技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法和制備包含所述高度濃縮的纖維蛋白原溶液和因子X(jué)III的纖維蛋白封閉劑組分1的方法。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法，其特征在于，向從血漿分離的低度濃縮的纖維蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物、鹽類等，然后使用超濾方法由此制備高度濃縮的纖維蛋白原。制備用于纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的纖維蛋白封閉劑組分1的方法，其特征在于，在制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法中的超濾前或超濾后加入因子X(jué)III。此處，根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑組分1優(yōu)選為溶液態(tài)。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的纖維蛋白封閉劑組分1可在液態(tài)下冷凍，在室溫下保存以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的存儲(chǔ)，并立即應(yīng)用于處理而不進(jìn)行重構(gòu)(reconstitution)過(guò)程。另外，本發(fā)明涉及由所述纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑組分2(其為填充在單獨(dú)的容器中的包含凝血酶和氯化鈣的溶液)配置的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品可以其中所述纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑組分2被分別填充在單獨(dú)的瓶中的瓶型，或者以其中所述纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑組分2被填充在彼此連接的單獨(dú)的注射器中從而可立即使用的預(yù)填充型提供。
背景技術(shù)：
：：纖維蛋白封閉劑(fibrinsealant)，其被稱為纖維蛋白膠或纖維蛋白組織粘合劑，使用人體血液凝結(jié)機(jī)制。更具體地，血液凝結(jié)通過(guò)血液凝結(jié)因子的鏈反應(yīng)進(jìn)行，并且纖維蛋白原、因子X(jué)III和凝血酶等等參與所述凝結(jié)途徑的最終步驟。此處，所述纖維蛋白封閉劑使用因子X(jué)III、纖維蛋白原、氯化鈣和凝血酶被混合以形成纖維蛋白聚合物的原理，并且這個(gè)時(shí)候，因子X(jué)III用于交聯(lián)所述纖維蛋白聚合物，這樣所述纖維蛋白聚合物被轉(zhuǎn)化為不能溶解的纖維蛋白聚合物。所述纖維蛋白封閉劑將上文描述的血液凝結(jié)機(jī)制應(yīng)用到粘合劑。也就是說(shuō)，所述纖維蛋白封閉劑是基于當(dāng)創(chuàng)傷等發(fā)生在組織時(shí)，纖維蛋白原與來(lái)自創(chuàng)傷組織周圍的毛細(xì)血管的血液組分一起釋放以形成纖維蛋白，從而粘合到所述創(chuàng)傷的周邊的原理。用于治療目的比如粘合到組織和止血的纖維蛋白封閉劑的應(yīng)用(對(duì)愈合創(chuàng)傷等起支撐作用)已在不斷擴(kuò)展。所述纖維蛋白封閉劑除了具有物理優(yōu)勢(shì)比如快速粘合、不受粘附性部分的濕度的影響等，還具有生物學(xué)優(yōu)勢(shì)比如沒(méi)有血小板凝固障礙、極好的組織相容性以及適當(dāng)?shù)奈盏?，這樣使得所述纖維蛋白封閉劑已作為下一代醫(yī)用粘合劑而備受關(guān)注?