本發(fā)明屬于抗血栓藥物領域，涉及rip3抑制劑在制備抗血小板血栓藥物中的用途。

背景技術：

眾所周知，血小板在止血和血栓形成過程中舉足輕重。一旦血管出現(xiàn)損傷，血小板即可黏附至內(nèi)皮下的蛋白成分，同時發(fā)生活化，從而觸發(fā)血小板內(nèi)致密顆粒的釋放及血栓素a2（txa2）的合成。釋放出的可溶性血小板激動劑（如二磷酸腺苷（adp）、凝血酶及txa2）進一步募集循環(huán)中的血小板，并通過結(jié)合至血小板表面的g蛋白偶聯(lián)受體（gprotein-coupledreceptor，gpcr）使聚集反應更加穩(wěn)定，從而形成不可逆的血小板血栓，達到凝血、止血的效果。

adp作為致密顆粒中的重要組分，在低濃度激動劑引起的血小板活化的信號放大效應中起主要介導作用。adp通過p2y1及p2y12受體分別激動gq及gi信號通路。p2y1受體在adp誘導的血小板活化中起著微弱卻至關重要的始動作用，p2y12受體不但接續(xù)并完善由p2y1起始的血小板聚集，更重要的是，參與其他激動劑（如txa2、凝血酶等）誘導的血小板聚集。因此，當血小板受到低濃度激動劑的刺激時，adp的作用尤為重要。

txa2或凝血酶刺激血小板均可導致adp自致密顆粒中釋放。雖然txa2通過血栓素a2/前列腺素h2（tp）受體激活血小板，而凝血酶通過蛋白酶活化受體（protease-activatedreceptors，pars）激活血小板，但是兩者均與gq及g13通路偶聯(lián)，而致密顆粒的釋放恰恰需要gq及g13通路的活化。從血小板中去除gq或g13不僅顯著抑制了致密顆粒的釋放，亦可影響體內(nèi)初級止血以及動脈血栓的形成。作為穩(wěn)定的txa2類似物，u46619可以誘導adp的二相釋放，而磷脂酰肌醇-3-激酶（pi3k）的激活對adp的二相釋放同樣發(fā)揮重要作用。去除pi3k的下游分子akt1或akt2可以減弱血小板的活化及致密顆粒的釋放。另外，pi3k可經(jīng)由gpcr結(jié)合到gβγ。由此可見，pi3k-akt信號通路在gpcr激動劑誘導的血小板釋放過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

受體相互作用蛋白激酶（receptor-interactingproteinkinase，rip）是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，包含7個成員（即rip1-7），其在n末端均含有一段高度同源的激酶結(jié)構(gòu)域（kinasedomain，kd），并且具有不同的c末端。其中，含有518個氨基酸的rip3蛋白是rip激酶家族中分子量最小的蛋白質(zhì)，其n末端包含的kd對其激酶活性及自身磷酸化均至關重要，而c末端包含的rip同型相互作用基序（riphomotypicinteractionmotif，rhim）可介導rip3與其他壞死性凋亡（necroptosis）相關蛋白的相互作用?，F(xiàn)有研究大多關注rip3對細胞凋亡和程序性壞死的調(diào)控作用，但其在止血和血栓形成中的地位尚屬未知。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次通過實驗探究了rip3在止血和血栓形成過程中的作用，發(fā)現(xiàn)rip3不僅在體外實驗中參與血小板的調(diào)節(jié)，而且在體內(nèi)的止血和血栓形成過程中也發(fā)揮重要作用，可以作為抗血栓的新靶點。通過調(diào)節(jié)adp的釋放，rip3選擇性地影響了血栓素a2（txa2）及凝血酶介導的血小板活化，表明rip3抑制劑可以參與血小板血栓形成過程，進而抑制血栓形成，可以開發(fā)成新型抗血栓藥物，極具科研和經(jīng)濟價值。因此，本發(fā)明提供了rip3抑制劑在制備抗血小板血栓藥物中的用途。

目前，關于rip3抑制劑的研究報道尚不多見，主要集中于以下三類：（1）無機物類抑制劑；（2）小分子有機物類抑制劑；以及（3）核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑。

無機物類抑制劑通常為金屬離子的氯化物（如hg2cl2）、氟化物（如bef2）和磷酸鹽（如cu3(po4)2），對常見的蛋白激酶均能夠產(chǎn)生抑制作用。但由于其毒性較大、選擇性較差，適用范圍比較受限。

