本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及了一種基于叔丁醇/水混合溶劑的制備用于超聲成像的微泡超聲造影劑的方法。

背景技術(shù)：

超聲造影劑通過改變組織的超聲特性來增強增強檢測部位的回聲信號從而幫助操作人員獲取更多更精確的信息，通常是脂質(zhì)、聚合物或蛋白質(zhì)包裹的氣體微泡。超聲造影劑在人體微小血管和組織血流灌注檢測與成像方面具有很大優(yōu)勢。從理論上講，超聲造影劑可以用于體內(nèi)除骨胳和肺以外任何器官血流灌注的評價。另外，近些年的研究表明超聲造影劑在腫瘤或炎癥部位的靶向成像和藥物遞送等方面表現(xiàn)出了廣闊的應用前景，因此可以預見超聲造影劑在不久的將來將會成為臨床上超聲診斷或治療中的不可或缺的試劑。

目前，國際市場上已經(jīng)被批準上市的超聲造影劑有optison、sonazoid、sonovue、definity、imagent等，國內(nèi)已經(jīng)批準使用的超聲造影劑主要是sonovue，但是價格都非常高，成像時間短，普通老百姓用不起。因此價格低廉、成像效果好的超聲造影劑將有助于解決目前國內(nèi)“看病難”、“看病貴”的大難題。

目前臨床上用的超聲造影劑的包膜材料可以分為兩類，以optison為代表的白蛋白類的超聲造影劑和以磷脂為主要包膜材料的超聲造影劑。其中白蛋白類的超聲造影劑因為成像時間較短，應用受局限，目前已經(jīng)逐漸失去市場，預計未來超聲造影劑市場將主要被以磷脂為主要包膜材料的造影劑所占據(jù)。

由于單獨的一種磷脂很難形成穩(wěn)定的微泡，通常磷脂類的超聲造影劑制備時都需要兩種以上的磷脂組合，有時還需要加入一些聚合物材料、表面活性劑、脂肪酸等其他材料以獲得穩(wěn)定的微泡。由于磷脂在高溫條件下或水溶液中長期存在時容易發(fā)生降解產(chǎn)生溶血性磷脂，影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性。另外超聲造影劑在制備時通常會加入一些帶有負電荷的磷脂，這類磷脂在一般的溶劑中都很難分散開，最終會嚴重影響產(chǎn)品的均一性和可重復性。因此開發(fā)高效安全 可重復性高的包膜材料混合方法顯得尤為重要。

專利文獻wo99036104公開了一種制備均一穩(wěn)定可過濾除菌的脂質(zhì)混懸液的方法，但是這種方法程序非常復雜，無疑提高了生產(chǎn)成本。該方法最后得到的產(chǎn)品中磷脂是以溶液狀態(tài)存在的，磷脂在處理過程中以及儲存中易降解。

專利文獻cn100496615c公開了一種制備微泡凍干粉的方法，使用前需向凍干粉中加入水化液并充氣然后機械震蕩就可以得到微泡懸浮液。但是這種方法中凍干前磷脂是在水溶液中通過加熱震蕩分散的，這就導致磷脂很容易在高溫水溶液中降解，而且磷脂在水中分散無法得到完全均一穩(wěn)定的溶液。當成膜脂質(zhì)有兩種以上時，無法實現(xiàn)分子水平上均勻混合，得到的微泡懸浮液中各個微泡的組分會有較大差別。另外，這種方法得到的磷脂混懸液中磷脂是以粒徑較大的脂質(zhì)體形式存在，難以直接進行過濾除菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上需求和問題，本發(fā)明提供一種基于叔丁醇/水混合溶劑制備超聲造影劑的方法，該方法操作簡單，微泡包膜材料可以在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，可以進行過濾除菌，容易進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種基于叔丁醇/水混合溶劑制備超聲造影劑的方法，包括制備微泡包膜材料混懸液，其中所述混懸液的溶劑為叔丁醇和水混合液。

為了獲得均一穩(wěn)定的微泡包膜材料混懸液，需要一種溶劑能夠?qū)⑽⑴莅げ牧?和凍干保護劑)均勻混合分散。另外，為了獲得微泡凍干粉，這種溶劑還需要具有合適的熔點和飽和蒸汽壓。

水是冷凍干燥工藝中最常用的溶劑，但是雙親性材料在水中很容易自組裝成膠束或脂質(zhì)體等結(jié)構(gòu)，直接將多種雙親性材料分散在水中很難實現(xiàn)分子水平上的均勻混合。

