)于青壯年，往往是發(fā)作一緩解一復(fù)發(fā)的模式，嚴重影響病人的生活質(zhì)量；其中uc主要發(fā)生在直腸和結(jié)腸，而cd的病變多見于末端回腸和鄰近結(jié)腸。所述炎癥性腸病的主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、體重下降及腹部包塊等，其中uc常伴有膿血便，同時也是結(jié)腸癌的高危因素；而cd常有瘺管形成和腸梗阻。ibd在西方國家相當(dāng)常見，患病率達100-200/10萬，在我國基于多家醫(yī)院病例統(tǒng)計推測，uc與cd的患病率分別為11.6/10萬和1.4/10萬，而近幾年患病率呈逐年增加之勢，由于疾病遷延不愈，給患者帶來沉重的經(jīng)濟和心理負擔(dān)，目前uc已成為嚴重危害國人健康的常見病、多發(fā)病。

炎癥性腸病的發(fā)病機制不明，目前認為ibd是由環(huán)境、遺傳、感染、代謝及免疫等多因素相互作用所致，氧化損傷可能是主要機制之一，在病理生理上ibd體現(xiàn)為粘膜損傷與粘膜修復(fù)的失代償。目前用于研究ibd的常用動物模型主要分為兩類：化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型如dss、tnbs、乙酸和oxz等；基因工程型動物模型如基因敲除或轉(zhuǎn)基因動物模型。實踐顯示，前者誘導(dǎo)方式相對簡便，但是造模的成功率與藥物的實驗濃度、培養(yǎng)環(huán)境以及實驗動物的種屬差異有關(guān)；后者造模成本較高，造模時間較長。然而目前化學(xué)誘導(dǎo)劑中主要是誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，但尚沒有從代謝角度或粘膜干細胞損傷修復(fù)角度探討腸道粘膜損傷的產(chǎn)生和腸道炎癥發(fā)生的理想模型。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種制備腸道粘膜損傷動物模 型的方法，通過建立合適的動物模型模仿炎癥性腸病，用于研究炎癥性腸病的病理發(fā)生和發(fā)展進程，幫助理解與炎癥性腸病有關(guān)的病因?qū)W因素，建立臨床上的診斷指標，為炎癥性腸病的治療提供實驗依據(jù)，本發(fā)明將對治療炎癥性腸病藥物的篩選具有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種制備腸道粘膜損傷動物模型的方法以及制得用于研究炎癥性腸病的動物模型，尤其從代謝損傷角度提供一種新型的l-mso誘導(dǎo)的腸道粘膜損傷動物模型。本發(fā)明建立的新的簡便穩(wěn)定的代謝型腸道粘膜損傷的誘導(dǎo)動物模型對炎癥性腸病的研究和實踐具有重大價值。

本發(fā)明的進一步的目的是提供制得的動物模型在用于l-mso在誘導(dǎo)小鼠腸道粘膜損傷中的應(yīng)用，通過建立合適的動物模型模仿炎癥性腸病。

本發(fā)明基于：谷氨酰胺(glutamine，gln)是一種具有多種生物學(xué)作用的條件必需氨基酸，主要應(yīng)用于改善機體的各種應(yīng)激反應(yīng)，維持機體免疫細胞正常功能；gln已在臨床實踐中用于腸炎治療，但其治療機制尚不明確，目前認為gln可減輕創(chuàng)傷、感染等多種應(yīng)激反應(yīng)對腸黏膜屏障功能的損傷，以及動物及臨床實驗研究顯示腸內(nèi)、腸外營養(yǎng)中適當(dāng)?shù)匮a充外源性gln能加快腸黏膜上皮細胞的更新，增強腸黏膜細胞間的緊密連接，防止炎癥所致的腸道通透性增加，進而起到恢復(fù)腸黏膜形態(tài)和功能完整性的作用，表明gln通過維持結(jié)腸粘膜形態(tài)及屏障功能的完整、提高機體的抗氧化能力、緩解炎癥反應(yīng)對潰瘍性結(jié)腸炎所致的結(jié)腸損傷起到修復(fù)作用，從而使?jié)冃越Y(jié)腸炎造成的結(jié)腸粘膜損傷得到緩解等的研究基礎(chǔ)；通過采用l-蛋氨酸砜亞胺(l-methioninesulfoximine，l-mso)誘導(dǎo)小鼠腸道粘膜損傷，建立合適的動物模型模仿炎癥性腸病。

