本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

山藥是藥食兼用植物之一，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為山藥具有補(bǔ)益強(qiáng)壯，補(bǔ)脾養(yǎng)胃，生津益肺，補(bǔ)腎澀精，治療消渴功效?，F(xiàn)代的研究發(fā)現(xiàn)，山藥不僅具有多種營(yíng)養(yǎng)成分，而且具備性平，味甘，健脾止瀉、補(bǔ)肺益腎等藥用價(jià)值。山藥中含有多糖、尿囊素、皂甙、糖蛋白等活性成分，而多糖作為植物和食用菌的活性成分已成為當(dāng)前藥學(xué)研究的熱點(diǎn)，山藥多糖是從山藥塊莖中分離提取的主要活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，已成為近年來(lái)山藥研究的熱點(diǎn)。其具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等作用。山藥多糖不僅具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，可作為免疫增強(qiáng)劑，用于提高機(jī)體免疫力，主要表現(xiàn)在免疫增強(qiáng)或免疫刺激，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化、B淋巴細(xì)胞分泌抗體等；同時(shí)山藥便宜易得，對(duì)動(dòng)物而言，其具有良好應(yīng)用前景，然而另一方面，山藥多糖屬于大分子多糖，若直接用于臨床，則存在著多糖在體內(nèi)代謝較快，作用時(shí)間短，作用范圍不集中，臨床用量大以及由此帶來(lái)的副作用增強(qiáng)等缺點(diǎn)。由此可知，如何合理利用山藥多糖這種活性成分，提高山藥多糖的生物利用率，突出其增強(qiáng)免疫的效果，是其在臨床推廣應(yīng)用首要解決的問(wèn)題。

聚乳酸羥基乙酸共聚物又叫又叫聚乙丙交酯，是乳酸與羥基乙酸聚合而成，它有著良好的生物相容性和安全性，無(wú)毒、無(wú)刺激性，還有很好的穩(wěn)定性，具有易于被吞噬細(xì)胞攝取，通過(guò)在顆粒表面吸附相應(yīng)的配體可以定位到特定的組織或器官等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)因其含有親水性基團(tuán)，所以在體內(nèi)降解為二氧化碳和水，現(xiàn)已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)為藥用輔料。聚乳酸羥基乙酸包裹藥物制成注射微球已成為制劑學(xué)熱點(diǎn)之一，例如在藥物，包括蛋白、多肽、基因等緩釋領(lǐng)域已被廣泛研究。聚乳酸羥基乙酸納米粒緩控釋系統(tǒng)適用于半衰期短或口服生物利用度低而又需要長(zhǎng)期給藥的藥物，制成聚乳酸羥基乙酸納米?？杀Ｗo(hù)被包裹藥物不被破壞，可有效控制包裹在納米粒內(nèi)的藥物在體內(nèi)的降解，其優(yōu)點(diǎn)是能在幾周或幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)以一定速率釋放藥物，維持有效血液濃度， 減少給藥次數(shù)，且能夠持續(xù)釋放，提高治療效果，減少用藥的總劑量，所以被深入研究。目前已有多種藥物采用聚乳酸羥基乙酸作為骨架材料制備生物可降解微球，實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥物的緩釋和控釋，因此已被廣泛應(yīng)用于人的臨床醫(yī)學(xué)。

本發(fā)明首次利用復(fù)乳法制備山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒膠體懸液，對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，并體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖，建立了山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備方法，優(yōu)化了制備條件，發(fā)現(xiàn)山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒能顯著提高山藥多糖的免疫活性及免疫增強(qiáng)功能，提高其生物利用度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的生物利用率不高，效果不佳等問(wèn)題。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種制備山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的方法，它包括如下步驟：

(1)取山藥多糖溶于水中，經(jīng)超聲溶解得到內(nèi)水相；將聚乳酸羥基乙酸和丙酮混合后攪拌，經(jīng)超聲溶解得到油相；將泊洛沙姆188溶于水中，得到外水相；

(2)將步驟(1)中制備得到的內(nèi)水相加入步驟(1)中制備得到的油相中，經(jīng)超聲得到穩(wěn)定的油包水型初乳；將油包水型初乳加入步驟(1)中制備得到的外水相中，經(jīng)超聲得到水包油包水型復(fù)乳；水包油包水型復(fù)乳經(jīng)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑和離心去除較大沉淀后，收集上清液，即得山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒。

