本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仿生肝臟的制備方法和用途。

背景技術(shù)：

穿孔毒素(Pore-forming Toxins)是自然界中普遍存在的一類毒素，常見于動(dòng)物叮咬和細(xì)菌感染，如α-溶血毒素和蜂毒肽等。穿孔毒素可以通過(guò)破壞細(xì)胞膜、引發(fā)細(xì)胞溶解從而有效地進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部、破壞宿主細(xì)胞的完整性。體外解毒裝置(如人工肝)是用于清除人體血液毒素的一種重要手段，它們是基于物理或生物的原理(如分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)MARS、生物型人工肝)，常常用于急性肝衰竭、肝腎綜合癥的治療。但這些人工肝裝置具有價(jià)格昂貴、選擇性差以及可能導(dǎo)致機(jī)體水電解質(zhì)失衡等缺點(diǎn)，目前針對(duì)血液中的穿孔毒素并沒有有效的清除方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)血液中的穿孔毒素提供有效的清除手段。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案提供了一種可以選擇性清除血液中穿孔毒素的仿生肝臟。該仿生肝臟是填充了聚乙二炔納米顆粒的脫細(xì)胞肝臟支架。即該仿生肝臟為用聚乙二炔納米顆粒填充從而激活脫細(xì)胞肝臟支架制得的PDA-DLS仿生肝裝置。

其中，上述的仿生肝臟中，所述的聚乙二炔納米顆粒(PDA)是由10,12-二十五碳二炔酸(PCDA)與改性的10,12-二十五碳二炔酸(PCDA-EDEA-SA-NHS)以質(zhì)量比為150～200︰7～11混合后，在超聲作用下通過(guò)自組裝先形成納米粒子，繼而在254nm紫外光的照射下交聯(lián)形成結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的聚乙二炔納米顆粒。

進(jìn)一步，所述改性的10，12-二十五碳二炔酸的制備過(guò)程為：將N-羥基琥珀酰亞胺以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽加到含有PCDA的二氯甲烷中反應(yīng)生成活化酯，此活化酯再與1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷反應(yīng)過(guò)夜生成PCDA-EDEA(中間體)，PCDA-EDEA再與丁二酸反應(yīng)過(guò)夜得到改性的10，12-二十五碳二炔酸。

上述的仿生肝臟中所述的改性PDA納米顆粒表面擁有離去基團(tuán)N-羥基琥珀酰亞胺，此特殊的基團(tuán)有利于PDA納米顆粒與脫細(xì)胞肝臟中膠原纖維上的氨基發(fā)生反應(yīng)。

其中，上述的仿生肝臟中，所述的PDA納米顆粒為通過(guò)酰胺化反應(yīng)與脫細(xì)胞肝臟支架中膠原連接。

其中，上述的仿生肝臟中，所述PDA納米顆粒的粒徑為80～100nm。

其中，上述的仿生肝臟中，所述的脫細(xì)胞肝臟支架是由離體肝臟經(jīng)脫細(xì)胞處理得到的。離體肝臟的來(lái)源一般可為哺乳動(dòng)物的肝臟。本發(fā)明在實(shí)施例中以大鼠肝臟為例，但顯然脫細(xì)胞肝臟支架的來(lái)源不限于大鼠肝臟，比如可用兔、猴、豬、人等的離體肝臟。

本發(fā)明同時(shí)還提供了制備上述仿生肝臟的方法。該方法包括以下步驟：a、制備脫細(xì)胞肝臟支架；b、制備聚乙二炔納米顆粒；c、將修飾的PDA納米顆粒灌注入脫細(xì)胞肝臟支架，修飾的PDA納米顆粒連在脫細(xì)胞肝臟支架的膠原纖維上，得到仿生肝臟。

其中，上述方法中，所述步驟a的操作步驟為：將大鼠肝臟門靜脈和肝下下腔靜脈插入鐵氟龍插管扎緊，結(jié)扎肝上下腔靜脈，將肝臟完整地取出；通過(guò)門靜脈以2mL/min依次灌水4h、0.01％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液12h、0.1％SDS溶液12h、1％SDS溶液12h，蒸餾水12h，制備得到脫細(xì)胞肝臟支架。