；谏衔乃龅睦w維蛋白封閉劑的優(yōu)勢(shì)使用所述纖維蛋白封閉劑的粘合作用的外周神經(jīng)縫合、微血管縫合上的纖維蛋白封閉劑的臨床研究已在歐洲進(jìn)行，并且在日本所述纖維蛋白封閉劑已作為外科粘合劑而用于血管外科、外科、神經(jīng)外科手術(shù)、骨的粘合等。為了制備該纖維蛋白封閉劑，最初，在歐洲將凝血酶(其為纖維蛋白組分之一)從牛血漿分離以供使用(專利文獻(xiàn)1，美國(guó)注冊(cè)專利第4627879號(hào))，但是由于安全問(wèn)題等而在歐洲以外不銷售。另外，盡管已開(kāi)發(fā)出使用自體血的纖維蛋白封閉劑制劑(參見(jiàn)美國(guó)專利第4714457號(hào)，美國(guó)專利第5030215號(hào)等)，然而由于需要采血過(guò)程和另外的制作過(guò)程，臨床使用它還是很不方便。因此，在要進(jìn)行商業(yè)銷售的從人血漿制備的纖維蛋白封閉劑中，針對(duì)病毒的安全應(yīng)該是有保證的，并且臨床使用應(yīng)該是便利的。最近，作為纖維蛋白封閉劑，冷凍干燥型纖維蛋白封閉劑和冷凍液型纖維蛋白封閉劑也被推向市場(chǎng)。在所述冷凍干燥型纖維蛋白封閉劑中，由于纖維蛋白原的分解時(shí)間長(zhǎng)并且需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行重構(gòu)，所以其不便在于所述冷凍干燥的纖維蛋白封閉劑應(yīng)被迅速使用。另一方面，所述冷凍液產(chǎn)品相對(duì)于所述冷凍干燥型產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)在于其實(shí)際使用需要相當(dāng)短的時(shí)間。代表性的產(chǎn)品為Tisseel(BaxterHealthcareCorp.)。Tisseel作為可在液態(tài)下被冷凍的預(yù)填充型產(chǎn)品，即，可立即注射的現(xiàn)成注射形式的產(chǎn)品而在售，并且預(yù)計(jì)作為大大減少使用的制備時(shí)間的產(chǎn)品。然而，在所述冷凍液產(chǎn)品的情況中，存在為了去除來(lái)源于血液的任何病毒應(yīng)進(jìn)行溶劑/去垢劑(S/D)處理和使用蒸汽的熱處理的缺點(diǎn)(參見(jiàn)美國(guó)專利第5962405號(hào)和Tisseel數(shù)據(jù)(www.baxter.com))。特別地，存在不便在于，為了使用蒸汽進(jìn)行熱處理，冷凍干燥應(yīng)在工藝中間進(jìn)行(參見(jiàn)歐洲專利公開(kāi)號(hào)345246和歐洲專利公開(kāi)號(hào)159311)。另外，自為獲得高度濃縮的纖維蛋白原使用冷凍干燥纖維蛋白原以分解纖維蛋白原的方法以來(lái)，存在不便在于，為獲得對(duì)于制備纖維蛋白封閉劑所需的具有高濃度，特別是70mg/ml或更高的濃度的纖維蛋白原溶液，應(yīng)進(jìn)行所述冷凍干燥工藝。已迫切需要能夠解決如上文所述當(dāng)前使用的制備纖維蛋白封閉劑的工藝中的問(wèn)題并且更經(jīng)濟(jì)和容易地制備所述纖維蛋白封閉劑的技術(shù)，特別是，能夠更經(jīng)濟(jì)、容易和高度濃縮纖維蛋白原以制備所述纖維蛋白封閉劑的技術(shù)。相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)(專利文獻(xiàn)1)美國(guó)專利第4627879號(hào)：Fibrinadhesivepreparedasaconcentratefromsingledonorfreshfrozenplasma,授予:1986年12月9日,專利權(quán)人:Rose等。(專利文獻(xiàn)2)美國(guó)專利第4714457號(hào)：Methodandapparatusforuseinpreparationoffibrinogenfromapatientsblood,授予:1987年12月22日,專利權(quán)人:Alterbaum。