本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及模式識別受體TLR3的抑制劑在制備防治腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品中的應(yīng)用在制備預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害國民健康的重大疾病之一，而且其發(fā)病率與死亡率仍持續(xù)攀升。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅與腫瘤細(xì)胞本身相關(guān)，腫瘤微環(huán)境作為腫瘤生存的重要土壤也發(fā)揮著極其重要的功能，成為腫瘤生物學(xué)研究以及尋找腫瘤治療靶點的一大熱點。

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)細(xì)胞組成(主要是宿主細(xì)胞)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞以及一些炎性細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等(Hanahan,D.和Weinberg,R.A.，Hallmarks of cancer:the next generation.Cell.2011；144：646-674)。

腫瘤生長過程中產(chǎn)生大量膜型和分泌型物質(zhì)，誘導(dǎo)基質(zhì)和相關(guān)炎性細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化，形成腫瘤的免疫微環(huán)境。越來越多的研究證實，腫瘤及遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移器官中的炎性細(xì)胞能通過與腫瘤細(xì)胞相互接觸或分泌可溶性的細(xì)胞因子(如VEGF-α、IL-10、TGF-β等)，改變腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，發(fā)揮腫瘤的負(fù)向免疫調(diào)控功能。因此，研究腫瘤免疫微環(huán)境的產(chǎn)生機制、誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的功能逆轉(zhuǎn)從而打破抑制性腫瘤免疫微環(huán)境成為腫瘤免疫治療學(xué)界關(guān)注的重點。

目前，針對免疫檢查點(PD-1和CTLA4)抗體治療有效的增強了微環(huán)境中T細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能，成為近年來免疫治療領(lǐng)域的重大突破(Topalian S.L.等,Immune checkpoint blockade:a common denominator approach to cancer therapy.Cancer Cell.2015；27:450)。

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤原位微環(huán)境、侵襲微環(huán)境以及轉(zhuǎn)移微環(huán)境。腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境(Pre-metastatic niche)概念的提出為腫瘤轉(zhuǎn)移尤其是轉(zhuǎn)移器官選擇性提供了新的理論解釋。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境是指原發(fā)灶的腫瘤能夠通過腫瘤來源的分泌物質(zhì)(Tumor-derived secreted factors,TDSFs)動員和募集骨髓來源細(xì)胞(Bone marrow-derived cells,BMDCs)到轉(zhuǎn)移靶器官，通過與靶器官中基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同作用，創(chuàng)造了利于腫瘤細(xì)胞定居的“土壤”(Kaplan,R.N.等.VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.Nature.2005，438：820-827)。多種BMDCs(VRGFR+骨髓前體細(xì)胞、CD11b+髓系細(xì)胞等)被證實參與了轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。因此，研究腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的影響因素對于腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療至關(guān)重要。

目前，中性粒細(xì)胞被證實在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中發(fā)揮了關(guān)鍵的促進作用。中性粒細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中抵御病原體感染的重要成員，當(dāng)炎癥發(fā)生時，它們被迅速趨化至炎癥部位，吞噬入侵的病原體和組織碎片，發(fā)揮抗感染和創(chuàng)傷修復(fù)的作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，中性粒細(xì)胞被大量募集到預(yù)轉(zhuǎn)移器官。這些中性粒細(xì)胞發(fā)揮著抑制抗腫瘤免疫、促進腫瘤細(xì)胞存活而促進腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成的功能。

目前，中性粒細(xì)胞所介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制及促腫瘤功能在多種小鼠及臨床腫瘤中得到驗證(Wculek,S.K.和Malanchi,I.Neutrophils support lung colonization of metastasis-initiating breast cancer cells.Nature.2015；528：413-417)。因此，基于中性粒細(xì)胞及其影響因素的干預(yù)已成為腫瘤治療新的生長點。

例如，腫瘤學(xué)頂級雜志Cancer Cell發(fā)表的最新研究顯示抑制趨化因子CXCR2的表達(dá)能夠顯著抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移與發(fā)展，其作用機制就是抑制了腫瘤微環(huán)境中中性粒細(xì)胞的募集(Steele C.W.等，CXCR2Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.Cancer Cell.2016；29:832)。

然而，轉(zhuǎn)移靶器官如何識別腫瘤來源的刺激信號而募集中性粒細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境、中性粒細(xì)胞如何遷移到轉(zhuǎn)移的靶器官尤其是肺臟中而促進微環(huán)境形成，這些問題的解決有利于尋找新的預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤治療的靶點。

