本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中AIDS治療反應(yīng)器,主要用于體外清除游離于艾滋病患者血細(xì)胞外的艾滋病毒,與此同時(shí)補(bǔ)充艾滋病患者體內(nèi)所缺乏的CD4+T細(xì)胞因子,達(dá)到治療艾滋病的目的。
背景技術(shù):
艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的傳染病,在全球廣泛流行,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報(bào)告,自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來,至今全球有208個(gè)國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅,約有4000萬人感染了艾滋病,死亡人數(shù)已超過2000萬,每天約有6000人成為艾滋病感染者,同時(shí)每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長(zhǎng)期,目前已遠(yuǎn)超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個(gè)人類面臨的重大感染性疾病,已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。
HIV是感染人類免疫細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒,直徑約120納米,大致呈球形,外膜是類脂包膜(來自宿主細(xì)胞),并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41,gp41是跨膜蛋白,gp120位于表面,并與gp41通過非共價(jià)作用結(jié)合,向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix),以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid),衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。HIV進(jìn)入人體后,首先被巨噬細(xì)胞吞噬,但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境,創(chuàng)造了適合其生存的條件,不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因?yàn)镃D4是HIV的受體,所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用,利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等),在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖,每天產(chǎn)生109~1010病毒顆粒,并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,制造更多的病毒感染細(xì)胞,使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞,感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞,整個(gè)免疫系統(tǒng)就會(huì)遭到致命的打擊,對(duì)各種疾病的感染都失去抵抗力;HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長(zhǎng)期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀,其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA,與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi),在整合酶的作用下,雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi),被整合的病毒DNA稱為前病毒,可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制,造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期,HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖,這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫,可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞,有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后,HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液,然后再進(jìn)入其他細(xì)胞繼續(xù)感染過程;HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測(cè)出低水平的抗病毒中和抗體,其中艾滋病病人水平最低,HIV攜帶者最高,說明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸,且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異,原有抗體失去作用,使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段,HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中,因此HIV不會(huì)被免疫系統(tǒng)所識(shí)別,所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個(gè)很重要的原因應(yīng)該是,根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測(cè),免疫性抗體與抗原結(jié)合后,要產(chǎn)生免疫效應(yīng),要么通過激活補(bǔ)體,介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原,但HIV不是細(xì)胞性抗原;要么通過趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬清除抗原,但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖;要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用,使失去感染力,但HIV無法被免疫系統(tǒng)殺滅、清除,終究要在抗體失去中和活性后又恢復(fù)感染力。
目前艾滋病治療常用的抗病毒一線藥物是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,該藥不能殺滅HIV,存在個(gè)體差異、耐藥性、腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎、肝損傷等多種毒副作用,其他如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、細(xì)胞因子、疫苗治療、基因治療和單克隆抗體被動(dòng)免疫療法等,均因?yàn)楦鞣N原因而難以普遍應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道利用T細(xì)胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激劑,大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細(xì)胞后,作為自身治療性細(xì)胞回輸,但HIV也隨著HIV感染細(xì)胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖,增量T細(xì)胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。
