本發(fā)明屬于醫(yī)藥學領域，更具體地，本發(fā)明涉及氫氧化鋁在制備防治肝纖維化藥物中的應用。

背景技術(shù)：

肝纖維化是肝臟受到損傷時，細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)彌漫性過度沉積的復雜、漸進過程，可造成肝臟結(jié)構(gòu)破壞和改變，并能進一步演變成肝硬化甚至肝衰竭等。許多肝臟疾病患者，包括慢性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等，在經(jīng)過有效的治療后，肝臟通過纖維化修復，緩慢進展為肝纖維化和肝硬化。目前，隨著慢性肝炎和非酒精性脂肪性肝病患者的增加，肝纖維化和肝硬化正在成為影響人類健康的重要肝臟疾病。為了阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進展，臨床上需采取有效的治療措施進行抗纖維化治療，但目前尚無有效的抗纖維化藥物。

肝臟星狀細胞(hepaticstellatecell，hsc)的活化被認為是肝臟發(fā)生纖維化的基礎。阻斷hsc由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)是針對慢性肝纖維化的有效治療方法之一。該領域的研究多集中在hsc去活化方面，目前已確定的hsc去活化過程包括三種方式：(1)活化的hsc表達一類特殊的配體，增強其與自然殺傷(nk)細胞之間的相互作用，進而發(fā)生nk細胞介導的凋亡；(2)活化的hsc表達衰老標志物和相關受體，募集免疫細胞，使其得以被清除出肝臟，進而抑制肝纖維化的進展；(3)活化hsc在一些分子的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殪o息狀態(tài)，如過氧化物酶體增殖物激活受體可使活化的hsc轉(zhuǎn)化為靜息期hsc，熱休克蛋白la/b在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中可促進靜息的hsc存活于肝臟中。靶向上述三種hsc去活化過程的藥物研發(fā)正是防治肝纖維化治療的研究熱點和難點。

因此，尋找和開發(fā)新的有效防治肝纖維化的藥物對于控制慢性肝臟疾病的進展至關重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供氫氧化鋁在制備防治肝纖維化藥物中的應用。

在本發(fā)明的第一方面，提供氫氧化鋁在制備預防、緩解或治療肝纖維化的組合物中的用途。

在一個優(yōu)選例中，所述的組合物用于抑制肝星狀細胞的增生或活化。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物用于降低肝臟α-平滑肌肌動蛋白的表達；或降低肝臟結(jié)蛋白的表達。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。

在另一個優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是注射劑。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物中不包含用于免疫的免疫原(或抗原)。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物中，氫氧化鋁單獨作為預防、緩解或治療肝纖維化的活性化合物。

在另一個優(yōu)選例中，所述的氫氧化鋁包括氫氧化鋁佐劑。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備預防、緩解或治療肝纖維化的組合物的方法，所述方法包括：將氫氧化鋁與藥學上可接受的載體混合，獲得預防、緩解或治療肝纖維化的組合物。

在一個優(yōu)選例中，所述的組合物中，氫氧化鋁的含量是有效量的。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物為單位劑型，每劑包含0.2mg～1g氫氧化鋁。

在另一個優(yōu)選例中，所述的方法中，不包括將氫氧化鋁與免疫原(或抗原)混合的步驟。

在另一個優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。

在另一個優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是注射劑。

在另一個優(yōu)選例中，所述的方法還包括：添加氫氧化鋁以外的對于抑制肝纖維化有效的藥物。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、大鼠肝纖維化模型的構(gòu)建及h&e染色。

a為生理鹽水組和al(oh)3組大鼠肝臟外觀圖；

b為各組大鼠肝臟h&e染色圖。

圖2、生理鹽水組和al(oh)3組大鼠肝臟天狼猩紅染色圖。

圖3、生理鹽水組和al(oh)3組大鼠肝臟desmin染色圖。

圖4、理鹽水組和al(oh)3組大鼠肝臟α-sma的westernblot檢測圖。

圖5、大鼠主要臟器的h&e染色圖。

圖6、小鼠肝纖維化模型中各組小鼠肝臟h&e染色圖。

圖7、生理鹽水組和al(oh)3組小鼠肝臟天狼猩紅染色圖。

圖8、生理鹽水組和al(oh)3組小鼠肝臟desmin染色圖。

圖9、生理鹽水組和al(oh)3組小鼠肝臟α-sma的westernblot檢測圖。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次揭示氫氧化鋁[al(oh)3]化合物能夠有效地防治肝纖維化，可應用于制備防治肝纖維化的藥物。本發(fā)明為氫氧化鋁的臨床治療應用提供了新的途徑。

