本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細(xì)胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性腎衰竭是臨床的常見重大疾病，是指由各種原因引起的腎臟功能在短期內(nèi)急劇降低，腎小球過濾迅速下降至正常的50％，血尿素氮及血肌酐迅速增高，導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂、水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)的臨床綜合征，臨床死亡率達(dá)50％-80％。
急性腎衰竭的治療原則主要包括：①一般治療，臥床休息、充分補(bǔ)充營養(yǎng)和熱量；②維持水、電解質(zhì)及酸堿平衡，恢復(fù)有效循環(huán)血容量，預(yù)防多臟器的損傷及并發(fā)癥的出現(xiàn)；③控制感染選用感染抗生素；④透析治療包括血液透析、血液濾過或腹膜透析，及早清除毒素對機(jī)體各系統(tǒng)的損害，有利于損傷細(xì)胞的修復(fù)；⑤積極治療原發(fā)病，及早發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致急性腎衰竭的危險(xiǎn)因素，并迅速去除，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生修復(fù)。
在過去的數(shù)十年，盡管血液凈化技術(shù)和危重醫(yī)學(xué)有了很大的發(fā)展，在急性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制和治療上也進(jìn)行了諸多研究，但治療的手段仍然有限，導(dǎo)致臨床上缺乏行之有效的治療方法。近年來，隨著生物療法的涌現(xiàn)，為急性腎衰竭的治療提供了新的思路，如何促進(jìn)壞死后的腎組織上皮細(xì)胞再生與休復(fù)，降低急性腎衰竭的病死率，是治療急性腎衰竭疾病的新的研究方向。因此，細(xì)胞治療方法，有可能成為提高急性腎衰竭治愈率的有效方法之一。
干細(xì)胞是生物個(gè)體生長和發(fā)育的先驅(qū)，是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩類。胚胎干細(xì)胞是一種全能的干細(xì)胞，具有分化為成體動(dòng)物不同類型細(xì)胞和各種組織器官的能力，由于存在倫理學(xué)、致瘤性及免疫排斥等因素的影響，胚胎干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中受到限制。成體干細(xì)胞是一種或多種組織器官的起源細(xì)胞，來源于骨髓、臍帶、胎盤和脂肪等組織。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞的一種，其仍具有分化潛能，只是失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，從而成功避開了使用胚胎干細(xì)胞的諸多限制，成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細(xì)胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)對腎臟受損組織的功能修復(fù)，對急、慢性腎衰竭均有一定的治療作用，特別是在某些特殊環(huán)境中或某些生物因子的作用下，其自身活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)；維生素E通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，其經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性使其具有廣闊的應(yīng)用范圍，但兩者單一使用都很難達(dá)到理想的治療效果。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
本發(fā)明將維生素E作為優(yōu)化劑與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合使用于腎臟組織細(xì)胞修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)作用效果的進(jìn)一步優(yōu)化。
維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，是人體最主要的抗氧化劑之一。近些年還發(fā)現(xiàn)維生素E可抑制過氧化脂反應(yīng)，使末稍血管擴(kuò)張，改善血液循環(huán)?，F(xiàn)有技術(shù)中，維生素E還可以通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，對急、慢性腎衰竭都有一定的治療效果，其經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性使其具有廣闊的應(yīng)用范圍，但是，單一維生素的使用，難以達(dá)到理想的治療效果。
本發(fā)明使用間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E對腎臟組織細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，能夠減慢腎臟組織細(xì)胞凋亡的速度，提高腎臟組織的再生能力，兩者聯(lián)合使用時(shí)，利用維生素E和間充質(zhì)干細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)，其對腎臟組織細(xì)胞的修復(fù)效果明顯優(yōu)于兩者的單獨(dú)使用，克服了單一使用維生素E和間充質(zhì)干細(xì)胞的缺點(diǎn)。
進(jìn)一步地，所述腎臟組織細(xì)胞修復(fù)包括腎小球細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)。
上述腎小球細(xì)胞是腎臟的過濾細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞是指腎小管的外面的一層細(xì)胞。腎小球細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均為腎臟組織細(xì)胞。
進(jìn)一步地，使用順鉑建立小鼠腎臟損傷模型，將間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E作用于小鼠腎臟損傷模型。
順鉑是二價(jià)鉑同兩個(gè)氯原子和兩個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，可抑制DNA的復(fù)制過程，臨床上常用于癌癥化療，但其毒性極大，尤其是腎毒性極大。腎臟組織細(xì)胞對順鉑最為敏感，高濃度時(shí)可以抑制腎臟組織細(xì)胞的RNA及蛋白質(zhì)合成。
本發(fā)明中，利用順鉑的腎毒性構(gòu)造小鼠腎臟損傷模型，并控制劑量以免致死小鼠。
進(jìn)一步地，本發(fā)明所采用的優(yōu)選技術(shù)方案，包括以下步驟：
步驟(1)將小鼠腎小管上皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，隨后放入培養(yǎng)皿中用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，然后加入順鉑建立小鼠腎臟損傷模型；
步驟(2)將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)，然后將懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿放入腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)板的上方，并在培養(yǎng)液中加入維生素E；
