本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及一種具有超長持續(xù)時間的超聲造影劑及其制備方法。

背景技術：

超聲造影劑通常是脂質、聚合物或蛋白質包裹的直徑在10微米以下的氣體微泡，能夠在超聲成像中用來增強檢測部位的回聲信號。超聲造影劑在人體微小血管和組織血流灌注檢測與成像方面具有很大優(yōu)勢。另外，近些年的研究表明超聲造影劑在腫瘤或炎癥部位的靶向成像和藥物遞送等方面表現(xiàn)出了廣闊的應用前景，因此可以預見超聲造影劑在不久的將來將會成為臨床上超聲診斷或治療中的不可或缺的試劑。

目前超聲造影劑已經有很多產品進入臨床應用，國際市場上如definity、optison、sonazoid、sonovue等，國內市場上現(xiàn)在有sonovue、雪瑞欣可以使用。盡管超聲造影劑在超聲診斷中有著諸多應用優(yōu)勢，但是目前國內臨床診斷中超聲造影劑卻很少被普通民眾所使用，一般只有在三甲以上的醫(yī)院才會有較多的使用。這其中一個很重要的原因就是造影劑的價格非常昂貴，如每瓶sonovue的價格在700人民幣左右，雪瑞欣的價格更是高達每瓶900多人民幣，普通老百姓難以負擔得起，極大地限制了超聲造影劑的普及。另外目前已有的超聲造影劑的成像時間都比較短(sonovue的有效時間為4-8分鐘，雪瑞欣不足2分鐘)，難以滿足一個完整的超聲檢查的需求。尤其是隨著介入超聲等技術的發(fā)展，對具有長持續(xù)時間的造影劑的需求就更加迫切。

另外，隨著超聲分子影像和介入治療的發(fā)展，亞微米的微泡(即含有一定比例的納米泡的超聲微泡)開始顯現(xiàn)出巨大的應用潛力。納米泡在高頻超聲下穩(wěn)定性更好，具有更好的穿透血管的能力，而微米級微泡的超聲造影增強效果更好，亞微米的微泡結合了兩者的優(yōu)勢表現(xiàn)出更好的應用價值。例如研究發(fā)現(xiàn)definity由于含有一定比例的納米泡具有更好的超聲溶栓效果，而同等條件下的 白蛋白微泡由于均是微米級尺寸則沒有這種效果。

技術實現(xiàn)要素：

基于以上需求和問題，本發(fā)明提供一種具有超長持續(xù)時間的超聲造影劑的制備方法，該方法操作簡單，微泡包膜材料可以在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，可以進行過濾除菌，容易進行產業(yè)化生產。本發(fā)明所述超聲造影劑為凍干制劑，為了制備凍干制劑，需要先制備超聲微泡包膜材料的混懸液，混懸液中的成分是雙親性包膜材料、凍干保護劑和溶劑。

本發(fā)明技術方案如下：

一種具有超長持續(xù)時間的超聲造影劑的制備方法，包括以下步驟：

1)制備微泡包膜材料混懸液，其中所述混懸液的溶劑為叔丁醇和水混合液；

2)冷凍干燥所述混懸液，制得微泡凍干粉；

3)將所述微泡凍干粉充入填充氣體，所述填充氣體為混合氣體。

本發(fā)明所述包膜材料為雙親性包膜材料，其主要組分是帶有負電荷的磷脂，疏水鏈的長度以18個碳為宜，適合的磷脂包括二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸、二硬脂?；?磷脂酸等中的一種。研究發(fā)現(xiàn)，由于這些磷脂在生理條件下凈電荷為負，保證了微泡帶有較強的負電荷，從而使得穩(wěn)定性大大提高。且較長的疏水鏈能夠保證能夠形成穩(wěn)定的膜結構以防止微泡內部氣體的溢出。另外這些磷脂的親水性頭部中的磷酸、甘油、絲氨酸等結構能夠通過氫鍵或靜電相互作用形成穩(wěn)定的親水層，大大提高微泡的穩(wěn)定性。