小分子有機物類抑制劑是rip3抑制劑中最重要的一類，包含了較為繁多的結(jié)構(gòu)類型，逐漸成為國內(nèi)外制藥企業(yè)的關注熱點。小分子有機物類抑制劑直接作用于rip3中n末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域，起到抑制rip3的作用，其主要包括如下類型：氨基苯并噻唑類抑制劑（如gsk’872、gsk’843）、二芳基馬來酰亞胺類抑制劑（如enzastaurin、sb216763等）、二芳基脲類抑制劑（如sorafenib）、苯氨基喹唑啉類抑制劑（如vandetanib、erlotinib等）、異喹啉磺胺類抑制劑（如fasudil）、吡啶并咪唑類抑制劑（如vemurafenib）和十字孢堿類抑制劑（如staurosporine）等。

在核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑中，多聚核苷酸類抑制劑通過由自身核酸序列編碼的蛋白質(zhì)作用于rip3中n末端的kd，發(fā)揮rip3抑制作用。除了通過核酸序列編碼相應的蛋白質(zhì)以外，rip3抗體同樣可以直接作用于rip3中n末端的kd，從而抑制rip3的活性。因此，作為能夠有效抑制rip3活性的一類物質(zhì)，核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑同樣可以發(fā)揮抗血小板血栓的功能。

本發(fā)明首次通過實驗探究了rip3與止血和血栓形成過程之間的關系，發(fā)現(xiàn)rip3不僅在體外實驗中參與血小板的調(diào)節(jié)，而且在體內(nèi)的止血和血栓形成過程中也發(fā)揮重要作用，可以作為抗血栓的新靶點，為抗血栓藥物研發(fā)提供了新方向。

附圖說明

圖1為wt與rip3^-/-小鼠的尾出血時間示意圖。

圖2為通過實時顯微術記錄的wt與rip3^-/-小鼠體內(nèi)fecl3誘導的腸系膜動脈血栓形成的典型性圖像，圖像右下角標注了fecl3致?lián)p后的時間。

圖3為通過fecl3損傷測定的wt與rip3^-/-小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

圖4為白細胞和血小板的免疫印跡法示意圖。

圖5為來源于分別采用wt和rip3^-/-小鼠供體骨髓衍生細胞重新填充的rip3^-/-（wt→rip3^-/-）和wt（rip3^-/-→wt）小鼠的血小板內(nèi)rip3表達的示意圖。

圖6為通過fecl3損傷測定的采用wt或rip3^-/-小鼠供體骨髓衍生細胞重新填充的wt和rip3^-/-小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

圖7為來源于wt（n=27）和rip3^-/-小鼠（n=26）的全血中檢測到的血小板計數(shù)示意圖。

圖8為wt和rip3^-/-小鼠血小板的電子顯微鏡分析圖。

圖9為不同基因型小鼠的ag和dg的定量示意圖。

圖10為采用特異性抗體通過流式細胞儀檢測的wt和rip3^-/-小鼠血小板膜表面主要糖蛋白表達的示意圖。

圖11為rip3在血小板聚集中的作用示意圖。

圖12為響應低劑量u46619或凝血酶的rip3^-/-血小板的atp分泌示意圖。

圖13為不足以誘導聚集的、低濃度的adp（0.25μm）翻轉(zhuǎn)rip3缺失對325nmu46619或0.008u/ml凝血酶誘導的血小板聚集的抑制作用的示意圖。

圖14為采用指定劑量的u46619或凝血酶刺激的小鼠血小板中p-選擇素暴露的流式細胞儀分析示意圖。

圖15為采用凝血酶（0.008u/ml）、adp（2.5mm）、膠原（0.5μg/ml）或載體（對照）刺激的wt和rip3^-/-血小板中txb2生產(chǎn)的示意圖。