氫氧化鋁

氫氧化鋁[al(oh)3]佐劑是經(jīng)典鋁膠佐劑的一種，其使用方便，成本低廉，安全無毒，已成為美國fda和中國食品藥品監(jiān)督局批準的唯一人用疫苗佐劑。氫氧化鋁佐劑在疫苗中使用可提高機體的免疫應答水平，其有效性和安全性已得到了實踐驗證和人們的公認，現(xiàn)已獲得批準應用于白喉、破傷風、麻疹等多種疫苗。商品化的氫氧化鋁佐劑為近乎透明的溶膠，其中al(oh)3是纖維狀結(jié)晶粒子，大小4.5nm×2.2nm×10nm，等電點11.4。這種粒子聚集后以松散的l～10μm大小的形式存在。作為佐劑的氫氧化鋁能從溶液中強烈黏附疫苗抗原，形成沉淀。當其接種到機體內(nèi)后可形成一個 “抗原庫”，緩慢釋放出抗原，充分延長了抗原的作用時間。同時還能促進局部(注射部位)巨噬細胞的應答。氫氧化鋁佐劑的生物作用主要包括：(1)與抗原物質(zhì)混合后，改變抗原的物理性狀，使抗原物質(zhì)緩慢釋放，延長抗原作用時間；(2)增加了抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細胞吞噬；(3)刺激吞噬細胞對抗原的處理；(4)促進淋巴細胞之間的接觸，增強輔助t細胞的作用；(5)刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞產(chǎn)生抗體；(6)提高機體初次和再次免疫應答的抗體滴變。近來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁還可通過多種方式刺激機體的免疫效應，包括促進免疫細胞的聚集，如中性粒細胞、炎性單核細胞和樹突狀細胞；誘導動物模型的th2型免疫應答；介導炎性因子的分泌；誘導t細胞顯著增殖，增強記憶性cd8⁺t細胞，誘導殺傷性t細胞的分化等。

盡管氫氧化鋁作為疫苗佐劑的作用機制已在體內(nèi)外進行了大量的實驗研究，但至今未見氫氧化鋁單獨用于防治肝纖維化及其相關機制的報道。

如本發(fā)明所用，所述的氫氧化鋁包含廣泛用于多種疫苗的氫氧化鋁佐劑。

如本發(fā)明所用，所述的氫氧化鋁也包括三氧化二鋁的水合物。

用途

本發(fā)明利用氫氧化鋁化合物作為單獨成分在大鼠和小鼠肝纖維化模型中進行了實驗。通過腹腔注射二乙基亞硝胺(diethy-lnitrosamine，den)建立大鼠肝纖維化模型，或腹腔注射四氯化碳(carbontetrachloride，ccl4)建立小鼠肝纖維化模型，在建模過程中給予生理鹽水(對照組)或氫氧化鋁(實驗組)治療，觀察大鼠或小鼠肝纖維化程度及hsc的活化情況。通過天狼猩紅染色，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，有大量的細胞外基質(zhì)沉積，實驗組給藥氫氧化鋁后動物肝纖維化程度明顯減輕，僅有少量細胞外基質(zhì)的沉積。通過對活化hsc標志物desmin和α-sma的檢測，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟中有較多的活化hsc，實驗組動物肝臟中活化hsc數(shù)量明顯減少。同時，對實驗動物各臟器的h&e染色亦表明，給藥氫氧化鋁后，與給予生理鹽水組相同，動物主要臟器未見明顯損傷。

因此，給予氫氧化鋁可明顯減少活化hsc的數(shù)量，進而抑制肝臟的纖維化，表明采用氫氧化鋁作為單獨唯一成分能夠安全、有效地抑制hsc的活化， 減緩或阻止肝纖維化進程。

基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了氫氧化鋁的用途，用于制備預防、緩解或治療肝纖維化的組合物。

