本發(fā)明涉及一種中藥提取物，具體地涉及一種從刺五加中提取的有效物質(zhì)組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：刺五加(RadixAcanthopanacisSenticosl)為五加科五加屬植物的根、根莖及莖，主要分布在中國東北部、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、日本北海道及朝鮮等地。始見于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名為五加參、老虎釕自、刺拐棒?！侗静菥V目》記載刺五加能“補(bǔ)力益精，明目下氣”，能“補(bǔ)五勞七傷，久服輕身耐老”，具有益氣健脾，補(bǔ)腎安神之功效。刺五加主要化學(xué)成分有苯丙素類(木脂素類、香豆素類、苯丙酸類)、三萜類、黃酮類、另有含氮化合物、多糖、脂肪酸及其酯類、氨基酸、微量元素以及揮發(fā)性成分等。刺五加總苷具有7種型式，其主要活性成分為刺五加苷B、刺五加苷E：刺五加苷B又稱紫丁香苷(Syringin)，相對含量最多，也是刺五加中的主要藥效成分之一，具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、護(hù)肝和釋放乙酰膽堿，增加胰島素分泌，防輻射等作用；刺五加苷E具有緩解壓力、抗焦慮、抗應(yīng)激、抗?jié)兒涂蛊诘茸饔?。刺五加能調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝的功能，提高機(jī)體對有害刺激因子的非特異性抵抗力，能增強(qiáng)垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的功能，提高機(jī)體的適應(yīng)性和耐受性，減低體內(nèi)外多種致病因子對機(jī)體的損害，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)即有興奮作用又有抑制作用。近年來由于其在臨床上廣泛的應(yīng)用所引起的不良反應(yīng)時有報道。其不良反應(yīng)類型主要有過敏反應(yīng)、過敏性休克、全身性過敏反應(yīng)等，臨床主要表現(xiàn)為頭暈、頭痛、胸悶、呼吸困難、血壓下降、煩躁，部分患者伴有皮疹、全身瘙癢、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、鼻塞、流涕等。造成上述不良反應(yīng)的原因主要是目前刺五加制品中含有的雜質(zhì)多、有效物質(zhì)成分及含量少，并且含有致敏物質(zhì)。本方提供一種刺五加有效物質(zhì)組合物及其制備方法能有效解決上述問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種刺五加有效物質(zhì)的組合物及該組合物的制備方法，使用該方法制備獲得的刺五加有效物質(zhì)組合物有效成分含量高，雜質(zhì)含量少，質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明創(chuàng)造所述的刺五加有效物質(zhì)的組合物，包含原兒茶素、刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷E、異嗪皮啶、5-咖啡?？鼘幩帷?-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸。進(jìn)一步地，所述的刺五加有效物質(zhì)的組合物包含重量比為原兒茶素4-5份、刺五加苷B22-24份、綠原酸50-52份、刺五加苷E25-26份、異嗪皮啶3-3.5份、5-咖啡酰奎寧酸11-15份、4-咖啡酰奎寧酸10-12份、咖啡酸7-9份。更進(jìn)一步地，所述的刺五加有效物質(zhì)的組合物包含重量比為原兒茶素4份、刺五加苷B23份、綠原酸51份、刺五加苷E25份、異嗪皮啶3.5份、5-咖啡?？鼘幩?2份、4-咖啡酰奎寧酸11份、咖啡酸8份。本發(fā)明創(chuàng)造所述的刺五加有效物質(zhì)的組合物，制備方法為取刺五加提取液適當(dāng)濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為18-25℃，流速為0.8ml/mi，收集洗脫液，濃縮干燥后得到有效組分；洗脫過程中流動相梯度如下：本發(fā)明還提供一種制備上述刺五加有效物質(zhì)的組合物的方法，如下：取刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為18-25℃，流速為0.8ml/mi，收集洗脫液，濃縮干燥后得到有效組分；洗脫過程中流動相梯度如下：將上述含有刺五加有效物質(zhì)的組合物制備成制劑，所述制劑由刺五加有效物質(zhì)組合物組成，或由刺五加組合物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成。