圖16為rip3在akt、gsk3β、erk和p38mapk磷酸化中的作用的示意圖。

圖17為采用抑制劑（sb216763）或載體（dmso）預處理后觀察到的u46619或凝血酶刺激wt和rip3^-/-血小板聚集的示意圖。

圖18為與采用載體（對照）或者指定劑量的u46619或凝血酶刺激的wt和rip3^-/-血小板結(jié)合的pe-jon/a（ab）的流式細胞儀分析示意圖。

圖19為與采用凝血酶或載體刺激的wt和rip3^-/-血小板結(jié)合的fitc標記的纖維蛋白原的流式細胞儀分析示意圖。

圖20為rip3抑制劑抑制u46619和凝血酶誘導的血小板聚集的示意圖。

圖21為通過實時顯微術記錄的注射有gsk'872或載體（dmso）的c57d小鼠體內(nèi)fecl3誘導的腸系膜動脈血栓形成的典型性圖像，每一個圖像的右下角都標出fecl3致?lián)p后的時間。

圖22為通過fecl3損傷測定的注射有gsk'872或載體的c57d小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖和具體實施例來進一步解釋和說明本發(fā)明的技術方案。

實施例一：gsk’872的抗血栓形成實驗。

1、試劑與材料：

阿司匹林、a3p5p、牛血清白蛋白（bsa）、戊巴比妥鈉、rgds（arg-gly-asp-ser）、sb216763購自sigma-aldrich公司；calcein-am購自同仁化學研究所；u46619購自calbiochem公司；凝血酶、膠原、adp以及chrono-lume購自chronolog公司；fitc標記的小鼠p-selectin（wug.e9）、pe標記的小鼠integrinαiibβ3（jon/a）、抗小鼠gpib抗體購自emfretanalytics公司；pe標記抗小鼠cd41購自biolegend公司；fitc標記小鼠纖維蛋白原購自abcam公司；txb2酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自enzolifesciences公司；抗小鼠rip3抗體購自prosci公司；抗磷酸化akt（thr308）、抗磷酸化akt（ser473）、抗總akt、抗磷酸化erk1/2（thr202/tyr204）、抗磷酸化gsk3β（ser9）、抗人rip3以及抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自cellsignalingtechnology公司；mrs2395由復旦大學醫(yī)學院丁忠仁教授惠贈；rip3抑制劑gsk’872購自德國merckmillipore公司。

2、實驗用小鼠：

rip3基因敲除小鼠以c57b6為背景，由北京生命科學研究院王曉東教授提供。應用與rip3基因敲除小鼠具有相同遺傳背景的野生型（wt）小鼠作為對照。全部動物實驗均經(jīng)蘇州大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。

3、尾出血時間：

采用2%戊巴比妥鈉將6至8周齡的小鼠麻醉，快速自鼠尾末端切去3mm，立即浸入到37℃恒溫水浴的等滲pbs中，計數(shù)尾出血時間。出血終止以60s內(nèi)無再次出血為標準，tbt＞600s為觀察終點。

4、洗滌血小板：

健康成人志愿者自肘正中靜脈采血，并按照li,z.,zhang,g.,lebreton,g.c.,etal.,twowavesofplateletsecretioninducedbythromboxanea2receptorandacriticalroleforphosphoinositide3-kinase[j],j.biol.chem.,2003,278:30725-30731中報道的方法洗滌血小板，獻血者均知情同意并簽署協(xié)議書。實驗方案經(jīng)蘇州大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，符合赫爾辛基宣言。

按照同樣的方法洗滌小鼠血小板。小鼠全身麻醉后，自下腔靜脈采血，1/7體積的acd抗凝。全血離心200g×11min，以獲得富血小板血漿（prp）。prp中的血小板以cgs洗滌2次，每次離心600g×2min。末次離心后棄上清，以modifiedtyrode’sbuffer（mtb）重懸。室溫靜置2h后用于實驗。

5、電鏡：

洗滌血小板以2.5%戊二醛于4℃固定過夜。室溫離心600g×2min以收集細胞沉淀。細胞沉淀以pbs洗滌，以1.0%鋨酸室溫固定1h，梯度丙酮脫水，70%丙酮-飽和醋酸鈾于4℃過夜，包埋并制備超薄切片。hitachih600透射電鏡觀察血小板形態(tài)及顆粒內(nèi)容物。wt組及rip3基因敲除組各選擇20個血小板（來自5個不同視野）進行觀察并拍照。