本發(fā)明所述的氫氧化鋁可作為單獨成分制備防治肝纖維化藥物，還可作為單獨成分與其他有效的肝纖維化治療方法或防治肝纖維化藥物用于綜合治療。

組合物

如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的組合物”是藥物組合物，只要它們含有氫氧化鋁作為防治肝纖維化的活性成分。

所述的組合物可以含有有效量的(如0.1-20wt％；更佳地0.5-10wt％；進一步更佳地1-7wt％)的氫氧化鋁作為活性成分；(b)藥物學上或食品上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。

本發(fā)明中，“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。

本發(fā)明中，“藥學上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的氫氧化鋁傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。

本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種可行的劑型，只要是能夠使活性成分有效地到達哺乳動物體內(nèi)的劑型都是可以的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的藥物組合物的劑型是溶液，其中氫氧化鋁以溶膠的形式存在于適宜液體載體或稀釋液中。

本發(fā)明的組合物可以采用氫氧化鋁溶膠來配制，所述的氫氧化鋁溶膠可采用以下的制備方法之一獲得：一種是氨水配法，即三氯化鋁(alcl3)與氨水反應，生成al(oh)3膠體；另一種是alcl3與氫氧化鈉(naoh)反應，生成al(oh)3膠體。后一種方法是較為優(yōu)選的，其具有操作簡便，無雜質(zhì)存留的優(yōu)點。制備完成后，可以配制為例如al(oh)3濃度約為0.1％的制劑。當然， 其它濃度也是可行的。

現(xiàn)在，已有多家公司提供用于動物實驗的al(oh)3佐劑，包括sigma，merck，invivogen等，這些產(chǎn)品均可應用于本發(fā)明中，配制本發(fā)明的適用于防治肝纖維化的組合物。

本發(fā)明的氫氧化鋁及其組合物也可儲存在適宜于注射或滴注或給藥的消毒器具中。通常，在本發(fā)明的藥物組合物中，氫氧化鋁作為活性成分一般占總重量的0.05～0.5wt％(質(zhì)量體積比)；較佳地約0.1wt％(質(zhì)量體積比)，其余可以為藥學上可接受的載體以及其他添加劑等物質(zhì)。

所用的活性成分的有效劑量可隨所用的氫氧化鋁、給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。然而，通常當本發(fā)明的化合物每天以約0.00001-0.1g/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，也可以以緩釋形式給藥。可調(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，根據(jù)臨床醫(yī)師的判斷，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。例如，當應用于小鼠時，氫氧化鋁的較適宜的劑量為每只小鼠每次給予0.1-0.5mg氫氧化鋁，對于其它哺乳動物或人，可以按照本領域公知的方式進行劑量的調(diào)整；或通過有限次的實驗來獲得一個較佳的劑量。例如，根據(jù)中國實驗動物信息網(wǎng)提供的數(shù)據(jù)，按照公斤體重來算，將成年人的體重以60公斤計，那么給20g小鼠灌胃的藥物劑量(公斤/體重)是人的用藥劑量(公斤/體重)的9.01倍。

根據(jù)臨床的治療需要，氫氧化鋁或其組合物還可與其它活性成分或藥物聯(lián)合給藥。當兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨給藥的效果。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、al(oh)3功能驗證──大鼠肝纖維化模型的構(gòu)建及h&e染色檢測

al(oh)3溶液：將al(oh)3溶膠(購自invovogen公司，alhydrogeladjuvant，2％(w/v(質(zhì)量體積比)))溶于生理鹽水中，獲得溶液，al(oh)3終濃度為0.1％(w/v(質(zhì)量體積比))。

選取6周齡、雄性wistar大鼠30只，腹腔注射二乙基亞硝胺(diethy-lnitrosamine，den)，70mg/kg，每周一次，連續(xù)注射10周，構(gòu)建肝纖維化模型。20只大鼠隨機分成兩組，實驗組大鼠在如上給予den的同時，腹腔注射al(oh)3溶液，注射0.6mg/只，每隔3天一次，連續(xù)注射10周；對照組給予den的同時，腹腔注射等量的生理鹽水(0.9％nacl液體)，每隔3天一次，連續(xù)注射10周。