(專利文獻(xiàn)3)美國(guó)專利第5030215號(hào)：Preparationoffibrinogen/FactorXIIIprecipitate，授予:1991年7月9日,專利權(quán)人:Morse等。(專利文獻(xiàn)4)美國(guó)專利第5962405號(hào)：Storage-stablefibrinogenpreparations,授予:1999年10月5日,專利權(quán)人:Seelich。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題為了解決這些問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了持續(xù)的研究并開(kāi)發(fā)出制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液和能夠確保對(duì)來(lái)源于人血漿的病毒的安全性并被用于制備可在室溫保存和在液態(tài)下冷凍，無(wú)需冷凍干燥工藝，的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的纖維蛋白封閉劑組分1的方法，從而完成本發(fā)明。技術(shù)方案在一個(gè)總的方面，提供了通過(guò)向低度濃縮的纖維蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物，和/或鹽等并通過(guò)超濾工藝濃縮所述纖維蛋白原溶液而制備高度濃縮的纖維蛋白原的方法，以及此外，除了上文提到的方法外進(jìn)一步包括加入因子X(jué)III的制備纖維蛋白封閉劑組分1的方法，以及制備纖維蛋白封閉劑的方法。以下，將詳細(xì)描述本發(fā)明。盡管本領(lǐng)域中已知由于纖維蛋白原溶液的高粘度使得使用超濾高度濃縮纖維蛋白原是不可能的，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在其中氨基酸或氨基酸衍生物，和/或鹽等被加入包含纖維蛋白原的溶液的情況下，所述溶液的粘度顯著降低，這樣使得所述超濾可容易地應(yīng)用。也就是說(shuō)，在根據(jù)本發(fā)明的制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法中，向從血漿獲得的低度濃縮的纖維蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物，和/或鹽等，然后進(jìn)行超濾工藝。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“低度濃縮的纖維蛋白原溶液”，其為使用冷凍沉淀法通過(guò)分離從人血漿冷凍沉淀的材料并通過(guò)進(jìn)行眾所周知的工藝比如使用溶劑/去污劑等的病毒滅活方法，陰離子色譜法，甘氨酸沉淀法等獲得的溶液，意為沒(méi)有通過(guò)超濾工藝濃縮的溶液。所述低度濃縮的纖維蛋白原溶液中的纖維蛋白含量可小于40mg/ml，并且優(yōu)選地，為35mg/ml或更少。例如，所述低度濃縮的纖維蛋白原溶液可通過(guò)加入乙醇、硫酸銨、β丙氨酸/甘氨酸、聚合物(聚乙二醇)和具有低度離子化的溶液中的一種而以相對(duì)高的產(chǎn)量沉淀均勻的纖維蛋白原，以及使用比如離子交換色譜法、親和色譜法等但不限于此的方法額外地純化所沉淀的纖維蛋白原而以高純度獲得。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“高度濃縮的纖維蛋白原溶液”意為通過(guò)使用超濾方法濃縮低度濃縮的纖維蛋白原溶液而獲得的纖維蛋白原溶液。所述高度濃縮的纖維蛋白原溶液中的纖維蛋白原含量并無(wú)特別限制，只要所述含量高于能夠應(yīng)用于所述纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的預(yù)定濃度。然而，所述含量可高于40mg/ml，優(yōu)選高于70mg/ml，并且更優(yōu)選為100至120mg/ml。