上述接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)干細(xì)胞與處在其下方的腎小管上皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子可以自由通過培養(yǎng)皿的多孔膜。
步驟(3)將小鼠腎小管上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，2～5天后檢測腎小管上皮細(xì)胞的增殖和凋亡情況。
優(yōu)選的，上述步驟(1)所使用的培養(yǎng)板為6孔培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)液為2％FBS培養(yǎng)液。
本發(fā)明中使用的FBS培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)基的一種，被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物細(xì)胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)和清蛋白，纖維蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同的功能，如提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，抗生物反應(yīng)器剪切力，作為脂質(zhì)和其他生長分化因子的載體等。
優(yōu)選的，上述步驟(1)中小鼠腎小管上皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)板的接種密度為1.5x103cells/cm2。
優(yōu)選的，上述步驟(1)中建立小鼠腎臟損傷模型時(shí)，順鉑的使用量為100μM。
優(yōu)選的，上述步驟(2)中培養(yǎng)液中維生素E的加入量為40μM/天。
優(yōu)選的，上述步驟(3)中所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為2天、3天或5天。
進(jìn)一步地，本發(fā)明所采用的優(yōu)選技術(shù)方案，包括以下步驟：將小鼠給予腹腔注射順鉑，建立小鼠腎臟損傷模型，隨后用尾靜脈注射的方式注入間充質(zhì)干細(xì)胞和維生素E，連續(xù)注射7～15天。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為7天、14天或21天。
優(yōu)選的，上述注射用順鉑為使用0.9％生理鹽水稀釋之后的順鉑，按18mg/kg體重的劑量腹腔注射小鼠，構(gòu)建小鼠腎臟損傷模型。
優(yōu)選的，上述每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
進(jìn)一步地，本發(fā)明中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材于一直作為分娩廢棄物的臍帶組織，取材方便，易于收集、保存、冷凍，不受倫理道德及法律方面的限制。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞含量豐富，一根30cm的臍帶可得到107原代細(xì)胞，且細(xì)胞較為原始，分化能力強(qiáng)，生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴(kuò)增后仍能保持旺盛功能，可以為實(shí)驗(yàn)和臨床提供充足的細(xì)胞來源。
目前為止，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)在多方面被證明是自體和異體細(xì)胞移植、治療的理想細(xì)胞。和胚胎干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在生物學(xué)特征和免疫學(xué)特性上與其相似，是細(xì)胞工程種子細(xì)胞的重要來源。
進(jìn)一步地，每千克小鼠的順鉑應(yīng)用劑量為18mg。
本發(fā)明中，每千克小鼠的順鉑應(yīng)用劑量為18mg，該計(jì)量可以嚴(yán)重?fù)p傷小鼠的腎臟組織細(xì)胞，但不會(huì)致死小鼠。
進(jìn)一步地，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
進(jìn)一步地，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
更進(jìn)一步地，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細(xì)胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)中間充質(zhì)干細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)對腎臟受損組織的功能修復(fù)，對急、慢性腎衰竭均有一定的治療作用，特別是在某些特殊環(huán)境中或某些生物因子的作用下，其自身活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)中也記載了維生素E通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，但兩者單一使用雖然可以達(dá)到一定的修復(fù)效果，但效果都不十分理想。本發(fā)明將維生素E作為優(yōu)化劑與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合使用于腎臟組織細(xì)胞修復(fù)，能夠減慢腎臟組織細(xì)胞凋亡的速度，提高腎臟組織的再生能力，兩者聯(lián)合使用時(shí)，利用維生素E和間充質(zhì)干細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)，其對腎臟組織細(xì)胞的修復(fù)效果明顯優(yōu)于兩者的單獨(dú)使用。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制得
(1)將臍帶放入酒精浸泡消毒，隨后用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，將沖洗后的臍帶分離臍靜脈及臍動(dòng)脈，然后將臍帶剪成長度約5mm的組織塊；
(2)在剪好的臍帶組織塊中加入細(xì)胞分離液，在37℃、5％CO2和95％空氣的條件下分離消化12h；
(3)將分離消化后的臍帶塊以1500rpm離心10min，棄上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12液體培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，分離得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞含量為5×104cells/ml。
實(shí)施例2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增過程
(1)原代培養(yǎng)：將所分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5×104cells/ml的密度接種在37℃、5％的CO2、95％的空氣氣相下培養(yǎng)48h后換液，先用PBS溶液輕輕沖洗3次，以去除大部分的未貼壁細(xì)胞，換上基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37℃、5％的CO2、95％的空氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液是指含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。