肺泡的上皮層主要由I型和II型上皮細(xì)胞組成，其在氣體交換和表面張力維持方面發(fā)揮了重要作用。此外，肺上皮細(xì)胞也能夠識別病原體和損傷相關(guān)的刺激信號，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能維持肺臟的穩(wěn)態(tài)。肺上皮細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)，其激活后能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子等誘導(dǎo)免疫細(xì)胞在肺部的浸潤。同樣，肺上皮細(xì)胞的長期刺激導(dǎo)致的異常炎癥反應(yīng)也是肺部慢性炎癥的產(chǎn)生因素，表明其在腫瘤發(fā)生中的潛在功能(Whitsett,J.A.和Alenghat,T.，Respiratory epithelial cells orchestrate pulmonary innate immunity.Nat.Immunol.，2015；16：27-35)。然而，作為肺泡的重要組成成分，目前尚未見報道肺上皮細(xì)胞對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)功能。

模式識別受體(PRRs)是機體識別外源性及內(nèi)源性危險信號啟動免疫應(yīng)答的主要媒介。目前發(fā)現(xiàn)的PRR主要分為三類：TLRs(Toll-like receptors)；RLHs(RIG-I-like helicases)；NLRs(Nucleotide-oligomerization domain-like receptors)。其中，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是最早發(fā)現(xiàn)且研究較為深入的一類模式識別受體。細(xì)菌或病毒成分如蛋白質(zhì)、RNA等能夠被免疫細(xì)胞的TLRs識別，進而活化下游信號途徑，促使免疫細(xì)胞活化并表達(dá)促炎癥細(xì)胞因子和干擾素，提高細(xì)胞的抗病原體能力，發(fā)揮清除病原體感染的作用。

TLRs是一種進化上高度保守的胚系編碼的I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。目前發(fā)現(xiàn)并克隆了十多種哺乳動物的TLRs分子，分別選擇識別不同的病原體相關(guān)分子模式(Cao,X.,Self-regulation and cross-regulation of pattern-recognition receptor signalling in health and disease.Nat.Rev.Immunol.2016；16:35-50)。

TLR3是機體識別雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的一種Toll樣受體，其在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著很重要的作用。TLR3的特異性配體是雙鏈RNA，病毒在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中可產(chǎn)生大量dsRNA。TLR3和dsRNA結(jié)合后，可經(jīng)由MyD88依賴和非依賴兩條途徑來誘導(dǎo)NF-κB的激活，促進其轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核內(nèi)和DNA片段結(jié)合，啟動相應(yīng)的炎性因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，如IL-8、IL-12、TNFα、IFNα等，從而引起抗病毒免疫反應(yīng)，抵抗病毒的感染。

除了感知雙鏈RNA病毒感染，TLR還被報道參與識別了內(nèi)源性的來自壞死或凋亡細(xì)胞的RNA，提示TLR3也參與了壞死誘導(dǎo)的炎癥的觸發(fā)(Cavassani,K.A.等，TLR3is an endogenous sensor of tissue necrosis during acute inflammatory events.J.Exp.Med.2008；205：2609-2621)。

在感染過程中，TLRs促發(fā)的炎癥信號對于中性粒細(xì)胞向感染部位的遷移及趨化至關(guān)重要，但目前尚未見報道TLR3影響中性粒細(xì)胞在腫瘤內(nèi)或轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的浸潤及遷移。

在腫瘤研究領(lǐng)域，Toll樣受體的功能日益受到關(guān)注。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)多種TLRs，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著雙向調(diào)控功能。本領(lǐng)域中已知某些模式識別受體與腫瘤具有一定的相關(guān)性，如TLR4信號的活化促使胃癌惡化(X,Yuan等，Activation of TLR4signaling promotes gastric cancer progression by inducing mitochondrial ROS production.Cell Death and Disease.2013；4,e794)，幫助肺癌細(xì)胞實現(xiàn)免疫逃逸(Weigang,H.等，TLR4signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology.2007；44(11):2850-2859)；TLR3在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用(Salaun B.等，TLR3can directly trigger apoptosis in human cancer cells.J Immunol.2006；176:4894-4901)。

宿主細(xì)胞表達(dá)的TLRs也日益受到關(guān)注，TLRs是宿主促腫瘤發(fā)生的慢性炎癥的啟動因素。宿主TLRs也影響了腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤產(chǎn)生的物質(zhì)能夠激活宿主髓系細(xì)胞的TLR2而促進腫瘤的肺轉(zhuǎn)移(Kim,S.等,Carcinoma-produced factors activate myeloid cells through TLR2to stimulate metastasis.Nature.2009；457:102-106)；腫瘤分泌的小RNA(microRNAs)能夠結(jié)合TLR7/8促進腫瘤誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥而促進腫瘤轉(zhuǎn)移(Fabbri,M.等，MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2012，109：E2110-2116)。

然而，由于腫瘤轉(zhuǎn)移模型以及研究的靶細(xì)胞不同，宿主TLRs在腫瘤轉(zhuǎn)移中功能報道往往不一致，這也提示著不同細(xì)胞以及不同腫瘤階段TLRs功能的多樣性。深入研究TLRs在宿主腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的功能有利于腫瘤治療靶點的尋找。

