相關(guān)申請本申請根據(jù)35USC119(e)要求美國臨時專利申請No.61/237,306的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該臨時專利申請?zhí)峤挥?009年8月27日，其完整內(nèi)容通過引用合并在此。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在其一些實施方式中涉及脂質(zhì)體組合物及其用途。
背景技術(shù)：
：基于脂質(zhì)體的DNA和藥物遞送系統(tǒng)在過去四十年有著廣泛的研究，并用作治療各種病況的裝置(mean)。脂質(zhì)體系統(tǒng)允許在良好界定的生物相容性和非免疫原性脂質(zhì)囊泡中高效地包埋親水性和水性化合物，該脂質(zhì)囊泡的直徑為幾納米至幾微米。脂質(zhì)體也可以利用特異性配體如蛋白質(zhì)結(jié)合物或結(jié)合特異細(xì)胞受體的抗體靶向。在癌癥治療中，脂質(zhì)體系統(tǒng)是最受歡迎且全面研究的藥物載體之一。這主要由于增強(qiáng)滲透性和滯留(EPR)效應(yīng)，所述增強(qiáng)滲透性和滯留效應(yīng)是指腫瘤血管的血管滲透性由于腫瘤血管新生而增大。EPR效應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)體累積在腫瘤細(xì)胞外液中，這作為被動靶向機(jī)制而被利用。用于癌癥治療的脂質(zhì)體藥物遞送的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)主要包括批準(zhǔn)用于臨床使用的藥物(例如，DaunoXomeTM、MyocetTM、DoxilTM、CaelyxTM)。當(dāng)前調(diào)查了使脂質(zhì)體系統(tǒng)靶向癌癥的數(shù)種途徑，包括使靶向部分(targetingmoiety)與脂質(zhì)體表面(例如，抗體)結(jié)合。合成的陽離子脂質(zhì)體是最常用的DNA遞送載體，但不論是體外還是體內(nèi)優(yōu)選的DNA轉(zhuǎn)移途徑，它們的細(xì)胞毒性仍然是個問題。另一方面，更加類似于細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(就它們的電荷而言)的陰離子脂質(zhì)體也被證明可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，但包封率較差，這由未凝集DNA(uncondensedDNA)的大尺寸和負(fù)電荷引起。通過使DNA與陽離子或聚陽離子(poly-cations)絡(luò)合(complexation)可以提高包封率和保護(hù)DNA不受降解，這種絡(luò)合隨后也顯著提高轉(zhuǎn)染效率。近十年來，數(shù)個研究已揭示當(dāng)向荷瘤動物給予某些原代細(xì)胞，如成人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSC)、成人造血干細(xì)胞(HSC)和內(nèi)皮細(xì)胞時，它們累積在腫瘤微環(huán)境中。最新數(shù)據(jù)表明分離的腫瘤細(xì)胞膜組分似乎包含強(qiáng)有力的MSC引誘劑(attractant)，多于從相同細(xì)胞分離的細(xì)胞質(zhì)組分中所包含的。這個數(shù)據(jù)暗示，MSC靶向腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要由在腫瘤和MSC上發(fā)現(xiàn)的表面分子結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用控制。然而，細(xì)胞對新生血管和腫瘤細(xì)胞分泌的不同可溶性因子(例如，趨化因子)的反應(yīng)被認(rèn)為也被暗示在某種程度上參與MSC歸巢(homing)機(jī)制。該歸巢機(jī)制激發(fā)人們研究這些細(xì)胞作為癌癥治療的靶向遞送媒介物(vehicle)的應(yīng)用。在這些研究中，原代細(xì)胞被分離并用感興趣的不同基因，抗癌基因或報告基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。將該細(xì)胞移植到荷瘤動物中，并利用表達(dá)的報告蛋白確定它們對腫瘤微環(huán)境的歸巢。腫瘤抑制利用表達(dá)的抗癌癥蛋白質(zhì)實現(xiàn)。源自哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)體通常用作研究膜和細(xì)胞機(jī)制的工具。也對細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL或復(fù)數(shù)的CDL)作為癌癥免疫治療的工具進(jìn)行了研究。在這些研究中，脂質(zhì)體由腫瘤細(xì)胞膜制備，并用作激發(fā)針對位于脂質(zhì)體膜上的腫瘤抗原的免疫系統(tǒng)的佐劑。然而，細(xì)胞來源的脂質(zhì)體從未從干細(xì)胞生產(chǎn)出，也從未用作遞送媒介物。此外，也從未開發(fā)出用作靶向平臺的CDL系統(tǒng)。相關(guān)技術(shù)：Boone，C.W.，F(xiàn)ord，L.E.，Bond，H.E.，Stuart，D.C.&Lorenz，D.IsolationofplasmamembranefragmentsfromHeLacells.JCellBiol41，378-392(1969).WestermanandJensenMethodsEnzymol.2003；373：118-27.技術(shù)實現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了包含附連(連接，attach)到藥劑上或包封(encapsulate)藥劑(pharmaceuticalgent)的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物(組合物，composition-of-matter)，該脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分(wholecellmembranefraction)組成。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該細(xì)胞是人細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，全細(xì)胞膜的細(xì)胞來源選自干細(xì)胞、原代細(xì)胞(primarycell)、細(xì)胞系(cell-line)、非致瘤細(xì)胞(non-tumorigeniccell)、癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成的組。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了包含由干細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該干細(xì)胞包含人間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了包含由原代人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了包含由非致瘤人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該細(xì)胞膜經(jīng)受基因修飾從而表達(dá)外源蛋白(exogenousprotein)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該外源蛋白選自細(xì)胞標(biāo)記(細(xì)胞標(biāo)記物，cellmarker)、靶向部分(targetingmoiety)和藥劑組成的組。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該脂質(zhì)體包封藥劑，或者附連到藥劑上。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該藥劑是治療劑(治療劑，therapeuticagent)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，物質(zhì)組合物在人對象(主體、受驗者，subject)中是非免疫原性的。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對象的自體(autologous)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對象的非自體(non-autologous)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，所述脂質(zhì)體在其外表面上附連到合成的聚合物上。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該藥劑是診斷劑。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體(單層的、單室的，unilamellar)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該脂質(zhì)體在其外表面上附連到合成的聚合物上。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，合成的聚合物是聚乙二醇(PEG)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該脂質(zhì)體的尺寸在30-1000nm的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，包含：(a)使細(xì)胞經(jīng)受低滲條件(hypotonicconditions)，以便獲得破裂的細(xì)胞膜和/或空胞(ghost)；和(b)使破裂的細(xì)胞膜和/或空胞均質(zhì)化(homogenize)從而產(chǎn)生脂質(zhì)體。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該均質(zhì)化通過以下而實現(xiàn)：(c)超聲處理破裂的細(xì)胞膜和/或空胞，和可選地(d)通過具有預(yù)定孔隙(孔隙度，porosity)的基質(zhì)(matrix)擠出破裂的細(xì)胞膜和/或空胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該方法進(jìn)一步包含在步驟(c)之后使合成的聚合物結(jié)合到脂質(zhì)體上。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了將藥劑包封在脂質(zhì)體中的方法，該方法包含根據(jù)上面的方法制造脂質(zhì)體和在均質(zhì)化步驟之前加入藥劑。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了包含作為活性成分的物質(zhì)組合物，和藥物可接受載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的方面，提供了遞送藥劑的方法，該方法包含向需要其的對象給予物質(zhì)組合物，從而遞送藥劑。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對于對象是自體的。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對于所述對象是非自體的。除非另有限定，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語的含義都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。雖然下面描述了示例方法和/或材料，但本發(fā)明實施方式的實施或試驗中可使用與本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有沖突，以專利說明書為準(zhǔn)，包括定義。另外，材料、方法和實施例僅為了說明，而未必是限制。附圖說明本文僅參考隨附的圖像和圖片[圖像1-10，圖片11]舉例說明本發(fā)明的一些實施方式。關(guān)于下面詳細(xì)討論的圖像/圖片，要強(qiáng)調(diào)的是，所示細(xì)節(jié)僅為了舉例，用于示意性地討論本發(fā)明的實施方式。在這方面，參考圖像/圖片所作的描述將使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明了本發(fā)明的實施方式如何實施。在圖中：圖1A-1C描繪了人MSC。通過吉姆薩(Giemsa)染色顯現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)(圖1A、1B)并通過流式細(xì)胞術(shù)分析典型的MSC(陽性和陰性)表面標(biāo)記(圖1C)。圖2是示出hMSC朝癌細(xì)胞遷移的照片。逐滴接種DiI(紅色)標(biāo)記的hMSC和DiO(綠色)標(biāo)記的BHK、PC3、Cf2Th和COS-7細(xì)胞。溫育72小時后的Maestro顯像證明hMSC朝PC3前列腺細(xì)胞特異性遷移，同時“避開”其它細(xì)胞系。圖3是示出MCF7來源的調(diào)整培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基，conditionmedia)刺激hMSC靶向MCF7乳腺癌細(xì)胞系的圖片。圖4A-4B是細(xì)胞來源的脂質(zhì)體的低溫(Cryo)TEM圖像。細(xì)胞來源的脂質(zhì)體由hMSC細(xì)胞質(zhì)膜制備，并通過與單甲氧基-PEG結(jié)合而PEG化(聚乙二醇化，PEGylated)。然后通過低溫TEM使形成的PEG化(圖4A)和未PEG化CDL(圖4B)顯像。圖5A-5C是示出CDL的DLS和Z(Zeta)-電位(Z電勢)分析的圖片。通過數(shù)量重量(數(shù)均重量，Number-weight)DLS(圖5A)、體積重量(體積均重量，Volume-Weight)DLS(圖5B)和Z-電位(圖5C)分析未PEG化和PEG化的hMSC來源的CDL的尺寸、尺寸分布和電荷。圖6示出hMSC來源的脂質(zhì)體的表面標(biāo)記特征。由hMSC制備CDL，使其與甲苯磺?；罨腄ynabeadsTM結(jié)合，并針對hMSC特異性膜標(biāo)記(即，CD44、CD29、CD90和CD105)進(jìn)行FACS分析。圖7A-7B示出由hMSC制備的CDL與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的結(jié)合。將PC3細(xì)胞用DiO(綠色)標(biāo)記，并與之前用DiI(紅色)標(biāo)記的CDL一起溫育。溫育12小時后使培養(yǎng)物顯像。示出代表性3D-投影圖像(圖7A)和單層(單片，singleslice)圖像(圖7B)。圖8A-8B是示出由hMSC制備的CDL與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的濃度依賴性結(jié)合的圖片和FACS直方圖(histogram)。將PC3細(xì)胞與之前用紅色熒光染料(DiI)標(biāo)記的各種濃度的CDL一起溫育。溫育24小時后，洗滌、收獲細(xì)胞并通過FACS分析(圖8A)。計算該細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，對該平均熒光強(qiáng)度與CDL濃度的自然對數(shù)作圖(圖8B)。