目前能夠用于冷凍干燥的最優(yōu)選的非水溶劑是叔丁醇，由于其具有較高的熔點(25.7℃)和飽和蒸汽壓(26.8mmhg，20℃)，用普通的冷凍干燥設備實現(xiàn)冷凍干燥，極大的節(jié)約成本。另外，較低的毒性也使得叔丁醇較適合用于藥物制劑的冷凍干燥。盡管純的叔丁醇可以溶解大多數(shù)雙親性材料和不同分子 量的聚乙二醇，但是卻無法溶解大多數(shù)的凍干保護劑。另外，微泡制備時通常需要加入一定比例的帶有負電荷的磷脂如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酸等，而這類磷脂在叔丁醇中的溶解度較差。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，以叔丁醇和水混合液為溶劑能夠同時溶解絕大多數(shù)雙親性包膜材料和凍干保護劑，而且溶解過程不需要太高的溫度，40℃左右甚至更低的溫度就可以溶解，且溶解后冷卻到室溫后不會析出。最后獲得的所述混懸液澄清、均一、穩(wěn)定，并且很容易利用過濾進行除菌。另外，使用叔丁醇和水混合液為溶劑進行冷凍干燥時，叔丁醇能夠在水中形成針狀結(jié)晶，大大縮短冷凍干燥的周期。

優(yōu)選地，所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的質(zhì)量含量為1％～99％，進一步優(yōu)選為30％～70％。

本發(fā)明所述微泡包膜材料混懸液，其中所述包膜材料主要包括雙親性的材料。這里所用的雙親性材料是構(gòu)成微泡殼層的主要成分，形成致密的膜來阻止微泡內(nèi)部氣體向外擴散，維持微泡的穩(wěn)定性，同時保證微泡具有一定的彈性。

雙親性材料包括氫化卵磷脂、氫化大豆磷脂、氫化卵磷脂酰絲氨酸、氫化卵磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇化的脂肪酸、單硬脂酸甘油酯、蔗糖單硬脂酸酯、氫化蓖麻油、棕櫚酸抗壞血酸脂、司盤類表面活性劑、吐溫類表面活性劑、脂肪酸、膽固醇、維生素e中的一種或幾種的混合物。

所述制備微泡包膜材料混懸液的時候還需要加入一些凍干保護劑，這些材料的主要作用是在混懸液冷凍干燥時能夠?qū)χ纹鸢げ牧希蛊浔３衷谌芤褐械姆€(wěn)定分散狀態(tài)而不至于塌陷聚集，使得凍干粉在水化時能夠很容易分散得到均一穩(wěn)定的溶液。另外凍干保護劑在凍干保護劑在水中能夠與微泡膜表面通過氫鍵作用大量附著，氫鍵的存在可以極大地提高微泡的穩(wěn)定性，而且凍干保護劑在微泡表面的附著也能夠降低微泡在體內(nèi)被識別的幾率從而延長微泡的循環(huán)時間。

這里所說的凍干保護劑可以分為兩類，聚合物類和小分子類。聚合物類的 凍干保護劑包括不同分子量的聚乙二醇、泊洛沙姆、多糖、聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或幾種的混合物。進一步地，所述的凍干保護劑為分子量為4000的聚乙二醇。小分子類的凍干保護劑包括葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、肌醇、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸中的一種或幾種的混合物。

本發(fā)明所述方法還包括將制備好的微泡包膜材料混懸液進行冷凍干燥的步驟，冷凍干燥后得到微泡凍干粉。該微泡凍干粉能夠穩(wěn)定存在，常溫條件下即可以保存很長時間。具體地，將微泡包膜材料混懸液制備好后分裝入藥物制劑用的西林瓶，然后通過冷凍干燥的方法除去所述溶劑(即叔丁醇和水混合液)得到微泡凍干粉。所述冷凍干燥可采用本領(lǐng)域常用方法。

本發(fā)明所述方法還包括將制備好的微泡凍干粉進行充入填充氣體的步驟。填充氣體是超聲造影劑(超聲微泡內(nèi)核)的成分，為了提高超聲微泡的穩(wěn)定性，填充氣體應該在水中具有較低的溶解度，還要對生物體安全無毒。這類填充氣體優(yōu)選的是八氟丙烷、八氟環(huán)丁烷、十氟丁烷等氟化碳類氣體或六氟化硫等氟化硫類氣體，因為這些氣體是生物惰性的，安全無毒，而且在水中的溶解度較低。

具體地，可在冷凍干燥結(jié)束后(制得微泡凍干粉)向西林瓶中充入填充氣體。本發(fā)明中氣體填充過程可以是在凍干機外用特定的充氣裝置進行，工業(yè)化生產(chǎn)時更優(yōu)選的方法是氣體填充、密封的過程都是在凍干設備中進行。