由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一，為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肺癌)，目前人們已經(jīng)越來越關(guān)注腫瘤轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后預(yù)判以指導(dǎo)腫瘤的治療。用臨床指標(biāo)(如TNM分級)和單個分子指標(biāo)(如NSE)預(yù)測肺癌進展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)有較長的歷史。但是，臨床指標(biāo)或者病理類型相似的患者卻有截然不同的臨床結(jié)局，所以用臨床指標(biāo)或者單獨的分子標(biāo)志來預(yù)測或評價患者難以取得滿意的效果。對腫瘤實行個體化、預(yù)見性的治療有助于更加深入理解臨床病理學(xué)特征，改善對患者的臨床處理，從而提高腫瘤患者的無瘤生存期及絕對生存期。確定肺癌發(fā)展過程中的腫瘤細(xì)胞以及微環(huán)境中相關(guān)基因及其參與肺癌發(fā)病機理，可為肺癌個體化預(yù)見性治療提供基礎(chǔ)，也為新的治療方案提供靶點，從而有利于提高肺癌的治愈率。

另一方面，腫瘤的發(fā)展包括轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤細(xì)胞本身有關(guān)，還與腫瘤所處的微環(huán)境(如上述的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境)密切相關(guān)。目前，針對腫瘤微環(huán)境中的免疫檢查點(PD-1和CTLA4)抗體治療有效的增強了微環(huán)境中T細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能，成為近年來免疫治療領(lǐng)域的重大突破(Topalian S.L.等,Immune checkpoint blockade:a common denominator approach to cancer therapy.Cancer Cell.2015；27:450)。

此外，針對中性粒細(xì)胞及其影響因素的干預(yù)已日益受到腫瘤治療領(lǐng)域研究者的關(guān)注，并取得了良好的效果(Steele C.W.等，CXCR2Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.Cancer Cell.2016；29:832)。以上進展提示除了腫瘤細(xì)胞本身針對腫瘤微環(huán)境重要靶點的檢測及干預(yù)治療方法成為腫瘤診斷及治療新的增長點。

目前，國內(nèi)外尚無有關(guān)宿主模式識別受體TLR3與中性粒細(xì)胞遷移及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究報道。

而本領(lǐng)域迫切需要尋找到可有效用于腫瘤診斷、腫瘤治療方案選擇、腫瘤預(yù)后評估的PRR分子，并將其用于這些用途中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了模式識別受體在預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，并由此提供了可用于預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移的新途徑、方法和產(chǎn)品。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了對腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中中性粒細(xì)胞遷移及趨化具有調(diào)控作用的肺上皮細(xì)胞表達(dá)的分子——模式識別受體TLR3，由此本發(fā)明進一步提供了對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)在預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移中的新用途，有由此提供了可用于預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移的新途徑、方法和產(chǎn)品。

在本發(fā)明的一個方面中，提供了對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)在制備用于預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。在與此相應(yīng)的本發(fā)明的另一方面中，提供了一種預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括給予所述對象對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)。

在一些實施方式中，所述物質(zhì)選自：抑制TLR3表達(dá)和/或功能的物質(zhì)，例如抗TLR3的抗體(優(yōu)選單克隆抗體)、針對TLR3的干擾RNA(siRNA)、針對TLR3的反義寡核苷酸、TLR3表達(dá)或功能抑制化合物、用于敲除或敲減TLR3表達(dá)的物質(zhì)。

在一些實施方式中，所述物質(zhì)為針對TLR3的干擾RNA，例如針對TLR3基因mRNA不同位點選取的siRNA序列，優(yōu)選為選自如下序列的siRNA：SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:3和SEQ ID No.:4。

在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種用于預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品，其包含對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)，所述物質(zhì)為針對模式識別受體TLR3的干擾RNA，例如針對TLR3基因mRNA不同位點選取的siRNA序列(優(yōu)選所述siRNA的長度為18～25bp，更優(yōu)選21～23bp)，優(yōu)選為選自如下序列的siRNA：SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:3和SEQ ID No.:4。

在本發(fā)明中各方面的一些實施方式中，所述模式識別受體TLR3表達(dá)于所述對象的非腫瘤細(xì)胞中，優(yōu)選腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞(或稱宿主細(xì)胞)，所述細(xì)胞選自：懷疑發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移組織中的細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移高風(fēng)險組織中的細(xì)胞、已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移組織中的細(xì)胞、已建立轉(zhuǎn)移灶中的細(xì)胞或它們的組合，或者所述宿主細(xì)胞選自：腫瘤侵襲微環(huán)境中的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的細(xì)胞或它們的組合，優(yōu)選表達(dá)于肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述對象為哺乳動物，例如靈長類動物、嚙齒類動物、家畜、寵物等，優(yōu)選人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述模式識別受體TLR3具有Gene ID：7098，或為其同源序列。