其中，上述方法中，所述步驟b的操作步驟為：在室溫的環(huán)境下，將N-羥基琥珀酰亞胺以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽加到含有10,12-二十五碳二炔酸的二氯甲烷中，攪動(dòng)2小時(shí)后得到活化酯；將合成的活化酯溶液滴加到1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷中，并在室溫的環(huán)境下攪動(dòng)過(guò)夜；然后通用真空蒸餾的方式將二氯甲烷去除，并將產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱色譜法純化后得到PCDA-EDEA；將PCDA-EDEA與丁二酸混合并攪動(dòng)過(guò)夜，通過(guò)柱純化后獲得到PCDA-EDEA-SA-NHS；所述N-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、10,12-二十五碳二炔酸、1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷與丁二酸的質(zhì)量比為9～10︰10～11︰6～7︰19～20︰2～3。

將PCDA和PCDA-EDEA-SA-NHS的混合物置于熱水中，聲波處理10min；于4℃存放過(guò)夜后，將254nm紫外照射10min產(chǎn)生藍(lán)色PDA納米顆粒；所述10,12-二十五碳二炔酸與改性的10,12-二十五碳二炔酸的質(zhì)量比為150～200︰7～11；所述熱水的溫度為70～75℃。

其中，上述方法中，所述步驟c的操作步驟為：將DLS(脫細(xì)胞肝臟支架)通過(guò)門靜脈套管連接到灌注設(shè)備，下腔靜脈作為灌注出口；將聚乙二炔納米粒以2mL/min的速度通過(guò)門靜脈灌注到DLS中，直到脫細(xì)胞肝臟支架顏色不再變深。

本發(fā)明同時(shí)還提供了上述的仿生肝臟在清除血液中的穿孔毒素的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所提供的仿生肝臟保留了肝臟本身復(fù)雜的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)，所填充的納米顆?？梢赃x擇性捕獲穿孔毒素，二者所組成的解毒裝置能高效地去除血液中的穿孔毒素。且制備仿生肝臟的材料對(duì)血液成分沒有明顯的影響，不會(huì)誘導(dǎo)補(bǔ)體激活。本發(fā)明提供的仿生肝臟制備成本低廉，高效安全，顯示出在針對(duì)穿孔毒素的解毒治療中良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1 聚乙二炔(PDA)納米顆粒與DLS組成的仿生肝臟用于清除血液中穿孔毒素的示意圖。

圖2 DLS完全失去細(xì)胞但保持完整的膠原結(jié)構(gòu)和血管床。(A，B)：在新鮮肝臟中(FL)和脫細(xì)胞肝臟支架(DLS)中的總DNA(A)和細(xì)胞蛋白(B)量；(C)：DLS中的膠原纖維掃描電鏡圖(SEM)；(D)：FL和DLS中膠原含量的生化定量(NS:無(wú)顯著性差異)；(E)：灌注臺(tái)盼藍(lán)后DLS中間葉的血管樹；(F，G)：大血管的掃描電鏡圖(F)和匯管區(qū)(箭頭所指)的掃描電鏡圖(G)。比例尺：10微米(C)，5毫米(E)，10微米(F，G)。

圖3 PDA納米顆粒的制備。(A)：PCDA-EDEA-SA-NHS的合成方案示意圖；(B)：PDA納米粒雙層結(jié)構(gòu)和其組裝過(guò)程的原理示意圖：PCDA和PCDA-EDEA-SA-NHS在超聲作用下自組裝形成無(wú)色的納米顆粒，然后在254納米的紫外光照射下通過(guò)1，4加成反應(yīng)形成交替的二三鍵，從而發(fā)生聚合；(C)：PDA納米顆粒通過(guò)氨基化學(xué)連接到DLS內(nèi)的膠原纖維上的示意圖；(D，E)：PDA納米顆粒的粒度分布(D)和電位分布(E)圖；(F)：PDA納米顆粒的透射電鏡圖像。比例尺：50納米(F)