6、體內(nèi)血栓成像：

按照ni,h.,papalia,j.m.,degen,j.l.,etal.,controlofthrombusembolizationandfibronectininternalizationbyintegrinalphaiibbeta3engagementofthefibrinogengammachain[j],blood,2003,102:3609-3614中報道的方法制備fecl3誘導的腸系膜微血管栓塞模型。自供體小鼠分離血小板，洗滌并以calcein-am（5μg/ml）標記。雄性受體小鼠戊巴比妥鈉麻醉，按照5×10⁶/g劑量球后注射相應基因型的calcein標記的血小板，放置于37℃預溫的平板上。腹前正中切口，顯露腸系膜血管床，在熒光顯微鏡（leica公司）下觀察并選擇合適的血管，在適當部位放置3mm²左右的5%fecl3浸潤的濾紙片，計時，觀察血流中斷及血栓形成的情況。在抑制劑實驗中，先將抑制劑通過眼球后靜脈注射吸收后，再進行血栓形成實驗。

7、全身照射及骨髓移植：

雄性wt及rip3基因敲除小鼠（10周齡）接受co⁶⁰來源的8gy劑量的全身照射。收集來自雄性wt及rip3基因敲除小鼠（8周齡）股骨及脛骨的骨髓細胞，并按照1×10⁷/只小鼠給予注射（接受照射后6h內(nèi)完成），放入ivc專用動物房，給予酸化水、co⁶⁰輻照飼料及墊料，每日觀察生存情況；3~4周后存活小鼠測定全血細胞計數(shù)，若恢復正常即可用于下一步實驗。移植是否成功通過westernblotting檢測受體小鼠血小板中rip3蛋白的表達來確定。

8、血小板聚集及釋放實驗：

血小板的聚集及釋放通過chrono-loglumi血小板聚集儀記錄。洗滌血小板（3×10⁸/ml）由不同激動劑刺激。10μl螢光素/螢光素酶在刺激前2min內(nèi)加入到240μl血小板懸液中。在某些實驗中，血小板懸液預先給予不同抑制劑于37℃預處理。聚集及釋放曲線持續(xù)記錄5至10min。

9、txa2合成的檢測：

txa2的合成用其穩(wěn)定的代謝物txb2來表示。血小板用如前所述的不同激動劑刺激，txb2的合成用txb2酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行檢測。

10、流式細胞術：

洗滌血小板（3×10⁸/ml）分別加入不同濃度激動劑進行刺激，并同時加入fitc標記的小鼠p-selectin（wug.e9）或pe標記的小鼠integrinαiibβ3（jon/a），室溫避光放置15min；加入pbs終止反應，通過cytomics^tmfc500mcl流式細胞儀（beckmancoulter公司）檢測熒光陽性細胞群體比例以及平均熒光強度。

11、纖維蛋白原結(jié)合實驗：

洗滌血小板分別加入不同濃度凝血酶或其溶劑以及fitc標記小鼠纖維蛋白原（135μg/ml），同時以rgds處理管（2mm，37℃，5min）作為陰性對照，以排除非特異結(jié)合。于37℃避光放置30min，每管內(nèi)加入350μlpbs終止反應，上機檢測結(jié)合熒光標記纖維蛋白原的細胞群體陽性率及平均熒光強度。

12、westernblotting：

洗滌血小板（轉(zhuǎn)速1000rpm），以凝血酶或u46619刺激，根據(jù)聚集曲線在不同時間點加入2x細胞裂解液（含2mmpmsf、2mmnaf、2mmna3vo4以及蛋白酶抑制劑）終止反應，冰上裂解，制樣。樣本以免疫印跡法檢測相應蛋白的表達。

13、統(tǒng)計學分析：

全部數(shù)據(jù)均來源于至少3次相互獨立的實驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，應用prismversion5.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，對數(shù)據(jù)進行非配對studentt檢驗，p<0.05作為差異性顯著界值。

14、實驗結(jié)果：

（1）rip3基因敲除小鼠表現(xiàn)出止血功能受損以及血栓形成受抑的傾向：

為了研究rip3在體內(nèi)止血過程中的作用，按照estevez,b.,etal.,limkinase-1selectivelypromotesglycoproteinib-ix-mediatedtxa2synthesis,plateletactivation,andthrombosis[j],blood,2013,121:4586-4594中報道的方法，對rip3基因敲除小鼠進行尾出血時間的檢測。rip3基因敲除小鼠在其生命周期中并未表現(xiàn)出顯著的出血傾向或發(fā)生血栓栓塞事件，但是其尾出血時間的中位值（410s）較wt小鼠（223s）顯著延長。使用雙尾mann-whitney檢驗進行統(tǒng)計分析，表明2組動物之間具有顯著性差異（^***p<0.0001），結(jié)果如圖1所示。此外，有44.4%的rip3基因敲除小鼠在為期10分鐘的觀察時間內(nèi)不能停止出血。以上數(shù)據(jù)表明rip3在初期止血過程中具有重要作用。