具體地，所述基于叔丁醇/水混合溶劑制備超聲造影劑的方法，包括以下步驟：

1)將所述包膜材料和凍干保護劑加入叔丁醇和水混合液中，加熱溶解，制得微泡包膜材料混懸液；然后過濾除菌；

2)將步驟1)過濾除菌的微泡包膜材料混懸液冷凍干燥，得到微泡凍干粉；

3)將步驟2)制備好的微泡凍干粉充入填充氣體。

上述制備方法中，

所述包膜材料和凍干保護劑的重量比例為1:200～1:5；優(yōu)選為1:50～1:10。

所述包膜材料和凍干保護劑的總重量占所述溶劑(即叔丁醇和水混合液)重量的1％～50％；優(yōu)選為5％～15％。

所述加熱溶解溫度為25℃～70℃；優(yōu)選為35℃～50℃。

所述過濾除菌優(yōu)選采用220nm的濾膜。

本發(fā)明所述基于叔丁醇/水混合溶劑制備超聲造影劑的方法在氣體填充后還包括密封、無菌處理等本領(lǐng)域常規(guī)步驟，最后可制得成品。

本發(fā)明還包括上述方法制得的超聲造影劑。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)在使用時需要向包裝容器(如西林瓶)中注入水化液，水化液的量優(yōu)選占包裝容器(如西林瓶)容積的10％～80％。水化液的選擇應該是完全無毒、可以進行靜脈注射的。大多數(shù)臨床使用的注射液都可以被用做水化液，如生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，甘油注射液，葡葡萄糖注射液，氨基酸注射液等。也可以是加入了一定量的甘油和/或丙二醇的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，甘油的加入能夠提高微泡的粘彈性和穩(wěn)定性，丙二醇可以促進雙親性包膜材料的分散。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)水化后優(yōu)選通過機械振蕩器來激活微泡以獲取可以用于超聲成像造影的微泡混懸液。這里所采用機械振蕩器與目前臨床上牙科所用的銀汞調(diào)和器的結(jié)構(gòu)原理基本一致。優(yōu)選地，震蕩方式是往復式，振蕩頻率為2000～7000rpm，震蕩幅度為0.5～3cm，震蕩時間為30～180s。

本發(fā)明制備方法簡單，微泡各組分之間能夠在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，達到分子水平的均勻混合，各組分在制備過程中不易發(fā)生降解，樣品凍干效率高，樣品均一穩(wěn)定，可以進行過濾除菌，可重復性高、容易規(guī)?；a(chǎn)，表現(xiàn)出廣闊的臨床應用前景。

特別地，本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法中因磷脂在高溫條件下或水溶液中長期存在時容易發(fā)生降解產(chǎn)生溶血性磷脂，影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性的技術(shù)問題。產(chǎn)品高效安全、方法可重復性高。

附圖說明

圖1為實施例1和對比例1制得微泡包膜材料混懸液照片。

圖2為實施例1制得的微泡懸液的微泡顯微鏡照片。

圖3為實施例1制得的微泡懸液的微泡的粒徑分布圖。

圖4為實施例1制得的超聲造影劑(微泡混懸液)對新西蘭大白兔的腎臟造影結(jié)果圖。圖4中，a，微泡注射前；b，微泡注射后2分鐘；c微泡注射后30分鐘；d，微泡注射后50分鐘。

圖5為對比例1制得的超聲造影劑(微泡混懸液)對新西蘭大白兔的腎臟造影結(jié)果圖。圖5中，a，微泡注射前；b，微泡注射后1分鐘；c微泡注射后8分鐘；d，微泡注射后16分鐘。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

準確稱取16mg二硬脂?；?磷脂酰甘油，16mg二硬脂?；?磷脂酰膽堿，1gpeg4000，加入溶劑(即9.5g去離子水和9.5g叔丁醇的混合液)，加熱到45℃溶解得到微泡包膜材料混懸液，為澄清的溶液(見圖1)，然后冷卻到室溫。將溶解后的溶液用220nm的濾膜過濾后分裝入2ml的西林瓶(實際容積約為3.5ml)，每瓶分裝入1g。將分裝好的西林瓶放于凍干機隔板上，迅速冷卻到-40℃冷凍2h，然后保持該溫度在真空度為120mtorr的條件下冷凍干燥10h，之后將隔板溫度升到25℃解析干燥3h。干燥結(jié)束后，保持凍干機的真空狀態(tài)，回填入八氟丙烷氣體，待真空度恢復到常壓后，壓下西林瓶上的橡膠塞，密封西林瓶，制得超聲造影劑。

該超聲造影劑(凍干粉制劑)使用之前，向西林瓶中注入1ml的生理鹽水，放于醫(yī)用銀汞調(diào)和機的夾頭上，振蕩頻率為4000rpm，振蕩45s后，得到微泡懸浮液。

實施例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于將磷脂成分更換為：32mg二硬脂?；?磷脂酰甘油。