所述制劑為注射液、凍干粉針劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑或合劑。上述刺五加有效物質(zhì)的組合物制劑，可應(yīng)用于制備治降血糖藥物中。本技術(shù)方案和現(xiàn)有技術(shù)相比其優(yōu)勢在于：1、本發(fā)明的提取分離工藝中使用了液相色譜分離，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分。2、本發(fā)明提供的刺五加有效組分化學(xué)成分及其含量明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機(jī)制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3、本發(fā)明提供技術(shù)方案制備所得刺五加有效物質(zhì)組合物中的有效物質(zhì)成分及含量高，該組合具有顯著的降糖作用，明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)所制備的產(chǎn)品。4、本發(fā)明提供技術(shù)方案制備所得刺五加有效物質(zhì)組合物制備所的注射劑在過敏反應(yīng)中安全性更高于市售刺五加注射劑。5、本發(fā)明提供的方法，和現(xiàn)有技術(shù)相比不僅能顯著提高終產(chǎn)物產(chǎn)品質(zhì)量，獲得較高有效成分含量的組合物，還具有操作簡單、反應(yīng)周期短、安全高效的優(yōu)點(diǎn)可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方式除非另有定義，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。通常，本發(fā)明使用的命名及實(shí)驗(yàn)操作方法都是本領(lǐng)域公知的或常用的，若未特別指明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑及材料均可市售獲得。為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1：取26g刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為18℃，流速為0.8ml/min，在0-145分鐘時間段內(nèi)收集洗脫液，濃縮干燥后得刺五加有效組分組合物4.06g；洗脫過程中流動相梯度如下：實(shí)施例2：取25g刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為25℃，流速為0.8ml/min，在0-145分鐘時間段內(nèi)收集洗脫液，濃縮干燥后得刺五加有效組分組合物3.91g；洗脫過程中流動相梯度如下：實(shí)施例3：取26g刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為20℃，流速為0.8ml/min，在0-145分鐘時間段內(nèi)收集洗脫液，濃縮干燥后得刺五加有效組分組合物4.12g；洗脫過程中流動相梯度如下：實(shí)施例4：取25g刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為20℃，流速為0.8ml/min，在0-145分鐘時間段內(nèi)收集洗脫液，濃縮干燥后得刺五加有效組分組合物4.03g；洗脫過程中流動相梯度如下：實(shí)施例5：取25g刺五加提取液濃縮后上樣于制備柱，通過液相色譜進(jìn)行分離，制備色譜的分離條件為色譜柱UltmateXB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，C18預(yù)柱；以0.5％甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性洗脫梯度，柱溫為20℃，流速為0.8ml/min，在0-145分鐘時間段內(nèi)收集洗脫液，濃縮干燥后得刺五加有效組分組合物4.05g；洗脫過程中流動相梯度如下：實(shí)施例6：有效成分含量的測定測定儀器與試藥Agilent1100高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器和AgilentChemstation工作站；MILLIPORE超純水制備儀；MettlerAE-240電子天平；KQ-250型超聲波清洗器；Minispin小型高速離心機(jī)。對照品原兒茶酸(純度99.23％)、刺五加苷B(純度98.93％)、綠原酸(純度99.05％)、刺五加苷E(純度98.85％)、異嗪皮啶(純度99.34％)、5-咖啡?？鼘幩?純度99.12％)、4-咖啡?？鼘幩?純度98.74％)、咖啡酸(純度98.96％)，均購于市售。