能夠被加入用于超濾所述低度濃縮的纖維蛋白原溶液的氨基酸或氨基酸衍生物并無(wú)特別限制，但是優(yōu)選地可為選自由甘氨酸、異亮氨酸、L-谷氨酸鈉和L-精氨酸鹽酸鹽組成的組中的至少一種，并且能夠被加入用于超濾所述低度濃縮的纖維蛋白原溶液的鹽類并無(wú)特別限制，但是優(yōu)選地可為氯化鈉或檸檬酸鈉。該氨基酸或氨基酸衍生物以及鹽在濃縮纖維蛋白溶液期間或在制備后儲(chǔ)存高度濃縮的纖維蛋白溶液期間防止由于纖維蛋白的高濃度而導(dǎo)致的自發(fā)凝結(jié)，從而有助于增加高度濃縮的纖維蛋白原溶液的溶解度和穩(wěn)定性。至于在根據(jù)本發(fā)明的高度或低度濃縮的纖維蛋白原溶液中包含的氨基酸或氨基酸衍生物和鹽，優(yōu)選地，異亮氨酸可具有10至70mM、優(yōu)選地40至50mM的濃度，L-谷氨酸鈉可具有10至50mM、優(yōu)選地20至30mM的濃度，L-精氨酸鹽酸鹽可具有5至30mM、優(yōu)選地10至20mM的濃度，甘氨酸可具有50至200mM、優(yōu)選地100至150mM的濃度，檸檬酸鈉可具有10至30mM的濃度，并且氯化鈉可具有100至200mM的濃度，并且至少一種材料可選自具有如上所述濃度的氨基酸或氨基酸衍生物以及鹽類并且被加入。根據(jù)本發(fā)明的所述高度或低度濃縮的纖維蛋白原溶液可具有5至9、優(yōu)選地6至8，并且更優(yōu)選7至8的pH。至于能夠用于本發(fā)明中的超濾的膜，可沒(méi)有限制地使用任何膜，只要所述膜可選擇性地過(guò)濾纖維蛋白原。例如，膜可由改良型的聚醚砜或纖維素材料制成，但不限于此。為了制備本發(fā)明中的高度濃縮的纖維蛋白原溶液而用于超濾的膜的截留值(cut-offvalue)可為50至300kDa，并且更優(yōu)選地，為80至150kDa。改良型的聚醚砜或纖維素意為其中部分聚醚砜或纖維素由具有特定功能的取代基等取代的形式。作為該膜的具體實(shí)例，Biomax或Ultracel(Milliporecorp.),Centrasette(PallCorp.),Sartocon(SatoriusCorp.)等等可被使用。產(chǎn)品的材料和特性示于下面的表1。表1、能夠被用于超濾的膜和其特性為了獲得高度濃縮的纖維蛋白原溶液的低度濃縮纖維蛋白原溶液的超濾可在10至37℃，并且優(yōu)選地，在15至30℃進(jìn)行，并且所述超濾并無(wú)特別限制，但是可在2小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行，并且優(yōu)選為10至90分鐘。進(jìn)一步地，在制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法中，為了去除病毒污染風(fēng)險(xiǎn)和增加安全性，可在超濾前進(jìn)行熱處理工藝。在所述熱處理時(shí)，所述溶液中包含的蛋白(纖維蛋白原，因子X(jué)III等)的濃度，穩(wěn)定劑的成分和濃度是重要的。也就是說(shuō)，所述蛋白可具有基于整個(gè)溶液的1至5mg/ml，優(yōu)選地，2至4mg/ml的濃度，并且作為所述穩(wěn)定劑，糖類比如白糖等可為優(yōu)選的，但并不限于此。另外，所述熱處理可在40至90℃，優(yōu)選地在50至70℃，并且更優(yōu)選地在55至65℃進(jìn)行2至20小時(shí)，優(yōu)選5至15小時(shí)，并且更優(yōu)選7至12小時(shí)。進(jìn)一步地，為了增加熱處理的穩(wěn)定性，額外的穩(wěn)定劑比如甘氨酸等可額外地加入。為了去除熱處理后產(chǎn)生的雜質(zhì)和所述穩(wěn)定劑，可使用一般的分離和純化方法比如陰離子色譜法等。在另一個(gè)總的方面，提供了制備所述纖維蛋白封閉劑成分1的方法，包括在制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法中加入因子X(jué)III等，以及由所述方法制備的纖維蛋白封閉劑成分1。