CD4+T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一種,平均壽命一般為7天左右,但某些T細(xì)胞特別是經(jīng)永生化成細(xì)胞系(株)后可長(zhǎng)期存活、無限擴(kuò)增。國外文獻(xiàn)報(bào)道,猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明,SV40 T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率,永生化細(xì)胞在體外多次傳代后,仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài),同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細(xì)胞株,構(gòu)建細(xì)胞模型以研究肝素對(duì)血管平滑肌的抑制作用機(jī)制。Su等利用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株,構(gòu)建細(xì)胞模型來分析上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。Miquel等用SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株,作為細(xì)胞模型研究層粘連蛋白5介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用。Webber等用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞株作為細(xì)胞模型來研究前列腺上皮細(xì)胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經(jīng)Ad12-SV40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細(xì)胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞株作為細(xì)胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下,細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的雙向分化的潛能,進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的機(jī)制。國外研究還表明,導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系,基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對(duì)正常的生長(zhǎng)特征。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系,細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上,細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性,誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系,細(xì)胞倍增達(dá)200次以上,細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。但未見制備CD4+T細(xì)胞用于體外治療艾滋病的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題,本發(fā)明人提出了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是要提供AIDS治療反應(yīng)器;另一目的是要提供反應(yīng)器的制備及應(yīng)用方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:基于HIV通過其受體CD4分子選擇性地感染CD4+T細(xì)胞且造成CD4+T細(xì)胞大量破壞和免疫功能喪失而致病的機(jī)理,通過外源基因整合而改變CD4+T細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),從而使之轉(zhuǎn)化為既保持原細(xì)胞生物學(xué)特性又能在體外無限制生長(zhǎng)的永生化細(xì)胞系,并利用CD4+T細(xì)胞表面特有分子抗體作為細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激劑,建立適應(yīng)體外人工產(chǎn)業(yè)制備既能結(jié)合HIV又能產(chǎn)生細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞的方法,將由此制備的CD4+T細(xì)胞配制于細(xì)胞凍存液,然后以高生物相容性材料包裹而進(jìn)一步制備能防止細(xì)胞及其碎片甚至HIV濾出的、能為CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及結(jié)合HIV提供場(chǎng)所的反應(yīng)器,體外循環(huán)中分離的血漿流經(jīng)反應(yīng)器時(shí),其中的HIV與CD4+T細(xì)胞發(fā)生結(jié)合反應(yīng)隨后進(jìn)入胞內(nèi)而從血漿中清除,同時(shí)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子隨血漿經(jīng)細(xì)胞間隙流出反應(yīng)器而回輸體內(nèi),從而實(shí)現(xiàn)既清除HIV又補(bǔ)充所需細(xì)胞因子的艾滋病人工CD4+T細(xì)胞替代療法。
本發(fā)明根據(jù)HIV選擇性地感染CD4+T細(xì)胞、生物人工肝治療細(xì)胞永生化的制備方法以及血液置換治療等機(jī)制,實(shí)施以人工制備CD4+T細(xì)胞并進(jìn)一步制成生物反應(yīng)器用以清除血漿HIV及補(bǔ)充相應(yīng)細(xì)胞因子的艾滋病治療新方法,因CD4+T細(xì)胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細(xì)胞,與HIV相遇時(shí)能吸附HIV,被吸附的HIV隨CD4+T細(xì)胞被固定于反應(yīng)器,制備的生物反應(yīng)器能防止細(xì)胞及其碎片甚至HIV濾出,能為CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及結(jié)合HIV提供場(chǎng)所,本發(fā)明的技術(shù)方案能有效阻斷新生的CD4+T細(xì)胞再被HIV感染,能使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失,從而達(dá)到免疫重建的治療目的,與目前無法殺滅HIV和有效阻斷從血漿到CD4+T細(xì)胞的循環(huán)感染途徑、且費(fèi)用昂貴、藥副作用大的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方法相比,本發(fā)明更經(jīng)濟(jì),實(shí)現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外加以清除的治療新方法。
具體實(shí)施方式
圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的AIDS治療反應(yīng)器的應(yīng)用示意圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的AIDS治療反應(yīng)器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
圖1中,動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通,另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連,血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個(gè)并聯(lián)的反應(yīng)器(8)、反應(yīng)器(9)相連,然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連,靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。
圖2中,1是血漿分離器,2是血漿分離器內(nèi)腔,3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔,4是不能通過微孔(3)的血細(xì)胞,5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份,6是血漿分離器外腔,7是血漿流出口,8是可開關(guān)的閥門。
圖3中,1是反應(yīng)器,2是CD4+T細(xì)胞,3是進(jìn)入反應(yīng)器的游離的HIV,4是HIV與CD4+T細(xì)胞結(jié)合物,5是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
下面結(jié)合圖1、圖2和圖3,對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。
一、AIDS治療反應(yīng)器的制備
1、制備依據(jù)
(1)根據(jù)CD4+T細(xì)胞是HIV的易感細(xì)胞制備:HIV進(jìn)入人體后,被巨噬細(xì)胞(含CD4分子)吞噬,但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境,創(chuàng)造了適合其生存的條件,不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因?yàn)镃D4是HIV的受體,所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用,利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入其他CD4+細(xì)胞,如單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等,特別是CD4+T細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖,每天產(chǎn)生109~1010病毒顆粒,并不斷進(jìn)入其他正常的CD4+T細(xì)胞內(nèi)或再生的CD4+T細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,制造更多的病毒感染細(xì)胞,使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。在HIV感染CD4+T細(xì)胞的過程中存在游離于血漿的時(shí)機(jī),設(shè)計(jì)以CD4+T細(xì)胞為吸附細(xì)胞的生物治療反應(yīng)器,用以吸附清除體外分離血漿中的HIV,從而使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失,有效阻斷新生的CD4+T細(xì)胞再感染HIV途徑,達(dá)到免疫重建的治療目的。