本發(fā)明所述雙親性包膜材料中除了前面提到的帶有負電荷的磷脂外，也可以摻入一些其他的雙親性成膜材料，但是為了保證微泡的穩(wěn)定性，前面提到的帶有負電荷的磷脂(即二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸以及二硬脂酰基-磷脂酸)的重量比例應該在70％以上，優(yōu)選90％以上，更優(yōu)選為100％。其他雙親性材料包括各種天然、半合成的的磷脂化合物，如卵磷脂、卵磷脂酰甘油、氫化大豆磷脂、氫化蛋黃磷脂、氫化磷脂酰絲氨酸，氫化磷脂酰甘油等。也包括各種合成磷脂如帶有各種脂肪酸鏈的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等。也包括改性的磷脂，例如聚乙二醇化的磷脂。也包括各種合成的陽離子脂質，如羥乙基乙二胺基化的磷脂、乙 基磷脂酰膽堿的衍生物(如1,2-二硬脂酸-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸)、帶有烷基鏈的銨鹽(如硬脂酰氯化銨、十二烷基溴化胺等)等。也包括各種表面活性劑，如司盤類、吐溫類、聚乙二醇化的脂肪酸、單硬脂酸甘油酯、蔗糖單硬脂酸酯、氫化蓖麻油、棕櫚酸抗壞血酸脂等。也包括類固醇類化合物(如膽固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麥角固醇)及其衍生物、維生素e及其衍生物、脂肪酸(如硬脂酸、棕櫚酸、花生酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸等)。

研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述雙親性包膜材料以單一一種磷脂為最佳，即選擇二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸以及二硬脂?；?磷脂酸中的一種作為微泡包膜材料。一方面單一一種磷脂避免了由于多種磷脂混合不均導致的微泡均一性和可重復性差的問題。另一方面，采用單一一種磷脂有利于磷脂形成均一的微泡包膜結構，穩(wěn)定性大大提高。

本發(fā)明制備微泡包膜材料混懸液的過程中還需加入凍干保護劑。

本發(fā)明優(yōu)選采用的凍干保護劑是聚乙二醇，平均分子量應該在1000-10000之間為宜，優(yōu)選的是平均分子量為4000左右的聚乙二醇。聚乙二醇的主要作用是在混懸液冷凍干燥時能夠對支撐起成膜材料，使其保持在溶液中的穩(wěn)定分散狀態(tài)而不至于塌陷聚集，使得凍干粉在水化時能夠很容易分散得到均一穩(wěn)定的溶液。另外，聚乙二醇在水中能夠與微泡膜表面的磷脂通過氫鍵作用大量附著，聚合物的附著可以極大地提高微泡的穩(wěn)定性，也能夠降低微泡在體內被識別的幾率從而延長微泡的循環(huán)時間。

為了獲得均一穩(wěn)定的微泡包膜材料混懸液，需要一種溶劑能夠將微泡包膜材料(和凍干保護劑)均勻混合分散。另外，為了獲得微泡凍干粉，這種溶劑還需要具有合適的熔點和飽和蒸汽壓。

水是冷凍干燥工藝中最常用的溶劑，但是雙親性材料在水中很容易自組裝成膠束或脂質體等結構，直接將多種雙親性材料分散在水中很難實現(xiàn)分子水平上的均勻混合。

目前能夠用于冷凍干燥的最優(yōu)選的非水溶劑是叔丁醇，由于其具有較高的熔點(25.7℃)和飽和蒸汽壓(26.8mmhg，20℃)，用普通的冷凍干燥設備實現(xiàn)冷凍干燥，極大的節(jié)約成本。另外，較低的毒性也使得叔丁醇較適合用于 藥物制劑的冷凍干燥。盡管純的叔丁醇可以溶解大多數雙親性材料和不同分子量的聚乙二醇，但是卻無法溶解大多數的凍干保護劑。另外，微泡制備時通常需要加入一定比例的帶有負電荷的磷脂如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酸等，而這類磷脂在叔丁醇中的溶解度較差。