實施例3

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于將凍干保護劑換成甘氨酸。

實施例4

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于將凍干保護劑換成蔗糖。

實施例5

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于溶劑為12g去離子水和7g叔丁醇的混合液。

實施例6

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于溶劑為8g去離子水和11g叔丁醇的混合液。

對比例1

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于以水為溶劑制備微泡包膜材料混懸液。

制備過程中發(fā)現(xiàn)，在制備微泡包膜材料混懸液的時候，實施例1中只需在45℃加熱溶解5min左右就可以得到澄清透明的混懸液，而對比例1中在45℃加熱溶解1h后仍然可以看到很多顆粒狀不溶物，而且混懸液渾濁不透明(圖1)。在使用傳統(tǒng)的220nmpvdf膜針頭濾器(直徑25mm)對混懸液進行過濾時，實施例1中混懸液在過濾100ml后沒有遇到明顯的阻力，而對比例1中的混懸液過濾時過濾的阻力非常明顯，僅過濾了2ml后濾器就基本完全被堵塞無法繼續(xù)進行了。

另外在同等凍干條件下，實施例1中的樣品能夠完全干燥并得到完整的凍干制劑，而對比例1中的樣品則發(fā)現(xiàn)幾乎所有的凍干制劑的底部都出現(xiàn)了坍塌，個別凍干樣品中出現(xiàn)了噴瓶。

對比例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例2的區(qū)別僅在于以水為溶劑制備微泡包膜材料混懸液。

制備過程中發(fā)現(xiàn)，在制備微泡包膜材料混懸液的時候，實施例2中只需在45℃加熱溶解5min左右就可以得到澄清透明的混懸液，而對比例2中在45℃加熱溶解0.5h后才基本完全溶解，而且混懸液渾濁不透明。在使用傳統(tǒng)的220nmpvdf膜針頭濾器(直徑25mm)對混懸液進行過濾時，實施例2中混懸液在過濾100ml后沒有遇到明顯的阻力，而對比例2中的混懸液過濾時過濾的阻力非常明顯，僅過濾了3ml后濾器就基本完全被堵塞無法繼續(xù)進行了。

在同等凍干條件下，實施例2中的樣品能夠完全干燥并得到完整的凍干制劑，而對比例2中的樣品則發(fā)現(xiàn)幾乎所有的凍干制劑的底部都出現(xiàn)了坍塌，個別凍干樣品中出現(xiàn)了噴瓶。

實驗例1

為獲取微泡在光學顯微鏡下的圖像；具體操作步驟如下：用等體積的生理鹽水稀釋實施例1制得的微泡懸液，用移液器吸取10μl微泡懸液滴在干凈的載玻片上，小心蓋上蓋玻片，使用顯微鏡在不同物鏡倍數(shù)下觀察微泡的大小、形態(tài)及分散情況并拍照。圖2是得到的微泡的顯微照片，可以看到微泡的尺寸大都在2μm以下。

實驗例2

采用庫爾特顆粒計數(shù)儀測試實施例1制得的微泡懸液微泡的粒徑分布及濃度。操作步驟如下：取新制備的微泡懸液20μl加入到20ml生理鹽水中中，輕微搖晃混合均勻。設定分析體積為20μl，測試微泡的粒徑分布及濃度。樣品測試重復三次，取平均值。圖3是其中一次代表性的結(jié)果，可以看到微泡的尺寸分布范圍很窄，大部分都在2μm以下，與顯微鏡照片吻合。

實驗例3

以新西蘭大白兔為實驗對象，于兔左耳經(jīng)耳緣靜脈建立外周靜脈通道，在導管的末端連接三通管，其中一個通道用于注射超聲造影劑，一個通道尾隨生理鹽水。新西蘭大白兔用3％的戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉(30mg/kg)，并輔以0.2％肝素鈉抗凝血。待兔完全麻醉后，以背臥的姿勢固定在兔床上。右腹部毛發(fā)用脫毛膏小心脫除，對兔肝臟和腎臟進行未注射造影劑的超聲檢查，記錄基礎狀態(tài)下的圖像。待圖像滿意后將分別將實施例1和對比例1中的超聲造影劑微泡 混懸液按20μl/kg的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈團注，即刻尾隨2.0ml生理鹽水沖洗管道，實時動態(tài)觀察并記錄兔肝臟和腎臟回聲強度增強情況以及腎臟能量多普勒血流信號增強情況。

圖4和圖5分別是實施例1和對比例1中造影劑的成像結(jié)果，可以看到實施例1中的造影劑能夠?qū)ν米痈闻K和腎臟進行超聲增強造影，并且這種增強效果能夠持續(xù)到50分鐘后仍然很強。而對比例1中的造影劑在注射后8分鐘信號明顯減弱，16分鐘后基本完全消退。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。