(2)CD4+T細(xì)胞能產(chǎn)生細(xì)胞因子:如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10,其中IL-2被認(rèn)為是最重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和動(dòng)態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)因子,引起CD4+T細(xì)胞增殖并增加CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛能,能使CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)長(zhǎng)時(shí)間增加;分泌的IFN具有促進(jìn)感染致炎癥性反應(yīng)的作用;分泌的IL-4和IL-10具有抑制炎癥反應(yīng)的作用;分泌的IL-6具有參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病反應(yīng)的作用。HIV感染的主要特征是進(jìn)行性免疫缺陷,包括以CD4+T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞數(shù)量減少和功能異常,各種細(xì)胞因子分泌減少或消失,導(dǎo)致免疫功能喪失。
2、反應(yīng)劑的制備
制備CD4+T細(xì)胞(包括其他CD4+細(xì)胞),作為反應(yīng)器內(nèi)部吸附HIV的反應(yīng)劑(基質(zhì))。
(1)原代淋巴細(xì)胞的來源:有以下種途經(jīng):①用于科研保存的傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫中凍存的淋巴細(xì)胞株(經(jīng)滅活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴細(xì)胞);②購買血站新鮮濃縮白細(xì)胞,然后進(jìn)行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細(xì)胞;③從商家直接購買的T淋巴細(xì)胞系(株);④用于科研保存的臍帶血淋巴細(xì)胞(經(jīng)滅活HIV免疫);⑤直接取自因做其他實(shí)驗(yàn)而順便采集的HIV-1感染者的存余的外周血淋巴細(xì)胞(用于自身),采用Histopaque淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。
(2)CD4+T細(xì)胞的制備:①主要試劑與儀器:CD4、CD8免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司);異硫氰酸熒光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司);淋巴細(xì)胞分離液(上海恒信生化試劑有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司);新生牛血清(Hyclone公司);MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司);EpicsXL型流式細(xì)胞儀(美國BeckmanCoulter公司)。②單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法):無菌取20mL血樣(500IU/mL2mL肝素鈉抗凝);PBS液將血液稀釋2~3倍,充分混勻后將6mL抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min,20℃)35min;離心后管內(nèi)分為3層,上層為血漿和PBS液,下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞,中層為淋巴細(xì)胞分離液,在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC,用毛細(xì)吸管插到云霧層,吸取PBMC置入另一50mL離心管中,加入5倍以上體積PBS離心(300r/min,20℃)10min,棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞,離心(350r/min,20℃)15min,棄上清,加入Buffer(PBS+0.5%新生牛血清+2mmol/LEDTA,pH7.2)2mL重懸細(xì)胞,取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。③CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分離純化:PBMC細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管,離心(300r/min,20℃)10min,棄去上清,重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)107個(gè),每107個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads,充分混勻,在4~8℃孵化15min,用1mLBuffer洗滌細(xì)胞,離心(300r/min,20℃)10min,棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞,將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中,以500uLBuffer漂洗,將500uL細(xì)胞懸液通過分離柱,用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次,收集流出液,流出液中含非CD4+T淋巴細(xì)胞或非CD8+T淋巴細(xì)胞,自分離器中取出分離柱,用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱,收集流出液,此為CD4+T淋巴細(xì)胞或CD8+T淋巴細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè):細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合,顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞,著色脹大者為死細(xì)胞,計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。
(3)體外產(chǎn)業(yè)制備CD4+T細(xì)胞
有文獻(xiàn)報(bào)道利用T細(xì)胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激劑,大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細(xì)胞后,作為自身治療性細(xì)胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細(xì)胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖,增量T細(xì)胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。本發(fā)明以SV40或hTERT永生化CD4+T細(xì)胞,并以CD3單克隆抗體為細(xì)胞生長(zhǎng)刺激劑,大量擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞,用于制備反應(yīng)器,結(jié)合血液凈化技術(shù),在體外清除HIV。
以CD3單克隆抗體為細(xì)胞生長(zhǎng)刺激劑的方法是:將抗CD3單抗(CD4+T細(xì)胞同時(shí)含有CD3分子)包被到培養(yǎng)板上刺激單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)生長(zhǎng),稱為抗CD3抗體包被法,可獲得很好的擴(kuò)增效果,應(yīng)用這種方法擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定的療效。國外文獻(xiàn)報(bào)道[Shimizu等]亦用此方法培養(yǎng)了5例晚期艾滋病患者的淋巴細(xì)胞,培養(yǎng)4周就可獲得1000倍的擴(kuò)增,且擴(kuò)增的細(xì)胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴(kuò)增(CD4+T細(xì)胞更明顯)。另一種是抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)法,即將抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)于滋珠上作為刺激劑培養(yǎng)HIV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞),可以擴(kuò)增大量的CD4+T細(xì)胞,并且擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞具有對(duì)抗HIV感染的能力,其培養(yǎng)過程中病毒也低于檢測(cè)水平,之后發(fā)現(xiàn)這可能與CD28提供了第二信號(hào),選擇性誘導(dǎo)分泌大量的Th1細(xì)胞因子和趨化因子有關(guān),用此方法擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸,無風(fēng)險(xiǎn)但效果一般。