圖4 PDA納米顆粒在DLS中的固定。(A)：PDA納米顆粒在DLS中的固定效果(umPDA:未修飾的PDA納米顆粒，n＝3)；(B，C)：PDA納米顆粒從DLS中的釋放情況。灌注PDA納米溶液至DLS中，24h后測(cè)定DLS中PDA納米顆粒被蒸餾水沖洗出的量(B)，將新鮮人血循環(huán)灌入(持續(xù)20分鐘)含PDA納米顆粒的DLS裝置中，檢測(cè)血液中PDA納米顆粒的含量(C)；(D)：PDA-DLS裝置的外形圖。由于充滿了藍(lán)色的PDA納米顆粒，該裝置呈深藍(lán)色；(E)：PDA-DLS裝置和DLS(右上角)掃描電鏡的照片。比例尺：10毫米(D),200納米(E)

圖5 PDA-DLS裝置的解毒能力。(A)：100mm³新鮮肝臟或者PDA-DLS對(duì)不同濃度蜂毒肽溶液中和能力的定量評(píng)價(jià)，n＝3；(B)：定量評(píng)價(jià)分別用DLS、PDA-DLS裝置單向灌流蜂毒肽溶液(10μg/mL)的解毒效果，n＝3；(C)：定量評(píng)價(jià)PDA-DLS裝置對(duì)循環(huán)灌注的蜂毒肽溶液(10μg/mL)的解毒效果，n＝3；(D)：正常組、PDA-DLS組和蜂毒肽組三個(gè)組的溶血率測(cè)定，n＝3；(E)：正常組、PDA-DLS組和蜂毒肽組三組中總膽紅素含量。n＝3；(F)：正常組、PDA-DLS組和蜂毒肽組三組中間接膽紅素含量。n＝3；(G)：正常組(左)、PDA-DLS組(中)和蜂毒肽組(右)三組中紅細(xì)胞的形態(tài)。棘紅細(xì)胞(箭頭所指)與溶血有緊密相關(guān)性。比例尺：10微米(G)

圖6 PDA-DLS裝置的安全性評(píng)價(jià)。(A，B)：血液涂片瑞氏染色。正常血液中(A)和經(jīng)PDA-DLS裝置灌注后的血液中(B)的紅細(xì)胞(單箭頭所指)、淋巴細(xì)胞(雙箭頭所指)和中性粒細(xì)胞(三箭頭所指)；(C)：經(jīng)PDA-DLS灌注之前和灌注之后的紅細(xì)胞數(shù)量，n＝3；(D)：經(jīng)PDA-DLS灌注之前和灌注之后的白細(xì)胞數(shù)量，n＝3；(E)：經(jīng)PDA-DLS灌注之前和灌注之后的血小板數(shù)量，n＝3；(F，G)：經(jīng)PDA-DLS灌注之前和灌注之后的總蛋白(F)和白蛋白(G)的量，n＝3；(H-J)：C3(H),C4(I)和SC5b9(J)在未經(jīng)任何處理的(NC)血液中、經(jīng)過(guò)PDA-DLS裝置(PDA-DLS)處理過(guò)的血液中和經(jīng)過(guò)FL處理過(guò)的血液中的含量，n＝3，NS:無(wú)顯著性差異。比例尺：20微米(A,B)。

具體實(shí)施方式

肝臟是人體內(nèi)最重要的解毒器官，活體肝臟的特殊微結(jié)構(gòu)可幫助肝細(xì)胞高效地清除血液中的毒素，這為本發(fā)明設(shè)計(jì)用于有效解毒的類肝裝置提供了思路。本發(fā)明創(chuàng)造性地采用PDA納米顆粒填充動(dòng)物的脫細(xì)胞肝臟，獲得“再細(xì)胞化”動(dòng)物的脫細(xì)胞肝臟的效果，構(gòu)建了一個(gè)仿生肝裝置來(lái)對(duì)血液中的靶毒素進(jìn)行清除。本發(fā)明中使用的PDA納米顆粒是由10，12-二十五碳二炔酸(PCDA)自組裝而成的囊泡狀納米顆粒。PDA納米顆粒表面是由二三鍵交替形成的π共軛主鏈構(gòu)成的，它類似于細(xì)胞膜的表面，可以誘導(dǎo)、捕獲及中和穿孔毒素。脫細(xì)胞肝臟支架(DLS)保留了肝臟原有的形狀和三維結(jié)構(gòu)，是一個(gè)天然精密的微流體系統(tǒng)。

