本發(fā)明涉及一種肺炎球菌結(jié)合物組合，通過選擇適合不同型別多糖的結(jié)合方法制備高免疫結(jié)合物，并將它們組成一個組合，成為高免疫原性的肺炎球菌結(jié)合物組合，用于預防肺炎球菌引起的感染性疾病。
背景技術(shù)：
：：肺炎鏈球菌是導致發(fā)展中國家和發(fā)達國家各年齡組人群社區(qū)獲得性肺炎(communityacquirepneumonia，CAP)最重要的病原菌，同時也是引起中耳炎、肺炎、腦膜炎和菌血癥的主要病原菌。在世界范圍內(nèi)，每年由于肺炎鏈球菌感染引起的死亡占總死亡人數(shù)的9％，每年由肺炎鏈球菌引起的腦膜炎3萬多例，菌血癥63萬多例，中耳炎1400萬例，肺炎2000萬例。預防肺炎球菌感染的生物制品包括多糖疫苗和結(jié)合疫苗，其中多糖疫苗可用于2歲以上人群，主要適用人群是老年人以及一些免疫功能低下的特殊人群等，而結(jié)合疫苗可使用在嬰幼兒及以上人群，免疫原性更好，可誘導免疫回憶反應，清除健康帶菌等，比多糖疫苗具有明顯的優(yōu)勢，是肺炎球菌疫苗研究的一個方向，目前已上市的肺炎球菌結(jié)合疫苗包括輝瑞公司的“13價肺炎球菌結(jié)合疫苗”和葛蘭素史克公司的“10價肺炎球菌結(jié)合疫苗”，輝瑞公司原上市品種“7價肺炎球菌結(jié)合疫苗”已逐漸被13價疫苗所替代。結(jié)合疫苗主要的抗原成分是多糖蛋白結(jié)合物，多糖蛋白結(jié)合物的制備方法有多種，常用的方法包括：1.直接結(jié)合法：利用多糖結(jié)構(gòu)上固有的反應基團直接或通過間隔劑與載體蛋白質(zhì)相偶聯(lián)。如宋內(nèi)氏痢疾多糖結(jié)構(gòu)中含有羧基基團，通過碳二亞胺(EDC)的介導，與己二酰二肼結(jié)合，再與載體蛋白質(zhì)上的羧基反應，形成結(jié)合產(chǎn)物(TaylorDN，TrofaAC，SadoffJ，etal.Synthesis，characterization，andclinicalevaluationofconjugatevaccinecomposedofO-specificpolysaccharidesofShigelladysenteriaetype1，shigellaflexneritype2a，andshigellasonnei(Plesiomonasshigelloides)boundtobacterialtoxoids[J].InfectImmun1993，61：3678-3687.)。碳二亞胺，結(jié)構(gòu)如下全名為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，常用于羧基和伯胺的縮合。碳二亞胺可以與羧基形成可與氨基反應的O-?；愲?O-acylisourea)中間體，在有氨基存在的情況下，可發(fā)生縮合。但若反應體系中沒有氨基，該中間體會很快水解恢復成羧基形式。若在反應體系中增加N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide，Sulfo-NHS)，則可形成穩(wěn)定的活潑脂中間體，可進一步和氨基縮合。碳二亞胺縮合反應路線如下。2.氰基活化法：通過氰根活化多糖鏈上的鄰羥基，再與六碳間隔劑己二酰二肼(ADH)相連，衍生出多糖制備出衍生的多糖。衍生多糖和載體蛋白質(zhì)在碳二亞胺的介導下，由碳二亞胺與載體蛋白質(zhì)上的羧基形成O-?；愲逯虚g體，再與衍生多糖上的胺基反應形成多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物。這種氰基活化方式采用的氰化物試劑通常為溴化氰(CNBr)、1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)等。采用的間隔劑包括丁二酸二酰肼(Butanedihydrazide)、己二酰二肼(ADH)等二肼類化合物，還包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷類化合物，也包括己二酸二琥珀酰亞胺酯(DEA)等酯類化合物，還包括含反應官能團不一致的間隔劑，如氨基硫醇。