圖9示出由調(diào)整hMSC(即，用癌細(xì)胞調(diào)整培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞)制備的CDL與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的特異性結(jié)合。由之前已與源自前列腺癌細(xì)胞系(PC3)和非人細(xì)胞系(BHK)的調(diào)整培養(yǎng)基一起溫育24小時的hMSC制備DiI-標(biāo)記的CDL。將由此形成的“調(diào)整”CDL，以及由未調(diào)整hMSC(對照，無CM)制備的CDL，與PC3和BHK細(xì)胞一起溫育15min、1小時和3小時。溫育后，洗滌、收獲細(xì)胞并通過FACS分析。標(biāo)記中的百分比是指標(biāo)記中DiI標(biāo)記的細(xì)胞比率。僅在左上角直方圖中指出的括號內(nèi)的百分比是指標(biāo)記中未標(biāo)記細(xì)胞的比率。標(biāo)記和標(biāo)記中未標(biāo)記細(xì)胞百分比對于所有直方圖都是相同的。圖10A-10B是包埋可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(sTRAIL)的，hMSC來源的脂質(zhì)體的低溫TEM圖像。所制備的含sTRAIL的CDL(圖10A)和空CDL(圖10B)的終濃度相同，并在相同條件下通過低溫TEM顯像。為了突出CDL含量，將初始灰度的低溫TEM圖像(左側(cè))重新著色成黑色和白色(右側(cè))。圖11示意性示出基于細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL)的靶向載體的整體設(shè)計。選擇天然特異性地與靶細(xì)胞相互作用的源細(xì)胞(原始細(xì)胞，origincell)作為細(xì)胞來源的脂質(zhì)體來源。例如，因此選擇通過膜與癌細(xì)胞相互作用的MSC作為癌癥靶向載體來源。對來源細(xì)胞(sourcecell)進(jìn)行低滲處理從而得到空胞細(xì)胞(ghostcell)，然后使空胞細(xì)胞均質(zhì)化從而制得CDL。由此產(chǎn)生的CDL然后可以與它的來源細(xì)胞類似的方式特異性地結(jié)合其靶細(xì)胞。具體實施方式本發(fā)明在其一些實施方式中涉及脂質(zhì)體組合物及其用途。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明的應(yīng)用不必局限于下面說明中陳述的或通過實施例舉例說明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實施方式，或能夠以多種方式實施或?qū)崿F(xiàn)。癌癥治療面臨的主要挑戰(zhàn)是對癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，同時不傷害健康細(xì)胞。開發(fā)用于癌癥治療的新型靶向治療遞送策略的重要性早已被世界公以。本發(fā)明人已設(shè)計出用于將治療和診斷劑靶向遞送到細(xì)胞和組織中的新型遞送媒介物。該遞送媒介物基于脂質(zhì)體，由包含天然脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的全細(xì)胞膜組分組成。通過采用自然(天然，native)細(xì)胞膜，可以將本發(fā)明遞送媒介物調(diào)配成具有低潛在免疫原性，容易歸巢到靶組織中，且可以進(jìn)行基因修飾從而表達(dá)治療劑或靶向部分。如下面和后面實施例部分說明的，本發(fā)明人已制得由間充質(zhì)干細(xì)胞的全細(xì)胞膜組成的脂質(zhì)體，間充質(zhì)干細(xì)胞因它們的歸巢能力以及它們的免疫抑制能力(即，它們減輕炎癥和抑制免疫細(xì)胞的能力)和低免疫原性特征(即，似隱形特征(stealth-likefeature)，這種特征使得在進(jìn)行異源移植時它們作為外來物質(zhì)免疫原性較小且不太容易被識別)而聞名。該脂質(zhì)體表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白質(zhì)簽章(proteinsignature)，因此預(yù)期可以介導(dǎo)與完整間充質(zhì)干細(xì)胞類似的免疫抑制和遷移特性。使這些細(xì)胞來源的脂質(zhì)體進(jìn)一步PEG化從而增大它們的生物利用率和分散性，并降低它們的凝聚性。還對該細(xì)胞來源的脂質(zhì)體進(jìn)行處理從而使其包封治療劑?？傊?，從這些研究結(jié)果可以看出，本發(fā)明遞送系統(tǒng)可以作為診斷和治療人疾病如癌癥的重要工具。因此，根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了包含附連到藥劑上或包封藥劑的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分組成。如本文使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”是指全封閉的載體分子(fullyclosedcarriermolecules)，其包含本身為液晶相或液體凝膠相的球形脂質(zhì)膜，其中包含所包埋液體的體積。該兩種液相是不混溶的。因而，本發(fā)明脂質(zhì)體(在本文也稱為細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL)，類似于細(xì)胞的膜，是完全凝膠/液體狀態(tài)和/或液晶狀態(tài)而不是固體狀態(tài)。本發(fā)明一些實施方式的脂質(zhì)體具有預(yù)期的蛋白質(zhì)脂質(zhì)比，約為0.8w/w。應(yīng)注意，hMSCcCDL的蛋白質(zhì)含量約為0.8mg/108個細(xì)胞(如通過Bradford分析測得的)。該脂質(zhì)含量容易利用Stewart磷脂分析測定。預(yù)期它為約1mg/108個細(xì)胞?？梢岳孟旅娴挠嬎愦_定理論磷脂含量。因為單個哺乳動物細(xì)胞的干質(zhì)量(干重)為10-7mg1數(shù)量級，且因為磷脂大約構(gòu)成該干細(xì)胞質(zhì)量2的10％，因此該細(xì)胞來源的脂質(zhì)體生產(chǎn)過程(假定100％效率)的理論產(chǎn)量應(yīng)為10-8mg磷脂/單個細(xì)胞或1mg/108個細(xì)胞的數(shù)量級。脂質(zhì)體包括泡囊(niosome)、轉(zhuǎn)鐵體(transfersome)、乳劑、泡沫、膠束(micelle)、液晶、分散體、層狀層(片狀層，lamellarlayer)等。該脂質(zhì)體可以是單層脂質(zhì)體或多層脂質(zhì)體(多層的，multilamellar)。根據(jù)本發(fā)明具體實施方式，該脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體，如通過低溫TEM測定的。根據(jù)本發(fā)明具體實施方式，該脂質(zhì)體具有自然膜對稱性和自然標(biāo)記的表達(dá)。本發(fā)明脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分組成。如本文使用的短語“細(xì)胞膜”或“細(xì)胞的膜”(它們可以互換使用)是指生物膜，該生物膜包圍細(xì)胞或者是其細(xì)胞器(例如，葉綠體、ER、高爾基質(zhì)、線粒體、液泡、細(xì)胞核和溶酶體)不可缺少的部分。根據(jù)本發(fā)明具體實施方式，細(xì)胞膜是指質(zhì)膜。使用質(zhì)膜具有特別的優(yōu)勢，因為它呈遞和細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，以及其它識別分子，如結(jié)合可溶性配體的受體。如本文使用的“全細(xì)胞膜組分”是指不僅包括脂質(zhì)而且包括膜蛋白質(zhì)的組分。膜蛋白質(zhì)實例包括，但不局限于，整合蛋白(integralprotein)、跨膜蛋白、脂質(zhì)錨定蛋白(lipidanchoredprotein)和糖蛋白。根據(jù)本發(fā)明實施方式，全細(xì)胞膜組分也包括碳水化合物。根據(jù)具體實施方式，該細(xì)胞是真核細(xì)胞[例如，哺乳動物(如人)、植物、昆蟲細(xì)胞]。根據(jù)另外的具體實施方式，該真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)又一個另外的實施方式，該細(xì)胞可以是原代細(xì)胞(即，非永生化(non-immortalized)且有時未被培養(yǎng))或細(xì)胞系。根據(jù)又一個另外的實施方式，該細(xì)胞可以是胚細(xì)胞。對于在自體或非自體(同系異體(同種異體，syngeneicallogeneic)或異種(xenogeneic))環(huán)境中使用未培養(yǎng)細(xì)胞的臨床應(yīng)用，使用原代細(xì)胞是有利的。根據(jù)具體實施方式，該真核細(xì)胞是干細(xì)胞。如本文使用的短語“干細(xì)胞”是指，在培養(yǎng)時能夠長時間保持未分化狀態(tài)(例如，多能性(全能，pluripotent)干細(xì)胞或多能(multipotent)干細(xì)胞)，直到被誘導(dǎo)分化成具有特定專一化功能的其它細(xì)胞類型(例如，完全分化的細(xì)胞)的細(xì)胞。優(yōu)選地，短語“干細(xì)胞”包括胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)、成人干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。根據(jù)具體實施方式，該干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是形成多能母細(xì)胞(formativepluripotentblastcells)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以產(chǎn)生一種或多種間充質(zhì)組織(例如，脂肪、骨、軟骨、彈性和纖維結(jié)締組織、成肌細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞)以及除起源于胚胎中胚層(例如，神經(jīng)細(xì)胞)的組織之外的組織，這取決于來自生物活性因子如細(xì)胞因子的各種影響。MSC可以從胚胎卵黃囊(embryonicyolksac)、胎盤(placenta)、臍帶、胎兒和青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪和其它組織中分離出，但它們在骨髓中的豐富度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過它們在其它組織中的豐富度。MSC已被證明在包括自身免疫性疾病和移植在內(nèi)的多種環(huán)境下具有免疫抑制功能，使得從其產(chǎn)生的脂質(zhì)體成為炎癥和自身免疫性環(huán)境中的終極工具。分離、純化和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如Caplan和Haynesworth的美國專利No.5,486,359，以及JonesE.A.等人，2002，Isolationandcharacterizationofbonemarrowmultipotentialmesenchymalprogenitorcells，ArthritisRheum.46(12)：3349-60中公開的那些。優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物如下制得：用等體積的漢克(Hank′s)平衡鹽溶液(HBSS；GIBCOLaboratories，GrandIsland，NY，USA)稀釋BM抽吸物(aspirate)(通常20ml)，并使所稀釋細(xì)胞在約10mlFicoll柱(Ficoll-Paque；Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)上分層。以2，500xg，離心30分鐘后，從分界面中移出單核細(xì)胞層，將其懸浮在HBSS中。然后以1，500xg離心細(xì)胞15分鐘，將其重懸在完全培養(yǎng)基(MEM，無脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的α培養(yǎng)基；GIBCO)中；批量選擇用于使MSC快速生長的20％胎牛血清(FCS)(AtlantaBiologicals，Norcross，GA)；100單位/ml青霉素(GIBCO)；100μg/ml鏈霉素(GIBCO)；和2mML-谷氨酰胺(GIBCO)。將重懸細(xì)胞接種(涂平板，plate)于10cm培養(yǎng)皿(CorningGlassWorks，Corning，NY)中的約25ml培養(yǎng)基中，并在37℃和5％加濕CO2下溫育。培養(yǎng)24小時后，棄去非粘附性細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽水(PBS)充分洗滌粘附細(xì)胞兩次。每隔3天或4天用新鮮完全培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，持續(xù)約14天。然后在37℃下利用0.25％胰蛋白酶和1mMEDTA(胰蛋白酶/EDTA，GIBCO)收獲粘附細(xì)胞5min，將其重新接種(replate)于6-cm板中，再培養(yǎng)14天。然后使細(xì)胞胰蛋白酶化(trypsinize)，并利用細(xì)胞計數(shù)裝置如血球計(HausserScientific，Horsham，PA)進(jìn)行計數(shù)。培養(yǎng)的細(xì)胞通過離心回收，并用5％DMSO和30％FCS以1～2X106個細(xì)胞/ml的濃度重懸。緩慢冷凍每個約1ml等分試樣，存放在液氮下。為了擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞組分，在37℃下使冷凍細(xì)胞解凍(thaw)，用完全培養(yǎng)基稀釋并通過離心回收從而除去DMSO。將細(xì)胞重懸在完全培養(yǎng)基中，并按約5,000個細(xì)胞/cm2的濃度接種。培養(yǎng)24h后，除去非粘附性細(xì)胞，利用胰蛋白酶/EDTA收獲并通過窄型巴士德移液管(Pasteurpipette)分離(dissociate)粘附細(xì)胞，優(yōu)選以約1.5～約3.0個細(xì)胞/cm2的密度重新接種。在這些條件下，MSC培養(yǎng)物可以生長約倍增50次(50populationdoublings)，并擴(kuò)增約2000倍[ColterDC，等人，Rapidexpansionofrecyclingstemcellsinculturesofplastic-adherentcellsfromhumanbonemarrow.ProcNatlAcadSciUSA.97：3213-3218，2000]。本發(fā)明利用的MSC培養(yǎng)物優(yōu)選包括通過形態(tài)特征限定的三組細(xì)胞：小的無顆粒細(xì)胞(agranularcells)(本文下面稱為RS-1)、小的粒細(xì)胞(顆粒細(xì)胞，granularcells)(本文下面稱為RS-2)，以及大的中度粒細(xì)胞(moderatelygranularcells)(本文下面稱為成熟MSC)。培養(yǎng)物中此種細(xì)胞的存在和濃度可以通過利用例如免疫熒光、原位雜交和活性分析鑒定是否存在各種細(xì)胞表面標(biāo)記來測定。