本發(fā)明屬于藥物微球制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天門(mén)冬酰胺酶微球及其制備方法。

背景技術(shù)：

天門(mén)冬酰胺酶(別稱天冬酰胺酶、門(mén)冬酰胺酶等，它的主要功能是水解天門(mén)冬酰胺為天門(mén)冬氨酸與氨，在動(dòng)物、微生物、植物組織中廣泛存在。動(dòng)物體內(nèi)的天門(mén)冬酰胺酶主要存在于哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的肝、胰、腎、胃和脾中。

L-天冬酰胺被天門(mén)冬酰胺酶水解成天冬氨酸、氨，天冬酰胺是核酸合成的重要組成部分，一些腫瘤細(xì)胞缺乏天冬酷胺合成酶，抑制蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡。其他細(xì)胞則不受影響。在臨床上常用于白血病的治療。它與大部分其他化療藥物不同的是，天門(mén)冬酰胺酶可通過(guò)靜脈注射、肌肉注射(或者皮下注射)給藥而不必?fù)?dān)心對(duì)周?chē)M織的刺激與傷害。

天門(mén)冬酰胺酶是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病誘導(dǎo)治療中不可缺少的重要藥物,但其毒副作用限制了該酶的臨床應(yīng)用。明確其各種毒副作用的機(jī)理及該酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用各種生物技術(shù)及基因工程，才能找到更好地降低其毒副作用的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，天門(mén)冬酰胺酶的毒副作用將會(huì)不斷降低，天門(mén)冬酰胺酶的應(yīng)用將會(huì)更安全、更廣泛。

現(xiàn)有的天門(mén)冬酰胺酶多為粉針劑，微有吸濕性。吸濕后該酶容易失去生物活性。藥物的靶向性差，該酶的粉針劑有過(guò)敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)，惡心、嘔吐、食欲不振、腹瀉、腹部痙攣等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性等毒副作用。

微球(micorspheres)的粒徑在1～250μm之間，是包載了1種或多種藥物的球形聚合物的新型復(fù)合藥物制劑。微球在形成過(guò)程中，將藥物或一定量的靶向誘導(dǎo)劑溶解或分散在聚合物材料基質(zhì)的固體骨架結(jié)構(gòu)中，當(dāng)微球中包載了磁性粒子后，可使給藥體系具有磁性，從而使藥物的治療具有靶向性。由于微球給藥體系具有緩釋、控釋和靶向的性質(zhì)，從20世紀(jì)70年代開(kāi)始，研究發(fā)展與臨床應(yīng)用十分迅速。國(guó)外已經(jīng)上市了幾個(gè)這類(lèi)劑型的藥品，盡管在臨床應(yīng)用上有待完善，但是其出色的緩控釋與靶向能力令人滿意。

常用的微球載體材料有天然的(明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉等)、半合成的(改性殼聚糖、交聯(lián)甲殼素、甲基纖維素、乙基纖維素等)、合成的(聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氰基丙烯酸烷酯等)高分子材料，其具備以下要求：化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與藥物或相關(guān)的輔助藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不改變藥物的藥理作用；自身材料以及在體內(nèi)的降解物應(yīng)無(wú)毒、無(wú)刺激性；形成的微球骨架具有一定或較強(qiáng)的包載藥物的能力；具有穩(wěn)定的藥物釋放速度。

合成高分子可降解載體材料，可以被體內(nèi)吸收，控釋能力強(qiáng)，被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。其特點(diǎn)在于無(wú)毒、成膜或成球性好，化學(xué)穩(wěn)定性高，工藝可控性強(qiáng)，批間質(zhì)量差異小，是微球制劑技術(shù)研究的重點(diǎn)。其中聚乳酸(poly lactic acid PLA)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid PLGA)的研究最為成熟，現(xiàn)在，它們已經(jīng)應(yīng)用于包載激素、化學(xué)合成藥物、蛋白質(zhì)和多肽、疫苗以及避孕藥物等。

聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)易制備，重現(xiàn)性好，易溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)等有機(jī)溶劑；不溶于醇、酮、醚等有機(jī)溶劑，不溶于水。PLGA具有良好的生物降解性和生物相容性，安全穩(wěn)定，其在體內(nèi)的降解產(chǎn)物為乳酸和羥基乙酸，是人體的正常代謝物，可以被人體消化吸收，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水。

制備PLGA微球的方法有無(wú)水法、復(fù)乳法、噴霧干燥法、低溫噴霧提取法、縮聚法、熔融-擠出法等。目前最常用的方法是復(fù)乳法和無(wú)水法。用復(fù)乳法制備蛋白質(zhì)微球的主要工藝過(guò)程是，將蛋白質(zhì)的水溶液加入到聚合物的有機(jī)溶劑(常用二氯甲烷)中，超聲或攪拌后制成初乳，將初乳轉(zhuǎn)移到另一含乳化劑的水相中制成復(fù)乳，不斷攪拌萃取有機(jī)溶劑，使高分子材料固化，收集微球、洗滌、冷凍干燥。這一過(guò)程的許多步驟可能會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，特別是在制備初乳時(shí)，由于蛋白質(zhì)具有表面活性易吸附在油水界面上，可引起蛋白質(zhì)的伸展、變性和不可逆的聚集。加之超聲、攪拌等劇烈的條件，很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。日前解決這一問(wèn)題主要的方法是加入各種類(lèi)型的添加劑。添加劑的種類(lèi)包括蛋白質(zhì)、糖、多元醇、表面活性劑、無(wú)機(jī)鹽等。

用復(fù)乳法制備蛋白質(zhì)PLGA微球主要的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單，且由于初乳乳滴的粒徑較易控制，因此蛋白質(zhì)在微球中較易分散均勻，制備的微球突釋(微球在體內(nèi)外剛開(kāi)始數(shù)小時(shí)釋放的藥物量)較少。主要缺點(diǎn)是工藝過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)活性影響較大。此外，由于復(fù)乳法制備微球需要兩步乳化，因此工藝中的影響因素很多，包括內(nèi)水相體積、油相體積、內(nèi)水相和油相的比例，制備初乳和復(fù)乳的攪拌條件，蛋白質(zhì)的濃度，攪拌裝置等，所以工藝放大較為困難。使用復(fù)乳法制備微球一個(gè)最大的缺點(diǎn)就是引入了油水界面，形成的疏水界面通常會(huì)引起蛋白質(zhì)的界面吸附，接著會(huì)導(dǎo)致其伸展和聚集。

為了改進(jìn)復(fù)乳法的缺點(diǎn)，國(guó)外學(xué)者越來(lái)越多地使用了無(wú)水制備微球的方法，在這種方法中蛋白質(zhì)以固體的形式分散在高分子材料的有機(jī)溶劑中從而避免了油水界面。這一策略的基本原理是脫水的蛋白質(zhì)粉末在有機(jī)溶劑中惰性較強(qiáng)，限制了其構(gòu)象的變動(dòng)，在微球的制備過(guò)程中限制了外界因素對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的干擾，從而有效地維持了蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

部分無(wú)水法(S/O/W)制備微球工藝是完全無(wú)水和復(fù)乳法(W/O/W)之間存在的一個(gè)折中的方法。在這一方法當(dāng)中，脫水的蛋白粉末混懸在溶有聚合物的有機(jī)溶劑中。這一混懸液在含有乳化劑的水溶液中乳化。微球在有機(jī)溶劑溶解和揮發(fā)過(guò)程中得到固化，最后洗滌、冷凍干燥。Cleland等報(bào)道了將rhGH和海藻糖或甘露醇一起冷凍干燥用S/O/W法制備的PLGA微球，從微球中釋放的rhGH保持了各部分的活性。盡管在乳化過(guò)程中蛋白在有機(jī)溶劑存在的條件下遇到了水性環(huán)境，但是聚合物固化的時(shí)間非常短，沒(méi)有導(dǎo)致蛋白的溶解和失活。用S/O/W法的一個(gè)主要問(wèn)題是通常包被水溶性藥物時(shí)包封率較低。這是由于在乳化過(guò)程中蛋白質(zhì)從內(nèi)水相溶解到了外油相。已有研究表明優(yōu)化工藝條件可以減少蛋白的損失，主要是通過(guò)減小蛋白質(zhì)的粒徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？梢栽谌榛^(guò)程中，或通過(guò)在有機(jī)溶劑中加入可溶性添加劑來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的微粉化。這種方法可以將蛋白的包封率從不到20％提高到超過(guò)80％。S/O/W工藝存在的另一個(gè)問(wèn)題是固相中添加劑的損失。因?yàn)樘砑觿┮话惴肿恿啃?例如海藻糖)、水溶性好，它們可進(jìn)入外水相而損失一部分，或在固化過(guò)程中從蛋白存在的固相中脫離而滯留在高分子材料中。這樣，添加劑就不能在工藝過(guò)程中發(fā)揮穩(wěn)定蛋白的作用，特別是最后的干燥過(guò)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種天門(mén)冬酰胺酶微球的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過(guò)上述方法制備得到的天門(mén)冬酰胺酶微球。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種天門(mén)冬酰胺酶微球的制備方法，包括如下制備步驟：