步驟(1)中，內(nèi)水相中，山藥多糖的濃度為2～20mg/mL，優(yōu)選10mg/mL。

步驟(1)中，油相中，聚乳酸羥基乙酸的濃度為10～40mg/mL，優(yōu)選20mg/mL。

步驟(1)中，外水相中，泊洛沙姆188的質(zhì)量百分比為0.1～0.7％，優(yōu)選0.7％。

步驟(2)中，內(nèi)水相和油項(xiàng)的體積比為1：3～9，優(yōu)選1：9。

步驟(2)中，油包水型初乳和外水相的體積比為1：4～10，優(yōu)選1：10。

步驟(2)中，得到穩(wěn)定的油包水型初乳的超聲方法為：在120W的功率下超聲2s間歇3s，總時(shí)長(zhǎng)2min。

步驟(2)中，得到水包油包水型復(fù)乳的超聲方法為：在150W的功率下超聲2s間歇3s，總時(shí)長(zhǎng)2min。

步驟(2)中，減壓蒸發(fā)的方法為：在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以55℃和100rpm的條件減壓蒸發(fā)20min左右。

步驟(2)中，離心的方法為2500rpm離心8min。

上述制備方法中任意一項(xiàng)制備得到的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

上述山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒在制備免疫增強(qiáng)藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

按此方法制備的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒，包封率高達(dá)66.82％。得到山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒后，利用馬爾文粒度分析儀對(duì)山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)及表面電勢(shì)進(jìn)行了分析，并通過(guò)透射電鏡對(duì)山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的表面形態(tài)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒呈現(xiàn)均一的納米分散體系。

體外將山藥多糖以及山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒以一定濃度重懸，用透析袋模擬體內(nèi)半透膜，探究?jī)烧叩尼尫乓?guī)律。發(fā)現(xiàn)山藥多糖被聚乳酸羥基乙酸包裹后，明顯減緩了藥物的釋放。說(shuō)明聚乳酸羥基乙酸有緩釋效果。

體外探究山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的最大安全濃度，在安全濃度下刺激淋巴細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)與其他空白組相比，載藥納米粒組在不同濃度下均能顯著刺激淋巴細(xì)胞增值。表明了其具有較好的免疫增強(qiáng)功能，對(duì)提高動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，防治疾病具有重要應(yīng)用價(jià)值。

有益效果

動(dòng)物疫病主要靠疫苗來(lái)預(yù)防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱、誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短，需多次接種等缺點(diǎn)，需要免疫增強(qiáng)劑輔助才能產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。現(xiàn)有的常用免疫增強(qiáng)劑如油佐劑、鋁膠佐劑等，這些佐劑通常存在刺激性較強(qiáng)、有殘留等缺點(diǎn)。由于中藥具有綠色安全的特點(diǎn)，從中藥中開(kāi)發(fā)免疫增強(qiáng)劑已成為熱點(diǎn)。

山藥多糖是山藥中所含的主要有效成分之一，其具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等作用。山藥多糖不僅具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，可作為免疫增強(qiáng)劑，用于提高機(jī)體免疫力，主要表現(xiàn)在免疫增強(qiáng)或免疫刺激，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化、B淋巴細(xì)胞 分泌抗體等；同時(shí)山藥便宜易得，對(duì)動(dòng)物而言，其具有良好應(yīng)用前景，然而，山藥多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑直接用于獸醫(yī)臨床，存在著分子量較大、藥物釋放太快、藥量過(guò)大、副作用增強(qiáng)、生物利用度低導(dǎo)致免疫增強(qiáng)作用相對(duì)較弱等問(wèn)題，從而限制了其臨床應(yīng)用。利用聚乳酸羥基乙酸包被山藥多糖，不僅可以減緩山藥多糖在體內(nèi)被排除，解決用藥量大等問(wèn)題，而且可以有效維持山藥多糖在機(jī)體內(nèi)的有效濃度，提高其生物利用度。

本發(fā)明采用復(fù)乳法將山藥多糖制備成山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒，所得納米粒懸液包封率較高，藥物性質(zhì)穩(wěn)定，同時(shí)可使藥物在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)緩慢釋放，有效地延長(zhǎng)藥效，具免疫增強(qiáng)作用，對(duì)防治動(dòng)物疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒(méi)有副作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下：

1.山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明提供了一種山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備方法及其優(yōu)化的條件，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外研究的空白。