當(dāng)在本發(fā)明培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MSC時，它們對造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD11B、CD43和CD45呈陰性染色。少部分細(xì)胞(少于10％)對CD31和/或CD38標(biāo)記呈弱陽性。另外，成熟MSC對造血干細(xì)胞標(biāo)記CD117(c-Kit)呈弱陽性；對成骨MSC標(biāo)記Stro-1呈中度陽性[Simmons，P.J.&Torok-Storb，B.(1991).Blood78，5562]，且對胸腺細(xì)胞和外周T淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD90(Thy-1)呈陽性。另一方面，RS-1細(xì)胞對CD117和Strol標(biāo)記呈陰性，而對CD90標(biāo)記呈弱陽性，RS-2細(xì)胞對所有這些標(biāo)記都呈陰性?？捎米魅?xì)胞膜組分有效來源的其它細(xì)胞包括，但不局限于，內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(chondrocyte)、神經(jīng)細(xì)胞等。該細(xì)胞可以以自然形式使用(usednative)(即，未通過基因修飾操縱)或?qū)υ摷?xì)胞進(jìn)行基因修飾從而操縱該細(xì)胞的膜組分?；蛐揎椀膬?yōu)點在于其效率提高。基因修飾細(xì)胞產(chǎn)生的基本所有(＞95％)CDL都表達(dá)感興趣的基因。該感興趣的基因可以組成型表達(dá)于細(xì)胞來源(通過整合到細(xì)胞基因組中)或短暫表達(dá)(游離型表達(dá)(episomalexpression))以便避免穩(wěn)定轉(zhuǎn)染劑(例如，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的有害影響。因而，該細(xì)胞可以經(jīng)過基因修飾從而表達(dá)感興趣的基因(即，不但表達(dá)未天然表達(dá)于天然膜中的基因，而且用以增強(qiáng)以較低水平天然表達(dá)于該細(xì)胞膜上的內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá))。根據(jù)具體實施方式，感興趣的基因編碼膜蛋白質(zhì)。感興趣的基因可以是天然膜蛋白質(zhì)，或者經(jīng)修飾從而具有膜錨定所需的膜定位信號和其它基序，如跨膜結(jié)構(gòu)域?？梢援愒?外源)表達(dá)的膜蛋白質(zhì)實例包括，但不局限于，靶向蛋白質(zhì)(例如，抗體、受體、膜錨定配體、誘餌蛋白(誘騙體，decoy))、影響膜化學(xué)(性質(zhì))的蛋白質(zhì)(例如，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、帶電荷蛋白質(zhì))、診斷蛋白質(zhì)(例如，在以下段落中描述的酶)，和治療性蛋白質(zhì)(如在以下段落中描述的)。靶向部分包括與細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記結(jié)合的靶向蛋白質(zhì)，如抗體、受體配體和非蛋白質(zhì)性分子如碳水化合物。例如，在前列腺癌細(xì)胞上過表達(dá)的前列腺特異膜抗原(PSMA)可以被它的結(jié)合到跨膜基序(例如，截斷LIME)4上的配體NAAG3靶向。這可以通過遺傳改造該細(xì)胞(CDL來源于其中)從而使其表達(dá)NAAG的嵌合或自然形式實現(xiàn)。例如，編碼LIME的表達(dá)質(zhì)粒通過PCR以及隨后將相應(yīng)片段插入到pcDNA3.1(Invitrogen)中來構(gòu)建。該引物也具有BamHI(5′引物和3′引物)位點延伸從而使亞克隆容易進(jìn)行。PCR產(chǎn)物利用BamHI消化并插入到pcDNA3.1(+)(CLONTECHLaboratories，Inc.)中的相應(yīng)位點處。對于編碼LIME-乙?；於滨；劝彼?NAAG)的表達(dá)載體，可以將開放閱讀框插入到編碼LIME的質(zhì)粒中，以便NAAG通過其N-端結(jié)合并且它的C端保持游離從而與PSMA[即，LIME(C)-(N)NAAG-COOH]反應(yīng)。替換地，編碼NAAG-LIME嵌合體的表達(dá)質(zhì)?？梢园凑涨懊驷槍D8-LIME嵌合體5描述的方法構(gòu)建。與NAAG和LIME跨膜區(qū)對應(yīng)的片段通過PCR產(chǎn)生。對編碼NAAG的3’序列和LIME片段的5’序列的引物進(jìn)行設(shè)計從而使其重疊(overlap)，以便使該兩種產(chǎn)物退火產(chǎn)生混合模版(hybridtemplate)。從這個模板，利用包含Xbal位點的外側(cè)引物(externalprimer)擴(kuò)增該嵌合體。將NAAG-LIME嵌合體插入pcDNA3.1(+)中。如本文使用的短語“表面標(biāo)記”是指被靶細(xì)胞/組織的細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)以獨(dú)特的高密度特異性展示，和/或以獨(dú)特構(gòu)型展示的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，靶向部分可能對靶向腫瘤細(xì)胞有用。例如，人們通常認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的堿性大于它們鄰近的細(xì)胞外環(huán)境，反過來它們鄰近的細(xì)胞外環(huán)境的酸性大于在滋養(yǎng)腫瘤的新生血管(angiogenicbloodvessel)中發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境。另外，許多先前的研究已證明，腫瘤細(xì)胞的表面電荷比良性正常細(xì)胞的表面電荷的負(fù)性更強(qiáng)(morenegative)，更不必說侵襲性腫瘤細(xì)胞。因此，表達(dá)膜結(jié)合酶和/或蛋白質(zhì)可能有用，這將使得僅帶正電荷的脂質(zhì)體位于酸性的腫瘤中間細(xì)胞外環(huán)境。例如，可以使用落在新生血管高堿性pH(pH＞7.4)和腫瘤鄰近的細(xì)胞外環(huán)境低酸性pH(pH＜7.2)之間pI為約7.2-7.4的任何膜蛋白。此種蛋白質(zhì)可以通過交叉參考人血漿膜蛋白的RCSBProteinDataBank(PDB)特異性鑒定。這些蛋白質(zhì)預(yù)期理想的pI(7.2-7.4)可以利用標(biāo)準(zhǔn)迭代算法10，11計算，標(biāo)準(zhǔn)迭代算法將為粗蛋白質(zhì)序列12，13給出相對精確的PI計算結(jié)果。在ExPASy服務(wù)器中的ComputepI/Mw工具中運(yùn)用該算法。預(yù)期此種脂質(zhì)體在新生腫瘤血管堿性微環(huán)境中具有負(fù)電荷或中性電荷，而在較酸性的腫瘤鄰近的細(xì)胞外環(huán)境中具有正電荷。因此，這種電荷改變對于顯著增大中性顆粒負(fù)性的脂質(zhì)體外滲(liposomalextravasation)有利，而且對于更容易利用帶正電荷顆粒完成的腫瘤內(nèi)遞送有利8，14，15。關(guān)于在疾病如癌癥中特異性過表達(dá)的表面標(biāo)記以及對此種表面標(biāo)記有特異性的抗體的詳盡指導(dǎo)記載在現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)(例如，參考：AMScott，CRenner.″TumourAntigensRecognisedbyAntibodies.″，EncyclopediaofLifeSciences，NaturePublishingGroup，Macmillan，London，UK，www.els.net，2001)中。與特異性展示生長因子受體/TAA表面標(biāo)記的靶細(xì)胞/組織關(guān)聯(lián)的，可通過本發(fā)明方法治療的疾病包括，例如，特異性展示生長因子受體/TAA的許多疾病中的一些，所述的生長因子受體/TAA為，例如EGF受體、血小板來源的生長因子(PDGF)受體、胰島素樣生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，和葉酸受體。此種疾病和這些疾病特異性展示的生長因子受體/TAA的具體實例在下表1中列出。表1*縮寫：EGF-表皮生長因子，PDGF-血小板來源的生長因子，IGF-胰島素樣生長因子，VEGF-血管內(nèi)皮生長因子，F(xiàn)GF-成纖維細(xì)胞生長因子。在優(yōu)選實施方式中，該配體是靶向?qū)Π屑?xì)胞上的受體有特異性的抗原的抗體或抗體片段?？贵w可以是單克隆抗體、多克隆抗體或抗體片段，它們是靶特異性的。在實施方式中，附連到脂質(zhì)體上的抗體是特異性結(jié)合到B-細(xì)胞表位上的抗-CD19、抗-CD20，或抗-CD22。這些抗體或抗體片段通常源自對受累(affected)B-細(xì)胞表現(xiàn)出陽性反應(yīng)性的雜交瘤?？紤]到，可以類似地使用靶向身體中任何其它細(xì)胞的其它抗體或抗體片段。例如，利用抗-CD19抗體使含有包埋劑(entrappedagent)的脂質(zhì)體靶向惡性B細(xì)胞。該抗體識別B細(xì)胞上的獨(dú)特(unique)表位，CD19表面抗原。在真核細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。因而，可以在后來從中抽提膜的細(xì)胞中表達(dá)設(shè)計和構(gòu)建用于表達(dá)感興趣的基因至少一個功能部分的外源多核苷酸序列。相應(yīng)地，該外源多核苷酸序列可以是感興趣的基因的DNA或RNA序列。如本文使用的術(shù)語“功能部分”是指表現(xiàn)出酶功能特性如與底物結(jié)合的特性的編碼蛋白質(zhì)(即，多肽)的部分。例如，抗體功能部分可以是賦予特異性的可變區(qū)和另外的恒定區(qū)/或者替換地為恒定區(qū)，即，F(xiàn)c，其可以活化補(bǔ)體(complement)和誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷。例如，細(xì)胞可以利用編碼GPCR家族一個或多個成員(例如，CCR5、CXCR4等)的基因轉(zhuǎn)染，該基因?qū)⑹怪|(zhì)體靶向包括自身免疫性疾病和病毒疾病(例如HIV/AIDS)在內(nèi)的大量細(xì)胞病狀。為了在真核(例如，哺乳動物)細(xì)胞中表達(dá)外源感興趣的基因，優(yōu)選將編碼感興趣的基因的多核苷酸序列連接到適合于真核細(xì)胞表達(dá)的核酸構(gòu)建體中。此種核酸構(gòu)建體包括用于指導(dǎo)該多核苷酸序列在細(xì)胞中以組成型或誘導(dǎo)型方式轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。適合于本發(fā)明使用的用于哺乳動物表達(dá)的組成型啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下和在大多數(shù)類型的細(xì)胞如巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)中有活性的啟動子序列。適合于本發(fā)明使用的誘導(dǎo)型啟動子包括例如，四環(huán)素可誘導(dǎo)的啟動子的誘導(dǎo)型啟動子(ZabalaM等人，CancerRes.2004，64(8)：2799-804)。本發(fā)明核酸構(gòu)建體(在本文也稱為“表達(dá)載體”)包括使這種載體適合于在原核生物、真核生物或優(yōu)選二者(例如，穿梭載體)中復(fù)制和整合的另外序列。另外，典型的克隆載體還可以包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子以及多腺苷酸化信號。舉例來說，此種構(gòu)建體通常包括5′LTR、tRNA結(jié)合位點、包裝信號、第二鏈DNA合成起點，以及3′LTR或其部分。本發(fā)明核酸構(gòu)建體通常包括指導(dǎo)翻譯的多肽到達(dá)膜的信號序列，另外包括膜錨定結(jié)構(gòu)域如跨膜結(jié)構(gòu)域或基于脂質(zhì)的錨(anchor)(例如GPI)。真核啟動子通常包含兩種類型的識別序列，TATA框和上游啟動子元件。TATA框，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的25-30位堿基對處，被認(rèn)為參與指導(dǎo)RNA聚合酶開始RNA的合成。其它上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始速率。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸構(gòu)建體利用的啟動子在轉(zhuǎn)化的特異細(xì)胞群體中有活性。細(xì)胞類型特異性和/或組織特異性啟動子的實例包括這樣的啟動子如肝特異性白蛋白[Pinkert等人，(1987)GenesDev.1：268-277]、淋巴特異性啟動子[Calame等人，(1988)Adv.Immunol.43：235-275]；特別是T細(xì)胞受體啟動子[Winoto等人，(1989)EMBOJ.8：729-733]和免疫球蛋白[Banerji等人(1983)Cell33729-740]；神經(jīng)元特異性啟動子如神經(jīng)微絲(neurofilament)啟動子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477]、胰腺特異性啟動子[Edlunch等人(1985)Science230：912-916]或乳腺特異性啟動子如乳清(milkwhey)啟動子(美國專利No.4,873,316和歐洲申請公開No.264,166)。與同源或異源啟動子連接時，增強(qiáng)子元件可刺激轉(zhuǎn)錄提升至1,000倍。增強(qiáng)子在處于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或者下游的時候具有活性。源自病毒的許多增強(qiáng)子元件具有寬廣的宿主范圍，并在多種組織中有活性。例如，SV40早期基因增強(qiáng)子適合于許多細(xì)胞類型。適合于本發(fā)明的其它增強(qiáng)子/啟動子組合包括源自多瘤病毒、人或鼠巨細(xì)胞病毒(CMV)的那些，以及來源于各種逆轉(zhuǎn)錄病毒如鼠白血病病毒、鼠或Rous肉瘤病毒和HIV的長末端重復(fù)序列。參見EnhancersandEukaryoticExpression，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.1983，該文獻(xiàn)通過引用合并在此。在構(gòu)建表達(dá)載體時，優(yōu)選將啟動子與異源轉(zhuǎn)錄起始位點的距離設(shè)置成與該啟動子在自然環(huán)境下與轉(zhuǎn)錄起始位點的距離近似相同。然而，如本領(lǐng)域熟知的，在不損害啟動子功能的情況下可以對這個距離作出各種改變。也可將多腺苷酸化序列加入到表達(dá)載體中以便增加mRNA翻譯的效率。準(zhǔn)確高效的多腺苷酸化需要2個不同的序列元件：位于多腺苷酸化位點下游的GU或U富含序列，和位于上游核苷酸11-30之間的六個核苷酸高度保守序列AAUAAA。適合于本發(fā)明的終止和多腺苷酸化信號包括源自SV40的那些。除已描述的元件以外，本發(fā)明表達(dá)載體通常還可以包含其它旨在增大所克隆核酸的表達(dá)水平或使攜帶重組DNA的細(xì)胞易于鑒定的特定元件(specializedelement，專用元件)。例如，許多動物病毒包含促進(jìn)病毒基因組在容許細(xì)胞類型中進(jìn)行染色體外復(fù)制的DNA序列。