ChiayungChu等制備結(jié)合疫苗時，就采用溴化氰活化多糖，己二酰二肼衍生為間隔劑，通過EDAC介導縮合，制備出結(jié)合物(ChuChiayung，R.Schneerson，JBRobbins，etal.FurtherStudiesontheImmunogenicityofHaemophilusinfluenzaeTypebandPneumococcalType6APolysaccharideProteinConjugates[J].InfectImmun1983，40：245-256.)。也有不采用間隔劑的，如CarineCapiau等以CDAP活化多糖后，直接與載體蛋白質(zhì)的氨基反應，制備出肺炎和流腦結(jié)合疫苗(U.S.Pub.No.2003/0147922)，葛蘭素史克上市的“10價肺炎球菌結(jié)合疫苗”就采用CDAP活化多糖，并直接與載體蛋白質(zhì)的胺基反應制備結(jié)合物。3.胺還原法：多糖經(jīng)氧化或水解后，可在末端生成醛基，醛基可與氨基反應形成希夫堿結(jié)構(gòu)(Schiffs’base)，再經(jīng)還原劑還原，可形成穩(wěn)定的C-N結(jié)構(gòu)，制備出結(jié)合物反應路線如下多糖氧化多采用高碘酸鈉法，高碘酸是一種氧化劑。多糖含有豐富的二醇基(CHOH-CHOH)，被高碘酸氧化后，斷裂形成二個末端醛基。高碘酸的特點是不再進一步氧化巳生成的醛基。如下面的C群流腦多糖高碘酸氧化反應氨還原法是醫(yī)藥領(lǐng)域應用最廣的一種多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物制備方法。Jennings等采用氨還原法制備流腦結(jié)合疫苗(U.S.Pat.No.4,356,170)。Anderson也采用氨還原法制備b型流感嗜血桿菌小分子多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合物(U.S.Pat.No.4,761,283)。輝瑞公司(Hausdorff等)上市的7價肺炎球菌結(jié)合疫苗和13價肺炎球菌結(jié)合疫苗也采用胺還原法(U.S.Pub.No.2007/0184071A1)。這些都是利用多糖氧化產(chǎn)生的醛基直接與蛋白質(zhì)上的氨基反應，通過硼氰化鈉的還原，制備結(jié)合物。也有學者利用氨還原法的原理，先將多糖產(chǎn)生的醛基與含氨基的間隔劑連接，再通過間隔劑與載體蛋白質(zhì)相連接。Jessouroun等將蛋白質(zhì)以肼基修飾，再與氧化后含醛基的多糖以氨還原法結(jié)合(U.S.Pub.No.2007/0110762A1)。Porro以氨還原法將氨基基團連接到還原寡糖上，再與載體蛋白質(zhì)連接(U.S.Pat.No.5,306,492)。4.其它結(jié)合方法：包括肟化學反應、重氮化反應、二硫鍵連接反應等，但使用不是很廣。N-琥珀酰亞胺-3-二硫代吡啶丙酸(SPDP)是常用的二硫鍵連接反應試劑，先將SPDP連接到含氨基的組分上，與含巰基的組分發(fā)生巰基交換反應，形成二硫鍵連接的結(jié)合物。Kossaczka等采用該方法制備了傷寒結(jié)合疫苗，但人體試驗數(shù)據(jù)證明效果不理想(KossaczkaZuzana，F(xiàn)YLin，VAHo，etal.SafetyandImmunogenicityofViConjugateVaccinesforTyphoidFeverinAdults，Teenagers，and2-to4-Year-OldChildreninVietnam[J].InfectImmun1999，67：5806-5810.)。以下為SPDP介導的結(jié)合反應。