具體的，本發(fā)明提供了一種制備腸道粘膜損傷動物模型的方法，采用藥物l-蛋氨酸砜亞胺l-mso從代謝損傷角度誘導(dǎo)制備腸道粘膜損傷動物模型，其包括步驟：

1)使用spf級c56bl/6的6-8周齡小鼠為實驗動物，設(shè)l-mso高濃度組和l-mso低濃度組；

2)l-mso高濃度組誘導(dǎo)腸道嚴重的持續(xù)性損傷，工作濃度為100mg/kg，每 隔一天灌胃給藥，給藥持續(xù)一周；

3)l-mso低濃度組誘導(dǎo)腸道輕中度的損傷，工作濃度為25mg/kg，每隔一天灌胃給藥，給藥持續(xù)一周；

4)實驗期間，每天觀察小鼠的應(yīng)激、活動減少的大體情況，并按所規(guī)定的指標觀察，同時進行疾病活動度(dai)評分；

表1dai評分標準

5)動物腸道評價及組織樣本收集；

6)he染色和組織病理學(xué)評分；

7)eilisa

檢測小鼠結(jié)腸組織勻漿中的炎性因子表達水平，并使用總蛋白bca蛋白定量作為調(diào)平依據(jù)；

8)內(nèi)源性谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶檢測

檢測小鼠結(jié)腸粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表達水平；

9)mpo檢測

鄰聯(lián)二茴香胺氧化法測定mpo活性。

本發(fā)明中，動物腸道評價及組織樣本的收集包括：

常規(guī)處理小鼠后，迅速在預(yù)冷環(huán)境解剖采樣；小鼠固定，用棉簽沾碘伏或生理鹽水潤濕腹部毛發(fā)，防止黏附腸道組織；工字切口，暴露腹腔臟器，拍攝臟器大體圖。使用潤濕的棉簽和鑷、剪分離腸道組織，截取一部分回腸到肛門口的腸道組織(回腸部預(yù)留6厘米以上)。從回盲部分離回腸，取盲腸及以下組織，回腸置遇冷環(huán)境備用。攤直腸道樣本，置于白紙上，用記號筆標記樣本號。放置直尺，作為標準。以三個一組(如ctrl組3只，l-mso組3只，對比放置)的方式，拍攝腸道長度直觀圖，并記錄長度。

在組織樣本采集前，需事先標記好相應(yīng)的1.5mlep管(4％多聚甲醛固定)或凍存管(液氮組織凍存用于之后的elisa和谷氨酰胺檢測)并預(yù)冷。取結(jié)腸組織6cm，縱行剪開腸道，用生理鹽水、棉簽等清除里面的糞便，將腸道組織攤于潤濕的白色濾紙上，并用棉簽小心將腸粘膜攤平。再蓋上一層潤濕的白色濾紙，形成三明治結(jié)構(gòu)。剪取1cm，用事先編號的固定夾夾好，投入4％的多聚甲醛，4度過夜。余下組織去濾紙，裝入凍存管，凍存于液氮；

本發(fā)明中，he染色和組織病理學(xué)評分包括：

將4％多聚甲醛固定4度固定24h的結(jié)腸樣本送上海威奧生物科技有限公司進行后續(xù)的包埋、固定和he染色；對腸道組織病理進行評分；

表2組織學(xué)損傷評分標準

本發(fā)明中，eilisa使用達科為的mouseelisa試劑盒檢測小鼠結(jié)腸組織勻漿中的炎性因子表達水平，并使用總蛋白bca蛋白定量作為調(diào)平依據(jù)；