攜載這些病毒復(fù)制子的質(zhì)?？梢杂坞x型復(fù)制(replicatedepisomally)，只要質(zhì)粒上攜帶的基因或宿主細(xì)胞基因組的基因能夠提供合適的因子即可。該載體可以包括或不包括真核復(fù)制子。如果存在真核復(fù)制子，則該載體可利用合適的可選擇標(biāo)記在真核細(xì)胞中擴(kuò)增。如果該載體不包含真核復(fù)制子，則無法進(jìn)行游離型擴(kuò)增。相反，重組DNA整合到工程細(xì)胞的基因組中，其中啟動子指導(dǎo)期望核酸的表達(dá)。本發(fā)明表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括如允許從單一mRNA如內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(IRES)翻譯幾種蛋白質(zhì)的另外多核苷酸序列和使啟動子嵌合多肽基因組整合的序列。哺乳動物的表達(dá)載體的實例包括，但不限于，可從Invitrogen獲得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可從Promega獲得的pCI，可從Strategene獲得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可從Clontech獲得的pTRES，以及它們的衍生物。也可以使用包含真核病毒如慢病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體。SV40載體包括pSVT7和pMT2。源自牛乳頭瘤病毒的載體包括pBV-1MTHA，且源自艾伯斯坦-巴爾病毒(EpsteinBarvirus)的載體包括pHEBO和p205。其它示例載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE，和允許蛋白質(zhì)表達(dá)在SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子(polyhedrinpromoter)或表現(xiàn)為對真核細(xì)胞中的表達(dá)有效的其它啟動子指導(dǎo)下進(jìn)行的任何其它載體。替換地，可以對細(xì)胞、膜、空胞或CDL(其中的任何一個可以是天然形式的或基因修飾的)進(jìn)行化學(xué)處理以便呈遞蛋白質(zhì)、糖、合成聚合物、肽或它們的任何組合。本文下面和后面實施例部分描述了用合成聚合物修飾膜的方法。此種化學(xué)連接可以在從活的培養(yǎng)或懸浮細(xì)胞到產(chǎn)生的CDL的任何階段下進(jìn)行。例如，也可以使CDL與可進(jìn)一步增強(qiáng)它們靶向和附連到腫瘤細(xì)胞的能力的葉酸鹽(酯)(folate)化學(xué)結(jié)合，已知腫瘤細(xì)胞相比良性細(xì)胞表達(dá)較高水平的葉酸鹽(酯)受體。根據(jù)另一個實例，也可以永久性地調(diào)節(jié)CDL從而使其具有正性更強(qiáng)的表面電荷，通過用陽離子、鹽或聚陽離子(例如聚乙烯亞胺和聚-L-賴氨酸)處理它們，使得它們具有正性更強(qiáng)的電荷從而更好地靶向腫瘤新生血管。也可以在CDL表面引入非自然材料，通過與可由良好界定的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和添加劑組成的其它脂質(zhì)體(例如，細(xì)胞來源或合成的脂質(zhì)體)融合(例如，PEG或清潔劑(去污劑)誘導(dǎo)的)實現(xiàn)。此種融合可以產(chǎn)生混合CDL，可用來使任何部分(例如，靶向、治療、診斷、致使隱形(stealth-rendering)的部分，等)結(jié)合到CDL上和改變它們的表面特性。脂質(zhì)體融合的進(jìn)一步指導(dǎo)參見實施例5。合成聚合物通常用來阻止或減少凝聚(coagulation)，增大分散性，降低與血液組分的相互作用，避開單核吞噬系統(tǒng)的非特異性攝取和在很大程度上延長顆粒循環(huán)時間，從而使該脂質(zhì)體具有通常稱為隱形特性的特性和特征或為長循環(huán)脂質(zhì)體。因此，顆粒表面處納米環(huán)境的pH也可能取決于這些分子的長度。有許多聚合物可以附連到脂質(zhì)上。通常用作脂質(zhì)修飾劑的聚合物包括，不局限于，聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、聚乳酸(也稱為多乳酸化合物(polylactide))、聚乙醇酸(也稱為聚乙交酯(聚乙醇酸交酯))、聚乳酸-聚乙醇酸的聚乙烯醇(apolylactie-polyglycolicacid′polyvinylalcohol)、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基乙基噁唑啉(polyllydroxyetlyloxazolille)、聚羥基丙基噁唑啉(solyhydroxypryloxazoline)、聚天冬酰胺(polyaspartarllide)、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲基醚、聚羥乙基丙烯酸酯、衍生化纖維素如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。所采用的聚合物可以為均聚物或者為嵌段或無規(guī)共聚物。衍生為脂質(zhì)聚合物的最常用市售脂質(zhì)是基于磷脂酰乙醇胺(PE)的那些，通常為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)?？杀槐景l(fā)明采用的脂質(zhì)聚合物的特異性家族包括其中PEG聚合物經(jīng)由氨基甲酸酯鍵連接到脂質(zhì)上的PEG-DSPE(具有不同長度的PEG鏈)，和聚乙二醇二硬脂酰甘油。該P(yáng)EG部分頭基的分子量優(yōu)選為約750Da～約20,000Da。更優(yōu)選地，該分子量為約750Da～約12,000Da，最優(yōu)選為約1,000Da～約5,000Da。兩種示例性DSPE-PEG為其中PEG分子量為2000Da和5000a的那些，它們在本文稱為DSPE-PEG(2000)(DSPE-PEG2k)和DSPE-PEG(5000)(DSPE-PEG5k)。也可以被本發(fā)明采用的脂質(zhì)聚合物的特異性家族包括C8和C16mPEG神經(jīng)酰胺(具有不同長度的PEG鏈)，其中PEG-神經(jīng)酰胺在PEG和神經(jīng)酰胺部分之間含有使該化合物容易代謝的酯鍵。該P(yáng)EG部分頭基的分子量優(yōu)選為約750Da～約2,000Da。更優(yōu)選地，該分子量為約2,000Da。常見脂質(zhì)體的常規(guī)插入后PEG化需要加熱或溶解在含有可能會損害表面蛋白質(zhì)并導(dǎo)致包封泄漏的溶液的清潔劑中。因此，CDL也可以通過下面描述的兩種方法或其組合進(jìn)行PEG化。首先，通過清潔劑透析將PEG化脂質(zhì)摻入空胞細(xì)胞膜(在制備CDL之前)制備PEG化CDL。接著，可以利用琥珀酰亞胺基琥珀酸酯活化的單甲氧基-PEG執(zhí)行CDL的直接PEG化，這種PEG化已被證明可增大轉(zhuǎn)染效率和降低血清介導(dǎo)的用作基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的PEG化慢病毒顆粒失活16?？梢圆捎梅堑鞍踪|(zhì)組分(例如，合成聚合物、碳水化合物等)與脂質(zhì)體表面的化學(xué)結(jié)合。因而，可以利用本領(lǐng)域已知的任何連接或結(jié)合方法和/或任何合適的化學(xué)連接子，使非蛋白質(zhì)部分共價或非共價連接到、嵌入或吸附到脂質(zhì)體上。此種交聯(lián)劑及交聯(lián)方法的確切類型和化學(xué)性質(zhì)優(yōu)選適合于所用親和基團(tuán)的類型和脂質(zhì)體的性質(zhì)。結(jié)合或吸附或連接酶和/或靶向部分的方法在本領(lǐng)域中也是熟知的。例如，酶和/或靶向部分可以在界面附連到基團(tuán)上，通過，但不局限于，極性基團(tuán)如氨基、SH、羥基、醛、甲?；?、羧基、His-標(biāo)簽或其它多肽。另外，酶和/或靶向部分可以通過，但不局限于活性基團(tuán)如琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、氰尿酰氯、甲苯磺?；罨幕鶊F(tuán)、咪唑基、CNBr、NHS、活化的CH、ECH、EAH、環(huán)氧基、硫丙基、活化的硫醇等附連。而且，酶和/或靶向部分可以通過，但不局限于可以包括或不包括交聯(lián)劑(例如，二價陰離子、聚陰離子、聚陽離子等)的疏水鍵(范德華力)或靜電相互作用附連。一旦細(xì)胞來源可用，就制備脂質(zhì)體。因而，提供了生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，包含：(a)將細(xì)胞置于低滲條件下，以便獲得破裂的細(xì)胞膜和/或空胞細(xì)胞(也稱為空胞(ghost))；和(b)使破裂的細(xì)胞膜和/或空胞均質(zhì)化從而產(chǎn)生脂質(zhì)體。該方法可以利用本領(lǐng)域中其它廣為接受的方案實施，如下面文獻(xiàn)中描述的并加以修改或未加以修改的那些：Boone，C.W.，F(xiàn)ord，L.E.，Bond，H.E.，Stuart，D.C.&Lorenz，D.IsolationofplasmamembranefragmentsfromHeLacells.JCellBiol41，378-392(1969)；和WestermanandJensenMethodsEnzymol.2003；373：118-27(其中的每篇文獻(xiàn)都通過引用合并在此)。如本文使用的術(shù)語“空胞”是指，所有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容和/或細(xì)胞核都通過細(xì)胞裂解和/或膜破裂除去以便僅殘留其外面的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜的細(xì)胞；和不受特定方案束縛，在特定實施方式中建議本發(fā)明脂質(zhì)體以分步方式制備。首先，主要利用低滲處理從細(xì)胞(109個細(xì)胞)中分離質(zhì)膜，使得細(xì)胞破裂和空胞細(xì)胞形成。替換地，空胞細(xì)胞可以利用溫和超聲波法、凍融法、弗氏壓碎器(French-press)、針通過(needle-passaging)或含清潔劑溶液溶解法形成。根據(jù)具體實施方式，低滲處理在Tris-鎂緩沖液(例如，在4℃下pH7.4或pH8.6，用HCl調(diào)節(jié)pH)中進(jìn)行。通過位相顯微術(shù)(相差顯微檢查，phase-contrastmicroscopy)監(jiān)視細(xì)胞溶脹(cellswelling)。一旦細(xì)胞溶脹并有空胞形成，就將懸浮液放入均質(zhì)機(jī)。通常，約95％細(xì)胞破碎已足夠。然后將膜/空胞放入蔗糖(0.25M或更高)中保存。為了避免粘附，將空胞放入塑料管中并進(jìn)行離心。產(chǎn)生層疊球粒(laminatedpellet)，其中最上面較淺的灰色層僅由空胞組成。但為了增大產(chǎn)量對全部球粒加以處理。離心(例如，4℃下以3,000rpm離心15min)和洗滌(例如，20體積的Tris鎂/TM-蔗糖pH7.4)可以重復(fù)進(jìn)行。在下一個步驟中，通過在不連續(xù)的蔗糖密度梯度中浮選(floatation)分離空胞組分。將少量過量的上清液置于洗滌的球粒上，該球粒此時包含空胞、細(xì)胞核和不完全破裂的全細(xì)胞。在懸浮液中另外加入pH為8.6的含60％w/w蔗糖的TM從而在折射計(refractometer)上給出45％蔗糖的讀數(shù)。這個步驟之后，所有溶液都含有pH8.6的TM。將15ml懸浮液放入SW-25.2硝酸纖維素管，并通過加入分別由40％和35％w/w蔗糖組成的15ml層，然后加入5mlTM-蔗糖(0.25M)在該懸浮液上形成不連續(xù)梯度。此時在4℃下以20,000rpm離心該材料10min。細(xì)胞核沉積物形成球粒，不完全破裂的全細(xì)胞聚集在40％-45％界面處，空胞聚集在35％-40％界面處。收集空胞并匯集在一起。在下一個步驟，通過超聲處理使空胞均質(zhì)化，超聲處理后可以接著進(jìn)行擠出。具體的超聲處理方案涉及利用振幅設(shè)置(amplitude)為8，帶有微探針的MSE超聲處理器(InstrumentationAssociates，N.Y.)超聲處理5秒。這個短暫的超聲處理時間足以使空胞質(zhì)膜分解為細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL)。在這些特定條件下，細(xì)胞器膜未被破壞并通過離心(3,000rpm，15min4℃)除去。然后通過在連續(xù)蔗糖密度梯度中沉積純化質(zhì)膜囊泡(CDL)。包含本發(fā)明一種或多種藥劑的脂質(zhì)體的尺寸范圍優(yōu)選為20-1000nm例如，30-1000nm、0.02-1.0μm，更優(yōu)選0.05-1.0μm，更優(yōu)選0.07-0.5μm且更優(yōu)選0.1-0.3μrn。較小或約0.2μm的脂質(zhì)體的優(yōu)點在于，它們?nèi)菀诐B透通過腫瘤血管系統(tǒng)(由于EPR效應(yīng))，它們不容易被巨噬細(xì)胞攝取且它們可以經(jīng)受過濾滅菌。通過市售聚碳酸酯膜(例如，購自華盛頓Sterlitech)或購自法國PallExecia的不對稱陶瓷膜(例如，Membralox)擠出脂質(zhì)體是將脂質(zhì)體尺寸減小到相對明確限定的尺寸分布的有效方法。通常，使該懸浮液通過該膜循環(huán)一次或多次直至獲得期望的脂質(zhì)體尺寸分布。可以通過連續(xù)變小孔隙的膜(例如，孔隙尺寸為400nm、100nm和/或50nm)擠出脂質(zhì)體從而使脂質(zhì)體尺寸逐漸減小并獲得均勻分布。在均質(zhì)化、超聲處理和/或擠出之前的任何步驟，即，通常在空胞制備之后，將藥劑加入反應(yīng)混合物中以便所形成的脂質(zhì)體包封該藥劑。如本文使用的短語“藥劑”是指可用來治療或診斷醫(yī)學(xué)病況的治療劑或診斷劑。根據(jù)具體實施方式，當(dāng)細(xì)胞來源是間充質(zhì)干細(xì)胞時，包含藥劑和脂質(zhì)體的組合物是低免疫原性或非免疫原性的。因而，本發(fā)明脂質(zhì)體可以具有吸附到其表面上或者包封在其中，包封在脂質(zhì)體內(nèi)極性相內(nèi)或包封在層狀非極性脂質(zhì)相內(nèi)的藥劑。使分子(例如，靶向部分、藥劑、合成聚合物等)結(jié)合到脂質(zhì)體上的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。例如，可以基于疏水相互作用(范德華力結(jié)合)或靜電相互作用，利用或不利用交聯(lián)劑(例如，陰離子或聚陰離子)，使藥劑(或任何其它分子)附連、結(jié)合或吸附到脂質(zhì)體、空胞或脂質(zhì)體來源于其中的細(xì)胞表面上。可以利用或不利用清潔劑和/或通過清潔劑透析(detergentdialysis)，使疏水和/或兩性藥劑(或任何其它疏水和/或兩性分子)溶解、部分溶解或分配(partition)到細(xì)胞、空胞或脂質(zhì)體脂質(zhì)膜中。藥劑(或任何其它分子)可以基于與活性基團(tuán)形成的共價鍵附連、結(jié)合或吸附到脂質(zhì)體、空胞或者脂質(zhì)體來源于其中的細(xì)胞的表面上。藥劑可以附連、結(jié)合或吸附到該脂質(zhì)體、空胞或者細(xì)胞的表面上，作為被在脂質(zhì)體、空胞或細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的天然部分特異性識別的抗體或其部分的結(jié)合物。