2.山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的免疫增強(qiáng)活性未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施，證明山藥多糖通過(guò)制備成山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒后能夠顯著增強(qiáng)其免疫活性，表現(xiàn)為體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖，與山藥多糖相比，具有較強(qiáng)的緩釋作用，從而長(zhǎng)時(shí)間刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)以達(dá)到增強(qiáng)免疫的效果。因此，山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒可作為研制新型免疫增強(qiáng)劑的材料，為研制新型免疫增強(qiáng)劑提供了材料和示范。

附圖說(shuō)明

圖1為山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)和空白聚乳酸羥基乙酸納米粒(BP)的透射電鏡和掃描電鏡圖；其中，A1和A2為BP的透射電鏡圖像，B1和B2為CYPP的透射電鏡圖像；C1和C2為CYPP的掃描電鏡圖像；

圖2為山藥多糖(CYP)和山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)的體外釋放結(jié)果圖；

圖3為藥物單獨(dú)刺激時(shí)淋巴細(xì)胞增殖的變化示意圖；

圖4為藥物協(xié)同LPS作用時(shí)淋巴細(xì)胞增殖的變化示意圖；

圖5為藥物協(xié)同PHA刺激時(shí)淋巴細(xì)胞增殖的變化示意圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備

精確稱取一定量的山藥多糖于小燒杯中，以超聲溶解形成內(nèi)水相，其濃度為10mg/mL；精確稱取一定量的聚乳酸羥基乙酸，加入丙酮，超聲溶解形成油相，濃度為20mg/mL；精確稱取一定量的泊洛沙姆188，溶于一定量的去離子水中形成外水相，其濃度為0.7％。將內(nèi)水相緩慢加入油相中，并以功率120W，超聲2s間歇3s，總時(shí)2min的條件進(jìn)行超聲得到穩(wěn)定的油包水型初乳，將初乳緩慢加入外水相中，并以功率150W，超聲2s間歇3s，總時(shí)2min的條件進(jìn)行超聲得到穩(wěn)定的水包油包水型復(fù)乳，之后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，轉(zhuǎn)速100rpm，水浴55℃，約20min。最后，將復(fù)乳裝入EP管中，以轉(zhuǎn)速2500rpm離心8min后收集上清，即得山藥多糖的聚乳酸羥基乙酸納米粒。

在單一因素考察的基礎(chǔ)上，確定影響山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒包封率的3個(gè)主要影響因素，即內(nèi)水相與油相的體積比(V/V)、初乳與外水相的體積比(V/V)以及泊洛沙姆188的濃度(％)等3個(gè)因素，以此3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素又選擇3個(gè)水平，以包封率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))二次回歸正交組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)表1中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過(guò)二次回歸擬合后，得到內(nèi)水相與油相的體積比(V/V)、初乳與外水相的體積比(V/V)以及泊洛沙姆188的濃度(％)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y＝+57.66+4.91X₁+3.74X₂+1.93X₃+0.50X₁X₂+0.83X₁X₃+1.38X₂X₃–1.48X₁²–0.48X₂²-2.16X₃²

表1

利用Design expert 7.0軟件對(duì)表1的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，模型P＜0.05，表示模型顯著；說(shuō)明該模型成立，本實(shí)驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)P＝0.3263＞0.05，不顯著，表明回歸方程無(wú)失擬因素存在，回歸式擬合的較好。進(jìn)一步說(shuō)明在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以用來(lái)解釋和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。模型中的A、B、C的“P”值均小于0.05，說(shuō)明其對(duì)山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒包封率有顯著影響；相關(guān)性R²＝0.9276，校正決定系數(shù)R_Adj²＝0.8346，僅有約10％的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒包封率總變異不能由此模型進(jìn)行解釋。綜上表明，此模型擬合度較好。

表2

通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到制備山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的最佳制備條件為：內(nèi)水相與油相的體積比為1:9，初乳與外水相的體積比為1:10，泊洛沙姆188的濃度為0.69％，所得山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的包封率高達(dá)66.82％。

實(shí)施例2山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒的表征

(1)粒徑電位檢測(cè)及透射電鏡觀察

分別取實(shí)施例1中制備得到的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)和空白聚乳酸羥基乙酸納米粒(BP)(其制備方法同實(shí)施例1，所不同的是，在制備初乳時(shí)，以等體積的去離子水作為內(nèi)水相代替山藥多糖溶液所制備的納米粒)，使用馬爾文粒徑分析儀分析兩種納米粒的粒徑和電勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表面形態(tài)使用透射電鏡和掃描電鏡分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表3