以hTERT永生化CD4+T細(xì)胞的方法是:以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物,構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的T淋巴細(xì)胞,使重組子與細(xì)胞的DNA整合,并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽性重組子的克隆,篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT永生化的CD4+T細(xì)胞。
以SV40永生化CD4+T細(xì)胞的方法是:以T4 DNA連接酶連接同時(shí)經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA,構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞,使重組子與細(xì)胞的DNA整合,以G418篩選的含陽性重組子的細(xì)胞,作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng),篩選細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測(cè)、mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定及DNA序列測(cè)定結(jié)果符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細(xì)胞。
①以hTERT永生化CD4+T細(xì)胞的具體方法
(I)hTERT的提取:(i)酶切pClneo-hTERT:hTERT位于質(zhì)粒pCl neo-hTERT的EcoRI與SalI位點(diǎn)之間,pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒,溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中,加2uL10×酶切緩沖液和18uL H2O,加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul,37℃溫育1h,75℃加熱15min,滅活酶,加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng),按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后,收取擴(kuò)增物以備電泳。(ii)hTERT電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠,倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上,插上樣品梳,待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶,拔出梳子,放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中,緩沖液高出凝膠表面大約1mm,用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品,然后用移液器將樣品加入樣品孔中,并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物,接通電極,使hTERT向陽極移動(dòng),然后在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min),關(guān)閉電源。(iii)hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長(zhǎng)波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中,向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液,使之浸沒凝膠,并排空汽泡,將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行),加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm),接通電源,150伏電洗,在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠,改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘,從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中,加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液,如此重復(fù)二次,自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇,于20℃過夜,12000g,4℃下離心10分鐘,得hTERT沉淀,棄上清,加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇,加入50μl TE溶解hTERT。此外,還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
(II)hTERT與pLXSNneo載體的連接:取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μl10mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合,15℃溫育24h,構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。
(III)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌,使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化,用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌,本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,操作過程簡(jiǎn)述如下:從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中,于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2~3h(旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min),每隔20~30min測(cè)量OD600值≈0.4,在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè),用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min,于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細(xì)胞,倒數(shù)培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上,于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細(xì)胞,倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,此時(shí),可以迅速將細(xì)胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆谩?ii)以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,DNA≤50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min,將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動(dòng)試管,快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1~2min,每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇,并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上,將平板置于室溫至液體被吸收,倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16h后可出現(xiàn)菌落。(iii)篩選、擴(kuò)增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中,培養(yǎng)過夜后,再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中,再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD600≈4,為提高產(chǎn)量,應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度,振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4℃,6000g離心10min,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存),加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液,重懸沉淀,于室溫放置10min,加入10mL新配NaOH/SDS溶液,并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠,于冰上放置10min,加入7.5mL乙酸溶液,用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置10min,于4℃,20 000g離心10min,將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中,如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾,加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻,室溫放置5~10min,于室溫,1 500g離心10min,加入2mL 70%乙醇輕輕洗滌沉淀,然后短暫快速離心,吸去乙醇,真空干燥(沉淀可在4℃長(zhǎng)期保存)。