應用fecl3損傷導致的腸系膜微動脈血栓模型來探索rip3在體內(nèi)血栓形成過程中的作用。血栓形成過程在熒光顯微鏡下實時監(jiān)測，結(jié)果如圖2所示。rip3基因敲除小鼠微動脈的阻塞時間（19.9±1.1min）較wt小鼠（13.5±1.2min）延遲（^**p=0.0012），結(jié)果如圖3所示。以上數(shù)據(jù)說明rip3在體內(nèi)參與血栓形成過程。

（2）rip3表達于血小板并參與調(diào)節(jié)小鼠血栓形成：

由于血小板在止血和血栓形成過程中起重要作用，因此首先需要檢測血小板內(nèi)是否有rip3的表達。采用免疫印跡法進行檢測，其具體方法如下：在室溫下，將洗滌后的血小板再懸浮于裂解緩沖液（包含0.15mnh4cl、10mmnahco3和1mmedta）中10min，通過600g×5min離心采用0.9%生理鹽水洗滌白細胞，采用sds-page上樣緩沖液裂解洗滌后的血小板和白細胞，并采用針對rip3和cd45（白細胞標記物）的抗體通過免疫印跡法探測血小板和白細胞，針對β-actin的印跡被用作泳道內(nèi)參照，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，人與小鼠的血小板內(nèi)有rip3的表達，同時證實了在rip3基因敲除小鼠的血小板中無rip3的表達。

除了血小板以外，尚有其他因素參與體內(nèi)止血和血栓形成過程，尤其是內(nèi)皮細胞。為了確定究竟是內(nèi)皮細胞還是血小板在rip3基因敲除小鼠的止血和血栓形成缺陷中起主要作用，對wt及rip3基因敲除小鼠分別進行骨髓移植，來源于wt和rip3^-/-小鼠的血小板被用作對照物，而β-actin被用作泳道內(nèi)參照。接受wt小鼠骨髓細胞移植的rip3基因敲除小鼠（wt→rip3^-/-）的血小板內(nèi)rip3表達水平與wt小鼠相仿，而接受rip3基因敲除小鼠骨髓細胞移植的wt小鼠（rip3^-/-→wt）的血小板無rip3表達，結(jié)果如圖5所示。

關于血管阻塞時間，rip3^-/-→wt小鼠（18.4±1.2min）比wt→rip3^-/-小鼠（12.5±0.9min）顯著延長（^**p=0.0047），而接受rip3基因敲除小鼠骨髓細胞移植的rip3基因敲除小鼠（rip3^-/-→rip3^-/-）（17.8±1.8min）也比接受wt小鼠骨髓細胞移植的wt小鼠（wt→wt）（12.6±1.2min）長（^*p=0.035），結(jié)果如圖6所示。此外，wt→wt及wt→rip3^-/-小鼠的血管阻塞時間與wt相仿，而rip3^-/-→rip3^-/-及rip3^-/-→wt小鼠的血管阻塞時間與rip3^-/-小鼠相近。以上數(shù)據(jù)表明，血小板而非內(nèi)皮細胞的rip3缺陷是rip3基因敲除小鼠血栓形成受抑的主要原因。

此外，與wt小鼠相比，rip3基因敲除小鼠在紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及血紅蛋白濃度等方面均無顯著差異，而血小板計數(shù)甚至略有升高（^*p<0.05，如圖7所示）。無論細胞計數(shù)分析抑或電鏡觀察結(jié)果（如圖8所示）均顯示rip3基因敲除小鼠的血小板大小及形態(tài)與正常情況無差異。兩種基因型小鼠的α-顆粒（ag）和致密顆粒（dg）的數(shù)量（如圖9所示）以及血小板膜表面主要糖蛋白（gp）cd42b（gpibα）和cd41（αiib亞基）的表達（如圖10所示）亦無差異。