肺炎球菌有90多個血清型，疫苗的開發(fā)多選擇地區(qū)優(yōu)勢血清型，因此，疫苗都為多價次的，如已上市的10價、13價以及默克公司進入臨床的15價。目前，各公司開發(fā)多價肺炎球菌結(jié)合疫苗時，多是利用各自的技術(shù)特點和優(yōu)勢制備結(jié)合物，各價次結(jié)合物的制備都采用同一種方法，如葛蘭素史克采用CDAP介導的氰基活化法制備10種結(jié)合物，輝瑞公司采用胺還原法制備其7價肺炎球菌結(jié)合疫苗和13價肺炎球菌結(jié)合疫苗，默克公司的15價肺炎球菌結(jié)合疫苗也采用胺還原法制備結(jié)合物(杜琳蔣仁生由結(jié)合疫苗產(chǎn)品歷史沿革帶來的思考《微生物學免疫學進展》2013，41(6)：60-65.)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，用相同型別的肺炎球菌多糖與相同的載體蛋白質(zhì)制備結(jié)合物時，不同的結(jié)合方法獲得的結(jié)合物在免疫原性上會有差別，而差別主要取決于多糖的型別，而非結(jié)合方法，即不同型別的多糖會有更適合它的結(jié)合物制備方法，如研究報道采用CDAP法制備19F型肺炎球菌結(jié)合物免疫效果就明顯優(yōu)于胺還原法(JanPoolman，CarlFrasch，AnuNurkka，etal.ImpactoftheConjugationMethodontheImmunogenicityofStreptococcuspneumoniaeSerotype19FPolysaccharideinConjugateVaccines.ClinVaccineImmunol.2011，18(2)：327-336.)，本發(fā)明針對肺炎球菌的不同型別，選用適合的方法制備各型結(jié)合物，再將結(jié)合物配制為一定價次的多價肺炎球菌結(jié)合物，所述結(jié)合物制備方法是兩種或以上。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明涉及一種肺炎球菌結(jié)合物組合疫苗的制備方法，所述組合疫苗是由多種肺炎球菌結(jié)合物組合制備而成，所述肺炎球菌結(jié)合物為相應肺炎球菌血清型莢膜多糖與生理上可接受的載體蛋白質(zhì)通過選擇適合不同型別多糖的結(jié)合方法制備的高免疫多糖蛋白結(jié)合物，所述結(jié)合物的制備方法采用兩種或兩種以上結(jié)合方法，包括直接結(jié)合法、氰基活化法、胺還原法以及其他結(jié)合方法。優(yōu)選的，所述組合疫苗由選自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F的肺炎球菌結(jié)合物組合制備而成。最優(yōu)選的，所述組合疫苗由選自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F的肺炎球菌結(jié)合物組合制備而成。本發(fā)明最優(yōu)選的組合疫苗，制備方法如下：其中19A和19F采用CDAP介導的氰基活化法制備結(jié)合物，1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、23F采用胺還原法制備結(jié)合物。本發(fā)明最優(yōu)選的組合疫苗，優(yōu)選的的制備方法如下：19A和19F采用CDAP介導的氰基活化法制備結(jié)合物，制備方法如下：溶解肺炎球菌多糖，經(jīng)醋酸溶液水解后，調(diào)pH值至6.4，加入高碘酸鈉氧化，甘油終止反應，透析或超濾去除小分子物質(zhì)，獲得氧化多糖。氧化多糖中加入ADH和硼氰化鈉至終濃度40mg/ml和2mg/ml，室溫反應3天，制備衍生物。衍生多糖和載體蛋白質(zhì)按一定質(zhì)量比混合，加入EDAC至終濃度0.02mol/L，維持pH值5.6反應150分鐘以上，制備結(jié)合物。