連續(xù)處理10周后，處死大鼠，收取各組大鼠肝臟，拍照。隨后以福爾馬林液固定，石蠟包埋，制作切片并進行蘇木精-伊紅染色(h&e染色)。

h&e染色方法如下：

1)臟器組織石蠟切片脫蠟至水；

2)蘇木精液染色5min，水洗；

3)1％鹽酸乙醇1-3s，水洗；

4)0.5％伊紅液染色1min，水洗；

5)脫水封片。

大鼠的肝臟照片如圖1a，可見生理鹽水組的肝臟發(fā)生較為顯著的肝纖維化，而al(oh)3處理組則肝纖維化不明顯。

大鼠肝臟切片的h&e染色結(jié)果如圖1b，可見生理鹽水組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，有較多的纖維結(jié)締組織堆積和炎性細胞浸潤；而al(oh)3處理組組織結(jié)構(gòu)相對完整，僅有少量纖維結(jié)締組織和炎性細胞。

因此可見，al(oh)3處理能夠使得肝纖維化程度明顯減輕。

實施例2、al(oh)3功能驗證──大鼠肝臟天狼猩紅染色檢測

膠原呈堿性，與酸性染料起強烈反應。天狼星紅是一種很強的酸性染料，它可以和膠原纖維反應使膠原纖維產(chǎn)生明顯的雙折光現(xiàn)象。天狼星紅染色后，膠原纖維特異性呈紅色，顯著區(qū)別于非膠原纖維部分，有助于確定膠原纖維的分布及其與周圍細胞的關系。

取實施例1中獲得的大鼠肝臟切片，包括生理鹽水組和al(oh)3組，進 行天狼猩紅染色。

天狼猩紅染色方法如下：

1)石蠟切片脫蠟至水；

2)蘇木精液染色5min，水洗；

3)天狼猩紅染色30min，水洗；

4)無水乙醇浸泡分化2min×3次；

5)封片。

大鼠肝臟天狼猩紅染色結(jié)果如圖2所示。由結(jié)果可見，對照組動物肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，有大量的細胞外基質(zhì)沉積；實驗組給藥氫氧化鋁al(oh)3后動物肝纖維化程度明顯減輕，僅有少量細胞外基質(zhì)的沉積。

實施例3、al(oh)3功能驗證──大鼠肝臟結(jié)蛋白(desmin)染色檢測

肝纖維化還表現(xiàn)為星狀細胞的增生活化。肝臟結(jié)蛋白(desmin)的是肝星形細胞(hsc)標志物，因此本實施例中以desmin抗體進行免疫組化染色以確定星狀細胞的增生情況。

取實施例1中獲得的大鼠肝臟組織，包括生理鹽水組和al(oh)3組，在o.c.t組織凍存保護液中進行冰凍保存并切片。

desmin免疫熒光染色方法如下：

1)冰凍切片丙酮固定10min；

2)0.4％triton100處理5min，水洗；

3)山羊血清封閉30min，水洗；

4)desmin抗體孵育(1:100，購自cellsignalingtechnology公司)，4℃過夜，水洗；

5)熒光二抗，30min，水洗；

6)dapi染色30sec，水洗；

7)封片。

大鼠肝臟desmin染色結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟中desmin染色較強，說明存在較多的活化hsc，al(oh)3實驗組動物肝臟中desmin較低，說明活化hsc數(shù)量明顯少于對照組。因此，al(oh)3可減少肝臟星狀細胞的增生活化，阻止肝纖維化進程。

實施例4、al(oh)3功能驗證──大鼠肝臟α-平滑肌肌動蛋白(α-sma)的westernblot檢測

肝臟α-平滑肌肌動蛋白(α-sma)的也是肝星形細胞(hsc)標志物，因此本實施例中以特異性抗α-sma抗體進行westernblot檢測，以確定星狀細胞的增生情況。