例如，藥劑可以通過但不局限于下面這些基團(tuán)吸附到脂質(zhì)體表面(內(nèi)部或外部)：極性基團(tuán)如氨基、SH、羥基、醛、甲?；?、羧基、His-標(biāo)簽或其它多肽。另外，藥劑可以通過，但不局限于活性基團(tuán)如琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、氰尿酰氯、甲苯磺酰基活化的基團(tuán)、咪唑基、CNBr、NHS、活化的CH、ECH、EAH、環(huán)氧基、硫丙基、活化的硫醇等附連。包埋在脂質(zhì)體內(nèi)，吸附、表達(dá)、結(jié)合、附連和/或溶解在脂質(zhì)體表面或膜上的治療劑是通過，但不局限于下列機(jī)制中的一種或多種機(jī)制遞送到靶細(xì)胞和/或組織中：藥劑通過脂質(zhì)體和細(xì)胞之間膜融合的直接細(xì)胞內(nèi)遞送，和/或脂質(zhì)體通過內(nèi)吞作用、吞噬作用或任何一種跨膜運(yùn)送機(jī)制被攝取。藥劑從脂質(zhì)體擴(kuò)散和/或泄漏，并隨后結(jié)合到靶細(xì)胞/組織的表面，和/或通過擴(kuò)散、內(nèi)吞作用、吞噬作用或通過任何一種跨膜運(yùn)送機(jī)制被靶細(xì)胞/組織攝取。永久性、連續(xù)性或短暫性表達(dá)、附連、吸附、結(jié)合和/或溶解在脂質(zhì)體表面或膜上的藥劑結(jié)合到靶細(xì)胞和/或組織的表面。多種治療劑可以包埋在脂質(zhì)囊泡中，包括可以穩(wěn)定地包封在脂質(zhì)體水性隔室中的水溶性藥劑、穩(wěn)定分配在該囊泡的液相中的親脂性化合物，或可以例如通過靜電、共價或疏水相互作用穩(wěn)定或短暫附連、結(jié)合、吸附或表達(dá)在脂質(zhì)體外表面或內(nèi)表面上的藥劑。示例水溶性化合物包括小分子(即，低于1000道爾頓)或大分子(例如，超過1000道爾頓)、生物分子(例如，蛋白質(zhì)性分子，包括但不局限于肽、多肽、翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、抗體等)或核酸分子(例如，雙鏈DNA、單鏈DNA、ds/ssRNA(例如，siRNA、反義、核酶)，或三螺旋核酸分子或化學(xué)物。治療劑可以是源自任何已知生物(包括但不局限于動物、植物、細(xì)菌、真菌、原生生物或病毒)或源自合成分子文庫的天然產(chǎn)物。治療劑可以是單體化合物和多聚體化合物。如上所述，該治療劑可以是蛋白質(zhì)，如補(bǔ)償內(nèi)源性酶，如不足會導(dǎo)致Tay-Sachs病的酶己糖胺酶A的活性降低或表達(dá)低下的酶?？梢源┻^血屏障遞送到腦、眼、睪丸或乳腺的治療劑實例包括，但不局限于，抗生素藥劑、抗腫瘤藥劑、消炎藥劑、抗寄生蟲藥劑、抗真菌藥劑、抗分支桿菌藥劑、抗病毒藥劑、抗凝血劑、放射治療劑、化療藥劑、細(xì)胞毒性藥劑、細(xì)胞生長抑制劑、血管擴(kuò)張劑、抗氧化劑、興奮劑、抗驚厥劑、抗組胺劑、神經(jīng)營養(yǎng)藥劑、心理治療劑、抗焦慮鎮(zhèn)靜劑、刺激劑、鎮(zhèn)靜劑、鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、節(jié)育劑、神經(jīng)遞質(zhì)藥劑、神經(jīng)遞質(zhì)模擬劑(neurotransmitteranalogagent)、凈化劑(scavengingagent)和生育增強(qiáng)劑。脂質(zhì)體包埋的化合物也可以是診斷劑如顯像劑或造影劑(contrastagent)如銦和锝，酶如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶，含有釓的MRI造影介質(zhì)，含有碘的X射線造影介質(zhì)，超聲造影介質(zhì)(ultrasonographycontrastmedia)如CO2，銪衍生物，熒光物質(zhì)如羧基熒光素和照明劑(發(fā)光體，illuminant)如N-甲基吖啶鹽(N-methylacrydium)衍生物。一旦形成脂質(zhì)體(即，帶有或不帶有藥劑)，就可以對它們的尺寸分布、組成、濃度、Z電位、表面電位(electricalsurfacepotential)、表面(局部)pH、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比率，以及體外和體內(nèi)的治療功效進(jìn)行表征。本發(fā)明實驗測試的脂質(zhì)體具有下表2中描述的下列尺寸值：表2空脂質(zhì)體或者包含本發(fā)明一種或多種藥劑的脂質(zhì)體的尺寸范圍優(yōu)選為30-3000-nm，更優(yōu)選50-500nm，更優(yōu)選30-300nm，更優(yōu)選50-200nm，且更優(yōu)選70-150nm。較小或約100-nm的脂質(zhì)體的優(yōu)點在于它們能夠滲透通過非常狹窄的血管，這對于診斷和治療非常重要?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法測定脂質(zhì)體的尺寸。例如，可以使用利用激光光散射的NicompSubmicronParticleSizer(370型號，Nicomp，SantaBarabara，Calif.)。測量脂質(zhì)體尺寸的其它方法包括光子相關(guān)光譜法、激光衍射法、小角激光光散射法(LALLS)、中角激光光散射法(MALLS)、光阻法(lightobscuration)(例如Coulter法)、流變學(xué)，或顯微術(shù)(光或電子)。優(yōu)選的有效平均顆粒尺寸取決于這些因素，如該化合物的預(yù)期給予途徑、劑型(formulation)、溶解性、毒性和生物利用率。下面提供了實驗測試的脂質(zhì)體的Z電位值。未PEG化的CDL：-17.9～-15.5mV。PEG化(空胞-間接)：-13.2mV。PEG化(CDL-直接)：-10.2mV。因而，本發(fā)明脂質(zhì)體的特征為：其在未PEG化時的z電位為-20～-15mV，其在PEG化時的Z電位為-15～-10mV。如所述的，本發(fā)明脂質(zhì)體有利地用于臨床中。因而，根據(jù)本發(fā)明的方面提供了遞送藥劑的方法，該方法包含給需要其的對象給予上述脂質(zhì)體，其中該藥劑包封在其中或者吸附在其上，從而遞送該藥劑。根據(jù)實施方式，該細(xì)胞是靶細(xì)胞，且該脂質(zhì)體包含靶向部分，該靶向部分是如上所述化學(xué)結(jié)合的、異源添加的，或自然存在于脂質(zhì)體由其構(gòu)成的膜中(例如，如在向腫瘤細(xì)胞遷移的MSC中)。該脂質(zhì)體的細(xì)胞來源可以是對象自體或非自體的(例如，異體、異種)。本文提到的“靶細(xì)胞”是將利用脂質(zhì)體向其中遞送物質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞簇(同源或異源群體的細(xì)胞簇)和/或組織。其實例包括癌細(xì)胞、血管新生癌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、癌癥組織的間質(zhì)細(xì)胞、受累于遺傳異常的細(xì)胞、受病原體感染的細(xì)胞等?！鞍蟹肿印笨梢允浅蔬f在靶細(xì)胞或與靶細(xì)胞相鄰的細(xì)胞表面上的任何分子。靶分子的另一種形式包括由細(xì)胞釋放的分子。其實例包括細(xì)胞外基質(zhì)組分、癌細(xì)胞或癌組織間質(zhì)細(xì)胞的分泌物或架構(gòu)(architecture)，且其具體實例包括腫瘤標(biāo)記、細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)等。遞送可以出于診斷原因(例如，該脂質(zhì)體包括診斷劑)或出于治療目的(即，作為遞送治療劑的藥物遞送工具)。該脂質(zhì)體可以單獨(dú)(自身)地或者作為藥物組合物的一部分給予給對象。如本文使用的“藥物組合物”是指含有本文描述的一種或多種活性成分和其它化學(xué)組分如生理上適合的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的在于使活性成分容易給予對象。本文的術(shù)語“活性成分”是指可引起生物效應(yīng)的治療劑(帶有或不帶有脂質(zhì)體)。應(yīng)理解，該脂質(zhì)體本身可以具有免疫調(diào)節(jié)功能，如當(dāng)由MSC膜或其它免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如，免疫B和T淋巴細(xì)胞等)制備時。還應(yīng)理解，由于與靶細(xì)胞膜融合以及隨后對細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架和功能造成破壞，該脂質(zhì)體本身可以對靶細(xì)胞有細(xì)胞毒效應(yīng)。在此種情況下，采用加入靶向部分的措施以便使該細(xì)胞毒效應(yīng)變得有特異性。下文中，短語“生理可接受載體”和“藥物可接受載體”可以互換使用，是指不會給對象造成顯著的刺激性而且不會消除所給予活性成分的生物活性和特性的載體或稀釋劑。佐劑包含在這些術(shù)語中。本文中，術(shù)語“賦形劑”是指加入到藥物組合物中從而進(jìn)一步使本發(fā)明活性成分容易給予或者增大保存期穩(wěn)定性的惰性物質(zhì)。賦形劑的實例包括，但不局限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類和鹽類及各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、EDTA、EGTA、聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚凝胺(polybrene)(溴化己二甲胺)、聚乙二醇和其它聚或單一陰離子。該藥物組合物可以有利地采用泡沫、氣溶膠或凝膠形式。藥物的調(diào)配和給予技術(shù)可以在“Remington’sPharmaceuticalSciences，”MackPublishing公司，Easton，PA，最新版中找到，該文獻(xiàn)通過引用合并在此。合適的給予途徑包含各種合適的全身和/或局部給予途徑中的任一種。合適的給予途徑可以，例如包括吸入、口服、頰部、直腸、經(jīng)粘膜、外用、經(jīng)真皮、真皮內(nèi)、經(jīng)鼻、腸和/或腸胃外途徑；肌內(nèi)、皮下和/或髓內(nèi)注射途徑；鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)和/或眼內(nèi)注射途徑、利用或不利用血管造影球囊(angioballoon)的導(dǎo)管插入術(shù)(Catheterization)，和/或直接注射到對象組織區(qū)域中的途徑。該藥物組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的工藝制造，如通過常規(guī)的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉(levigating)、乳化、制成膠囊、包埋或冷凍干燥(凍干)工藝。根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可采用常規(guī)方法利用一種或多種使活性成分容易加工成可以藥用的制品、包含賦形劑(excipient)和輔助物(輔劑，auxiliary)在內(nèi)的生理可接受載體調(diào)配。合適的劑型取決于所選的給予途徑。對于注射，該藥物組合物的活性成分可以調(diào)配在水溶液中，優(yōu)選在生理相容性緩沖液如漢克溶液、林格氏溶液，或生理鹽緩沖液中。對于經(jīng)粘膜給予，在配方中使用適合于待滲透屏障的穿透劑(penetrant)。此種穿透劑一般在本領(lǐng)域中是已知的。對于口服給予，該藥物組合物可以容易地通過將活性成分與本領(lǐng)域熟知的藥物可接受載體結(jié)合而調(diào)配。此種載體使該藥物組合物能夠調(diào)配成供病人口服攝取的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、漿液、混懸劑等?？诜褂玫乃幬镏破房衫霉腆w賦形劑制造，可選地研磨所得混合物，需要時可加入合適的輔助物并在此后對顆?；旌衔镞M(jìn)行處理，從而獲得片劑或糖衣核。合適的賦形劑為，特別是，填充劑如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纖維素制品如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂，或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。糖衣核(drageecore)具有合適的包衣。為此目的，可使用濃縮的糖溶液，其可以可選地包含阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蛏丶尤氲狡瑒┗蛱且峦璋轮?，以便鑒定或表征不同的活性化合物劑量組合?？煽诜褂玫乃幬锝M合物，包括明膠制成的推入配合膠囊(push-fitcapsule)，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。推入配合膠囊可包含與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉、潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂，和可選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性成分可以溶解于或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。另外，可加入穩(wěn)定劑。所有口服給予的制劑的劑量應(yīng)適合于所選的給予途徑。對于頰部給予，該組合物可采用按常規(guī)方法調(diào)配的片劑或含片的形式。對于通過吸入途徑給予，根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分可以氣溶膠/噴霧形式遞送，該氣溶膠/噴霧是從加壓包或噴灑器，借助于合適的拋射劑(推進(jìn)劑，propellant)，例如氟氯烴如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，二氧化碳，或揮發(fā)性烴如丁烷、丙烷、異丁烷或其混合物呈遞的。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可通過提供用于遞送計量的量的閥門確定?？蓪⒂迷诜峙淦髦械睦缑髂z制成的膠囊和藥筒(cartridge)，調(diào)配成包含該活性成分與合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。該藥物組合物可以調(diào)配用于腸胃外給予，例如通過推注或連續(xù)輸注給予。注射用制劑可以單位劑量的形式呈遞，如，在安瓿或在多劑量容器中，其中可選地加入防腐劑。該組合物可以是油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液，或乳液，并可包含調(diào)配劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑，和/或分散劑。用于腸胃外給予的藥物組合物可以包括水溶性形式的活性成分水溶液。另外，可將該活性成分的懸浮液配制成適當(dāng)?shù)挠托曰蚧谒淖⑸鋺腋∫?。合適的親脂溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可包含增大懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇，或葡聚糖?？蛇x地，該懸浮液還可包含合適的穩(wěn)定劑或增大活性成分的溶解度從而允許制備高度濃縮的溶液的試劑。