(1)將天門(mén)冬酰胺酶溶解于聚乙二醇(PEG)中，溶解后冷凍干燥，洗滌，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于有機(jī)溶劑中，然后加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉，水浴攪拌條件下超聲處理得到混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到聚乙烯醇(PVA)水溶液中，攪拌乳化后用蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢璺稚⒕鶆?，離心收集微球，所得微球經(jīng)洗滌、冷凍干燥，得到天門(mén)冬酰胺酶微球。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的聚乙二醇是指PEG400。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的洗滌是指用二氯甲烷洗滌。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量為14000～34000Da；更優(yōu)選重均分子量為30000Da。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述有機(jī)溶劑是指二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亞砜(DMSO)。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物溶于有機(jī)溶劑的濃度為80～120mg/mL；更優(yōu)選的濃度為120mg/mL。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比為0.3％～1.2％；更優(yōu)選的質(zhì)量百分比為0.6％。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述聚乙烯醇水溶液的質(zhì)量濃度為2.5％～5.0％。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述攪拌乳化的攪拌速度為1000～1600rpm；更優(yōu)選的攪拌速度為1400rpm。

一種天門(mén)冬酰胺酶微球，通過(guò)上述方法制備得到。

本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明采用體內(nèi)可生物降解的高分子材料PLGA將天門(mén)冬酰胺酶包被成微球，通過(guò)微球內(nèi)部的孔道以及高分子材料的融蝕降解來(lái)調(diào)控天門(mén)冬酰胺酶在體內(nèi)外的釋放；可以提高藥物的穩(wěn)定性；防止藥物失活；便于藥物的存儲(chǔ)與應(yīng)用；使藥物集中于靶區(qū)，提高療效，降低毒副作用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

(2)本發(fā)明采用部分無(wú)水法，在制初乳時(shí)避免了使用水，因而繞開(kāi)了復(fù)乳法可能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要階段；第二步在水中進(jìn)行乳化，又解決了無(wú)水法制備的微球難于洗滌的問(wèn)題；

(3)本發(fā)明對(duì)天門(mén)冬酰胺酶進(jìn)行微粉化(將天門(mén)冬酰胺酶溶解于聚乙二醇后冷凍干燥，成為高分散的乳化微粉)，減少了微球的突釋效應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例5所得天門(mén)冬酰胺酶微球的體外釋放試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)將20mg天門(mén)冬酰胺酶溶解于100mL PEG400中，然后冷凍干燥，再經(jīng)二氯甲烷洗滌去除PEG400，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，分別形成80mg/mL、100mg/mL和120mg/mL的溶液，然后分別加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉(天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比為0.6％)，水浴攪拌條件下超聲處理得到不同PLGA濃度的混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到50mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm轉(zhuǎn)速下攪拌乳化10min后用600mL蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢?h分散均勻，離心收集微球，所得微球經(jīng)蒸餾水洗滌3次、冷凍干燥24h，得到天門(mén)冬酰胺酶微球。