本發(fā)明中，使用谷氨酰胺測定試劑盒檢測小鼠結(jié)腸粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表達水平；

本發(fā)明中，使用髓過氧化物酶(mpo)測定試劑盒以鄰聯(lián)二茴香胺氧化法測定mpo活性。

本發(fā)明中，實驗結(jié)果采用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗比較差異。p＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。所有統(tǒng)計采用spss20.0軟件。

本發(fā)明中，采用低濃度l-mso制備一般損傷模型，其中，實驗小鼠腸道粘膜輕-中度的損傷；

本發(fā)明中，采用高濃度l-mso制備嚴重損傷模型，其中，實驗小鼠腸道粘膜重度損傷。

本發(fā)明提供了從代謝損傷角度提供了一種新型的l-mso誘導(dǎo)的腸道粘膜損傷動物模型的制備方法以及制得用于研究炎癥性腸病的動物模型，尤其通過使用 水溶性好，灌胃操作方便簡單得藥物l-mso，可以方便穩(wěn)定地誘導(dǎo)出小鼠腸道粘膜損傷，并引起相應(yīng)組織病理學(xué)改變和炎性因子變化，本發(fā)明的制備方法從代謝損傷方向明顯區(qū)別現(xiàn)有技術(shù)的誘導(dǎo)免疫損傷的造模方向制得腸道粘膜損傷動物模型，其對炎癥性腸病的研究和實踐具有重大價值。

附圖說明

圖1顯示了實驗動物體重下降結(jié)果。

圖2顯示了藥物對實驗動物結(jié)腸長度縮短的影響。

圖3，圖4顯示了組織病理學(xué)評分發(fā)現(xiàn)腸道粘膜損傷(he染色)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

(一)試劑

l-蛋氨酸砜亞胺(l-methioninesulfoximine，l-mso)購自sigma-aldrich公司(貨號：m5379)，使用ddh2o溶解，l-mso在使用前需要新鮮配置。elisa試劑盒購自深圳市達科為生物技術(shù)有限公司，所使用的elisa試劑盒和貨號分別如下：mouseil-6(dkw12-2060)、mouseil-10(dkw12-2100)、mouse-17a(dkw12-2170)mouseil-1β(dkw12-2012)和mouseil-12/il-23p40(dkw12-2123)。谷氨酰胺測定試劑盒(a073)、谷氨酰胺合成酶(gs)測定試劑盒(a047)和髓過氧化物酶(mpo)測定試劑盒(a044)購于南京建成生物科技研究所。

(二)動物實驗

spf級c57bl/6小鼠，6-8周齡(體重20-25g左右)，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：scxk(滬)2012-0002。小鼠飼養(yǎng)和動物實驗在復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部進行，飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)為ivc級動物培養(yǎng)室，溫度在20～26℃，相對濕度40～70％。噪音60分貝以下，氨濃度14/(mg/m³)以下.通風(fēng)換氣大于等于15次/小時。光照循環(huán)條件是是12小時明/12小時暗；其實驗動物使用許可證號：syxk(滬)2014-0029；

動物入駐動物房后，先打耳釘編號和稱首次體重，并記錄數(shù)據(jù)，待實驗動物適應(yīng)動物房環(huán)境一周后，隨機分為三組：高濃度l-mso組：劑量100mg/kg，每隔一天灌胃給藥，給藥持續(xù)一周，更優(yōu)的，給藥持續(xù)2周：該高濃度l-mso造成小鼠腸道粘膜重度損傷；低濃度l-mso組，劑量25mg/kg，每隔一天灌胃給藥，給藥持續(xù)一周；更優(yōu)的，給藥持續(xù)2周；該低濃度l-mso造成小鼠腸道粘膜輕-中度的損傷；對照組：給予同等體積的ddh2o，每隔一天灌胃，持續(xù)一周；