(iv)重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增:挑取平皿上的單菌落,接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中,37℃,250r/min搖床中培養(yǎng),14h后收集培養(yǎng)物,4℃、10000r/min離心5min,按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒;以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、l0×buffer 2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補(bǔ)足至20ul,37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳,時(shí)間30min,凝膠成像系統(tǒng)拍照;按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列;重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后,將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中,擴(kuò)增培養(yǎng),按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化,紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
(IV)CD4+T細(xì)胞:從本發(fā)明“(2)CD4+T細(xì)胞的制備”取樣制備。
(V)CD4+T細(xì)胞預(yù)培養(yǎng):將上述細(xì)胞接種于含5~10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中,或接種于含20%胎牛血清、5~10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中,一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6%1M HEPES緩沖液;15%胎牛血清(FBS);1%青霉素和鏈霉素;PRMI 1640補(bǔ)足到100%),置于37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)1-2天,離心,去上清液,備用。
(VI)pLXSNneo-hTERT重組子導(dǎo)入T淋巴細(xì)胞及擴(kuò)大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A,將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μl無血清培養(yǎng)液中;管B,將20μlLipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中,將管A和管B混勻,室溫下靜置45min,用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細(xì)胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液,輕輕混勻,滴加至上述T淋巴細(xì)胞中,加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L),在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h,吸出轉(zhuǎn)染液,加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20%),繼續(xù)培養(yǎng)20h,棄去培養(yǎng)液,更換濃度為400mg·L-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后,再加大G418濃度到800mg·L-1,將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察,可見淋巴細(xì)胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢,或細(xì)胞密度低,或培養(yǎng)液pH值呈酸性,吸出半量培養(yǎng)液,進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中,每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代),仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,即細(xì)胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系,死亡細(xì)胞少于10%(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況;通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎5幕罴?xì)胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能夠排斥,使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi);而喪失活性的細(xì)胞,胞膜的通透性增加,可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色,可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液,與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5~10分鐘,然后制成細(xì)胞薄片,在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù),計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來越多,直至細(xì)胞不再增加,甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí),置50ml離心管中,離心1500轉(zhuǎn),10分鐘,棄上清后,加入3ml凍存培養(yǎng)基(5%二甲基亞楓(dimethylsufoxide),95%FBS)混勻,成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝,1ml/管,置-20℃2h,再置-70℃2h,然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度,1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。
(VII)永生化CD4+T細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定:(i)觀察細(xì)胞形態(tài):可見淋巴細(xì)胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,具有淋巴母細(xì)胞化特征。(ii)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,經(jīng)計(jì)數(shù),分別取1.4×104細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算均值,連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降,培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液,采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù)),描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成;(iii)檢查染色體:通過分析染色體核型,如果染色體核型為二倍體“46,XX”或“46,XY”,則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體,如果沒有,也說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul,混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時(shí),經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型;(iv)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例,如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng),說明是hTERT整合、表達(dá)的結(jié)果。(vii)DNA序列測(cè)定:按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè),顯示hTERT基因序列。(v)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中hTERT檢測(cè):如以免疫組織化學(xué)檢測(cè),hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒,表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi);(vi)mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:取100μl體系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠回收試劑盒(Takara,日本)回收產(chǎn)物,取2μl DNA溶液稀釋100倍,測(cè)濃度,余下的DNA及上、下游引物各10μl進(jìn)行測(cè)序。