而穿孔毒素具有細(xì)胞破壞能力，它們可以通過(guò)在細(xì)胞膜上形成孔洞改變細(xì)胞膜的通透性從而破壞細(xì)胞。由于PDA納米顆粒具有尺寸微小及制備靈活等優(yōu)點(diǎn)，可通過(guò)對(duì)其進(jìn)行合理地設(shè)計(jì)從而用于毒素的捕獲與清除，因此，本發(fā)明創(chuàng)造性地將將可回收的PDA納米顆粒和流動(dòng)的循環(huán)系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，達(dá)到激活脫細(xì)胞肝臟，選擇性地清除血液中的穿孔毒素的目的，這種技術(shù)在穿孔毒素的解毒中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明提供的仿生肝臟是填充了聚乙二炔納米顆粒的脫細(xì)胞肝臟支架。即是用聚乙二炔納米顆粒填充從而激活脫細(xì)胞肝臟支架制得PDA-DLS仿生肝裝置。

其中，上述的仿生肝臟中，所述的聚乙二炔納米顆粒(PDA)是由10,12-二十五碳二炔酸(PCDA)與改性的10,12-二十五碳二炔酸(PCDA-EDEA-SA-NHS)以質(zhì)量比為150～200︰7～11混合后，在超聲作用下通過(guò)自組裝先形成納米粒子，繼而在254nm紫外光的照射下交聯(lián)形成結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的聚乙二炔納米顆粒。

進(jìn)一步，上述改性的10，12-二十五碳二炔酸的制備過(guò)程為：將N-羥基琥珀酰亞胺以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽加到含有PCDA的二氯甲烷中反應(yīng)生成活化酯，此活化酯再與1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷反應(yīng)過(guò)夜生成PCDA-EDEA(中間體)，PCDA-EDEA再與丁二酸反應(yīng)過(guò)夜得到改性的10，12-二十五碳二炔酸。

上述的仿生肝臟中所述的改性PDA納米顆粒表面擁有離去基團(tuán)N-羥基琥珀酰亞胺，此特殊的基團(tuán)有利于PDA納米顆粒與脫細(xì)胞肝臟中膠原纖維上的氨基發(fā)生反應(yīng)。所述的PDA納米顆粒為通過(guò)酰胺化反應(yīng)與脫細(xì)胞肝臟支架中膠原連接。

上述的仿生肝臟中，所述PDA納米顆粒的粒徑優(yōu)選為80～100nm。

上述的仿生肝臟中，所述的脫細(xì)胞肝臟支架是由離體肝臟經(jīng)脫細(xì)胞處理得到的。離體肝臟的來(lái)源一般可為哺乳動(dòng)物的肝臟。本發(fā)明在實(shí)施例中以大鼠肝臟為例，但顯然脫細(xì)胞肝臟支架的來(lái)源不限于大鼠肝臟，比如可用兔、猴、豬、人等的離體肝臟。

本發(fā)明同時(shí)還提供了制備上述仿生肝臟的方法。該方法包括以下步驟：a、制備脫細(xì)胞肝臟支架；b、制備聚乙二炔納米顆粒；c、將修飾的PDA納米顆粒灌注入脫細(xì)胞肝臟支架，修飾的PDA納米顆粒連在脫細(xì)胞肝臟支架的膠原纖維上，得到仿生肝臟。