在一些實施方式中，所述產(chǎn)品的形式適于選自下組的給予途徑：經(jīng)胃腸給予、非經(jīng)胃腸給予，例如經(jīng)靜脈、黏膜、鼻腔、腹腔內(nèi)、顱內(nèi)、瘤內(nèi)、舌下、頰部、透皮(如離子導(dǎo)入)等方式給予。例如可通過選自下組的途徑給予：脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法以及復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述物質(zhì)遞送后靶向包含模式識別受體TLR3的宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述腫瘤可包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、腸癌、頭部頸部癌、皮膚癌、膀胱癌、胰腺癌。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述物質(zhì)施用于或靶向于懷疑發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的組織或細(xì)胞、已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的組織或細(xì)胞、已建立轉(zhuǎn)移灶的組織或細(xì)胞、或它們的組合，或者所述物質(zhì)施用于或靶向于：腫瘤侵襲微環(huán)境中的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的細(xì)胞或它們的組合，或為全身的系統(tǒng)性給予。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述產(chǎn)品選自：藥物、保健品、試劑盒、醫(yī)療設(shè)備、或它們的組合。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述產(chǎn)品可選的還包含：藥學(xué)上、免疫性上或保健品學(xué)上可接受的載體、輔料、容器、包裝物、給予裝置，指示給予所含對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)以預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的指示物(如說明書或使用手冊等)。

在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明的對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)或其產(chǎn)品，可與本領(lǐng)域中已知用于預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品或療法聯(lián)用。所述聯(lián)用包括：同時、依序、分開或單獨給予本發(fā)明的物質(zhì)或產(chǎn)品以及其他已知產(chǎn)品或療法。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對前述的技術(shù)方案和技術(shù)特征進行任意組合而不脫離本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思和保護范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，其中這些附圖僅為了圖示說明本發(fā)明的實施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。

圖1：肺癌癌旁組織中TLR3的表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)性，其中：

圖1A為肺癌癌旁組織中TLR3、CD66b表達(dá)的示例性免疫組化圖；

圖1B為以TLR3表達(dá)中位數(shù)為界分為TLR3高表達(dá)與低表達(dá)兩組，評估兩組病例中中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量(Unpaired Student’s t-tests)，***，P<0.001；

圖1C為評估兩組病例中中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量與TLR3表達(dá)的相關(guān)性(Pearson correlation)。

圖2：肺癌癌旁組織中TLR3的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量與患者總體生存時間的相關(guān)性，其中：

圖2A為TLR3高表達(dá)與低表達(dá)患者總體生存時間的Kaplan-Meier生存曲線；

圖2B為中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量多與少的患者總體生存時間的Kaplan-Meier生存曲線。

圖3：小鼠肺癌及黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型中TLR3對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的調(diào)控。利用小鼠肺癌細(xì)胞系LLC及黑色素瘤細(xì)胞系B16/F10皮下接種后自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的模型，觀察TLR3缺陷小鼠與正常對照小鼠肺轉(zhuǎn)移情況及小鼠荷瘤生存率，其中：

圖3A為TLR3缺陷小鼠與正常對照小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移的體外活體成像圖及相關(guān)統(tǒng)計，Unpaired Student’s t-tests；**，P<0.01；***,P<0.001；

圖3B為TLR3缺陷小鼠與正常對照小鼠荷瘤生存時間Kaplan-Meier生存曲線；

圖4：宿主的TLR3影響轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中中性粒細(xì)胞向肺組織的遷移及趨化，其中：

圖4A為TLR3缺陷小鼠與正常對照小鼠荷瘤后肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤的流式細(xì)胞圖及其比例的統(tǒng)計；

圖4B為TLR3缺陷小鼠與正常對照小鼠荷瘤后血清及肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子的表達(dá)水平；Unpaired Student’s t-tests；*，P<0.05；**，P<0.01；***,P<0.001。

圖5：TLR3在肺組織中的定位及腫瘤誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞TLR3與趨化因子的表達(dá)，其中：

圖5A為免疫熒光法對TLR3在肺組織中的定位進行研究，對肺組織切片分別標(biāo)記TLR3、Sftpd(肺上皮標(biāo)記)、Ly6G(中性粒細(xì)胞標(biāo)記)，觀察TLR3與Sftpd及Ly6G的共定位情況；

圖5B為分選正常荷瘤小鼠肺上皮細(xì)胞，利用qRT-PCR檢測上皮細(xì)胞中TLR3及中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL12)的表達(dá)；Unpaired Student’s t-tests；*，P<0.05；**，P<0.01；***,P<0.001。

圖6：肺上皮細(xì)胞TLR3缺陷或干擾RNA干擾TLR3表達(dá)后中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子的表達(dá)，其中：

