本發(fā)明屬于可用于神經(jīng)退行性疾病治療的支架材料的制備領(lǐng)域，尤其涉及一種具有優(yōu)越的神經(jīng)退行性疾病治療性能的纖維支架材料、其制備方法、及亞甲藍(lán)負(fù)載量的調(diào)節(jié)方法，主要應(yīng)用于神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(ad)是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，一般表現(xiàn)為神經(jīng)元的壞死，β淀粉樣蛋白(aβ)沉積和tau蛋白過度磷酸化。目前治療方法主要有干細(xì)胞移植，利用干細(xì)胞的增殖和分化潛能補(bǔ)充缺失的神經(jīng)元，但是移植的干細(xì)胞增殖率和分化率都很低，一方面患者腦內(nèi)存在毒性物質(zhì)，例如aβ和病變的tau蛋白，另一方面移植的干細(xì)胞缺乏可以支持其增殖或分化用的基底。

目前主要采用各種形式的支架材料，例如靜電紡絲納米纖維支架。為提高細(xì)胞存活率或分化率，一般采用在支架上負(fù)載生長因子或分化因子，或者移植轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞，但是支架上負(fù)載因子后不利于保存和運(yùn)輸，而轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞會增加細(xì)胞癌變概率。亞甲藍(lán)是一種正在研發(fā)的治療ad的藥物，目前的研究表明亞甲藍(lán)患者腦內(nèi)的毒性物質(zhì)，例如能夠促進(jìn)aβ清除，并減弱tau蛋白病變。但是單獨(dú)使用亞甲藍(lán)不能補(bǔ)充受損的神經(jīng)元。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種纖維支架材料、其制備方法、及亞甲藍(lán)負(fù)載量的調(diào)節(jié)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種纖維支架材料，包括基體以及負(fù)載于基體表面的亞甲藍(lán)，所述基體包括纖維支架、以及包被于所述纖維支架表面的氧化石墨烯。

優(yōu)選的，在上述的纖維支架材料中，所述纖維支架為plga納米纖維支架。

相應(yīng)的，本發(fā)明還公開了一種纖維支架材料的制備方法，包括步驟：

(1)通過靜電紡絲方法制備纖維支架；

(2)將氧化石墨烯通過物理吸附方法包被到纖維支架表面；

(3)通過物理吸附將亞甲藍(lán)負(fù)載到氧化石墨烯包被的纖維支架上。

優(yōu)選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述物理吸附包括π-π共軛作用和/或靜電作用。

優(yōu)選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述步驟(1)中，將plga溶解于四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制備靜電紡絲前驅(qū)體溶液；采用靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架，然后采用等離子體進(jìn)行處理。

優(yōu)選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述步驟(2)中，將氧化石墨烯分散到去離子水中，獲得氧化石墨烯溶液，然后將纖維支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后獲得氧化石墨烯包被的纖維支架。

優(yōu)選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述氧化石墨烯溶液的濃度為0.1g/l～1.0g/l，尤其優(yōu)選為0.5g/l。

本發(fā)明實(shí)施例還公開了一種纖維支架材料表面亞甲藍(lán)負(fù)載量的調(diào)節(jié)方法，在纖維支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通過物理吸附方法負(fù)載亞甲藍(lán)，通過提高氧化石墨烯的用量來增加亞甲藍(lán)的負(fù)載量。

優(yōu)選的，當(dāng)所述氧化石墨烯溶液的濃度為0.5g/l或1.0g/l時，亞甲藍(lán)負(fù)載量接近最大，約為1.56±0.12ng/cm²。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：通過改變氧化石墨烯的濃度，使納米纖維上包被的氧化石墨烯的量不同，而通過π-π堆垛、靜電作用等物理作用吸附在支架材料上的亞甲藍(lán)的量也不同。從而治療處于不同階段的ad病變，使其既能夠清除患者腦內(nèi)毒性物質(zhì)，又能補(bǔ)充受損的神經(jīng)元。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明中記載的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中纖維支架材料的制備流程圖；

圖2a所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中不同濃度氧化石墨烯包被的納米纖維膜的掃描電鏡圖；

圖2b所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中包被于纖維支架上氧化石墨烯的拉曼特征峰；

圖2c所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中纖維支架材料總亞甲藍(lán)釋放量；

圖2d所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中纖維支架材料中氧化石墨烯的拉曼特征峰；

圖3a所示為本發(fā)明具體實(shí)施例步驟三中細(xì)胞活性的示意圖；

圖3b所示為本發(fā)明具體實(shí)施例步驟三中共聚焦顯微鏡采集圖片；

圖4所示為本發(fā)明具體實(shí)施例步驟四中纖維支架材料對tau蛋白磷酸化的抑制作用示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例提供一種更好的能夠負(fù)載干細(xì)胞，并能清除患者腦內(nèi)毒性物質(zhì)的支架材料及其制備方法。利用氧化石墨烯特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及對亞甲藍(lán)超強(qiáng)的吸附性能，通過改變石墨烯的濃度而調(diào)控支架上亞甲藍(lán)的負(fù)載量，制備出可控緩釋亞甲藍(lán)的氧化石墨烯-靜電紡絲納米纖維復(fù)合支架材料，該材料既可以清除患者腦內(nèi)毒性物質(zhì)，又能有效補(bǔ)充受損的神經(jīng)元。

具體地，本發(fā)明實(shí)施例提供一種纖維支架材料，包括基體以及負(fù)載于基體表面的亞甲藍(lán)，所述基體包括plga(聚乳酸羥基乙酸)納米纖維支架、以及包被于所述plga納米纖維支架表面的氧化石墨烯。

plga納米纖維支架還可以為其他任意一種纖維支架。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種纖維支架材料的制備方法，包括步驟：