本發(fā)明仿生肝臟的制備方法，具體的可包括以下步驟：

a、制備脫細(xì)胞肝臟支架：將大鼠肝臟門靜脈和肝下下腔靜脈插入鐵氟龍插管扎緊，結(jié)扎肝上下腔靜脈，將肝臟完整地取出；通過(guò)門靜脈以2mL/min依次灌水4h、0.01％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液12h、0.1％SDS溶液12h、1％SDS溶液12h，蒸餾水12h，制備得到脫細(xì)胞肝臟支架；

b、制備聚乙二炔納米顆粒：在室溫的環(huán)境下，將N-羥基琥珀酰亞胺以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽加到含有10,12-二十五碳二炔酸的二氯甲烷中，攪動(dòng)2小時(shí)后得到活化酯；將合成的活化酯溶液滴加到1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷中，并在室溫的環(huán)境下攪動(dòng)過(guò)夜；然后通用真空蒸餾的方式將二氯甲烷去除，并將產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱色譜法純化后得到PCDA-EDEA；將PCDA-EDEA與丁二酸混合并攪動(dòng)過(guò)夜，通過(guò)柱純化后獲得到PCDA-EDEA-SA-NHS；將PCDA和PCDA-EDEA-SA-NHS的混合物置于熱水中，聲波處理10min；于4℃存放過(guò)夜后，將254nm紫外照射10min產(chǎn)生藍(lán)色PDA納米顆粒；

c、將DLS(脫細(xì)胞肝臟支架)通過(guò)門靜脈套管連接到灌注設(shè)備，下腔靜脈作為灌注出口；將聚乙二炔納米粒以2mL/min的速度通過(guò)門靜脈灌注到DLS中，直到脫細(xì)胞肝臟支架顏色不再變深，得到仿生肝臟。

其中，上述方法步驟b所述N-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、10,12-二十五碳二炔酸、1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷與丁二酸的質(zhì)量比為9～10︰10～11︰6～7︰19～20︰2～3。所述10,12-二十五碳二炔酸與改性的10,12-二十五碳二炔酸的質(zhì)量比為150～200︰7～11。所述熱水的溫度為70～75℃。

本發(fā)明的研究成果表明，由PDA納米粒和DLS組合而成的仿生肝臟(稱為PDA-DLS裝置)可以在體外高效地清除血液中的穿孔毒素，且不影響血液成分及激活補(bǔ)體因子。此項(xiàng)工作能為今后臨床體外解毒裝置的研發(fā)及應(yīng)用提供新方法和新技術(shù)。

本發(fā)明同時(shí)還提供了上述的仿生肝臟在清除血液中的穿孔毒素的應(yīng)用。根據(jù)上述介紹的原理和下述的試驗(yàn)證據(jù)，顯然本發(fā)明技術(shù)對(duì)α-溶血毒素和蜂毒肽等穿孔毒素都能有很好的清除效果。

以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1 PDA-DLS仿生肝裝置的構(gòu)建

首先采用脫細(xì)胞技術(shù)制備DLS，然后將PDA納米顆粒灌注至DLS，PDA納米顆粒通過(guò)與膠原纖維上的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從而固定在DLS里面，最后獲得PDA-DLS裝置。

PDA納米顆粒的制備步驟為：在室溫的環(huán)境下，將N-羥基琥珀酰亞胺(920毫克，7.99毫摩爾)以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1020毫克，5.32毫摩爾)加到含有PCDA(500毫克)的二氯甲烷(100毫升)中，攪拌2小時(shí)后得到活化酯；將合成的活化酯溶液逐滴加入至1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷(1980毫克，13.35毫摩爾)中，并在室溫的環(huán)境下攪拌過(guò)夜；采用真空蒸餾的方式將二氯甲烷去除，并將產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱色譜法純化后得到PCDA-EDEA；將其與丁二酸(230毫克)混合并攪拌過(guò)夜，通過(guò)柱純化后獲得PCDA-EDEA-SA-NHS；將PCDA(190毫克)和PCDA-EDEA-SA-NHS(10毫克)的混合物置于70℃的蒸餾水中，聲波處理10分鐘后，于4℃存放過(guò)夜，254納米紫外照射10分鐘得到藍(lán)色的PDA納米粒。