(2)傳代培養(yǎng)是指將待臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長至占培養(yǎng)皿底面的80％時(shí)傳代，先吸去舊培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2次，用細(xì)胞分離液消化至大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮，將要從培養(yǎng)皿底壁脫落時(shí)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，以1:3的比例將細(xì)胞接種在另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)凍存是指當(dāng)傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長至占培養(yǎng)皿底面的80％時(shí)，消化并收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清液，以5×106cells/ml的比例加入預(yù)冷凍存液，充分混勻后置預(yù)冷的凍存管中。按4℃30min,-20℃30min,-80℃過夜的程序進(jìn)行凍存。最后置于液氮罐中保存。長期凍存后應(yīng)間隔一定時(shí)間復(fù)蘇細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長情況。
(4)復(fù)蘇是指從液氮罐中取出凍存管，迅速投入37℃水浴中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解，要在1-2min內(nèi)完成復(fù)溫。然后吸出細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)皿中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2、95％的空氣氣相下培養(yǎng)，第二天換液。
實(shí)施例3體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
步驟(1)：進(jìn)行細(xì)胞分組
將小鼠腎臟組織細(xì)胞細(xì)胞分為以下5組：
1)小鼠腎臟組織細(xì)胞正常對照組
2)小鼠腎臟組織細(xì)胞順鉑損傷組
3)小鼠腎臟組織細(xì)胞順鉑損傷+間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)組
4)小鼠腎臟組織細(xì)胞順鉑損傷+維生素E共培養(yǎng)組
5)小鼠腎臟組織細(xì)胞順鉑損傷+間充質(zhì)干細(xì)胞+維生素E共培養(yǎng)組
步驟(2)：將小鼠腎小管上皮細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1.5x103cells/cm2。隨后放入培養(yǎng)皿中用2％FBS培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，然后加入順鉑100μM建立小鼠腎臟損傷模型；
步驟(3)：將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)，然后將懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿放入腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)板的上方，并在培養(yǎng)液中加入維生素E40μM/天。上述接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)干細(xì)胞與處在其下方的腎小管上皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子可以自由通過培養(yǎng)皿的多孔膜。
步驟(4)：將小鼠腎小管上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，3天后檢測腎小管上皮細(xì)胞的增殖和凋亡情況。
實(shí)施例4體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)7天
步驟(1)：選用6-8周齡清潔級裸小鼠30只，根據(jù)尾靜脈注射物質(zhì)的不同，隨機(jī)分成5組，每組6只：
組l：正常對照組；
組2：生理鹽水治療組；
組3：間充質(zhì)干細(xì)胞+維生素E共培養(yǎng)組細(xì)胞治療組；
組4：間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞治療組；
組5：維生素E細(xì)胞治療組。
步驟(2)：將分組后的小鼠給予腹腔注射順鉑100μM，建立小鼠腎臟損傷模型。
步驟(3)：隨后用尾靜脈注射的方式向各組小鼠分別注入間充質(zhì)干細(xì)胞和維生素E，連續(xù)注射7天，并處死各組動(dòng)物。而后測定各項(xiàng)治療指標(biāo)，從而評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟的功能狀態(tài)。其中：
組l：正常對照組，該組不進(jìn)行順鉑的注射，以進(jìn)行正常小鼠腎臟組織細(xì)胞的對照；
組2：生理鹽水治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，用以作為不經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞和/或維生素E治療的小鼠腎臟組織細(xì)胞的對照；
組3：間充質(zhì)干細(xì)胞+維生素E共培養(yǎng)組細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
組4：間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天；
組5：維生素E細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
實(shí)施例5體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)15天
步驟(1)：選用6-8周齡清潔級裸小鼠30只，根據(jù)尾靜脈注射物質(zhì)的不同，隨機(jī)分成5組，每組6只：
組l：正常對照組；
組2：生理鹽水治療組；
組3：間充質(zhì)干細(xì)胞+維生素E共培養(yǎng)組細(xì)胞治療組；
組4：間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞治療組；
組5：維生素E細(xì)胞治療組。
步驟(2)：將分組后的小鼠給予腹腔注射順鉑100μM，建立小鼠腎臟損傷模型。
步驟(3)：隨后用尾靜脈注射的方式向各組小鼠分別注入間充質(zhì)干細(xì)胞和維生素E，連續(xù)注射15天，并處死各組動(dòng)物。而后測定各項(xiàng)治療指標(biāo)，從而評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟的功能狀態(tài)。其中：
組l：正常對照組，該組不進(jìn)行順鉑的注射，以進(jìn)行正常小鼠腎臟組織細(xì)胞的對照；
組2：生理鹽水治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，用以作為不經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞和/或維生素E治療的小鼠腎臟組織細(xì)胞的對照；
組3：間充質(zhì)干細(xì)胞+維生素E共培養(yǎng)組細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
組4：間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天；
組5：維生素E細(xì)胞治療組，該組進(jìn)行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。