替換地，該活性成分可以是粉末形式，在使用前用合適的媒介物如無菌的基于無熱源水的溶液進(jìn)行配制。該藥物組合物還可利用如常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可豆油或其它甘油酯，調(diào)配成直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑(retentionenemas)。該藥物組合物應(yīng)包含對治療疾病有效的量的活性成分。治療有效量的確定完全在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是在閱讀本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容之后。對于本發(fā)明方法中使用的任何制劑，治療有效量或劑量可以根據(jù)體外和細(xì)胞培養(yǎng)物和體內(nèi)分析加以評價。例如，可以在動物模型中調(diào)配劑量從而獲得期望的濃度或滴度(滴定度，titer)。此種信息可以用于更準(zhǔn)確地確定對人有用的劑量。本文描述的活性成分的毒性和治療效能可通過體外、細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)藥物程序來確定。可利用從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)物分析及動物研究中獲得的數(shù)據(jù)，調(diào)配用于人的劑量范圍。該劑量可隨著采用的劑型和利用的給予途徑而改變。確切的制劑、給予途徑和劑量可由個人醫(yī)生根據(jù)患者的病況加以選擇(參見如Fingl等人，1975，″ThePharmacologicalBasisofTherapeutics″，Ch.1p.1)。劑量和時間間隔可單獨(dú)地調(diào)整從而為血漿或腦提供足以獲得期望治療效果的水平的活性成分(最低有效濃度，MEC)。對于每種制劑，MEC有所不同，但可根據(jù)體外數(shù)據(jù)評價。達(dá)到MEC所需的劑量取決于個體特征和給予途徑。可利用檢測試驗測定血漿濃度。根據(jù)受治療病況的嚴(yán)重性和反應(yīng)(responsiveness)，可進(jìn)行單劑量或多劑量給予，持續(xù)幾天至幾周的治療療程，或直到實現(xiàn)治愈或病情減輕。該組合物的給予量將取決于受治療對象、疼痛嚴(yán)重性、給予方式，處方醫(yī)生的判斷等。本發(fā)明組合物如果需要可放置在包裝或分配裝置，如FDA批準(zhǔn)的試劑盒中，其可包含含有活性成分的一種或多種單位劑量形式。該包裝可包含，例如，金屬或塑料箔，如泡罩包裝(blisterpack)。該包裝或分配器裝置還可附有給予說明。該包裝或分配器還可提供與該容器相關(guān)的由管理藥物制造、使用或銷售的政府部門所規(guī)定的形式的通知，該通知證明了該組合物的形式或人用或獸用已被政府部門批準(zhǔn)。此通知，例如，可以是美國食品和藥品管理局對于處方藥批準(zhǔn)的標(biāo)簽或者是已批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁。如本文使用的術(shù)語“約”是指±10％。術(shù)語“包含”、“包含的”、“包括”、“包括的”、“具有”，和它們的詞形變化形式意思是指“包括但不局限于”。術(shù)語“由……組成”是指“包括并限于”。術(shù)語“基本上由……組成”意思是指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括另外的成分、步驟和/或部分，但僅該另外的成分、步驟和/或部分不能實質(zhì)性地改變要求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本特征和新特征。如本文使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物，包括其混合物。在整篇專利申請中，本發(fā)明的各種實施方式可以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解范圍形式的描述僅是為了方便和簡潔，而不應(yīng)該理解為對本發(fā)明范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為已具體地公開了所有可能的子范圍以及在此范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，如從1至6的范圍描述應(yīng)視為已具體地公開了諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等的子范圍，以及在此范圍中的各個數(shù)值，例如，1、2、3、4、5，和6。不論范圍寬度如何，這都能適用。當(dāng)本文中指出了數(shù)值范圍時，其意在包括在所指范圍內(nèi)的任何提及數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。本文中的表達(dá)在第一個指定數(shù)和第二個指定數(shù)之間的“范圍”與從第一個指定數(shù)“至”第二個指定數(shù)的“范圍”可互換使用，意在包括第一和第二個指定數(shù)及其間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。如本文使用的術(shù)語“方法”是指用于完成給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和程序，包括但不限于，化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知，或易于從已知方式、方法、技術(shù)和程序開發(fā)出的那些方式、方法、技術(shù)和程序。如本文使用的術(shù)語“治療”包括消除、基本上抑制、減慢或逆轉(zhuǎn)病況的進(jìn)展，基本上改善病況的臨床或美學(xué)(aesthetical)癥狀或者基本上阻止病況的臨床或美學(xué)病況的出現(xiàn)。應(yīng)理解，為清楚起見而在單獨(dú)實施方式的上下文中描述的本發(fā)明某些特征，也可結(jié)合提供在單個實施方式中。相反，為簡潔起見而在單個實施方式的上下文中描述的本發(fā)明的多種特征，也可單獨(dú)地或以任何合適的子組合形式，或作為適合于本發(fā)明的任何其他被描述的實施方式提供。在各個實施方式的上下文中描述的某些特征不應(yīng)被認(rèn)為是這些實施方式的必需特征，除非這些實施方式?jīng)]有這些元素(元件)時是無效的。如上文所描繪的和如下面權(quán)利要求部分所要求保護(hù)的本發(fā)明的各種實施方式和方面將在下面的實施例中找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參考下面的實施例，結(jié)合上面的描述以非限制方式闡述本發(fā)明的一些實施方式。一般地，本文使用的術(shù)語和本發(fā)明利用的實驗操作程序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)，和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見，例如，″MolecularCloning：AlaboratoryManual″Sambrook等人，(1989)；″CurrentProtocolsinMolecularBiology″卷I-IIIAusubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，″CurrentProtocolsinMolecularBiology″，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″APracticalGuidetoMolecularCloning″，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等人，″RecombinantDNA″，ScientificAmericanBooks，NewYork；Birren等人(eds)″GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries″，卷1-4，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)；如美國專利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法；″CellBiology：ALaboratoryHandbook″，卷I-IIICellis，J.E.，ed.(1994)；″CurrentProtocolsinImmunology″卷I-IIIColiganJ.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，″BasicandClinicalImmunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；MishellandShiigi(eds)，″SelectedMethodsinCellularImmunology″，W.H.FreemanandCo.，NewYork(1980)；可用的免疫分析法詳述在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見，例如，美國專利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″OligonucleotideSynthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；″NucleicAcidHybridization″Hames，B.D.，andHigginsS.J.，eds.(1985)；″TranscriptionandTranslation″Hames，B.D.，andHigginsS.J.，Eds.(1984)；″AnimalCellCulture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″ImmobilizedCellsandEnzymes″IRLPress，(1986)；″APracticalGuidetoMolecularCloning″Perbal，B.，(1984)and″MethodsinEnzymology″卷1-317，AcademicPress；″PCRProtocols：AGuideToMethodsAndApplications″，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)；Marshak等人，″StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual″CSHLPress(1996)；其中的所有文獻(xiàn)都通過引用合并在此如同全部列出在此。其它一般性參考文獻(xiàn)遍及本文。其中的程序被認(rèn)為是本領(lǐng)域熟知的，僅為了便于讀者閱讀而提供。包含在其中的所有信息都通過引用合并在此。實施例1MSC遷移和靶向能力的表征(characterization)人MSC購自(瑞士)，并利用吉姆薩染色和人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)典型的細(xì)胞表面標(biāo)記的FACS分析進(jìn)行表征。如圖1A-1C所示，該細(xì)胞似乎對CD90、CD105、CD44和CD29呈陽性，而對CD133、CD31、CD34和CD144呈陰性，如對hMSC預(yù)期的一樣。還測試了hMSC朝向癌細(xì)胞遷移的能力。在這些實驗中，用紅色熒光染料(DiI)標(biāo)記hMSC，同時用綠色熒光染料(DiO)標(biāo)記數(shù)種其它細(xì)胞系(包括前列腺癌細(xì)胞系-PC3)。將標(biāo)記的細(xì)胞逐滴接種于組織培養(yǎng)板中，溫育72小時并利用Maestro體內(nèi)顯像儀(invivoImager)顯像(圖2)。如所看到的，表明hMSC朝向PC3癌細(xì)胞特異性遷移，同時“避開”與其它細(xì)胞系(BHK、Cf2Th和COS-7)相互作用。另外進(jìn)行了驗證調(diào)整hMSC對乳腺癌細(xì)胞系MCF7的靶向能力的實驗。對此，人hMSC用或不用MCF7來源的調(diào)整培養(yǎng)基培養(yǎng)，用DiI(紅色)標(biāo)記，并與用DiO(綠色)標(biāo)記的MCF7細(xì)胞一起共培養(yǎng)。溫育2小時后，洗滌培養(yǎng)物，利用熒光顯微鏡圖像分析測定每種細(xì)胞類型和細(xì)胞重疊(細(xì)胞覆層，celloverlay)(黃色)的覆蓋范圍。假設(shè)DiI與DiO的重疊是由于這兩種細(xì)胞類型的物理相互作用引起的，那么重疊百分比可以代表這兩種細(xì)胞類型的膜相互作用量。如圖3所示，調(diào)整hMSC與MCF7細(xì)胞一起溫育將導(dǎo)致總細(xì)胞覆蓋范圍中有7％重疊(覆層，overlay)，相比之下，在利用未調(diào)整hMSC時無重疊發(fā)生(p＜0.001)。這種明顯的靶向性顯然不同于圖2中描述的遷移，因為它主要由hMSC與癌細(xì)胞之間的膜相互作用控制，而不依據(jù)很大程度上受可溶性因子介導(dǎo)的hMSC的遷移能力。實施例2從hMSC制備的細(xì)胞來源的脂質(zhì)體表征細(xì)胞來源的脂質(zhì)體制備-收獲約107個細(xì)胞，用PBS洗滌。然后通過將細(xì)胞在4℃下重懸于冰冷的pH7.4Tris-鎂(TM緩沖液，0.01MTris，0.001MMgCl2)中15min，對該細(xì)胞進(jìn)行低滲處理。低滲處理后，用定轉(zhuǎn)子機(jī)械均質(zhì)機(jī)(rotor-statormechanicalhomogenizer)(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均質(zhì)化細(xì)胞1min，使該細(xì)胞變成空胞(通過位相顯微術(shù)證實95％的細(xì)胞膜破裂)。為了使空胞懸浮液穩(wěn)定，立即在該懸浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液從而使終濃度為0.25M或按體積計為10％。然后4℃下以3000rpm離心空胞15min。棄去上清液，用含0.25M蔗糖的pH7.4TM緩沖液洗滌空胞球粒兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。為了獲得超聲處理的空胞，將重懸的球粒用VibraCellVCX750(Sonics&MaterialsInc.，Newtown，CT)以27％的振幅超聲處理5秒，并在4℃下以3000rpm離心15min。超聲處理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH8.6TM緩沖液洗滌兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。為了形成單層脂質(zhì)體，手動使超聲處理的空胞重懸球粒連續(xù)21次通過孔隙尺寸為0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(OsmonicsInc.，MinnesotaUSA)擠出。所擠出的脂質(zhì)體然后在4℃下以150,000g離心45min。棄去上清液，用pH8.6的TM緩沖液重懸所得脂質(zhì)體球粒。細(xì)胞來源的脂質(zhì)體表面蛋白質(zhì)PEG化(根據(jù)Croyle，M.A.等人，2004描述的方法)-收獲約107個細(xì)胞，用PBS洗滌。然后通過將細(xì)胞在4℃下重懸于冰冷的pH7.4Tris-鎂(TM緩沖液，0.01MTris，0.001MMgCl2)中15min，對該細(xì)胞進(jìn)行低滲處理。