圖6A為分選TLR3缺陷小鼠以及正常對照小鼠荷瘤14天后肺上皮細(xì)胞，qRT-PCR法檢測細(xì)胞趨化因子的基因表達(dá)；

圖6B為利用si-Tlr3l(SEQ ID No.:1)、si-Tlr3 2(SEQ ID No.:2)干擾人肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系A(chǔ)549的TLR3表達(dá)，腫瘤培養(yǎng)上清刺激后qRT-PCR法檢測細(xì)胞趨化因子的基因表達(dá)；

圖6C為利用si-Tlr3 3(SEQ ID No.:3)、si-Tlr3 4(SEQ ID No.:4)干擾小鼠肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系MLE-12的TLR3表達(dá)，腫瘤培養(yǎng)上清刺激后qRT-PCR法檢測細(xì)胞趨化因子的基因表達(dá)。Unpaired Student’s t-tests；**，P<0.01；***，P<0.001。

具體實施方式

本申請的發(fā)明人經(jīng)長期而深入的研究發(fā)現(xiàn)模式識別受體TLR3能夠啟動腫瘤誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)移部位募集，促進了腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人通過進一步的研究完成了本發(fā)明。

具體而言，通過細(xì)胞實驗和動物實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：

1)利用肺癌LLC及黑色素瘤B16/F10自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的模型，在TLR3基因缺陷的小鼠中，小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移明顯減少，生存期延長；

2)中性粒細(xì)胞是肺臟中促進腫瘤肺轉(zhuǎn)移的重要因素，在TLR3基因缺陷的小鼠中，中性粒細(xì)胞向肺臟的遷移及趨化明顯減少，血清及肺泡灌洗液中的趨化因子顯著減低；

3)分析肺臟中TLR3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TLR3主要表達(dá)于肺上皮細(xì)胞中，肺上皮細(xì)胞TLR3缺陷后，其趨化因子的表達(dá)明顯減少；

4)體外細(xì)胞實驗證實，分別用si-TLR3 1、si-TLR3 2及si-TLR3 3、si-TLR34干擾人和小鼠肺上皮細(xì)胞系，能夠明顯抑制腫瘤誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞趨化因子的表達(dá)；

5)本發(fā)明經(jīng)臨床樣本研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者的癌旁組織中，TLR3的高表達(dá)與中性粒細(xì)胞的浸潤增加顯著相關(guān)，兩者均與肺癌患者生存期縮短、預(yù)后差相關(guān)。

由此，本發(fā)明提供了TLR3分子在腫瘤轉(zhuǎn)移的判斷和抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物制備中的新用途，為模式識別受體的研究和開發(fā)利用提供了新的思路和途徑；并且，本發(fā)明的TLR3分子可有效用于腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)判及治療，從而為本領(lǐng)域提供一種新穎的腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

此外，針對促癌基因進行特定基因沉默是腫瘤治療的熱點之一，RNA干擾技術(shù)是目前高特異性的有效技術(shù)，因此無論是在功能基因組研究，還是腫瘤的基因治療方面均具有廣闊地應(yīng)用前景。本發(fā)明分別針對人和小鼠的TLR3基因不同靶位點設(shè)計了2條干擾siRNA序列，用以抑制肺上皮細(xì)胞模式識別受體TLR3的表達(dá)。這些發(fā)明證實TLR3的siRNA可望成為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的有效手段。本發(fā)明的siRNA可以單獨使用或幾條siRNA聯(lián)合，還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合，用于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的治療。

如本文所用，術(shù)語“模式識別受體TLR3”或“Toll樣受體3”或“TLR3”可互換使用，且具有本領(lǐng)域中已知的含義。例如，TLR3可為Gene ID:7098所示的序列，或可為其同源序列。TLR3可表達(dá)于對象宿主細(xì)胞中，例如表達(dá)于肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”或“非腫瘤細(xì)胞”可互換使用，可包括腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞，例如包括但不限于：懷疑發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移組織中的細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移高風(fēng)險組織中的細(xì)胞、已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移組織中的細(xì)胞、已建立轉(zhuǎn)移灶中的細(xì)胞或它們的組合，如肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。從另一角度而言，所述非腫瘤細(xì)胞選自：腫瘤侵襲微環(huán)境中的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的細(xì)胞或它們的組合。

“腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)”是指腫瘤存在的細(xì)胞環(huán)境，主要由腫瘤細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)組成，其可包括周圍血管、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞等，腫瘤微環(huán)境包括腫瘤原位微環(huán)境、侵襲微環(huán)境以及轉(zhuǎn)移微環(huán)境(可例如參見Hanahan,D.和Weinberg,R.A.，Hallmarks of cancer:the next generation.Cell.2011；144：646-674)。腫瘤與其微環(huán)境密切相關(guān)并始終存在相互作用。