本發(fā)明中用來制備微泡包膜材料混懸液的溶劑是叔丁醇和水的混合液。優(yōu)選地，所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的質量含量為1％～99％，進一步優(yōu)選為30％～70％。

本發(fā)明中所采用的成膜材料主要是帶有負電荷的磷脂，這類磷脂在水中難以分散，在氯仿、甲醇、正己烷、叔丁醇、乙醇等大多數有機溶劑中的溶解性都不好。而且除了要保證磷脂能夠充分分散，還要保證混懸液能夠在一般的冷凍干燥設備中被凍干。我們經過大量實驗發(fā)現(xiàn)只有叔丁醇和水的混合液能夠滿足需求，帶負電荷的磷脂在這種溶劑中能夠被很容易地溶解，混懸液中的溶劑能夠很容易地通過冷凍干燥除去，而且這種溶劑的生物毒性很低，痕量殘留的溶劑毒性可以被忽略。

另外，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，以叔丁醇和水混合液為溶劑能夠同時溶解絕大多數雙親性包膜材料和凍干保護劑，而且溶解過程不需要太高的溫度，40℃左右甚至更低的溫度就可以溶解，且溶解后冷卻到室溫后不會析出。最后獲得的所述混懸液澄清、均一、穩(wěn)定，并且很容易利用過濾進行除菌。另外，使用叔丁醇和水混合液為溶劑進行冷凍干燥時，叔丁醇能夠在水中形成針狀結晶，大大縮短冷凍干燥的周期。

本發(fā)明所述微泡包膜材料混懸液制備好后通常還需要進行過濾，比較優(yōu)選的是用220nm的濾膜進行過濾。使用叔丁醇和水作為溶劑能夠很容易將包膜材料溶解得到澄清透明的溶液，很容易進行過濾。過濾的目的一方面能夠除去可能存在的微量雜質，另一方面能夠起到對混懸液過濾除菌的目的。

本發(fā)明中微泡包膜材料混懸液制備好后(例如分裝入藥物制劑用的西林瓶)，通過冷凍干燥的方法除去溶劑(即叔丁醇和水混合液)得到微泡凍干粉，凍干粉能夠穩(wěn)定存在，常溫條件下即可以保存很長時間。所述冷凍干燥可采用本領域常用方法。

本發(fā)明方法還包括將制備好的微泡凍干粉進行充入填充氣體的步驟。例如冷凍干燥結束后向西林瓶中充入填充氣體。填充氣體是超聲微泡內核的成分，為了提高超聲微泡的穩(wěn)定性，填充氣體應該在水中具有較低的溶解度，還要對生物體安全無毒。常用的超聲造影劑的填充氣體是氟化碳類氣體，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)當使用氟化碳類氣體如八氟丙烷作為填充氣體時，最后制備的超聲微泡的尺寸較大，較多的微泡尺寸在10微米以上，由于人體中肺部最細的血管的內徑在10微米左右，這種微泡難以被安全用到生物體中。另一方面，在水中溶解度較高的氣體，如空氣、氮氣等氣體用作填充氣體所制備的微泡盡管尺寸較小但是穩(wěn)定性極差。

本發(fā)明中所使用的填充氣體是混合氣體，其含有兩類氣體：氣體a和氣體b。氣體a的特點是分子量比較小(<100)，可以利用的氣體包括空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、氖氣、氬氣中的一種或幾種的混合氣。氣體b的特點是分子量較大(>100)，并且含有氟元素，可以利用的氣體包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟環(huán)丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷等氟化碳類氣體以及六氟化硫等氟化硫類氣體中的一種或幾種的混合氣。

本發(fā)明中填充氣體(即混合氣體)中氣體a的體積比例為1％～99％，優(yōu)選的比例為95％～99％?；旌蠚怏w的使用，一方面能夠保證微泡具有很好的穩(wěn)定性，另一方面能夠顯著降低微泡的尺寸使得絕大多數的微泡尺寸都在7微米以下，并且有很多納米泡。