低滲處理后，用定轉(zhuǎn)子機(jī)械均質(zhì)機(jī)(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均質(zhì)化細(xì)胞1min，使該細(xì)胞變成空胞(通過位相顯微術(shù)證實95％的細(xì)胞膜破裂)。為了使空胞懸浮液穩(wěn)定，立即在該懸浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液從而使終濃度為0.25M或按體積計為10％。然后4℃下以3000rpm離心空胞15min。棄去上清液，用含0.25M蔗糖的pH7.4TM緩沖液洗滌空胞球粒兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。為了獲得超聲處理的空胞，將重懸的球粒用VibraCellVCX750(Sonics&MaterialsInc.，Newtown，CT)以27％的振幅超聲處理5秒，并在4℃下以3000rpm離心15min。超聲處理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH8.6TM緩沖液洗滌兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。為了形成單層脂質(zhì)體，手動使超聲處理的空胞重懸球粒連續(xù)21次通過孔隙尺寸為0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(OsmonicsInc.，MinnesotaUSA)擠出。所擠出的脂質(zhì)體然后在4℃下以150,000g離心45min。棄去上清液，用pH8.6的TM緩沖液重懸所得脂質(zhì)體球粒。利用Bradford蛋白質(zhì)分析法測定該脂質(zhì)體表面上的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)。琥珀酰亞胺基琥珀酸酯活化的單甲氧基-PEG得自SigmaChemicals(St.Louis，Mo.)，將它以與前面利用Bradford分析法測得的脂質(zhì)體蛋白質(zhì)含量10∶1的比例加入到該重懸的脂質(zhì)體中。例如，每1μg蛋白質(zhì)加入10μg單甲氧基-PEG。在25℃通過輕輕地攪動進(jìn)行單甲氧基-PEG與脂質(zhì)體之間的結(jié)合反應(yīng)。通過加入相對于所加入單甲氧基-PEG量的10X的L-賴氨酸(SigmaChemicals)終止反應(yīng)。在用pH8.6的TM緩沖液平衡的Micro-BioSpinP-30色譜柱(Bio-Rad)上，通過更換緩沖液除去未反應(yīng)的游離PEG、過量的賴氨酸和反應(yīng)副產(chǎn)物。CDLFACS分析.材料-耦合緩沖液-用于預(yù)先洗滌和使DynabeadsM-280結(jié)合到脂質(zhì)體上。該緩沖液由0.1MpH7.4的鈉磷酸鹽緩沖液，溶解在蒸餾水中并調(diào)節(jié)至1升的2.62gNaH2PO4xH2O(MW137.99)和14.42gNa2HPO4x2H2O(MW177.99)組成。洗滌、封閉和儲存緩沖液-含有0.1％(w/v)BSA的pH7.4的PBS：在80ml0.01MpH7.4的鈉磷酸鹽中加入0.88gNaCl(MW58.4)和0.1％(w/v)BSA。充分混合并用0.01MpH7.4的鈉磷酸鹽(Na-phosphate)調(diào)節(jié)體積至100ml。方法：按前面描述的方法從2x107個hMSC制得脂質(zhì)體。使用甲苯磺酰基活化的順磁M-280(invitrogen)，因為它們可以與任何蛋白質(zhì)和/或與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂質(zhì)體非特異性地共價結(jié)合，而且稍后可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。利用磁力分離設(shè)備(MACS，DynalTMMagneticParticleSeparator-Invitrogen)，用耦合緩沖液(couplingbuffer)洗滌該珠粒。為了增大它們與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，然后進(jìn)一步用添加到耦合緩沖液中的3M硫酸銨洗滌該珠粒。然后，準(zhǔn)備4個含有107個珠粒的樣品，分別為：僅珠粒、珠粒與脂質(zhì)體、珠粒與第二抗體標(biāo)記的脂質(zhì)體(同種型對照)，以及與用第一抗體和第二抗體標(biāo)記的脂質(zhì)體結(jié)合的珠粒(測試樣品)。在每個樣品中添加約5x106個細(xì)胞等效脂質(zhì)體。然后在4℃下溫育脂質(zhì)體和珠粒至少12小時。附連后，將樣品重懸在洗滌\封閉緩沖液中。將每個樣品懸浮在200μl總體積中。首先，將小鼠MAB抗人CD29、CD44、CD90或CD105以1∶100的比率加入到合適的樣品中。RT下溫育樣品30min。接著，利用磁力設(shè)備洗滌樣品兩次。然后加入第二AB(FITC-結(jié)合的山羊抗小鼠抗體)并在RT下避光溫育樣品30min。所有抗體，第一抗體和第二抗體都購自BD-Becton，DickinsonandCompany。如前所述洗滌樣品后，對樣品進(jìn)行電泳(run)并利用FACSCalibur和CellQuestPro(BD)進(jìn)行分析。結(jié)果預(yù)期PEG化細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(PEG-CDL)將受到保護(hù)而免遭調(diào)理(opsonization)和降解，因而具有隱形特性(stealthproperty)和較長的體內(nèi)循環(huán)時間。而且，PEG化可以降低脂質(zhì)體與非靶細(xì)胞一樣以非特異性方式結(jié)合和融合的風(fēng)險17-19。CDL的低溫TEM顯像表明，PEG化對CDL的理想小單層形態(tài)沒有明顯影響(圖4A-4B)。然而，與在相同濃度和在相同條件下顯像的未PEG化脂質(zhì)體(圖4B)相比，PEG化脂質(zhì)體(圖4A)的分散性似乎更大，而凝聚性似乎更小。明顯地，PEG化不但不會損壞脂質(zhì)體的形態(tài)，而且它還可以提高它們的分散性和穩(wěn)定性。利用數(shù)量重量和體積重量DLS分析(DynamicLightScattering，MalvernNanosize)進(jìn)一步分析CDL的尺寸和尺寸分布。雖然數(shù)量重量DLS分析(圖5A)表明PEG化之后脂質(zhì)體的尺寸增大(從～30nm增大至-100nm)，但體積重量DLS分析(圖5B)表明PEG的加入對該系統(tǒng)有均質(zhì)化作用，因而脂質(zhì)體尺寸分布有著顯著的降低。顯然，PEG基團(tuán)的加入穩(wěn)定了該系統(tǒng)并阻止聚集，盡管Z電位從-17.9mV下降到-10.2mV(圖5C)。最后，通過FACS分析(圖6)證實了MSC特異性表面標(biāo)記在hMSC來源的脂質(zhì)體上的表達(dá)。如所示的，該CDL保留了它們的細(xì)胞質(zhì)膜對稱性和正確定向(correctlyoriented)的典型hMSC表面標(biāo)記(即，CD44、CD29、CD90和CD105)的表達(dá)。實施例3CDL結(jié)合并特異性靶向癌細(xì)胞系利用共聚焦顯微鏡成像和流式細(xì)胞術(shù)分析確定從hMSC制備的，熒光標(biāo)記的CDL與前列腺癌細(xì)胞(PC3)的結(jié)合。如圖7A所示，大多數(shù)囊泡有利于細(xì)胞結(jié)合。另外，該囊泡在細(xì)胞膜內(nèi)被檢測到，并與該細(xì)胞膜融合(圖7A)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，大多數(shù)細(xì)胞以濃度依賴方式(圖8A)結(jié)合囊泡，因而使得脂質(zhì)體結(jié)合程度可以根據(jù)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度確定。為了測試對癌細(xì)胞系的特異靶向性，從之前已與源自前列腺癌細(xì)胞系(PC3)，和源自非人細(xì)胞系(BHK)的調(diào)整培養(yǎng)基溫育24小時的hMSC制備DiI標(biāo)記的CDL。將所得的“調(diào)整”CDL，以及從未調(diào)整hMSC制備的CDL(對照)與PC3和BHK細(xì)胞溫育15min、1小時和3小時。溫育后，洗滌、收獲并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞(圖9)。給定特定調(diào)整培養(yǎng)基(無CM、BHK-來源和PC3-來源)和溫育時間(15min、1小時和3小時)，根據(jù)下面公式計算每個實驗的特異性指數(shù)：特異性指數(shù)結(jié)果概括在下表3中，該結(jié)果不但表明該系統(tǒng)對癌細(xì)胞表現(xiàn)出特異性，而且這種特異性，與預(yù)期的一樣，隨著溫育時間降低。另外，特異性指數(shù)值表明，該系統(tǒng)對癌細(xì)胞的特異親和性很大程度上受到在CDL制備之前將細(xì)胞暴露于各種調(diào)整培養(yǎng)基中這一處理的影響。表3-CDL與前列腺癌PC3細(xì)胞系結(jié)合的特異性指數(shù)實施例4在CDL內(nèi)的蛋白質(zhì)包埋sTRAIL生產(chǎn)培養(yǎng)基和緩沖液-從16grBactoTM胰化蛋白胨(Tryptone)(BD貨號：211705)、10grBactoTM酵母抽提物(DIFCO貨號：212750)和5grNaCl(化學(xué)純)制備IL2YT培養(yǎng)基。用于在Petri培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有位于上面組分之上的16grAgarGranulated(DIFCO貨號：214530)。對該培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。用2grKC1、2.4grKH2PO4、14.4grNa2HPO4·7H2O和80grNaCl制備PBSX10。用DDW將體積調(diào)節(jié)至1L，并通過0.2μm過濾器(濾膜，filter)對緩沖液過濾滅菌。質(zhì)粒、DNA、細(xì)菌和抗生素-pGEX-2TK質(zhì)粒中的GST-sTRAIL編碼DNA由Bethesda，MD的StanleyLipkowitz博士友情提供，利用100μg/ml氨必西林(Ampicillin)作為選擇劑將該質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21中。從溶解在超純DDW(UP-水)中至終濃度為100mg/ml的氨必西林鈉鹽(Sigma貨號：A9518)制備氨必西林儲液，并通過0.2μm過濾器過濾。另外的材料：乙醇99％脫水(FRUTAROM貨號：2355516400)；D(+)葡萄糖(Sigma貨號：G5146)；IPTG(OrnatBiochemicals貨號：INA-1758-1400)；CompleteMini無EDTA蛋白酶抑制劑雞尾酒片(EDTA-freeProteaseinhibitorcocktailtablet)(RocheAppliedScience貨號：04693159001)；DTT-DL-二硫蘇糖醇溶液(Sigma貨號：43816)；GSH珠(GEHealthcare)；谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B(10ml，DanyelBiotech貨號：17-0756-01)；和L-還原型谷胱甘肽(Sigma貨號：G4251)。設(shè)備：AmiconUltra-15離心過濾器(Millipore貨號：UFC901024)和FrenchPress細(xì)胞破碎系統(tǒng)。所有溶液都通過0.2μm過濾器過濾滅菌；第2天(步驟4，IPTGO/N誘導(dǎo)之后的細(xì)菌球粒)之前的所有操作程序都在SterileHood中進(jìn)行。Swith1/100GST-TRAIL甘油儲液(例如，在40ml培養(yǎng)基中的400μlGST-追蹤(trail)甘油儲液)。該溶液在37℃，250RPM下的振蕩溫育器(shakingincubator)中溫育O/N。第2天步驟2：使“起子(starter)”培養(yǎng)物在1000g下減速旋轉(zhuǎn)(spindown)15min從而除去該抗生素。棄去上清液，并重懸在40ml新鮮2YT中。在SterileHood中，將重懸的40ml步數(shù)(步驟號，stepnumber)1中的O/N制品(preparation)添加到4L燒瓶中的2L2YT中(替換地在兩支均含1L2YT的2L燒瓶中加入20ml步數(shù)1中的O/N制品重懸球粒)。將該溶液在37℃，250RPM下的振蕩溫育器中溫育2-3小時。應(yīng)采取措施確保溫育時間不超過3小時，直至O.D.值到達(dá)2.5-3.0(建議在2小時后測量O.D.595)。步驟3：就在IPTG誘導(dǎo)之前，添加PBS至終濃度為0.1X從而維持培養(yǎng)物的pH。添加EtOH(99％脫水)至終濃度為2％(在2L培養(yǎng)物中添加的EtOH為40ml)，從而增加蛋白質(zhì)的溶解度。按10ml/L添加作為碳源的0.5M葡萄糖至終濃度為5mM。步驟4：在該補(bǔ)加的培養(yǎng)物中加入500μMIPTG。于20-25℃在振蕩溫育器(250RPM)中溫育培養(yǎng)物過夜。第3天步驟5：以6,000g使細(xì)菌形成球粒，持續(xù)10min，棄去上清液。利用按1片/10mlPBS補(bǔ)加4個蛋白酶抑制劑片(RocheAppliedScience)的40mlPBS，將所有細(xì)菌重懸在50mlFalcon管中。步驟6：讓來自步數(shù)5的細(xì)菌兩次通過FrenchPress細(xì)胞破碎系統(tǒng)，如此使細(xì)胞裂解。替換地，取10ml等分試樣于50ml管中，在冰上以30％的力(功率，power)超聲破碎4次，每次10秒。細(xì)胞破碎后，在每40ml細(xì)胞裂解液中加入以下物質(zhì)：0.1％Triton-X(40μlTritonX100)、1mMMgCl2(40μl的1MMgCl2儲液)和1mMDTT(40μl的1MDTT儲液)。充分混合該溶液并于RT在搖擺器或振蕩器中溫育15min。步驟7：使細(xì)菌裂解液在4℃，16,900g下減速旋轉(zhuǎn)10min。吸出上清液，收集在50ml管中。步驟8：與GSH(谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B珠)的結(jié)合-取3mlGSH珠于15mlFalcon管中，用PBS洗滌三次。收集上清液，并再次離心，因為有大量珠散落。將洗滌的珠加入到來自步數(shù)7的細(xì)菌細(xì)胞裂解液中，并在4℃翻滾溫育1小時。步驟9：使來自步數(shù)8的，含有瓊脂糖凝膠珠的細(xì)菌細(xì)胞裂解液在2000RPM下的MULTICENTRIFUGECM6MELMI中減速旋轉(zhuǎn)1min，從而使蛋白質(zhì)結(jié)合的珠與細(xì)胞裂解液分離。收集上清液，再次離心從而使上清液中剩余的瓊脂糖凝膠珠(這些瓊脂糖凝膠珠在第一次離心中可能沒有形成球粒)形成球粒(沉淀，pellet)。將兩次離心獲得的，含有sTRAIL-結(jié)合珠的球粒用5mlPBS洗滌5次，每20mlPBS中補(bǔ)加了0.1％Triton-X100、150mMNaCl和1個蛋白酶抑制劑片。步驟10：GST-sTRAIL的洗脫-如前所述的使該珠粒減速旋轉(zhuǎn)，吸出上清液。加入3ml50mM在10mMTris-HCl和100mMNaCl中的谷胱甘肽(pH8.5)。使每3ml渦旋2min，并將蛋白質(zhì)洗脫到上清液中。如前所述的吸出上清液，保存上清液。