如本文所用，術(shù)語“對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)”或“TLR3抑制劑”或“本發(fā)明的活性物質(zhì)”可互換使用，均是指可抑制TLR3水平和/或功能的物質(zhì)。所述抑制可為部分抑制，即降低TLR3水平和/或功能，也可為完全抑制，即完全消除TLR3和/或其功能，所述抑制可為mRNA水平、DNA水平和/或蛋白質(zhì)水平上的抑制?？捎糜诒景l(fā)明中的抑制劑包括但不限于，針對TLR3或其編碼序列的：抗體(優(yōu)選單克隆抗體)、siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、拮抗劑、阻斷劑、化學(xué)物質(zhì)等?？刹捎帽绢I(lǐng)域中已知的方法獲得所述抑制劑或通過市售獲得市售抑制劑，例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域已知雜交瘤法制備針對TLR3的單克隆抗體，并將其用于本發(fā)明中。

如本文所用，術(shù)語“產(chǎn)品”或“本發(fā)明的產(chǎn)品”可互換使用，是指包含對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)且用于預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括但不限于：藥物、保健品、試劑盒、醫(yī)療設(shè)備、或它們的組合。所述產(chǎn)品可選的還包含：藥學(xué)上或保健品學(xué)上可接受的載體、輔料、容器、包裝物、給予裝置，指示給予所含對模式識別受體TLR3具有抑制作用的物質(zhì)以預(yù)防和/或治療對象中腫瘤轉(zhuǎn)移的指示物(如說明書或使用手冊等)。

本發(fā)明的產(chǎn)品中可含有有效量的本發(fā)明的TLR3抑制劑，以及可選的藥學(xué)上、保健品學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體。如本文所用，術(shù)語“可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。

如本文所用，術(shù)語“載體”指用于向?qū)ο筮f送TLR3抑制劑的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。

在組合物中可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。

應(yīng)理解，所用本發(fā)明活性物質(zhì)的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。

本文中提供的所有數(shù)值范圍旨在清楚地包括落在范圍端點之間的所有數(shù)值及它們之間的數(shù)值范圍?？蓪Ρ景l(fā)明提到的特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“一”、“一個”或“一種”等表示單數(shù)的用語也可根據(jù)實際情況表示復(fù)數(shù)概念。

實施例

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變動，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供應(yīng)商所建議的條件。DNA的測序方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。

除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1：肺癌癌旁組織中TLR3的表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)

所用樣品為2004年90例肺癌患者的組織切片(獲自上海芯超生物科技有限公司)，其肺癌組織類型均為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，患者在手術(shù)前未接受化療及放療?；颊呋厩闆r如表1所示。

表1. 90例肺癌患者臨床信息

免疫組化法：取小鼠肺組織，4％多聚甲醛固定過夜。石蠟包埋后切片。70℃烤片3小時。脫蠟置水后，利用枸櫞酸進行抗原修復(fù)。血清37℃封閉40分鐘。PBS洗3次。一抗孵育4℃孵育過夜。PBS洗3次。二抗孵育37℃孵育30分鐘。PBS洗3次。辣根過氧化酶孵育37℃孵育20分鐘。PBS洗3次。經(jīng)DAB染色、蘇木素染核后脫水、風(fēng)干，中性樹脂封片。送顯微鏡下觀察。所用TLR3抗體，目錄號ab13915；CD66b抗體，目錄號ab197678，均購自美國abcam公司。

TLR3免疫組化評分：采用quick score(QS)的方法對TLR3蛋白的表達(dá)進行評分。首先，對陽性細(xì)胞的比例按1-6分進行評分(1＝1～4％；2＝5～19％；3＝20～39％；4＝40～59％；5＝60～79％；和6＝80～100％)；其次，對陽性染色細(xì)胞的平均強度評分(0＝無染色；1＝弱，2＝中間，和3＝強染色)；之后，用陽性細(xì)胞數(shù)比例與陽性平均強度相乘，得到0-18的數(shù)值。0-9的數(shù)值表示TLR3低表達(dá)，10-18數(shù)值表示TLR3高表達(dá)。

采用免疫組化方法，對該90例肺癌癌旁組織中TLR3及CD66b(反映中性粒細(xì)胞數(shù)量)蛋白的表達(dá)進行了分析，研究TLR3的表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。P值使用SPSS 17.0中的Unpaired Student’s t-tests(圖1B)或Pearson correlation(圖1C)計算。結(jié)果分別如圖1A至圖1C所示。

結(jié)果表明：肺癌癌旁組織中TLR3的高表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量多具有相關(guān)性。

實施例2：肺癌癌旁組織中TLR3的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤與患者生存時間的相關(guān)性。