(VIII)hTERT介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的細(xì)胞,經(jīng)離心分離(1200r/min,6min),用含二甲亞砜的凍存液0.5~1ml重懸細(xì)胞,細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml,加入凍存管,經(jīng)4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,過夜,入-196℃液氮凍存,以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化CD4+T細(xì)胞庫備用。
②以SV40永生化CD4+T細(xì)胞的具體方法
(I)SV40大T抗原DNA的提?。?i)SV40DNA酶切:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒,溶解于適量的H2O或TE緩沖液中,加2uL10×酶切緩沖液和18uLH2O,加限制性內(nèi)切酶BamH I(1-5U/ugDNA),37℃溫育1h,75℃加熱15min,滅活酶,加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。(ii)SV40DNA電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠,倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上,插上樣品梳,待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶,拔出梳子,放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中,緩沖液高出凝膠表面約1mm,用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品,然后用移液器將樣品加入樣品孔中,并同時(shí)做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物,接通電極,使DNA向陽極移動(dòng),在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時(shí),關(guān)閉電源。(iii)從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長(zhǎng)波紫外光源下(使用長(zhǎng)波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中,向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液,使之浸沒凝膠,并排空汽泡,將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行),加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm),接通電源,150伏電洗,在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠,改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘,從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中,加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液,如此重復(fù)二次,自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇,于20℃過夜,12000g,4℃下離心10分鐘,得DNA沉淀,棄上清,加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇,加入50μl TE溶解DNA。此外,還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。
(II)SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接:取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4 DNA連接酶(20~500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合,15℃溫育24h,構(gòu)建成SV40T/pcDNA3.1重組子。
(III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定:(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌,使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化,用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌,本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,操作過程簡(jiǎn)述如下:從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中,于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2~3h(旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min),每隔20~30min測(cè)量OD600值≈0.4,在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè),用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min,于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細(xì)胞,倒數(shù)培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上,于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細(xì)胞,倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,此時(shí),可以迅速將細(xì)胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆?,用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,應(yīng)在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,DNA≤50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min,將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動(dòng)試管,快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1~2min,每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇,并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上,將平板置于室溫至液體被吸收,倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16h后可出現(xiàn)菌落。(ii)重組子的篩選、擴(kuò)增與提?。河脽o菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中,培養(yǎng)過夜后,再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中,再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD600≈4,為提高產(chǎn)量,應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度,振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4℃,6000g離心10min,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存),加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液,重懸沉淀,于室溫放置10min,加入10mL新配NaOH/SDS溶液,并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠,于冰上放置10min,加入7.5mL乙酸溶液,用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置10min,于4℃,20 000g離心10min,將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中,如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾,加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻,室溫放置5~10min,于室溫,1 500g離心10min,加入2mL 70%乙醇輕輕洗滌沉淀,然后短暫快速離心,吸去乙醇,并真空干燥(沉淀可在4℃長(zhǎng)期保存)。(iii)重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1),同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶切,10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶,前者符合GenBank中SV40T片段的大小。