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“纖維蛋白封閉劑組分1”，其為當(dāng)提供由凝血酶和氯化鈣配置的纖維蛋白封閉劑組分2時(shí)可立即作為纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品使用的溶液，意為其中包含纖維蛋白原、因子和其它必要成分的溶液。根據(jù)本發(fā)明的制備纖維蛋白封閉劑組分1的方法進(jìn)一步包括在制備高度濃縮的纖維蛋白原的方法中在超濾前或超濾后額外地加入因子X(jué)III。也就是說(shuō)，因子X(jué)III可在用于制備高度濃縮的纖維蛋白原的超濾前加入低度濃縮的纖維蛋白原溶液中，或在所述超濾后加入高度濃縮的纖維蛋白原溶液中。考慮到純化和病毒滅活的容易性，將因子X(jué)III在超濾前加入低度濃縮的纖維蛋白原溶液以被用于制備纖維蛋白封閉劑組分1可能是優(yōu)選的，并且在其中將因子X(jué)III在超濾后加入高度濃縮的纖維蛋白原溶液以被用于制備纖維蛋白封閉劑組分1的情況中，比如病毒滅活等的處理可在加入的因子X(jué)III等上預(yù)先進(jìn)行。在其中將因子X(jué)III在超濾前加入低度濃縮的纖維蛋白原溶液以經(jīng)受熱處理工藝(其為病毒滅活工藝)的情況中，在所述熱處理時(shí)在優(yōu)選濃度的蛋白中的蛋白預(yù)計(jì)包括纖維蛋白原和因子X(jué)III。在根據(jù)本發(fā)明的制備纖維蛋白封閉劑組分1的方法中，在高度濃縮的纖維蛋白原溶液中，因子X(jué)III和纖維蛋白原的混合比可優(yōu)選為0.1至0.8IU，優(yōu)選地，0.7至0.8IU每1mg的纖維蛋白原。在本發(fā)明中，為了制備所述纖維蛋白封閉劑組分1而使用的因子X(jué)III可來(lái)自使用眾所周知的工藝比如沉淀、熱變性、病毒滅活、陰離子色譜法等從人血漿通過(guò)乙醇沉淀獲得的餾分I(FractionI)的沉淀物。另外，根據(jù)本發(fā)明的制備纖維蛋白封閉劑組分1的方法可包括在超濾后向包含因子X(jué)III的高度濃縮的纖維蛋白原溶液中加入選自由抑肽酶、去垢劑比如吐溫系列(吐溫20、吐溫80等)和白蛋白組成的組的至少一種材料。抑肽酶可以100至5000KIU/mL，優(yōu)選地200至3000KIU/mL的濃度被包含在所述纖維蛋白封閉劑組分1中，白蛋白可以2至50mg/mL，優(yōu)選地5至30mg/mL的濃度包含其中，并且所述去垢劑比如吐溫系列(吐溫20、吐溫80等)可以0.01至0.05重量％，優(yōu)選地0.02至0.04重量％的濃度被包含其中。隨著根據(jù)本發(fā)明的制備纖維蛋白封閉劑組分1的方法，可在不進(jìn)行冷凍干燥工藝等的情況下提供能夠在液態(tài)下冷凍的所述纖維蛋白封閉劑組分1。另外，在由根據(jù)本發(fā)明的方法制備的纖維蛋白封閉劑組分1中，去除病毒的工藝被包括在所述制備工藝中，這樣使得不會(huì)發(fā)生由來(lái)源于血液的病毒引起的問(wèn)題并且所述纖維蛋白封閉劑組分1可在4至25℃保存2至8個(gè)月以及在-18℃或更低溫保存超過(guò)24個(gè)月。根據(jù)本發(fā)明的最終的纖維蛋白封閉劑組分1可具有6.0至9.0，優(yōu)選地，7.0至8.0的pH。在另一個(gè)總的方面，提供了包含根據(jù)如上文所述的方法制備的纖維蛋白封閉劑組分1的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品和其方法。根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品可通過(guò)向由如上文所述的方法制備的纖維蛋白封閉劑組分1提供填充在單獨(dú)的容器中的包含凝血酶和氯化鈣的纖維蛋白封閉劑組分2制備，并且根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品可以其中所述纖維蛋白封閉劑組分1和包含凝血酶和氯化鈣的纖維蛋白封閉劑組分2被分別填充在單獨(dú)的瓶中的瓶型，或者以其中所述纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑組分2被填充在彼此連接的單獨(dú)的注射器中從而可立即使用的預(yù)填充型(見(jiàn)圖2)提供，但不限于此。