重復(fù)執(zhí)行洗脫操作程序3-4次。步驟11：利用AmiconUltra-1510KNMWLnumberUFC9010濃縮蛋白質(zhì)，所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為約5mg/L培養(yǎng)物。制得終濃度為0.2mg/ml的sTRAIL。sTRAIL包埋-收獲約107個細(xì)胞，用PBS洗滌。然后通過將細(xì)胞在4℃下重懸于冰冷的pH7.4Tris-鎂(TM緩沖液，0.01MTris，0.001MMgCl2)中15min，對該細(xì)胞進(jìn)行低滲處理。低滲處理后，用定轉(zhuǎn)子機(jī)械均質(zhì)機(jī)(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均質(zhì)化細(xì)胞1min，使該細(xì)胞變成空胞(通過位相顯微術(shù)證實95％的細(xì)胞膜破裂)。為了使空胞懸浮液穩(wěn)定，立即在該懸浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液從而使終濃度為0.25M或按體積計為10％。然后4℃下以3000rpm離心空胞15min。棄去上清液，然后用含0.25M蔗糖的pH7.4TM緩沖液洗滌空胞球粒兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。為了獲得超聲處理的空胞，將重懸球粒用VibraCellVCX750(Sonics&MaterialsInc.，Newtown，CT)以27％的振幅(amplitude)超聲處理5秒，并在4℃下以3000rpm離心15min。超聲處理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH8.6TM緩沖液洗滌兩次，該洗滌通過重復(fù)執(zhí)行懸浮和4℃下以3000rpm離心15min的操作完成。此后，將sTRAIL加入到懸浮的超聲處理空胞(在pH8.6的緩沖液中)中至終濃度為1μg/1ml空胞懸浮液。為了形成含sTRAIL的單層脂質(zhì)體，手動使含sTRAIL的超聲處理空胞重懸球粒連續(xù)21次通過孔隙尺寸為0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(OsmonicsInc.，MinnesotaUSA)擠出。所擠出的含sTRAIL脂質(zhì)體然后在4℃下以150,000g離心45min。棄去含有多余未包封的sTRAIL的上清液，用pH8.6的TM緩沖液重懸所得脂質(zhì)體球粒。結(jié)果TRAIL-腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是II型跨膜蛋白，其可以誘導(dǎo)不同起源的腫瘤細(xì)胞凋亡，同時不傷害大多數(shù)正常細(xì)胞20-24。已證明，遞送全長和截斷的分泌形式的TRAIL(sTRAIL)都可以誘導(dǎo)培養(yǎng)物中和體內(nèi)的多種癌細(xì)胞凋亡25，26。我們利用sTRAIL進(jìn)行的初步實驗包括，制造sTRAIL和使它以1μg/ml的終濃度被動包封在hMSCCDL內(nèi)。所得含sTRAIL的CDL的低溫TEM顯像(圖10A，左側(cè))表明，與在相同條件下制備和顯像的空CDL(圖10B，左側(cè))相比，含sTRAIL的CDL內(nèi)累積有14-20nm蛋白膠粒。在通過數(shù)字重新著色使該圖像從灰度變成黑白(圖10A和10B，右側(cè))之后，sTRAIL膠粒甚至更清晰可見。實施例5通過與其它脂質(zhì)體融合制備“混合(雜合，hybrid)CDL”通過使CDL與其它脂質(zhì)體(合成或細(xì)胞來源的)融合，可以將各種分子(例如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、添加劑和甚至包封物(encapsulates))導(dǎo)入、結(jié)合或附連到CDL表面上，從而產(chǎn)生“混合CDL”。例如，由合成的良好界定的脂質(zhì)制成的脂質(zhì)體制劑可以在它的表面上與蛋白質(zhì)結(jié)合，或者可以包含期望的包封物。然后，依靠誘導(dǎo)的所述合成脂質(zhì)體和CDL之間的膜融合，可以形成混合CDL。這些混合CDL包含它們來源于其中的細(xì)胞膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，以及起初在所融合的合成脂質(zhì)體上調(diào)配的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。此類在混合CDL上導(dǎo)入“非自然”材料的方法可以用來附連或結(jié)合與一些特性相關(guān)的任何分子或部分，所述特性不限于脂質(zhì)體靶向性、治療效果、診斷效果、致使隱形的特性等。還可以利用此種融合，通過導(dǎo)入合成脂質(zhì)、添加劑(例如，膽固醇、神經(jīng)酰胺)等來改變CDL的生物化學(xué)或化學(xué)物理特性。還可以利用此種融合增大所述CDL的包封率。既然CDL的包封主要受限于被動包封，那么與主動加載高濃度包封物的合成脂質(zhì)體融合就可以顯著提高CDL的包封率。制備合成脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，主要包括使脫水脂質(zhì)水合(hydration)從而形成層狀結(jié)構(gòu)，隨后均質(zhì)化這些層狀結(jié)構(gòu)從而形成脂質(zhì)體。具有所述應(yīng)用的合成脂質(zhì)體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制造，包括但不局限于，溶劑蒸發(fā)法、溶劑更換法、清潔劑透析法、擠出法、超聲處理法、冷凍干燥法、逆相蒸發(fā)法、乙醇/醚注入法、攪動和/或任何其它形式的機(jī)械均質(zhì)法。脂質(zhì)體可以由多種合成和天然來源的脂質(zhì)制備，并可以包含或者不包含另外的添加劑(例如，膽固醇、神經(jīng)酰胺等)。使物質(zhì)主動包封在此種合成脂質(zhì)體中的方法主要基于膜pH梯度或主動轉(zhuǎn)運(yùn)體，此類方法在本領(lǐng)域中也是熟知的，可以用來制取具有高包封率的合成脂質(zhì)體。使CDL和其它脂質(zhì)體融合形成“混合CDL”，這可以容易和輕松地通過在脂質(zhì)體中加入短鏈游離PEG(-200-500Da)完成。PEG誘導(dǎo)的囊泡融合機(jī)制被認(rèn)為與隨后將導(dǎo)致囊泡凝聚和融合的水分活度(wateractivity)降低和脂質(zhì)頭基脫水有關(guān)。也可以在稱為電融合的工藝中通過電穿孔人工誘導(dǎo)融合。據(jù)認(rèn)為，這種現(xiàn)象由電穿孔期間形成的積極主動邊(energeticallyactiveedges)引起，這種積極主動邊可以用作使兩個雙層之間的莖生長成核的局部缺陷點。也可以通過在脂質(zhì)體混合物(例如，Cymal-5TM、1-S-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷等)中加入清潔劑(通常低于2％)，在輕微攪動下溫育并隨后進(jìn)行清潔劑透析，完成融合。實施例6hMSC空胞和hMSC來源的CDL的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對含有源自hMSC的空胞細(xì)胞和CDL的4個樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，所述hMSC受到或未受到源自前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的培養(yǎng)基的調(diào)整。為了制取調(diào)整空胞和CDL，在收獲之前將hMSC在由50％的源自PC3細(xì)胞的調(diào)整培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基中溫育24小時。然后收獲細(xì)胞，并通過前面描述的方法制備超聲處理的空胞和CDL。將經(jīng)超聲處理的，來自調(diào)整和未調(diào)整hMSC(106個細(xì)胞)的空胞重懸在1mlpH7.4的TM緩沖液中用于分析。將源自7x106個調(diào)整和未調(diào)整hMSC的細(xì)胞來源的脂質(zhì)體重懸在50μlpH8.6的TM緩沖液中。將樣品送往TECHNION蛋白質(zhì)組學(xué)中心-以色列科技協(xié)會(IsraelInstituteofTechnology)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。簡言之，用胰蛋白酶消化樣品，通過LC-MS/MS分析所得的肽。通過HPLC分離肽混合物，將其電噴射到離子阱質(zhì)譜儀(ion-trapmassspectrometer)(OrbitrapTM)上。進(jìn)行質(zhì)譜實驗是為了分析肽質(zhì)量電荷比光譜和測定蛋白質(zhì)質(zhì)量。為了進(jìn)行另外的分析和鑒定，通過碰撞誘導(dǎo)分解(CID)將肽進(jìn)一步片段化，并再次分析。利用Sequest3.31軟件，根據(jù)uniprot數(shù)據(jù)庫的人部分，鑒定該肽。所有蛋白質(zhì)結(jié)果都以Uniport登錄號給出。為每種蛋白質(zhì)/登錄號測定下列值。MW-分子量Ppro-找到與偶然觀察到的匹配一樣或者優(yōu)于它的匹配的概率。為該蛋白質(zhì)展示的值是最佳肽匹配(得分最低的肽)的概率。Pep計數(shù)-所鑒定肽的總數(shù)目。平均值-對每種蛋白質(zhì)鑒定的前3種肽(top3identifiedpeptides)峰面積的平均值。平均SE-平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。Med-對每種蛋白質(zhì)鑒定的所有肽峰面積的中位數(shù)(median)。MedErr-中位數(shù)絕對偏差(medianabsolutedeviation)。蛋白質(zhì)名稱。結(jié)果從這4個樣品中的一個或多個中鑒定出數(shù)百種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以分為以下4個不同的組：1.普遍存在于所有這4個樣品，即調(diào)整和未調(diào)整空胞及CDL中的蛋白質(zhì)(表7)，2.普遍存在于空胞或調(diào)整空胞中，但不存在于CDL中的蛋白質(zhì)(表5)。這些蛋白質(zhì)很可能或大多數(shù)是沒有完全從空胞中除去的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)殘余物。3.僅在調(diào)整空胞和CDL中普遍存在的蛋白質(zhì)(表6)。這些蛋白質(zhì)很可能或大多數(shù)是僅在誘導(dǎo)或暴露于調(diào)整培養(yǎng)基中之后才被表達(dá)的膜蛋白質(zhì)。4.在除從未調(diào)整hMSC制得的CDL之外的所有樣品中都普遍存在的蛋白質(zhì)(表7)。這些蛋白質(zhì)很可能或大多數(shù)是在未調(diào)整hMSC上低水平表達(dá)而在來源于它們的CDL上完全耗盡的膜蛋白質(zhì)。用調(diào)整培養(yǎng)基誘導(dǎo)hMSC很可能將這些蛋白質(zhì)水平升高至使它們在調(diào)整CDL上變得更明顯的程度。表4-普遍存存于調(diào)整和未調(diào)整的空胞和CDL中的蛋白質(zhì)表5-普遍存在于空胞或調(diào)整空胞中但不存在于CDL中的蛋白質(zhì)表6-僅在調(diào)整空胞和CDL中普遍存在的蛋白質(zhì)表7-存空胞、調(diào)整空胞和調(diào)整CDL中普遍存存，但不存存于未調(diào)整CDL中的蛋白質(zhì)。雖然本發(fā)明已結(jié)合其具體實施方式進(jìn)行描述，但顯然，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，許多替換、修改和變更都是很明顯的。因此，本發(fā)明旨在包括落在附屬權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有此類替換、修改和變更。本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都通過引用完整地合并在本說明書中，如同每篇單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾垎为?dú)地明確被指出通過引用合并在此。另外，本申請中任何參考文獻(xiàn)的引用或列出不應(yīng)該被解釋為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。對于使用的章節(jié)標(biāo)題，它們不應(yīng)該被解釋為限制性的。參考文獻(xiàn)(其它參考文獻(xiàn)在本申請各處列出)1.Petersson，B.ThedrymassofthepancreaticB-cellsinrelationtotheircontentofsecretiongranules.TheHistochemicalJournal1，55-58(1968).2.Loewenstein，J.E.&Cohen，A.I.DryMass，LipidContentandProteinContentoftheIntactandZona-FreeMouseOvum.JEmbryolExpMorphol12，113-121(1964).3.Lapidus，R.G.，Tiffany，C.W.，Isaacs，J.T.&Slusher，B.S.Prostate-specificmembraneantigen(PSMA)enzymeactivityiselevatedinprostatecancercells.Prostate45，350-354(2000).4.Hur，E.M.etal.LIME，anoveltransmembraneadaptorprotein，associateswithp56lckandmediatesTcellactivation.JExpMed198，1463-1473(2003).5.Lewis，L.A.etal.TheLckSH2phosphotyrosinebindingsiteiscriticalforefficientTCR-inducedprocessivetyrosinephosphorylationofthezeta-chainandIL-2production.JImmunol159，2292-2300(1997).6.Crowther，M.，Brown，N.J.，Bishop，E.T.&Lewis，C.E.Microenvironmentalinfluenceonmacrophageregulationofangiogenesisinwoundsandmalignanttumors.JLeukocBiol70，478-49(2001).7.Martinez-Palomo，A.，G.H.Bourne，J.F.D.&Jeon，K.W.inInternationalReviewofCytology，Vol.Volume2929-75(AcademicPress，1970).8.Marquez，M.etal.Charge-dependenttargeting：resultsinsixtumorcelllines.AnticancerRes24，1347-1351(2004).9.Carter，H.B.&Coffey，D.S.CellsurfacechargeinpredictingmetastaticpotentialofaspiratedcellsfromtheDunningratprostaticadeno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