混合對照品溶液配制：取上述原兒茶酸、刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷E、異嗪皮啶、5-咖啡?？鼘幩帷?-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸的對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1ml含原兒茶酸187μg、刺五加苷B303μg、綠原酸547μg、刺五加苷E723μg、異嗪皮啶102μg、5-咖啡?？鼘幩?47μg、4-咖啡?？鼘幩?47μg、咖啡酸192μg乙腈、甲醇為色譜純；Milli-Q純化水；冰醋酸為色譜純。檢測組：按本技術(shù)方案實(shí)施例1-5所述，制備獲得的組合物，編號分別為檢測組1-5；檢測組溶液配制：稱取本效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度搖勻即可。對比組：按照專利文獻(xiàn)公開號CN102579532中實(shí)施例1-4刺五加組合物制備方法部分所述，制備獲得的組合物，編號分別為對比組1-4。對比組溶液配制：稱取本效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度搖勻即可。色譜條件：色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.5醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0-10min，10％A-10％A；10-20min，10％A-13.5％A；20-70min，13.5％A-15.5％A)；流速：0.6ml/min；柱溫：24℃；檢測波長：270nm(0-51min)、345nm(51min-70min)；進(jìn)樣量：20μL。含量檢測結(jié)果如下：結(jié)果顯示：與對比組1-4組相比，本發(fā)明提供的刺五加組合物檢測組1-5中的原兒茶酸、刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷E、異嗪皮啶、5-咖啡?？鼘幩帷?-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸的有效物質(zhì)成分及含量均大大增加。實(shí)施例7：對四氧嘧啶所致小鼠血糖升高的影響實(shí)驗(yàn)動物：昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)試劑：四氧嘧啶，購自Sigma公司。實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組、模型組、實(shí)施例1-5組、對比例1-2組。對比例組：按照專利文獻(xiàn)公開號CN102579532中實(shí)施例1-2刺五加組合物制備方法部分所述，制備獲得的組合物，編號分別為對比組1-2。實(shí)驗(yàn)方法模型制備：將四氧嘧啶用生理鹽水配成2％水溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。取昆明種小鼠，雌雄各半，按四氧嘧啶溶液50mg/kg的劑量，對禁食12小時后的小鼠進(jìn)行尾靜脈注射。連續(xù)飼養(yǎng)3天后，禁食12小時，眼眶采血，分離血清，測定空腹血糖，以血糖大于14mmol/l作為糖尿病模型小鼠。分組給藥：取糖尿病模型小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為實(shí)施例1-5組、對比例1-2組和模型組；另取重量相近正常昆明種小鼠10，雌雄各半，作為空白對照組。實(shí)施例1-5組、對比例1-2組分別灌胃給予實(shí)施例1-5的刺五加組合物、對比例1-2的提取物，劑量均為1.0g生藥量/kg，模型組和空白對照組分別按照15ml/kg體重灌胃給予同體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃15天，每天觀察小鼠外貌特征的改變。試驗(yàn)結(jié)束后對試驗(yàn)動物禁食12小時，眼眶靜脈叢采血，測定空腹血糖。統(tǒng)計學(xué)處理：進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、一般觀察：在試驗(yàn)結(jié)束后，四氧嘧啶模型組動物有明顯多飲、多尿、體型消瘦、毛發(fā)失去光澤、蜷臥弓背沒精神等現(xiàn)象。而空白對照組動物精神狀況良好，毛發(fā)光澤，生長發(fā)育正常。實(shí)施例1-4組動物外貌特征得到顯著改善，對比例1-2組動物外貌特征有所改善。