本實(shí)施例不同PLGA濃度下所得天門(mén)冬酰胺酶微球的平均粒徑及包封率如表1所示。

表1

由表1結(jié)果可以看出，PLGA濃度增大，微球的平均粒徑顯著增大，包封率明顯增加。

實(shí)施例2

(1)將20mg天門(mén)冬酰胺酶溶解于100mL PEG400中，然后冷凍干燥，再經(jīng)二氯甲烷洗滌去除PEG400，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成100mg/mL的溶液，然后加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉(天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比為0.6％)，水浴攪拌條件下超聲處理得到混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到50mL 3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，分別在1000rpm、1400rpm和1600rpm轉(zhuǎn)速下攪拌乳化10min后用600mL蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢?h分散均勻，離心收集微球，所得微球經(jīng)蒸餾水洗滌3次、冷凍干燥24h，得到天門(mén)冬酰胺酶微球。

本實(shí)施例不同乳化攪拌轉(zhuǎn)速下所得天門(mén)冬酰胺酶微球的平均粒徑及包封率如表2所示。

表2

表2結(jié)果表明，攪拌速度增大，微球的平均粒徑顯著減小，包封率有所降低。

實(shí)施例3

(1)將20mg天門(mén)冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷凍干燥，再經(jīng)二氯甲烷洗滌去除PEG400，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成100mg/mL的溶液，然后分別加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉(天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比分別為0.3％、0.6％、1.2％)，水浴攪拌條件下超聲處理得到混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，在1000rpm轉(zhuǎn)速下攪拌乳化10min后用600mL蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢?h分散均勻，離心收集微球，所得微球經(jīng)蒸餾水洗滌3次、冷凍干燥24h，得到理論載藥量分別為0.3％、0.6％和1.2％的天門(mén)冬酰胺酶微球。

本實(shí)施例不同理論載藥量下所得天門(mén)冬酰胺酶微球的平均粒徑及包封率如表3所示。

表3

表3結(jié)果表明理論載藥量增加對(duì)微球的平均粒徑影響不明顯，包封率有所下降。

實(shí)施例4

(1)將20mg天門(mén)冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷凍干燥，再經(jīng)二氯甲烷洗滌去除PEG400，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將平均分子量分別為14000Da和34000Da的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，分別形成100mg/mL和120mg/mL的溶液，然后分別加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉(天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比為0.6％)，水浴攪拌條件下超聲處理得到不同PLGA分子量及濃度的混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm轉(zhuǎn)速下攪拌乳化10min后用600mL蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢?h分散均勻，離心收集微球，所得微球經(jīng)蒸餾水洗滌3次、冷凍干燥24h，得到天門(mén)冬酰胺酶微球。

本實(shí)施例不同PLGA分子量及濃度下所得天門(mén)冬酰胺酶微球的平均粒徑及包封率如表4所示。

表4

表4結(jié)果表明在相同條件下PLGA的平均分子量越大所制備的微球的粒徑也相應(yīng)增加，且微球的比表面積減小，提高了包封率。

實(shí)施例5

(1)將20mg天門(mén)冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷凍干燥，再經(jīng)二氯甲烷洗滌去除PEG400，得天門(mén)冬酰胺酶微粉；

(2)將平均分子量為30000Da的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成120mg/mL的溶液，然后加入步驟(1)所得天門(mén)冬酰胺酶微粉(天門(mén)冬酰胺酶微粉與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量百分比為0.6％)，水浴攪拌條件下超聲處理得到混懸液；

(3)將步驟(2)所得混懸液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm轉(zhuǎn)速下攪拌乳化10min后用600mL蒸餾水稀釋?zhuān)瑪嚢?h分散均勻，離心收集微球，所得微球經(jīng)蒸餾水洗滌3次、冷凍干燥24h，得到天門(mén)冬酰胺酶微球。

將本實(shí)施例所得天門(mén)冬酰胺酶微球進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)，并與天門(mén)冬酰胺酶未進(jìn)行微粉化所得微球進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖1所示。由圖1結(jié)果可以看出，本發(fā)明對(duì)天門(mén)冬酰胺酶進(jìn)行微粉化(將天門(mén)冬酰胺酶溶解于聚乙二醇后冷凍干燥，成為高分散的乳化微粉)，減少了微球的突釋效應(yīng)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。