由大鼠肝臟通過(guò)從門靜脈長(zhǎng)時(shí)間灌注SDS，可得到透明的保留了肝臟形狀的DLS。在DLS中未檢測(cè)出殘留的DNA和細(xì)胞蛋白(圖2A,B)，但保留了膠原纖維結(jié)構(gòu)(圖2C)和膠原成分(圖2D)。將臺(tái)盼藍(lán)染料從門靜脈注入，便可將DLS完整的微脈管系統(tǒng)展現(xiàn)出來(lái)(圖2E)。在掃描電鏡下也直觀地觀察到DLS中的大血管和小血管同于原肝臟中的門脈三聯(lián)管(圖2F,G)。由此表明，脫細(xì)胞過(guò)程可以選擇性地清除肝臟中的細(xì)胞成分，并保留細(xì)胞外基質(zhì)成分和DLS中完整的血管網(wǎng)絡(luò)。

得到DLS后，用PDA納米顆粒將其填充，PDA納米?？商娲糠指渭?xì)胞的功能。通過(guò)往大鼠DLS中灌注50毫克的PDA納米粒，制造出PDA-DLS裝置，它的外觀如圖4D所示。

PDA納米顆粒經(jīng)過(guò)修飾，使其表面擁有離去基團(tuán)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，它易和膠原上的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(圖3C)。合成的納米顆粒平均粒徑約為100納米(圖3D)，Zeta電勢(shì)為-20mV(圖3E)。在透射電鏡下，納米顆粒呈現(xiàn)出囊泡結(jié)構(gòu)，粒徑在80-100納米(圖3F)。

如果PDA納米粒不經(jīng)過(guò)修飾則不能有效地被DLS截留。用比色法檢測(cè)流出液中PDA的含量發(fā)現(xiàn)修飾后的PDA納米粒被100％保留在了DLS中(圖4A)。PDA-DLS裝置被蒸餾水或者血液進(jìn)一步地沖洗，可以看到修飾過(guò)的PDA納米粒不會(huì)被洗脫出來(lái)，而未經(jīng)修飾的PDA納米粒會(huì)被洗脫出來(lái)(圖4B,C)。通過(guò)透射電鏡可以觀察到PDA納米粒被保留在PDA-DLS中的膠原纖維上(圖4E)。因此，PDA納米粒的化學(xué)修飾對(duì)于將其高效地保留在DLS中是必不可少的步驟。

實(shí)施例2 PDA-DLS仿生肝裝置的體外解毒能力

通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)證明實(shí)施例一中所制備得到的PDA-DLS裝置對(duì)穿孔毒素的解毒能力。

以蜂毒肽作為模式穿孔毒素。以新鮮肝臟作為對(duì)照組，檢測(cè)PDA-DLS裝置對(duì)蜂毒肽溶液的解毒能力。首先，我們測(cè)試了PDA-DLS裝置和新鮮肝臟在靜置的蜂毒肽溶液中的解毒能力。PDA-DLS裝置和新鮮肝臟分別被切成100mm³的小塊，設(shè)置不同濃度的蜂毒肽(200μL)組，將切好的組織塊與之分別孵育60分鐘，然后將孵育的溶液離心后取上清液，將上清液加入到大鼠的紅細(xì)胞液中進(jìn)行紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)，孵育30分鐘后離心，檢測(cè)各組上清液的OD值。如圖5A所示，PDA-DLS裝置和新鮮肝臟對(duì)蜂毒肽的最大解毒濃度分別為80μg/mL和10μg/mL.因此，PDA-DLS對(duì)于蜂毒肽的解毒能力差不多是新鮮肝臟的8倍以上。

然后對(duì)PDA-DLS裝置在灌流狀態(tài)下對(duì)蜂毒肽溶液的解毒能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。蜂毒肽溶液(10μg/mL，100mL)經(jīng)門靜脈以2mL/min的流速分別灌入PDA-DLS和DLS中。每隔5分鐘收集一次從下腔靜脈流出的液體，進(jìn)行紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)，孵育30分鐘后離心，檢測(cè)各組上清液的OD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDA-DLS可以完全清除單向灌流溶液中的蜂毒肽，但DLS并不能明顯地減少灌流液中的毒素。解毒能力比較如圖5B所示。PDA-DLS裝置在單向灌流蜂毒肽溶液中的解毒能力為100％，而DLS的解毒能力幾乎為0。這一結(jié)果意味著PDA-DLS裝置的解毒能力主要是通過(guò)PDA納米顆粒的作用。