（3）rip3缺失導致凝血酶及u46619誘導的血小板聚集反應受抑：

檢測激動劑誘導的血小板聚集反應，以確定rip3在其中所發(fā)揮的作用。在持續(xù)攪拌的條件下，于37℃采用不同濃度的u46619、凝血酶（thrombin）、膠原（collagen）和adp刺激來源于wt和rip3^-/-小鼠的洗滌后的血小板，使用比濁集合度計監(jiān)測血小板聚集，結(jié)果如圖11所示。rip3基因敲除小鼠的血小板對于低濃度的u46619（^****p<0.0001）及凝血酶（^*p=0.016，^**p=0.0071）誘導的聚集呈現(xiàn)出顯著的反應降低，增加激動劑的劑量則可以糾正這一缺陷，但在膠原及adp誘導的聚集反應中則未見顯著差異。上述數(shù)據(jù)表明，rip3選擇性地參與由低濃度u46619或凝血酶誘導的血小板聚集的信號放大過程。

（4）rip3缺失導致凝血酶及u46619誘導的血小板adp釋放受抑：

如前所述，自血小板致密顆粒中釋放的adp在提高血小板對低濃度激動劑的敏感性及放大血小板聚集反應中發(fā)揮非常重要的作用。rip3缺失僅在應用低濃度刺激劑時導致血小板聚集受抑，由此可以假設rip3影響了刺激劑誘導的adp釋放環(huán)節(jié)。為了驗證這一假設，檢測刺激劑誘導的atp釋放作為致密顆粒釋放的指標。采用不同濃度的u46619或凝血酶刺激來源于wt和rip3^-/-小鼠的洗滌后的血小板，在螢光素/螢光素酶試劑（80nm）的存在下與血小板聚集同時記錄atp分泌。如圖12所示，rip3基因敲除血小板中低濃度u46619誘導的二相釋放反應缺失，在低濃度凝血酶誘導的atp釋放中亦可觀察到同樣的現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，rip3缺失可導致凝血酶及u46619誘導的血小板致密顆粒釋放受抑。

為了進一步確定致密顆粒釋放的adp在刺激劑誘導的血小板活化過程中的作用，采用特異性拮抗劑a3p5p和mrs2395分別阻斷相應的adp受體p2y1和p2y12，結(jié)果如圖13所示。a3p5p和mrs2395在wt及rip3^-/-血小板中均可抑制u46619誘導的二相聚集與釋放，亦可抑制低濃度凝血酶誘導的血小板聚集與釋放。上述結(jié)果表明，在低濃度u46619和凝血酶誘導的血小板聚集中，致密顆粒釋放的adp發(fā)揮非常重要的作用。

（5）adp釋放受抑與rip3基因敲除血小板聚集功能降低有關：

adp誘導的rip3基因敲除血小板聚集反應并未受到抑制，表明rip3信號通路在adp誘導的整合素活化及血小板聚集中并非必需，由此假設rip3缺失對于u46619或凝血酶誘導的血小板聚集的抑制作用是其抑制adp釋放的結(jié)果。為了驗證這一假設，檢測補充外源性adp是否可以糾正u46619及凝血酶在rip3基因敲除血小板中引起的聚集受抑。補充單獨應用不足以誘導血小板發(fā)生聚集的低濃度adp后即可糾正低濃度u46619及凝血酶在rip3基因敲除血小板中引起的聚集受抑。上述結(jié)果表明，adp釋放受抑與rip3基因敲除血小板聚集功能降低有關，而rip3在血小板活化中的初步功能是介導u46619或凝血酶刺激導致的adp釋放。

（6）rip3基因敲除血小板α-顆粒的釋放及txa2的產(chǎn)生：

各種刺激劑誘導的顆粒釋放及txa2的產(chǎn)生在刺激信號的放大中起到重要作用，并可進一步使血管損傷部位血小板的活化趨于穩(wěn)定。因此，進一步檢測rip3基因敲除血小板α-顆粒的釋放，結(jié)果如圖14所示。從中可以發(fā)現(xiàn)，在u46619刺激的血小板中僅能檢測到極為微量的α-顆粒釋放，而在凝血酶刺激的wt及rip3^-/-血小板中也沒有觀察到α-顆粒釋放的顯著性差異。