本發(fā)明中氣體填充過程可以是在凍干機外用特定的充氣裝置進行。工業(yè)化生產時更優(yōu)選的方法是氣體填充、密封的過程都是在凍干設備中進行。本發(fā)明中混懸液分裝入西林瓶中后，在經過凍干、氣體填充、密封、無菌處理后即可得到最終的超聲造影劑(微泡凍干粉)成品。

本發(fā)明上述制備方法中，

步驟1)包括將所述包膜材料和凍干保護劑加入叔丁醇和水混合液中，加熱溶解，制得微泡包膜材料混懸液；然后過濾除菌；

所述包膜材料和凍干保護劑的重量比例為1：200～1:5；優(yōu)選為1:50～1:10。

所述包膜材料和凍干保護劑的總重量占所述溶劑(即叔丁醇和水混合液) 重量的1％～50％；優(yōu)選為5％～20％；

所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的質量含量為1％～99％，優(yōu)選為30％～70％。

所述加熱溶解溫度為25℃～70℃；優(yōu)選為35℃～50℃。

所述過濾除菌優(yōu)選采用220nm的濾膜。

具體地，本發(fā)明所述具有超長持續(xù)時間的超聲造影劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將所述包膜材料和凍干保護劑加入叔丁醇和水混合液中，加熱溶解，制得微泡包膜材料混懸液；然后采用220nm的濾膜過濾除菌；

2)將步驟1)過濾除菌的微泡包膜材料混懸液冷凍干燥，得到微泡凍干粉；

3)將步驟2)制備好的微泡凍干粉充入混合填充氣體；

上述制備方法中，

所述包膜材料為二硬脂酰基-磷脂酰甘油、二硬脂酰基-磷脂酰絲氨酸或二硬脂?；?磷脂酸；

所述凍干保護劑為平均分子量4000的聚乙二醇；

所述包膜材料和凍干保護劑的重量比例為1:50～1:10；

所述包膜材料和凍干保護劑的總重量占所述溶劑重量的5％～20％；

所述加熱溶解溫度為35℃～50℃；

所述混合氣體含有兩類氣體：氣體a和氣體b；其中氣體a的分子量<100；氣體b的分子量>100，并且含有氟元素；

所述氣體a包括空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、氖氣、氬氣中的一種或幾種的混合氣；

所述氣體b包括氟化碳類氣體、氟化硫類氣體中的一種或幾種的混合氣；其中，氟化碳類氣體包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟環(huán)丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷；氟化硫類氣體包括六氟化硫。

本發(fā)明還包括上述方法制得的超聲造影劑。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)在使用時需要向所述超聲造影劑中注入水化液，經震蕩制得超聲造影劑懸浮液。

具體地，本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)在使用時需要向包裝容器 (如西林瓶)中注入水化液，水化液的量優(yōu)選占包裝容器(如西林瓶)容積的10％～80％。水化液的選擇應該是完全無毒、可以進行靜脈注射的。純水和大多數臨床上使用的注射液都可以被用做水化液，如生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，甘油注射液，葡萄糖注射液，氨基酸注射液等。也可以是加入了一定量的甘油和/或丙二醇的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，甘油的加入能夠提高微泡的粘彈性和穩(wěn)定性，丙二醇可以促進雙親性包膜材料的分散。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)水化后優(yōu)選通過機械振蕩器來激活微泡以獲取可以用于超聲成像造影的微泡混懸液。這里所采用機械振蕩器與目前臨床上牙科所用的銀汞調和器的結構原理基本一致。優(yōu)選地，震蕩方式是往復式，震蕩頻率為2000～7000rpm，震蕩幅度為0.5～3cm，震蕩時間為30～180s。