從表3可以看出，CYPP的粒徑較BP的粒徑大，其原因在于其包裹了多糖；納米粒的Zeta電勢(shì)均為負(fù)值，CYPP的Zeta電勢(shì)絕對(duì)值較BP大，Zeta電勢(shì)的絕對(duì)值越大說(shuō)明納米粒穩(wěn)定性越好；PDI指示的是納米粒粒徑分布的均勻度，PDI越小說(shuō)明納米粒大小越均勻，分散性也就越好，從表中看出所制備的納米粒的多分散性(PDI)小于0.3，說(shuō)明其分散性較好。

由透射電鏡圖可以看出，山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)和空白聚乳酸羥基乙酸納米粒(BP)分布均勻，粒子均呈圓整的球形，大小均一，表面光滑。掃描電鏡下，觀察納米粒CYPP呈均勻圓整的球體，且球體大小均一，納米球囊壁致密無(wú)孔。電鏡及粒徑、電勢(shì)分析表明山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)。

(2)體外藥物釋放

選擇PBS(PH＝7.4)作為釋放介質(zhì)，其中包含0.08％吐溫80，其作用是增加納米粒在PBS中的溶解度和濕潤(rùn)度。將5mL 1mg/mL的山藥多糖(CYP)和5mL 1mg/mL的山藥多糖PLGA納米粒(CYPP)置于透析袋中，密封好透析袋后置于釋放介質(zhì)中，并密封瓶口，置于搖床中在37℃下恒溫振蕩(80rpm)。定時(shí)取樣(0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,36h,48h,72h,96h)，取樣后加入等量含有0.08％吐溫80的PBS，用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量，計(jì)算藥物累積釋放百分率。

由山藥多糖(CYP)和山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)的體外釋放結(jié)果(圖2)可知，CYP在前24h藥物累積釋放百分率為53.86％，在48h時(shí)幾乎釋放完全且藥物累積釋放百分率隨時(shí)間的增加并無(wú)明顯的上升。而CYPP在前24h藥物累積釋放百分率為42.84％，且隨時(shí)間的增加，藥物累積釋放百分率呈逐漸上升趨勢(shì)。對(duì)比兩條曲線可知，CYPP較CYP有明顯的緩釋效果，這是由于納米粒的粒徑使它具有特殊的表面效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)，從而減緩了藥物的釋放。

實(shí)施例3山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒體外免疫增強(qiáng)活性比較

以根據(jù)最佳制備條件制備的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒(CYPP)為研究對(duì)象，以山藥多糖(CYP)和空白聚乳酸羥基乙酸(BP)作為對(duì)照，探索其體外對(duì)小鼠淋巴細(xì) 胞增殖的影響。

(1)脾臟淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備

用頸椎脫臼法處死小鼠，75％乙醇浸泡3-5min。在超凈臺(tái)內(nèi)，將小鼠置于一平皿中，左側(cè)面朝上，在最后一根肋骨處打開(kāi)皮膚和腹腔，小心取出脾臟，將脾移入200目鋼篩。用剪刀和鑷子將脾臟破碎，加入少許PBS，用玻璃研磨棒輕輕研磨脾臟，邊研邊加PBS(加5mL左右即可)，使細(xì)胞懸液流入平皿中。將細(xì)胞懸液混勻后加入10mL離心管中，以1500r·min^-1離心8min，棄上清，加入適量紅細(xì)胞裂解液，并用吸管吹打均勻后靜置3min，以1500r·min^-1離心8min，沉淀經(jīng)PBS反復(fù)洗滌2次。用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2.8×10⁶個(gè)·mL^-1。

(2)最大安全濃度的測(cè)定

用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液分別將CYPP和CYP自0.8mg·mL^-1倍比稀釋至11個(gè)濃度。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入各濃度的CYPP和CYP，每孔100μL，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，同時(shí)加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液設(shè)為細(xì)胞對(duì)照組，將所得到的淋巴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，除空白調(diào)零孔外其余孔中，每孔100μL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5％CO₂條件下連續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入30μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO 100μL裂解細(xì)胞，微量震蕩器震蕩5min，待沉淀完全溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光值(A₅₇₀值)。CYPP和CYP組的A₅₇₀值顯著高于細(xì)胞對(duì)照組時(shí)，表示CYPP和CYP促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)顯著。選擇A₅₇₀值不顯著低于細(xì)胞對(duì)照組時(shí)的CYPP和CYP的最大濃度作為它們的最大安全濃度。