為了模擬生理?xiàng)l件下肝臟的解毒過(guò)程，我們考察了PDA-DLS裝置對(duì)循環(huán)灌注的蜂毒肽溶液的解毒能力。將置于溶液池的蜂毒肽溶液(10μg/mL)由門靜脈以2mL/min的流速灌入到PDA-DLS裝置中，從下腔靜脈流出的溶液又回收至溶液池，再次灌注入門靜脈。每隔25分鐘抽取溶液池中的蜂毒肽溶液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)，如圖5C所示，PDA-DLS可幾乎將循環(huán)灌注的蜂毒肽完全清除。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，循環(huán)灌注蜂毒肽溶液，75分鐘后解毒效果可以達(dá)到100％(單向灌流時(shí)間的1.5倍)(圖5C)。這一結(jié)果證明PDA-DLS可以高效中和循環(huán)灌注中的蜂毒肽的毒性。

實(shí)施例3 PDA-DLS仿生肝裝置清除人血中穿孔毒素的能力

為了評(píng)價(jià)PDA-DLS對(duì)血液的解毒能力，將實(shí)施例一中制備的PDA-DLS進(jìn)行血液中蜂毒肽的清除實(shí)驗(yàn)。

在正常人血中事先加入蜂毒肽(10μg/mL)，經(jīng)PDA-DLS循環(huán)灌注20分鐘后，對(duì)正常人血(正常組)、經(jīng)PDA-DLS循環(huán)后的血液(PDA-DLS組)、未經(jīng)PDA-DLS循環(huán)的含有蜂毒肽的血液(蜂毒肽組)進(jìn)行血常規(guī)和血生化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明PDA-DLS組的紅細(xì)胞裂解率明顯低于蜂毒肽組(圖5D)?？偰懠t素和間接膽紅素檢測(cè)結(jié)果表明PDA-DLS裝置組的裂解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于蜂毒肽組(圖5E,F)。同時(shí)，用血液涂片觀察每個(gè)組的血細(xì)胞形態(tài)，正常紅細(xì)胞有著光滑雙面凹陷的形狀，蜂毒肽將正常的紅細(xì)胞變?yōu)榧瑺罴t細(xì)胞，與溶血有緊密的關(guān)聯(lián)。在PDA-DLS裝置組，棘狀紅細(xì)胞的比例明顯低于蜂毒肽組(圖5G)。由此說(shuō)明PDA-DLS裝置能有效地清除循環(huán)血液中的蜂毒肽，從而保護(hù)紅細(xì)胞免受蜂毒肽破壞。

實(shí)施例4 PDA-DLS仿生肝裝置的安全性評(píng)價(jià)

為了評(píng)估PDA-DLS仿生肝臟對(duì)正常人血的影響，將正常人血(100毫升)經(jīng)門靜脈以2mL/min的流速循環(huán)灌注到PDA-DLS裝置中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌注后的血細(xì)胞維持了正常的細(xì)胞形態(tài)(圖6A,B)，并且血細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯變化(圖6C,D,E)。另外，血生化分析顯示血液中的總蛋白和白蛋白在灌注過(guò)程中也沒有明顯減少(圖6F,G)。

對(duì)于補(bǔ)體的激活的能力，將PDA-DLS和新鮮大鼠肝臟作為對(duì)比，以正常血液做空白對(duì)照(NC組)。人的血液經(jīng)大鼠新鮮肝臟灌注后，其中補(bǔ)體C3和C4明顯減少，而補(bǔ)體SC5b9的含量升高，這意味著人血液中的補(bǔ)體被新鮮肝臟的異質(zhì)性激活(圖6H、I、J)。而經(jīng)PDA-DLS灌注處理過(guò)的血液中補(bǔ)體C3、C4和SC5b9的含量和正常血液中的含量幾乎一致(圖6H、I、J)。因此，PDA-DLS在對(duì)血液中的穿孔毒素進(jìn)行清除時(shí)，不會(huì)明顯影響正常血液的成分以及激活補(bǔ)體因子。