采用免疫組化方法，對該90例肺癌癌旁組織中TLR3及CD66b(反映中性粒細(xì)胞數(shù)量)蛋白的表達(dá)進行了分析，比較肺癌癌旁組織中TLR3的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤與患者生存時間的相關(guān)性，P值使用SPSS 17.0中的log-rank test計算，結(jié)果分別如圖2A和圖2B所示。

圖2A的結(jié)果表明：TLR3的高表達(dá)與患者更低的總體生存時間顯著相關(guān)。圖2B的結(jié)果表明：中性粒細(xì)胞浸潤多與患者更低的總體生存時間顯著相關(guān)。

上述結(jié)果表明：癌旁組織中TLR3的高表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量多相關(guān)，且兩者均與患者較差的預(yù)后顯著相關(guān)。該結(jié)果提示了癌旁組織中TLR3可能參與了中性粒細(xì)胞遷移及趨化的調(diào)控，并最終影響了腫瘤患者的預(yù)后，由此可作為腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估的標(biāo)志物。

實施例3：小鼠肺癌及黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型中TLR3對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

TLR3缺陷小鼠購自美國Jackson實驗室，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，通過雜交獲得TLR3基因缺陷型小鼠及同窩野生型對照小鼠。本研究所使用的實驗及對照小鼠均為C57BL/6背景、周齡為8-10周的雌性小鼠。

小鼠肺癌及黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型的建立：每只小鼠背部皮下注射約1×10⁶個肺癌細(xì)胞系LLC或黑色素瘤B16/F10細(xì)胞(細(xì)胞均購自美國PerkinElmer公司)。待腫瘤長至1cm²大小(18-20天)時，切除背部腫瘤。接種后40-45天時檢測小鼠肺部轉(zhuǎn)移情況。

體外肺組織活體成像：利用熒光素酶慢病毒載體FLuc-Puromycin(購自PerkinElmer公司，目錄號CLS960002)感染LLC及B16/F10細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞克隆后進行小鼠皮下接種(接種細(xì)胞數(shù)為1×10⁶/只)，建立腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型。上機檢測前給予小鼠D-Luciferin(15μg/g體重)腹腔注射，10分鐘后取小鼠肺臟，置于小動物活體成像儀(PerkinElmer公司)中檢測。

生存曲線分析采用Kaplan and Meier分析方法作圖，計算P值，P＜0.05時，認(rèn)為兩組之間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

該結(jié)果表明：TLR3缺陷后小鼠自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移極顯著減少(圖3A)，小鼠生存時間明顯延長(圖3B)，提示宿主細(xì)胞表達(dá)TLR3具有促進腫瘤肺轉(zhuǎn)移的功能。

實施例4：宿主的TLR3影響轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中中性粒細(xì)胞向肺組織的遷移及趨化。

肺組織單細(xì)胞懸液的制備：取小鼠肺組織(同實施例3處理后取組織)，用剪刀將其剪碎，在含有Ⅳ型膠原酶(1mg/ml)、DNA酶I(40mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基中消化60分鐘，每10分鐘用巴氏吸管輕輕吹打懸液，直到?jīng)]有可見的團塊。然后通過40μm的網(wǎng)格，洗滌兩次，并再懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中。

流式細(xì)胞術(shù)：收集細(xì)胞，用預(yù)冷的流式專用PBS(0.1％NaN₃+0.5％BSA+2mM EDTA，pH7.2)洗1遍(500g離心5分鐘)，再用PBS 100μl重懸，加入抗CD16/CD32抗體(1μg/ml，購自美國BD Pharmingen公司)以消除非特異性結(jié)合，分別加入各種熒光素標(biāo)記的抗體以及相應(yīng)的同型對照抗體等(Ly6G抗體，目錄號12-5931；Ly6C抗體，目錄號53-5932，均購自美國BD Pharmingen公司)，終濃度均為1μg/ml，混勻后置4℃，30分鐘，加入500μl PBS洗2遍，加入200μl PBS。

利用ELISA試劑盒檢測小鼠血清及肺泡灌洗液中趨化因子的表達(dá)(詳見趨化因子ELISA說明書，所有趨化因子ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D公司)。

結(jié)果顯示：流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺部浸潤的中性粒細(xì)胞顯示，隨著荷瘤時間的延長，肺組織中的中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多，但TLR3缺陷小鼠荷瘤后肺部中性粒細(xì)胞的浸潤較正常對照荷瘤小鼠顯著減少(圖4A)。

ELISA檢測小鼠血清及肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子發(fā)現(xiàn)，TLR3缺陷小鼠趨化因子的分泌較正常對照小鼠明顯減少(圖4B)。

上述結(jié)果提示：宿主細(xì)胞TLR3在小鼠荷瘤后通過促進趨化因子分泌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在預(yù)轉(zhuǎn)移的肺組織中聚集。