取實施例1中獲得的大鼠肝臟組織，包括生理鹽水組和al(oh)3組，以ip裂解液充分裂解組織，離心提取蛋白并定量。

westernblot方法如下：

1)配制sds-page凝膠；

2)蛋白樣品上樣，60ug/每孔；

3)電泳80v-30min，120v-2hr；

4)轉(zhuǎn)膜15v，60min；

5)封閉液中，室溫敷育1hr；

6)加入抗α-sma的一抗，室溫雜交2hr或4℃過夜；

7)加入二抗，室溫雜交1hr；

8)odyssey掃膜儀掃膜。

大鼠肝臟α-sma的westernblot結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟中α-sma表達較高，說明存在較多的活化hsc；al(oh)3實驗組動物肝臟中α-sma表達顯著低于對照組，說明活化hsc數(shù)量少于對照組。因此，al(oh)3可減少肝臟星狀細胞的增生活化，阻止肝纖維化進程。

實施例5、al(oh)3對大鼠肝以外的主要臟器的影響

生理鹽水組和al(oh)3組大鼠按實施例1所述方法給予處理，10周后處死大鼠，收取各組大鼠臟器(心、脾、肺和腎)，以福爾馬林液固定，石蠟包埋，制作切片并進行h&e染色，染色方法如實施例1所述。

大鼠心、脾、肺和腎的h&e染色結(jié)果如圖5所示，各組大鼠臟器的結(jié)構(gòu)、組成細胞均未見明顯異常，表明注射al(oh)3對大鼠主要臟器沒有明顯的損傷作用。

實施例6、al(oh)3功能驗證──小鼠肝纖維化模型中各組小鼠肝臟h&e染色檢測

選取6周齡、雄性c57小鼠30只，腹腔注射ccl4，4ml/kg(以5％體積溶解于橄欖油)，每周注射2次，連續(xù)注射10周，構(gòu)建小鼠肝纖維化模型。將20只小鼠隨機分成兩組，實驗組小鼠在如上給予ccl4的同時，腹腔注射al(oh)3溶液(濃度為0.1％(w/v(質(zhì)量體積比)))，0.25mg/只，每隔3天一次，連續(xù)注射10周。對照組如上給予ccl4的同時，腹腔注射等量的生理鹽水(0.9％nacl液體)，每隔3天一次，連續(xù)注射10周。連續(xù)處理10周后，處死小鼠，收取各組小鼠肝臟。隨后制作切片并進行h&e染色，方法如實施例1所述。

小鼠肝臟h&e染色如圖6所示，可見生理鹽水組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，有較多的纖維結(jié)締組織堆積和炎性細胞浸潤，而al(oh)3處理組組織結(jié)構(gòu)相對完整，僅有少量纖維結(jié)締組織和炎性細胞。因此可見，al(oh)3處理能夠使得肝纖維化程度明顯減輕。

實施例7、al(oh)3功能驗證──小鼠肝臟天狼猩紅染色檢測

取生理鹽水組和al(oh)3組的小鼠肝臟切片，按實施例2所述方法進行天狼猩紅染色。

小鼠肝臟天狼猩紅染色結(jié)果如圖7所示，可見對照組動物肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，有大量的細胞外基質(zhì)沉積；實驗組給藥氫氧化鋁al(oh)3后動物肝纖維化程度明顯減輕，僅有少量細胞外基質(zhì)的沉積。

實施例8、al(oh)3功能驗證──小鼠肝臟desmin染色檢測

取生理鹽水組和al(oh)3組的小鼠肝臟切片，按實施例3所述方法進行desmin染色。

小鼠肝臟desmin染色結(jié)果如圖8所示，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟中desmin染色較強，說明存在較多的活化hsc，al(oh)3實驗組動物肝臟中desmin較低，說明活化hsc數(shù)量明顯少于對照組。

上述結(jié)果說明，al(oh)3可減少肝臟星狀細胞的增生活化，阻止肝纖維化進程。

實施例9、al(oh)3功能驗證──小鼠肝臟α-smawesternblot檢測

取生理鹽水組和al(oh)3組的小鼠肝臟組織，按實施例4所述方法進行α-smawesternblot檢測。

小鼠肝臟α-sma的westernblot結(jié)果如圖9所示，發(fā)現(xiàn)對照組動物肝臟中α-sma表達較高，說明存在較多的活化hsc；al(oh)3實驗組動物肝臟中α-sma表達顯著低于對照組，說明活化hsc數(shù)量少于對照組。

上述結(jié)果說明，al(oh)3可減少肝臟星狀細胞的增生活化，阻止肝纖維化進程。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。