本發(fā)明制備方法簡單，微泡各組分之間能夠在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，達到分子水平的均勻混合，各組分在制備過程中不易發(fā)生降解，樣品凍干效率高，樣品均一穩(wěn)定，可以進行過濾除菌，可重復性高、容易規(guī)?；a，表現(xiàn)出廣闊的臨床應用前景。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法中因磷脂在高溫條件下或水溶液中長期存在時容易發(fā)生降解產生溶血性磷脂，影響產品的穩(wěn)定性和安全性的技術問題。本發(fā)明中優(yōu)選的方法采用單一一種帶負電的磷脂作為成膜材料，提高了產品的均一性和可重復性。產品高效安全、方法可重復性高。

本發(fā)明中造影劑體內(例如肝臟、腎臟和脾臟等臟器)造影持續(xù)時間達到了2-6小時以上，是目前已報道的微氣泡類超聲造影劑中超聲造影持續(xù)時間最長的一類造影劑。打破了傳統(tǒng)的對氣體微泡超聲造影劑穩(wěn)定性差的認知。這種造影劑除了含有較多的微米級氣泡之外，還含有很多納米級的氣泡。另外，這種造影劑的成分簡單、價格低廉，主要原料均為fda已經批準的可注射藥用輔料，制備工藝簡單、可重復性高、易于進行規(guī)模化生產，預計工業(yè)化生產后每瓶生產成本僅為2人民幣左右。良好的超聲造影效果、低廉的價格使得這種超聲造影劑具有良好的應用價值，預計將有助于超聲造影劑的普及應用，具有很廣闊的臨床應用前景。

附圖說明

圖1為實施例1和對比例1制得的微泡包膜材料混懸液照片。

圖2為實施例1制得的微泡懸液的微泡顯微鏡照片。

圖3為對比例2得的微泡懸液的微泡顯微鏡照片。

圖4為實施例1制得的微泡懸液的微泡的粒徑分布圖。

圖5為實施例1制得的超聲造影劑(微泡混懸液)對新西蘭大白兔的腎臟和肝臟實質在不同時間點的造影效果圖。a，微泡注射前；b，微泡注射后30秒；c微泡注射后30分鐘；d，微泡注射后1小時；e，微泡注射后3小時；f，微泡注射后5小時。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產品。

實施例1

準確稱取128mg二硬脂?；?磷脂酰甘油，1872mgpeg4000，加入溶劑(即9g去離子水和9g叔丁醇的混合液)，加熱到45℃溶解得到微泡包膜材料混懸液，為澄清的溶液(見圖1)，然后冷卻到室溫。將溶解后的溶液用220nm的濾膜過濾后分裝入2ml的西林瓶(實際容積約為3.5ml)，每瓶分裝入250mg。將分裝好的西林瓶放于凍干機隔板上，迅速冷卻到-40℃，冷凍干燥過夜。冷凍干燥結束后，保持凍干機的真空狀態(tài)，充填入氮氣體積比例為98％的氮氣和八氟丙烷混合氣體，待真空度恢復到常壓后，壓下西林瓶上的橡膠塞，密封西林瓶，制得超聲造影劑。

該超聲造影劑(凍干粉制劑)使用之前，向西林瓶中注入1ml的生理鹽水，放于醫(yī)用銀汞調和機的夾頭上，振蕩頻率為4000rpm，振蕩45s后得到微泡懸浮液。

實施例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于將二硬脂?；?磷脂酰甘油成分更換為：128mg二硬脂酰基-磷脂酰絲氨酸。

實施例3

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于將二硬脂?；?磷脂酰甘油成分更換為：128mg二硬脂?；?磷脂酸。

實施例4

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于溶劑為12.6g去離子水和5.4g叔丁醇的混合液。

實施例5

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于溶劑為5.4g去離子水和12.6g叔丁醇的混合液。

實施例6

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氮氣體積含量為95％的全氟丙烷和氮氣的混合氣體。

實施例7

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為空氣體積含量為98％的全氟丙烷和空氣的混合氣體。

實施例8

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為空氣體積含量為98％的全氟丁烷和空氣的混合氣體。

實施例9

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氮氣體積含量為98％的全氟丁烷和氮氣的混合氣體。

實施例10

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氧氣體積含量為98％的全氟丙烷和氧氣的混合氣體。

對比例1

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例1的區(qū)別僅在于以水為溶劑制備微泡包膜材料混懸液。