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通常在本領(lǐng)域使用的所有類型均被包括在本發(fā)明的所附權(quán)利要求中，只要它們滿足本發(fā)明的目標(biāo)。包含凝血酶和氯化鈣的纖維蛋白封閉劑組分2可包含4至1200IU/ml、優(yōu)選400至600IU/mL的凝血酶和20至60mM、優(yōu)選30至50mM的氯化鈣。在根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品中，白蛋白可額外地被包括在填充在單獨(dú)的容器中的纖維蛋白封閉劑組分2中。填充在單獨(dú)的容器中的纖維蛋白封閉劑組分2包含5至100mg/mL、優(yōu)選10至50mg/mL的白蛋白。更具體地，制備纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的方法的實(shí)例包括：(1)使用冷凍沉淀法沉淀人血漿；(2)從所沉淀的餾分獲得低度濃縮的纖維蛋白原溶液；(3)從使用所述冷凍沉淀法沉淀的人血漿的上清液獲得因子X(jué)III；(4)向低度濃縮的纖維蛋白原溶液中加入因子X(jué)III、氨基酸和/或鹽并進(jìn)行超濾以獲得包含因子X(jué)III的纖維蛋白封閉劑組分1；以及(5)向所述纖維蛋白封閉劑組分1提供填充在單獨(dú)的容器中的纖維蛋白封閉劑組分2。在上文的方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，步驟(2)和步驟(3)可以改變的順序進(jìn)行，以及熱處理步驟可在進(jìn)行超濾前額外地進(jìn)行。更具體地，制備纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的方法的另一個(gè)實(shí)例包括：(1’)使用冷凍沉淀法沉淀人血漿；(2’)從所沉淀的餾分獲得低度濃縮的纖維蛋白原溶液；(3’)從使用所述冷凍沉淀法沉淀的人血漿的上清液獲得因子X(jué)III；(4’)向低度濃縮的纖維蛋白原溶液中加入氨基酸和/或鹽并進(jìn)行超濾以獲得高度濃縮的纖維蛋白原溶液；(5’)向所獲得的高度濃縮的纖維蛋白原溶液加入因子X(jué)III等以獲得纖維蛋白封閉劑組分1；以及(6)提供所述纖維蛋白封閉劑組分1和填充在單獨(dú)的容器中的纖維蛋白封閉劑組分2。在上文的方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，步驟(2)和步驟(3)可以改變的順序進(jìn)行，以及熱處理步驟可在進(jìn)行超濾前額外地進(jìn)行。有益效果如上文所列舉的，隨著根據(jù)本發(fā)明的使用超濾制備高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法，能夠被用于制備纖維蛋白封閉劑的高度濃縮的纖維蛋白原溶液可不同于現(xiàn)有方法在不進(jìn)行冷凍干燥工藝的情況下經(jīng)濟(jì)、有效和快速地獲得。另外，由于使用由如上文所述的方法制備的高度濃縮的纖維蛋白原溶液制備的纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品可以液態(tài)提供從而可立即使用而無(wú)需重構(gòu)操作，所以所述纖維蛋白封閉劑組分1和纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品可便于臨床使用，在室溫保存很長(zhǎng)時(shí)間，并且在冷凍保存的情況下保存至少24個(gè)月。