(IV)CD4+T細(xì)胞:從本發(fā)明“(2)CD4+T細(xì)胞的制備”取樣制備。
(V)CD4+T細(xì)胞預(yù)培養(yǎng):將上述細(xì)胞接種于含5~10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中,或接種于含20%胎牛血清、5~10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中,一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6%1M HEPES緩沖液;15%胎牛血清(FBS);1%青霉素和鏈霉素;PRMI1640補(bǔ)足到100%),置于37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)1-2天,離心,去上清液,備用。
(VI)SV40T/pcDNA3.1的導(dǎo)入及擴(kuò)大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A,將SV40T/pcDNA3.1溶于100μl無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)中;管B,將20μlLipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中,將管A和管B混勻,室溫下置45min。用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細(xì)胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液,輕輕混勻,再滴加至上述T淋巴細(xì)胞中,然后加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L),在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h,吸出轉(zhuǎn)染液,加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20%),繼續(xù)培養(yǎng)20h,棄去培養(yǎng)液,更換濃度為400mg·L-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后,再加大G418濃度到800mg·L-1,將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察,可見淋巴細(xì)胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢,或細(xì)胞密度低,或培養(yǎng)液pH值呈酸性,吸出半量培養(yǎng)液,進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中,每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)約6-8周(約第55代),仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng),即培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞增加數(shù)量呈倍增關(guān)系,死亡細(xì)胞少于10%(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況;通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎5幕罴?xì)胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能夠排斥,使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi);而喪失活性的細(xì)胞,胞膜的通透性增加,可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色,可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液,與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5~10分鐘,然后制成細(xì)胞薄片,在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù),計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來越多,直至細(xì)胞不再增加,甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí),置50ml離心管中,離心1500轉(zhuǎn),10分鐘,棄上清,加入3ml凍存培養(yǎng)基(5%二甲基亞楓(dimethylsufoxide),95%FBS)混勻,成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝,1ml/管,置-20℃2h,再置-70℃2h,然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度,1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。
(VII)永生化CD4+T細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定:(i)觀察細(xì)胞形態(tài):可見淋巴細(xì)胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,具有淋巴母細(xì)胞化特征。(ii)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,經(jīng)計(jì)數(shù),分別取1.4×104細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算均值,連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降,培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液,采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù)),描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成;(iii)檢查染色體:通過分析染色體核型,如果染色體核型為二倍體“46,XX”或“46,XY”,則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體,如沒有,說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul,混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時(shí),經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型;(iv)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例,如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng),說明是SV40大T抗原整合、表達(dá)的結(jié)果。(viii)DNA序列測(cè)定:按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè),顯示SV40大T抗原DNA序列。(v)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測(cè):如以免疫組織化學(xué)檢測(cè),SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒,表明SV40T抗原已整合入細(xì)胞內(nèi);也可用RT-PCR法檢測(cè)T抗原在細(xì)胞中的表達(dá),其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’,下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為268bp,擴(kuò)增條件為94℃,5min,即:(94℃,1min;55℃,1min,-0.5℃/循環(huán);72℃,1min)×30、(94℃,30S;40℃,30S,72℃,30S)×15,擴(kuò)增體系為50μl:[Mg2+]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl;實(shí)驗(yàn)組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成,產(chǎn)物-20℃保存);陰性對(duì)照設(shè)兩個(gè),分別以無菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板,陽性對(duì)照以SV40 DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA,因?yàn)镾V40病毒無包膜,不使用SDS破膜,取5μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),其余-20℃保存?zhèn)溆?;(vi)mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序:取100μl體系的擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠回收試劑盒(Takara,日本)回收產(chǎn)物,取2μl DNA溶液稀釋100倍,測(cè)濃度,余下的DNA及上、下游引物各10μl進(jìn)行測(cè)序。