制備過程中發(fā)現(xiàn)，在制備微泡包膜材料混懸液的時候，實施例1中只需在45℃加熱溶解5分鐘左右就可以得到澄清透明的混懸液，而對比例1中在45℃ 加熱溶解30分鐘后仍然可以看到很多顆粒狀不溶物，而且混懸液渾濁不透明(圖1)。在使用傳統(tǒng)的220nmpvdf膜針頭濾器(直徑25mm)對混懸液進行過濾時，實施例1中混懸液在過濾100ml后沒有遇到明顯的阻力，而對比例1中的混懸液過濾時過濾的阻力非常明顯，僅過濾了2ml后濾器就基本完全被堵塞無法繼續(xù)進行了。

對比例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為全氟丙烷單一氣體。

對比例3

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為空氣單一氣體。

對比例4

一種超聲造影劑，其制備方法與實施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為氮氣單一氣體。

實驗例1

為獲取微泡在光學顯微鏡下的圖像；具體操作步驟如下：用等體積的生理鹽水分別稀釋實施例1和對比例2～4中制得的微泡懸液，用移液器吸取10μl微泡懸液滴在干凈的載玻片上，小心蓋上蓋玻片，使用顯微鏡在不同物鏡倍數下觀察微泡的大小、形態(tài)及分散情況并拍照。圖2是實施例1中得到的微泡的顯微照片，可以看到微泡的尺寸大都在2μm以下，并且能夠明顯看到很多納米泡。圖3是對比例2中得到的微泡的顯微照片，可以看到很多尺寸都位于10μm以上，較多的大尺寸微泡在體內使用的時候容易堵塞血管，安全性沒有保證，無法被用于體內超聲實驗。而對比例3和對比例4中的微泡在顯微鏡可以看到微泡大多都是2μm以下，尺寸很小，但是這種微泡非常不穩(wěn)定，常溫放置約30分鐘后就完全消失了。

實驗例2

采用采用庫爾特顆粒計數儀測試新型微泡的尺寸分布及濃度。操作步驟如下：取實施例1新制備的微泡懸液20μl加入到20ml生理鹽水中中，輕微搖 晃混合均勻。設定分析體積為20μl，測試微泡的粒徑分布及濃度。樣品測試重復三次，取平均值。圖4是其中一次代表性的結果，可以看到微泡的尺寸分布范圍很窄，大部分都在2μm以下，與顯微鏡照片吻合。

實驗例3

以新西蘭大白兔為實驗對象，于兔左耳經耳緣靜脈建立外周靜脈通道，在導管的末端連接三通管，其中一個通道用于注射超聲造影劑，一個通道尾隨生理鹽水。新西蘭大白兔用3％的戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉(30mg/kg)，并輔以0.2％肝素鈉抗凝血。待兔完全麻醉后，以背臥的姿勢固定在兔床上。右腹部毛發(fā)用脫毛膏小心脫除，對兔肝臟和腎臟進行未注射造影劑的超聲檢查，記錄基礎狀態(tài)下的圖像。待圖像滿意后分別將實施例1以及對比例3和對比例4中的超聲造影劑微泡混懸液按20μl/kg的劑量經兔耳緣靜脈團注，即刻尾隨2.0ml生理鹽水沖洗管道，實時動態(tài)觀察并記錄兔肝臟和腎臟回聲強度增強情況以及腎臟能量多普勒血流信號增強情況。

圖5是實施例1中的微泡在兔肝臟和腎臟的造影結果，可以看到造影信號在肝臟和腎臟有顯著的造影增強效果，并且能夠持續(xù)很長時間，注射后5小時仍能看到較強的信號。在注射后7小時，盡管腎臟的信號已經基本完全消失，但在在肝臟部位仍然能夠看到顯著的增強信號。

而對比例3和對比例4中的造影劑在注射入動物體內后基本看不到造影增強的信號。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。