附圖說(shuō)明從下面的結(jié)合附圖給出的優(yōu)選實(shí)施方案的描述中，本發(fā)明的上述和其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)將變得顯而易見(jiàn)，其中：圖1為說(shuō)明制備包含因子X(jué)III的高度濃縮的纖維蛋白原溶液的方法的視圖。圖2為說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品中的預(yù)填充型產(chǎn)品的視圖。圖3A和3B為商業(yè)銷售的冷凍干燥型纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品和根據(jù)本發(fā)明的液體型纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的電子顯微鏡照片：(a)商業(yè)銷售的冷凍干燥型產(chǎn)品；以及(b)根據(jù)本發(fā)明的液體型纖維蛋白封閉劑。最佳實(shí)施方式實(shí)施例1：高度濃縮的纖維蛋白原溶液的制備本發(fā)明中的低度濃縮的纖維蛋白原溶液和因子X(jué)III從人血漿分離和制備。首先，在將冷凍沉淀物從所述人血漿分離后，使用冷凍沉淀法、病毒滅活法(使用溶劑/去垢劑(S/D)處理方法)、陰離子色譜法、甘氨酸沉淀法制備纖維蛋白原沉淀物(見(jiàn)圖1)。在從人血漿去除所述冷凍沉淀物后，通過(guò)檸檬酸鹽沉淀工藝、所述S/D處理工藝、陰離子色譜工藝和濃縮工藝從由乙醇沉淀獲得的餾分I制備因子X(jué)III后，將所述纖維蛋白原沉淀溶解和混合，然后進(jìn)行熱處理(10小時(shí)，在60℃)，其為病毒滅活工藝、陰離子色譜工藝、透析濃縮工藝，這樣使得低度濃縮的纖維蛋白原溶液具有大約40mg/mL的蛋白濃度并包含因子X(jué)III(見(jiàn)圖1)。其中氨基酸被加入包含因子X(jué)III的低度濃縮的纖維蛋白原溶液的情況和其中氨基酸沒(méi)有被加入其的情況是分開(kāi)的，分別進(jìn)行超濾。在其中氨基酸被加入的情況中，包含因子X(jué)III的低度濃縮的纖維蛋白原溶液在pH7.5包含50mM的異亮氨酸、30mM的L-谷氨酸鈉、20mM的L-精氨酸鹽酸鹽、150mM的甘氨酸、20mM的檸檬酸鈉、150mM的氯化鈉和30mg/mL的蛋白(因子X(jué)III和纖維蛋白原)，并且在其中氨基酸不被加入的情況中，包含因子X(jué)III的低度濃縮的纖維蛋白原溶液在pH7.5包含20mM的檸檬酸鈉、150mM的氯化鈉和30mg/mL的纖維蛋白原。在所有的情況中，所述溶液具有7.5的pH值。高度濃縮的纖維蛋白原溶液和纖維蛋白封閉劑組分1通過(guò)超濾制備。此處，BiomaxTM(MilliporeCorp.)作為用于超濾的膜使用，并且使用Pellicon2mini-cassettes(50至100kDa，0.1㎡，A，C和V型)。所述超濾在其中溶液進(jìn)入超濾膜的一側(cè)的壓力維持在1至2巴(bar)的狀態(tài)下進(jìn)行。作為結(jié)果，據(jù)確認(rèn)，在其中氨基酸比如異亮氨酸、L-谷氨酸鈉、L-精氨酸鹽酸鹽、甘氨酸等(其為穩(wěn)定劑)被包含的情況中，具有最大量140mg/mL的因子X(jué)III的高度濃縮的纖維蛋白原溶液在2小時(shí)內(nèi)獲得，乃至在其中纖維蛋白原被高度濃縮的情況下，也不發(fā)生自發(fā)凝結(jié)，如表2所示。表2、根據(jù)超濾膜和穩(wěn)定劑加入的纖維蛋白原的濃縮效率實(shí)施例2：根據(jù)溫度保存條件的纖維蛋白封閉劑組分1的穩(wěn)定性將10mg/mL的白蛋白、1000KIU/mL的抑肽酶、Tween80與根據(jù)實(shí)施例1制備的高度濃縮的纖維蛋白原溶液混合，這樣制備纖維蛋白封閉劑組分1。將所制備的纖維蛋白封閉劑組分1使用0.2μm過(guò)濾器通過(guò)過(guò)濾殺菌以填充在1mL注射器中，這樣根據(jù)保存條件確認(rèn)穩(wěn)定性。用于本實(shí)驗(yàn)的纖維蛋白封閉劑組分1包含88mg/mL的纖維蛋白原和65IU/mL的因子X(jué)III。