(1)通過靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架；

(2)將氧化石墨烯通過物理吸附方法包被到plga納米纖維支架表面；

(3)通過物理吸附將亞甲藍(lán)負(fù)載到氧化石墨烯包被的plga納米纖維支架上。

優(yōu)選的，所述物理吸附包括π-π共軛作用、靜電作用。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中，將plga溶解于四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制備靜電紡絲前驅(qū)體溶液；采用靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架，然后采用等離子體進(jìn)行處理。所述步驟(2)中，將氧化石墨烯分散到去離子水中，獲得氧化石墨烯溶液，然后將plga納米纖維支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后獲得氧化石墨烯包被的plga納米纖維支架。其中氧化石墨烯溶液的濃度為1.0g/l與0.5g/l時對纖維膜的覆蓋面積相當(dāng)，幾乎達(dá)到完全覆蓋

本發(fā)明實(shí)施例還公開一種纖維支架材料表面亞甲藍(lán)負(fù)載量的調(diào)節(jié)方法，在纖維支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通過物理吸附方法負(fù)載亞甲藍(lán)，通過改變氧化石墨烯的用量以調(diào)節(jié)亞甲藍(lán)的負(fù)載量。

當(dāng)所述氧化石墨烯溶液的濃度為1.0g/l或0.5g/l時，亞甲藍(lán)的負(fù)載量相當(dāng)，約為1.56±0.12ng/cm²。

本發(fā)明通過下列實(shí)施例作進(jìn)一步說明：根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

纖維支架復(fù)合材料的制備如圖1的合成示意圖所示，是通過物理吸附的方法將氧化石墨烯包被在納米纖維表面，并通過物理作用將亞甲藍(lán)負(fù)載在納米復(fù)合材料上。

材料的詳細(xì)制法分為三個部分：靜電紡絲納米纖維制備、表面包被不同濃度的氧化石墨烯、負(fù)載不同量的亞甲藍(lán)。具體步驟如下：

步驟一，不同濃度氧化石墨烯包被的靜電紡絲納米纖維的制備：

3gplga溶解于20ml四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液(3/1,v/v)，用 超聲清洗儀超聲溶解10min(53w，sk、1200h，上海kudosinc.)。

plga溶液通過bgg40/2(北京高科生物技術(shù)有限公司)在10kv高壓下以0.25ml/h的速率紡織到覆蓋有玻璃基底的金屬接收器上。噴射器和接收器之間的距離為20cm。真空干燥兩天后，plga納米纖維用等離子體處理30s。

單層的氧化石墨烯是通過hummer’s法制備的。然后將氧化石墨烯分散到去離子水中(濃度1.0g/l、0.5g/l、0.25g/l、0.1g/l)，再將材料浸泡在氧化石墨烯溶液中15min，然后將基底材料放在真空干燥箱里干燥6h。掃描電鏡照片顯示氧化石墨烯包被在靜電紡絲納米纖維膜表面(圖2a)，拉曼光譜也檢測到氧化石墨烯的拉曼特征峰(圖2b)。

步驟二，可控緩釋亞甲藍(lán)的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復(fù)合支架材料的制備和表征：

將氧化石墨烯包被的納米纖維支架材料浸泡在0.5g/lmb溶液中2h。將材料用pbs溶液清洗3次后，真空干燥過夜后用掃描電鏡觀察表面形態(tài)。mb的緩釋是檢測面積約為635mm²納米纖維上mb在不同的時間點(diǎn)(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天)在腦脊液模擬液中的釋放?？俶b釋放量如圖2c，mb在材料上的緩釋結(jié)果如圖2d。

步驟三，可控緩釋亞甲藍(lán)的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復(fù)合支架材料用于神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)：

神經(jīng)前體細(xì)胞接種到聚賴氨酸(pdl)和層粘連蛋白(laminin)包被的plga，plga-go，plga-go-mb納米纖維支架上以密度為5×10⁴每孔接種到48孔板里。用wst-1測定在不同的時間點(diǎn)里(1、3、5、7天)的細(xì)胞活性，結(jié)果如圖3a所示。為了考察npc在材料上的分化行為，單個神經(jīng)前體細(xì)胞被接種到pdl和laminin包被的基底上培養(yǎng)24h后，添加神經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，每3天換一次液。其中分化培養(yǎng)基的組成是在不含有egf和bfgf的neurobasalmedium中添加b27(1:100)和2nml-谷氨酸。之后細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，用anti-betaiiitubulinantibody和cy3-標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫染色，然后用共聚焦顯微鏡采集圖片(圖3b)。

步驟四，可控緩釋亞甲藍(lán)的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復(fù)合支架材料減弱tau蛋白磷酸化：

將用慢病毒構(gòu)建的過表達(dá)tau蛋白的神經(jīng)前體細(xì)胞接種到復(fù)合材料上，用3nm岡田酸誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mb能顯著抑制tau蛋白磷酸化(圖4)。

綜上所述，本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn)在于：可以通過改變氧化石墨烯的濃度來調(diào)節(jié)亞甲藍(lán)的負(fù)載量，并且可以同時實(shí)現(xiàn)ad患者腦部有害物質(zhì)的清除和受損神經(jīng)元的補(bǔ)充。該方法制備的材料已顯現(xiàn)出抑制tau蛋白病變的效果。并且該材料易于保存和運(yùn)輸，并且制備方法簡單成本低，排除了負(fù)載生長因子的缺陷。

還需要說明的是，為了避免因不必要的細(xì)節(jié)而模糊了本發(fā)明，在附圖中僅僅示出了與根據(jù)本發(fā)明的方案密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)和/或處理步驟，而省略了與本發(fā)明關(guān)系不大的其他細(xì)節(jié)。

最后，還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。