實驗期間，每天觀察小鼠的大體情況(有無應(yīng)激、活動減少以及體重、糞便等)，并按照以下指標對小鼠進行觀察，若小鼠體重下降10％，繼續(xù)以隔1天灌胃造模；若小鼠體重下降11-25％，給藥改為隔2天灌胃；若小鼠體重下降26-50％，給藥改為隔4天灌胃；若小鼠體重下降>50％，停止給藥；并拍攝小鼠肛門口情況和新鮮糞便照片留底，同時進行疾病活動度(dai)評分，具體評分方法見下表。

dai評分標準

(三)動物腸道評價及組織樣本的收集

常規(guī)處理小鼠后，應(yīng)迅速在預(yù)冷環(huán)境解剖采樣；小鼠固定，用棉簽沾碘伏或生理鹽水潤濕腹部毛發(fā)，防止黏附腸道組織。工字切口，暴露腹腔臟器，拍攝臟器大體圖。使用潤濕的棉簽和鑷、剪分離腸道組織，截取一部分回腸到肛門口的腸道組織(回腸部預(yù)留6厘米以上)。從回盲部分離回腸，取盲腸及以下組織，回腸置遇冷環(huán)境備用。攤直腸道樣本，置于白紙上，用記號筆標記樣本號。放置直尺，作為標準。以三個一組(如ctrl組3只，l-mso組3只，對比放置)的方式，拍攝腸道長度直觀圖，并記錄長度；

在組織樣本采集前，需事先標記好相應(yīng)的1.5mlep管(4％多聚甲醛固定)或凍存管(液氮組織凍存用于之后的elisa和谷氨酰胺檢測)并預(yù)冷；取結(jié)腸組織6cm，縱行剪開腸道，用生理鹽水、棉簽等清除里面的糞便，將腸道組織攤于潤濕的白色濾紙上，并用棉簽小心將腸粘膜攤平。再蓋上一層潤濕的白色濾紙，形成三明治結(jié)構(gòu)。剪取1cm，用事先編號的固定夾夾好，投入4％的多聚甲醛，4度 過夜。余下組織去濾紙，裝入凍存管，凍存于液氮；

(四)he染色和組織病理學(xué)評分

將4％多聚甲醛固定4度固定24h的結(jié)腸樣本送上海威奧生物科技有限公司進行后續(xù)的包埋、固定和he染色；邀請資深病理學(xué)專家對腸道組織病理進行評分。

組織學(xué)損傷評分標準

(五)eilisa

使用達科為的mouseelisa試劑盒檢測小鼠結(jié)腸組織勻漿中的炎性因子表達水平，并使用總蛋白bca蛋白定量作為調(diào)平依據(jù)；

(六)內(nèi)源性谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶檢測

使用谷氨酰胺測定試劑盒檢測小鼠結(jié)腸粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表達水平；

(七)mpo檢測

使用髓過氧化物酶(mpo)測定試劑盒以鄰聯(lián)二茴香胺氧化法測定mpo活性；

(八)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗比較差異。p＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。所有統(tǒng)計采用spss20.0軟件。

實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明采用水溶性好，灌胃操作方便簡單的藥物l-mso，可以方便穩(wěn)定地誘導(dǎo)出小鼠腸道粘膜損傷，并引起相應(yīng)組織病理學(xué)改變和炎性因子變化，本發(fā)明的制備方法從代謝損傷方向明顯區(qū)別現(xiàn)有技術(shù)的誘導(dǎo)免疫損傷的造模方向制得腸道粘膜損傷動物模型，尤其，采用低濃度l-mso制備一般損傷模型，其中，實驗小鼠腸道粘膜輕-中度的損傷；采用高濃度l-mso制備嚴重損傷模型，其中，實驗小鼠腸道粘膜重度損傷；制得的腸道粘膜損傷模型對炎癥性腸病的研究和實踐具有重大價值。