結(jié)合物經(jīng)Sepharose4FF層析純化，收集V0附近洗脫峰，獲得結(jié)合物原液；1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、23F采用胺還原法制備結(jié)合物，制備方法如下：溶解肺炎球菌多糖，調(diào)整pH值至9.0左右，按質(zhì)量比1∶0.75加入CDAP乙腈溶液(濃度為100mg/ml)，維持pH值為9.00-10.00反應，與CDAP等體積加入2％三乙胺溶液，pH值為10.00-11.00，反應5min；調(diào)整pH值為8.60左右，按多糖蛋白質(zhì)量比1∶1加入蛋白，維持pH值8.6附近反應120分鐘以上，甘氨酸終止反應，超濾或透析后獲得多糖結(jié)合物。結(jié)合物經(jīng)sepharose4FF層析純化，收集V0附近洗脫峰，獲得結(jié)合物原液。本發(fā)明所述結(jié)合方法包括直接結(jié)合法、氰基活化法、胺還原法以及其他結(jié)合方法，利用莢膜多糖上獲得的醛基、羧基或氨基等與載體蛋白質(zhì)直接相連，也可通過橋聯(lián)劑與載體蛋白質(zhì)相連接，所述橋聯(lián)劑包括但不限定為丁二酰二肼(SDH)、己二酰二肼(ADH)、3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)等。結(jié)合方法中，19型制備結(jié)合物優(yōu)選氰基活化法，更進一步是CDAP介導的氰基活化法，其他型別結(jié)合物的制備優(yōu)選直接結(jié)合法、氰基活化法和胺還原法，更優(yōu)選氰基活化法和胺還原法，最優(yōu)選胺還原法。本發(fā)明所采用的載體蛋白是生理上可接受的載體蛋白質(zhì)，包括白喉類毒素(DT)及其交叉反應物質(zhì)(CRM)，CRM是一類與白喉抗毒素形成反應的物質(zhì)，含有如CRM197、CRM9、CRM173、CRM228和CRM45；包括破傷風類毒素(TT)、百日咳類毒素(PT)、霍亂毒素B亞單位、不耐熱大腸桿菌腸毒素(LT)、耐熱大腸桿菌腸毒素(ST)、綠膿桿菌外毒素A(EPA)；包括外膜蛋白復合物(OMPC)、肺炎球菌溶血素(PLY)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、流感嗜血桿菌蛋白D。載體蛋白質(zhì)優(yōu)選DT、TT和CRM197，最優(yōu)選DT。本發(fā)明多價肺炎球菌結(jié)合物組合中，各型多糖的含量為0.1-10μg；優(yōu)選含量為0.5-5μg；最優(yōu)選含量為1-4μg。在結(jié)合物組合物中，各型多糖的含量可以相同，也可以不同。本發(fā)明多價肺炎球菌結(jié)合物組合可包含佐劑和/或緩沖液，所述的佐劑選自鋁佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等。水包油或細菌細胞壁成份，如MF59、SAE、RAS等?；蛘咴斫穷愖魟鏠uilA、QS-21?；蛘呒毦嗵腔蚝铣深愔珹佐劑。細胞因子，如白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、共刺激分子B7-1、B7-2等?；蛘叨舅貋唵挝活愖魟缁魜y毒素及亞單位、百日咳毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)等。所述的緩沖液選自磷酸緩沖液或Tris緩沖液，也可以是生理氯化鈉溶液。緩沖液濃度可以是0.01-0.05M，優(yōu)選0.01-0.02M，最優(yōu)選0.01M。本發(fā)明的多價肺炎球菌結(jié)合物組合還可包含穩(wěn)定劑和/或分散劑，穩(wěn)定劑選自氨基酸，氨基酸可以是組氨酸，優(yōu)選L-組氨酸，使用濃度1-100mM，優(yōu)選2-50mM，更優(yōu)選3-10mM，最優(yōu)選5mM。組氨酸可以組氨酸緩沖液的形式出現(xiàn)。分散劑選自多聚山梨醇酯，優(yōu)選Tween80，使用濃度0.01-1％，更優(yōu)選0.01-0.1％，最優(yōu)選0.02-0.05％。