表4

由表4可知，CYPP濃度在800-400μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值顯著小于細(xì)胞對(duì)照(P<0.05)，濃度200μg·mL^-1至0.781μg·mL^-1與細(xì)胞對(duì)照差異均不顯著(P>0.05)，且濃度為1.562μg·mL^-11時(shí)A₅₇₀值高于對(duì)照組，說(shuō)明在此濃度，CYPP促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)。CYP在800μg·mL^-1的A₅₇₀值顯著小于細(xì)胞對(duì)照(P<0.05)，在濃度400μg·mL^-1至0.781μg·mL^-1與細(xì)胞對(duì)照差異均不顯著(P>0.05)，且濃度為100μg·mL^-1到12.5μg·mL^-1時(shí)和濃度為0.781μg·mL^-1時(shí)A₅₇₀值均高于對(duì)照組，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，CYP促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)。CYPP在200μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值不顯著小于細(xì)胞對(duì)照組(P>0.05)，CYP在400μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值不顯著小于細(xì)胞對(duì)照組(P>0.05)。因此，將200μg·mL^-1和400μg·mL^-1分別定為CYPP和CYP的最大安全濃度。

(3)淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

淋巴細(xì)胞制備同上，將細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞板中，每個(gè)樣品重復(fù)12個(gè)孔，每孔80μL，其中4個(gè)孔每孔加LPS(10μg·mL^-1)20uL，另外4個(gè)孔每孔加PHA(5μg·mL^-1)20μL，剩余4個(gè)孔每孔加RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(不含小牛血清)20μL。用LPS刺激B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，用PHA刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)44h后，每孔加入30μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心后將每孔中的上清棄去，加入100μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩5min左右使沉淀完全溶解。用酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處的吸光值(A₅₇₀)。

由圖3可知，在藥物單獨(dú)刺激淋巴細(xì)胞增殖的情況下，CYPP組在12.5-200μg·mL^-1濃度的A₅₇₀值均顯著高于CYP組和BP組(P<0.05)，CYP組在12.5-100μg·mL^-1濃度的A₅₇₀值均顯著高于BP組(P<0.05)。圖3表明這些濃度下刺激淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。

如圖4所示，在藥物協(xié)同LPS作用對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的情況下，在濃度為 12.5-200μg·mL^-1時(shí)，CYPP組的A₅₇₀值均為最高，并且均顯著高于LPS對(duì)照組(P<0.05)，且在12.5-200μg·mL^-1時(shí)顯著高于BP組(P<0.05)；CYP組在12.5-200μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值均顯著高于LPS對(duì)照組(P>0.05)，且在12.5-25μg·mL^-1均顯著高于BP組。見(jiàn)圖4，表明它們?cè)谶@些濃度均能協(xié)同LPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，并且CYPP協(xié)同LPS作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的效果在適合濃度下強(qiáng)于CYP。

如圖5所示，在藥物協(xié)同PHA刺激時(shí)淋巴細(xì)胞增殖的情況下，濃度范圍在12.5-25μg·mL^-1時(shí)和100-200μg·mL^-1，CYPP組的A₅₇₀值均為最高，并且均顯著高于PHA對(duì)照組及細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，且在12.5μg·mL^-1時(shí)和100-200μg·mL^-1時(shí)均顯著高于CYP組(P<0.05)，在濃度為200μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值最高；CYP組在12.5-200μg·mL^-1時(shí)的A₅₇₀值均顯著高于PHA組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。表明CYPP和CYP在這些濃度時(shí)，能協(xié)同PHA促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，并且CYPP協(xié)同PHA作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的效果強(qiáng)于CYP，且顯效范圍大。

根據(jù)上述體外刺激淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)結(jié)果可以得出山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒能夠單獨(dú)和協(xié)同LPS、PHA分別刺激T、B淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示所有濃度組均顯著比對(duì)照組高。說(shuō)明本發(fā)明涉及的山藥多糖聚乳酸羥基乙酸納米粒能夠提高山藥多糖的免疫活性，可用于提高動(dòng)物機(jī)體免疫功能以達(dá)到抵抗疾病的目的。