實施例5：TLR3在肺組織中的定位及腫瘤誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞TLR3的表達(dá)

組織免疫熒光法：取小鼠肺組織(同實施例3處理后取組織)，用OCT膠包埋于塑料小盒中，-80℃冷凍保存。冰凍切片機6微米切片，室溫放置20分鐘。選擇一抗種屬來源的血清室溫封閉1小時。一抗孵育12小時。PBS洗3次。孵育第二個一抗，室溫孵育1～2小時。PBS洗3次。二抗孵育2小時，室溫。PBS洗3次。DAPI染色15分鐘。PBS洗3次。蓋上蓋玻片，送激光共聚焦顯微鏡下觀察。所用抗體如下文中所述。

利用免疫熒光的方法對TLR3在肺組織中的定位進行研究，對肺組織切片分別標(biāo)記TLR3、Sftpd(肺上皮標(biāo)記)、Ly6G(中性粒細(xì)胞標(biāo)記)(TLR3抗體，目錄號ab13915；Sftpd抗體，目錄號ab17781；Ly6G抗體，目錄號ab25377，均購自美國abcam公司)，觀察TLR3與Sftpd及Ly6G的共定位情況。

結(jié)果顯示：TLR3與Sftpd具有較好的共定位，而與Ly6G無共定位，提示TLR3主要在肺組織的肺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在中性粒細(xì)胞中不表達(dá)(圖5A)。

采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提肺組織總RNA。qRT-PCR檢測TLR3基因的相對定量使用2^-ΔΔCt法計算(β-actin為內(nèi)參)(Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method.Methods.2001；25：402-408)。

結(jié)果顯示：腫瘤能夠極顯著上調(diào)肺上皮細(xì)胞中TLR3的表達(dá)以及趨化因子的表達(dá)(圖5B)。

該結(jié)果表明：腫瘤誘導(dǎo)的趨化因子分泌及中性粒細(xì)胞的浸潤可能是通過上調(diào)肺上皮細(xì)胞TLR3表達(dá)，提示肺上皮細(xì)胞TLR3的表達(dá)參與了中性粒細(xì)胞募集及腫瘤肺轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

實施例6：肺上皮細(xì)胞TLR3缺陷或干擾RNA干擾TLR3表達(dá)后中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子的表達(dá)。

分選TLR3缺陷小鼠以及正常對照小鼠荷瘤14天肺上皮細(xì)胞(如實施例3處理)，采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，qRT-PCR法檢測細(xì)胞趨化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL12)的基因表達(dá)。

體內(nèi)結(jié)果(圖6A)顯示：TLR3缺陷后肺上皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子的能力下降。

培養(yǎng)小鼠肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系MLE-12及人肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系A(chǔ)549(購自ATCC)，細(xì)胞接種于含10％的小牛血清的RPMI 1640(Gibco BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，置于37攝氏度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，利用si-Tlr3l(SEQ ID No.:1)、si-Tlr3 2(SEQ ID No.:2)干擾人肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系A(chǔ)549；利用si-Tlr3 3(SEQ ID No.:3)、si-Tlr3 4(SEQ ID No.:4)干擾小鼠肺上皮細(xì)胞細(xì)胞系MLE-12的TLR3的表達(dá)，并以si-Tlr3neg1(SEQ ID No.:5)和si-Tlr3neg2(SEQ ID No.:6)為陰性對照，各siRNA以50nmol的終濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液，于孵育后24～48h利用腫瘤培養(yǎng)上清刺激以后，采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，qRT-PCR法檢測細(xì)胞趨化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL12)的基因表達(dá)。

各siRNA的序列如下所示：

針對人TLR3基因mRNA不同位點選取的2段21個堿基的siRNA序列：

SEQ ID No.1:5’-GAGGUCUUCAAGGAUUUAUTT-3’

SEQ ID No.2:5’-GUCCCAUUUAUUUCCUAAATT-3’

針對小鼠TLR3基因mRNA不同位點選取的2段21個堿基的siRNA序列：

SEQ ID No.3:5’-GGAGAGGUCUGAGAAAUAUTT-3’

SEQ ID No.4:5’-CGGCCUUAAUGAAAUUGAATT-3’

作為陰性對照的隨機序列：

SEQ ID No.5:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’

SEQ ID No.6:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。

體外RNA干擾結(jié)果(圖6B與6C)顯示：干擾RNA干擾Tlr3表達(dá)后能明顯減低腫瘤誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞趨化因子的表達(dá)。

該結(jié)果表明：肺上皮細(xì)胞的TLR3能夠調(diào)控其趨化因子的分泌，結(jié)合實施例3-5的結(jié)果，提示肺上皮細(xì)胞的TLR3可以作為腫瘤治療的靶點，利用干擾RNA技術(shù)干擾其表達(dá)后能夠抑制中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位遷移及趨化，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。