本發(fā)明的多價肺炎球菌結(jié)合物組合可以制成供臨床用的各種制劑形式，所述的制劑選自液體劑型、凍干劑型，優(yōu)選液體劑型。本發(fā)明的多價肺炎球菌結(jié)合物組合，其接種途徑包括肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射途徑。以下通過實驗數(shù)據(jù)進一步說明本發(fā)明的有益效果：1.單一結(jié)合方法制備結(jié)合物組合與多種結(jié)合方法制備結(jié)合物組合小鼠免疫原性比較本發(fā)明比對了3個結(jié)合物組合，為6價組合，含有肺炎球菌血清型6B、9V、14、18C、19F、23F，載體蛋白質(zhì)均為DT，其中組合1所有結(jié)合物都采用CDAP介導的氰基活化法制備，組合2所有結(jié)合物都采用胺還原法制備，組合3的結(jié)合物中，19F采用CDAP介導的氰基活化法制備，其他都采用胺還原法制備。將3個結(jié)合物組合分別皮下免疫NIH小鼠，結(jié)合物組合中6B濃度為10μg/ml，其余各型結(jié)合物濃度為5μg/ml，每只小鼠免疫0.1ml，共免疫3針，每針間隔2周，末次免疫后4周，采血測定各型特異性IgG抗體滴度，取2為底的對數(shù)進行分析，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)組合3的誘導的特異性抗體滴度優(yōu)于組合1和組合2。表1.不同結(jié)合物組合免疫小鼠的特異性IgG抗體水平6B9V1418C19F23F組合19.0413.249.1411.9413.849.24組合210.4413.0410.6412.449.6410.74組合313.2413.3414.3413.4513.9413.542.本發(fā)明制備15價肺炎球菌結(jié)合物組合小鼠免疫力實驗實驗的15價肺炎球菌結(jié)合物組合中，19A和19F結(jié)合物制備采用CDAP介導的氰基活化法，其他型別采用胺還原法，共采用了2種15價肺炎球菌結(jié)合物，一種含有磷酸鋁佐劑，一種不含任何佐劑，每毫升組合中含1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F多糖各4μg，含6B多糖8μg。實驗采用NIH小鼠，皮下免疫2針，間隔1月，劑量為0.1ml/次。免疫后14天采血，分離血清，測定15種特異性IgG抗體效價。以陰性對照平均值加2倍SD作為cutoff值判定血清抗體滴度，抗體滴度取對數(shù)后分析處理；以抗體4倍以上增長評定陽轉(zhuǎn)率，結(jié)果見表2。分析比較了含佐劑和不含佐劑組合誘導抗體滴度間的情況，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。表2.15價肺炎球菌結(jié)合物組合在小鼠中的免疫原性經(jīng)過比較實驗，本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的組合中，采用不同方法制備的疫苗優(yōu)于采用同一方法制備的疫苗，尤其是19A和19F采用CDAP介導的氰基活化法制備結(jié)合物，1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、23F采用胺還原法制備結(jié)合物。具體實施方式：下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述：實施例1：肺炎球菌細菌培養(yǎng)菌種開啟后，轉(zhuǎn)接至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，復蘇生長出菌落，轉(zhuǎn)接至小量改良胰大豆液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8-12小時，轉(zhuǎn)接至二代改良胰大豆菌種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)入含35000ml液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，期間維持pH值在7.0左右，至對數(shù)生長期末期時滅活菌體。