測(cè)量凝結(jié)纖維蛋白原蛋白的時(shí)間減少10％作為保存期限，從而評(píng)估穩(wěn)定性。作為結(jié)果，據(jù)觀察，根據(jù)本發(fā)明的包含因子X(jué)III的纖維蛋白封閉劑組分1可在-18℃穩(wěn)定地保存至少24個(gè)月以及在25℃保存多達(dá)6個(gè)月(見(jiàn)表3)。表3、根據(jù)保存條件的纖維蛋白封閉劑組分1的穩(wěn)定性實(shí)施例3：纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的制備向?qū)嵤├?中制備的纖維蛋白封閉劑組分1提供填充在單獨(dú)的容器中的包含凝血酶和氯化鈣的纖維蛋白封閉劑組分2以制備纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品，以及最后，將兩種溶液彼此混合，這樣纖維蛋白聚合物形成并可用于醫(yī)學(xué)目的等。在填充在單獨(dú)容器中的纖維蛋白封閉劑組分2中，包含500IU/mL的凝血酶和40mM的氯化鈣，并可額外加入40mg/mL的白蛋白。實(shí)施例4：纖維蛋白封閉劑的電子顯微鏡觀察為了比較和確認(rèn)根據(jù)實(shí)施例3制備的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品形成纖維蛋白聚合物時(shí)和商業(yè)銷售的用于治療目的的冷凍干燥型纖維蛋白封閉劑(Greenplast1mLkit,GreenCrossCorp.)形成纖維蛋白聚合物時(shí)的物理性質(zhì)，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中使用的掃描電子顯微鏡為場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM,設(shè)備:Supra55vp,CarlZeiss,德國(guó))。作為結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的凝結(jié)纖維蛋白的物質(zhì)具有其中纖維蛋白象一束線一樣被纏結(jié)的網(wǎng)狀，類似于商業(yè)銷售的冷凍干燥的纖維蛋白封閉劑的那個(gè)，如圖3A和3B所示。實(shí)施例5：纖維蛋白封閉劑的毒性測(cè)試為了測(cè)試根據(jù)實(shí)施例3制備的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的毒性，使用兩個(gè)物種，即SD大鼠和兔子。設(shè)置在其中使用比根據(jù)本發(fā)明制備的纖維蛋白封閉劑產(chǎn)品的預(yù)期的最大臨床劑量高5倍的低劑量組(0.5mL/kg)和在其中使用比其預(yù)期的最大臨床劑量高50倍的高劑量組(5mL/kg)，并且在單劑量皮下施用后評(píng)估毒性反應(yīng)。在向所有雌性和雄性SD大鼠和兔子施用測(cè)試材料14天后，進(jìn)行一般癥狀、體重、采食量、血液學(xué)檢測(cè)、尸體解剖、組織病理學(xué)檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。作為使用雌性和雄性大鼠和兔子的毒性測(cè)試結(jié)果，所有的大鼠和兔子都沒(méi)有死亡，并且沒(méi)有觀察到測(cè)試材料的施用對(duì)體重、采食量和血液學(xué)檢測(cè)的影響。在一般癥狀中，在測(cè)試材料施用組的施用位點(diǎn)觀察到硬結(jié)，并且在尸體解剖和組織病理學(xué)檢測(cè)中，除了異物反應(yīng)以外，在所有的器官和組織中均沒(méi)有觀察到異常。因此，在SD大鼠和兔子中在多達(dá)5mL/kg的劑量沒(méi)有觀察到測(cè)試材料的毒性效應(yīng)，并且可以理解，在雌性和雄性大鼠和兔子中的原理致死劑量(schematiclethaldose)均高于5mL/kg。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3