2、血糖值的改變：對四氧嘧啶所致小鼠血糖升高的影響，見下表：組別血糖值空白對照組6.78±0.52模型組21.23±1.31實(shí)施例1組12.64±0.71實(shí)施例2組13.56±0.68實(shí)施例3組12.71±0.65實(shí)施例4組13.42±0.75實(shí)施例5組13.22±0.67對比例1組19.32±0.81對比例2組18.52±0.84實(shí)施例組與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與對比例1組相比，P＜0.05，與對比例2組相比，P＜0.05。結(jié)果顯示：實(shí)施例1-5組血糖濃度與四氧嘧啶模型組比較有極顯著差異(p＜0.01)，對比例1-2組與四氧嘧啶模型組比較有顯著差異(p＜0.05)。實(shí)施例1-5組血糖濃度與對比例1-2組比較有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的刺五加組合物具有顯著的降糖作用，效果優(yōu)于公開號CN102579532中實(shí)施例產(chǎn)品。實(shí)施例8：過敏試驗(yàn)對比研究取實(shí)施例1-5所得刺五加有效組分組合物，制備刺五加注射液。注射液制備方法：取實(shí)施例3制備所得刺五加有效組分組合物，加注射用水使溶解，用40％的NaOH溶液調(diào)pH值至5.5，攪拌均勻后加熱，加入0.2％的活性炭，煮沸吸附15分鐘，冷卻至50℃以下用40％的NaOH溶液調(diào)pH值至5.7，補(bǔ)加新鮮注射用水至含生藥5g/ml。經(jīng)0.45μm濾膜過濾至澄清，灌裝，115℃高壓滅菌40分鐘。冷凍，緩化后冷藏20天，常溫放置3.5個月。經(jīng)0.65μm濾芯過濾，加注射用水至含生藥5g/ml，調(diào)pH值至5.0，加入活性炭脫色，過濾，調(diào)pH值至5.0，補(bǔ)加注射用水至含生藥5g/ml，分別經(jīng)0.45μm、0.22μm濾芯精濾，灌封，115℃下30分鐘滅菌，即得，分別編號實(shí)驗(yàn)組。對比組：市售刺五加注射液，編號對比組。方法：取體重250-300g豚鼠24只，隨機(jī)分為四組，每組6只。陰性對照組：腹腔注射0.9％氯化鈉注射液；陽性對照組：腹腔注射5％新鮮蛋清溶液。試驗(yàn)A組：腹腔注射實(shí)驗(yàn)組樣品；試驗(yàn)B組：腹腔注射對比組市售刺五加注射液。給藥劑量均為0.5ml/只。隔日一次，共三次。首次給藥后14天，21天，每組隨機(jī)取2只，試驗(yàn)A組和B組分別由耳緣靜脈注射實(shí)驗(yàn)組樣品和對比組市售刺五加注射液；陰性對照組注射0.9％氯化鈉注射液，陽性對照組注射5％新鮮蛋清溶液。給藥劑量均為1.0ml/只。給藥后立即觀察動物有無噴嚏、搔鼻、干咳或咳嗽、顫抖、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡的過敏反應(yīng)，觀察時間為15分鐘。過敏反映分級主要分為0-4級，其反應(yīng)癥狀分別如下：0級過敏反映癥狀：無明顯反應(yīng)；1級過敏反映癥狀：具有輕微抓鼻、顫抖或豎毛；2級過敏反映癥狀：有幾次咳嗽，有抓鼻顫抖或豎毛；3級過敏反映癥狀：多次或連續(xù)咳嗽，伴有呼吸困難或痙攣、抽搐；4級過敏反映癥狀：痙攣、抽搐、大小便失禁、休克、死亡；結(jié)果判斷準(zhǔn)則：如兩次豚鼠均無明顯反應(yīng)，認(rèn)為受試藥物過敏試驗(yàn)合格，反映級數(shù)達(dá)2級以上(包括2級)時，認(rèn)為受試藥物過敏反映不合格。試驗(yàn)結(jié)果：注射0.9％氯化鈉注射液的陰性對照組的豚鼠過敏反應(yīng)級數(shù)均為0，無過敏反應(yīng)；注射5％蛋清的陽性對照組豚鼠出現(xiàn)噴嚏、搔鼻、干嘔或咳嗽、抽搐、顫抖、呼吸困難、大小便失禁、休克等過敏反應(yīng)，且皆于15min內(nèi)死亡，過敏反應(yīng)級數(shù)為4級，試驗(yàn)條件成立。注射實(shí)驗(yàn)組樣品試驗(yàn)A組的6只豚鼠均無過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)級數(shù)均為0。注射對比組市售刺五加注射液的試驗(yàn)B組的6只豚鼠中有2只豚鼠出現(xiàn)輕微抓鼻、豎毛現(xiàn)象，過敏反應(yīng)級數(shù)為1。表明實(shí)驗(yàn)組樣品的安全性高于市售刺五加注射液。同時使用實(shí)施例2-5制備所得的刺五加有效組分組合物，制備刺五加注射液，和市售刺五加注射液進(jìn)行本實(shí)施例的試驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得出同樣的結(jié)論。應(yīng)當(dāng)說明的是，雖然本發(fā)明以較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟習(xí)此項技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3