實施例2：肺炎球菌莢膜多糖純化培養(yǎng)上清離心后，100K濾膜超濾濃縮，置換緩沖液至0.01mol/L磷酸緩沖液中，調(diào)pH值至6.8～7.4，按1％終濃度加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，充分攪拌均勻，放置過夜。離心收集沉淀(7F、14型收集上清)，加0.25mol/L的NaCl溶液解離CTAB(3型用0.35mol/L的NaCl溶液)，加入0.5％的NaI，充分攪拌，離心收集上清，用超濾膜超濾透析。經(jīng)羥基磷灰石層析，收集目標多糖，75％乙醇沉淀，乙醇、丙酮洗滌，干燥后為純化多糖。實施例3：純化多糖檢測結(jié)果對24種肺炎球菌莢膜多糖分別進行純化，每型3批，各批的質(zhì)量檢定結(jié)果如表3：表3.肺炎球菌莢膜多糖質(zhì)量檢測結(jié)果實施例4：胺還原法制備結(jié)合物溶解肺炎球菌多糖，經(jīng)醋酸溶液水解后，調(diào)pH值至6.4，加入高碘酸鈉氧化，甘油終止反應，透析或超濾去除小分子物質(zhì)，獲得氧化多糖。氧化多糖中加入ADH和硼氰化鈉至終濃度40mg/ml和2mg/ml，室溫反應3天，制備衍生物。衍生多糖和載體蛋白質(zhì)按一定質(zhì)量比混合，加入EDAC至終濃度0.02mol/L，維持pH值5.6反應150分鐘以上，制備結(jié)合物。結(jié)合物經(jīng)Sepharose4FF層析純化，收集V0附近洗脫峰，獲得結(jié)合物原液。實施例5：CDAP介導的氰基活化法制備結(jié)合物溶解肺炎球菌多糖，調(diào)整pH值至9.0左右，按質(zhì)量比1∶0.75加入CDAP乙腈溶液(濃度為100mg/ml)，維持pH值為9.00-10.00反應，與CDAP等體積加入2％三乙胺溶液，pH值為10.00-11.00，反應5min；調(diào)整pH值為8.60左右，按多糖蛋白質(zhì)量比1∶1加入蛋白，維持pH值8.6附近反應120分鐘以上，甘氨酸終止反應，超濾或透析后獲得多糖結(jié)合物。結(jié)合物經(jīng)sepharose4FF層析純化，收集V0附近洗脫峰，獲得結(jié)合物原液。實施例6：結(jié)合物檢測結(jié)果以CDAP介導的氰基活化法制備肺炎球菌19A和19F結(jié)合物，以胺還原法制備其他型別肺炎球菌結(jié)合物，共制備15種不同型別的結(jié)合物，每個型別3批，各批次結(jié)合物的檢測結(jié)果見表4：實施例7：凍干15價肺炎球菌結(jié)合物組合將15種肺炎球菌結(jié)合物原液按一定比例混合，至各型多糖含量為4μg/ml(6B為8μg/ml)，加入乳糖至終濃度0.5％，0.5ml/支分裝后，冷凍干燥，制備為15價肺炎球菌結(jié)合物組合。實施例8：吸附15價肺炎球菌結(jié)合物組合將15種肺炎球菌結(jié)合物原液按一定比例混合，以適量磷酸鋁佐劑吸附，配制為肺炎球菌各型多糖含量4μg/ml(6B為8μg/ml)，鋁離子含量不高于0.4mg/ml的半成品，0.5ml/支分裝制備為吸附15價肺炎球菌結(jié)合物組合。實施例9：15價肺炎結(jié)合物組合小鼠免疫原性采用NIH小鼠，皮下免疫3針，每針間隔2周，劑量為0.1ml。每針免疫后14天采血，分離血清，測定特異性血清效價。以陰性對照平均值加2倍SD作為cutoff值判定血清抗體滴度，取對數(shù)后進行數(shù)據(jù)分析，以抗體4倍以上增長評定陽轉(zhuǎn)率，不同型別各針次的陽轉(zhuǎn)率基本都可達到100％。表5.15價肺炎球菌結(jié)合物組合在小鼠免疫應答狀況當前第1頁1 2 3