通過檢測txa2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物txb2，進一步探討rip3是否參與介導txa2的合成，結(jié)果如圖15所示。在凝血酶及膠原刺激的wt及rip3^-/-血小板中，沒有觀察到txa2合成的顯著性差異，但在adp誘導的rip3^-/-血小板中，txb2的合成卻顯著高于wt血小板（^*p<0.05）。

（7）rip3參與調(diào)節(jié)血小板akt磷酸化：

由于pi3k/akt信號通路被證實參與u46619誘導的血小板的二相釋放，因此推測rip3可能通過pi3k/akt通路來調(diào)節(jié)致密顆粒的釋放。在37℃和1000rpm攪拌速度下，采用100nmu46619或0.006u/ml凝血酶在指定的時間內(nèi)刺激洗滌后的血小板。將血小板溶解，并通過westernblotting采用anti-phospho-akt（thr³⁰⁸/ser⁴⁷³）、anti-phospho-gsk3β（ser⁹）、anti-phospho-erk、anti-phospho-p38或anti-β-actin（作為泳道內(nèi)參照）抗體進行探測，結(jié)果如圖16所示。從中可以發(fā)現(xiàn)，akt作為pi3k下游分子，其活化的指標（308位蘇氨酸與473位絲氨酸的磷酸化）在凝血酶及u46619刺激的rip3基因敲除血小板中顯著降低。此外，pi3k抑制劑在wt及rip3基因敲除血小板中均可降低凝血酶及u46619誘導的聚集反應。gsk3β（一種絲/蘇氨酸激酶）也可為akt的激酶活性所磷酸化。gsk3的磷酸化可負反饋調(diào)控依賴于pi3k/akt信號通路的致密顆粒釋放。與akt的活化相一致，gsk3β的磷酸化程度在rip3基因敲除血小板中也有所降低。

為了進一步證實akt在rip3信號通路中的作用，在加入凝血酶或u46619刺激之前，向rip3基因敲除血小板中給予gsk3β拮抗劑sb216763預處理，該試劑可解救akt的功能受抑。sb216763可使u46619或凝血酶誘導的rip3基因敲除血小板聚集程度提高至與單獨應用u46619或凝血酶刺激的wt血小板相若，結(jié)果如圖17所示。上述結(jié)果表明，rip3在血小板中是參與介導akt活化的上游分子。

除了pi3k/akt信號通路外，erk的活化也參與調(diào)節(jié)刺激劑誘導的血小板釋放。u46619或凝血酶誘導的erk磷酸化在rip3基因敲除血小板中減低，表明erk的活化亦受到rip3的調(diào)控。

（8）rip3缺失導致u46619及凝血酶誘導的整合素αiibβ3活化受抑：

由于整合素αiibβ3的活化為體外血小板聚集反應所必需，因此探討rip3在整合素αiibβ3活化過程中的作用。u46619及凝血酶誘導的整合素αiibβ3活化的程度在rip3基因敲除血小板中減弱（如圖18所示）。低濃度凝血酶誘導的纖維蛋白原結(jié)合在rip3基因敲除血小板也顯著降低（如圖19所示）。以上結(jié)果表明，rip3參與刺激劑誘導的整合素αiibβ3的活化。

（9）rip3抑制劑抑制血小板聚集和小鼠體內(nèi)動脈血栓形成：

在37℃下，采用不同濃度的rip3抑制劑gsk'872或載體（dmso）孵育洗滌后的人血小板30min，然后采用u46619和凝血酶刺激，并用比濁集合度計監(jiān)測血小板聚集。rip3抑制劑與血小板作用后，可劑量依賴地抑制u46619和凝血酶誘導的血小板聚集，結(jié)果如圖20所示。

應用fecl3損傷導致的腸系膜微動脈血栓模型來探索rip3抑制劑在體內(nèi)血栓形成過程中的作用，并在熒光顯微鏡下實時監(jiān)測血栓形成過程，結(jié)果如圖21所示。另外，rip3抑制劑作用的小鼠微動脈的阻塞時間較對照小鼠明顯延遲（如圖22所示，^**p<0.01）。以上結(jié)果表明，rip3可以作為抗血栓的新靶點，并為研究抗栓治療策略提供新思路。rip3抑制劑能夠抑制血栓形成，有望成為高效、特異、副作用小的新一代抗血栓藥物。