(VIII)SV40LT基因介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的細(xì)胞,經(jīng)離心分離(1200r/min,6min),用含二甲亞砜的凍存液0.5~1ml重懸細(xì)胞,細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml,加入凍存管,經(jīng)4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,過夜,入-196℃液氮凍存,以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞庫備用。
(4)與CD4+T細(xì)胞相似功能顆粒的制備:可將CD4分子、基因重組的CD4分子及類似功能的分子通過常規(guī)化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆粒,或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細(xì)胞應(yīng)用。本發(fā)明的CD4+T細(xì)胞代表其他CD4+細(xì)胞,包括用其他方法制備永生化CD4+T細(xì)胞。
3、反應(yīng)器的規(guī)格
將本發(fā)明制備的CD4+T細(xì)胞,以無菌生理鹽水清洗后,再以1000r/min離心5min(低速短時(shí)離心),取細(xì)胞沉淀裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同)制成的圓柱形反應(yīng)器,至4/5,然后加細(xì)胞凍存液(含30%胎牛血清、12%二甲亞砜的1640培養(yǎng)液),使細(xì)胞濃度達(dá)80%,輕輕搖勻,封口,經(jīng)4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,過夜,入-196℃液氮凍存?zhèn)溆谩=鈨鍪褂脮r(shí),需迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的37℃水浴中,并不斷搖動(dòng),使管中的液體迅速融化,然后以無菌生理鹽水清洗后使用。
反應(yīng)器可為漏斗形,底徑小,頂徑大,容積為200~300ml,進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng),進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目;出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0~5.0目(2.5~5.0目相當(dāng)于0.1~0.2微米或100~200納米),具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格,用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌;液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng),用以阻擋可能濾出的細(xì)胞;液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū),有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。
二、血漿分離器的制備
1、原理:根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為:正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm),是雙凹圓盤狀的細(xì)胞;白細(xì)胞分為5種,中性粒細(xì)胞約12μm,嗜酸性粒細(xì)胞略大些,嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近,小淋巴細(xì)胞6-8μm,與紅細(xì)胞近似,單核細(xì)胞最大,約15-20μm。血小板為圓盤形,直徑1~4微米到7~8微米不等,人的血小板平均直徑為2-4微米,厚0.5~1.5微米。
2、材料:用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物,要求幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變??赏ㄟ^共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生,如選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等。
3、型號(hào)與規(guī)格:就分離器的外形來說,可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀,按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明的血漿分離器制成空心纖維型濾器,空心纖維膜直徑為270~370μm,膜厚度為50μm,孔徑為0.2~0.6μm,纖維長(zhǎng)度為13.5~26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過,但能阻擋所有的細(xì)胞成分。
三、生物治療反應(yīng)器的應(yīng)用
1、體外循環(huán)裝置的構(gòu)成及作用
(1)反應(yīng)器:內(nèi)含反應(yīng)劑(CD4+T細(xì)胞),用于吸附、清除HIV。
(2)血漿分離器:用于體外循環(huán)裝置中分離血漿和血細(xì)胞。
(3)動(dòng)靜脈壓監(jiān)測(cè):動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿分離器微孔的堵塞情況,另外用以監(jiān)測(cè)體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí),動(dòng)脈壓就會(huì)降低;當(dāng)有凝血、血栓形成,特別是分離器微孔堵塞時(shí),動(dòng)脈壓就會(huì)升高;靜脈壓監(jiān)測(cè)用來監(jiān)測(cè)管路血液回流的壓力,當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí),靜脈壓就會(huì)下降,如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí),靜脈壓就會(huì)升高。
(4)空氣監(jiān)測(cè)(Air Detector):用來監(jiān)測(cè)血液流路的空氣氣泡,一般用超聲波探測(cè)的原理,為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測(cè)到有空氣氣泡時(shí),檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來阻斷血流,防止危險(xiǎn)的發(fā)生。
其他還包括溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、超濾監(jiān)測(cè)和漏血監(jiān)測(cè)等部分??傊?,在本發(fā)明構(gòu)成體系的基礎(chǔ)上,有望進(jìn)一步研發(fā)自動(dòng)化治療儀器,發(fā)展為操作的人性化、治療的個(gè)性化、設(shè)計(jì)的安全性以及模塊化、自動(dòng)監(jiān)測(cè)及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理系統(tǒng)。
2、使用方法
(1)安裝:以無菌操作連接各部件,包括血漿分離器、反應(yīng)器及各循環(huán)管路。
(2)排氣:以無菌生理鹽水充液分離器、反應(yīng)器及各循環(huán)管路,排除分離器、反應(yīng)器及其循環(huán)管道內(nèi)的氣體、氣泡,仔細(xì)檢查,確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。
(3)通液:將動(dòng)脈血路管(1)接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管,在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全,液流是否通暢,并避免管內(nèi)流液污染。
(4)抗凝:從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素),初次為2500∪或20~30∪/kg。
(5)啟動(dòng):將靜脈管路(5)接通艾滋病患者的靜脈血管,然后打開血液泵,血流量為100~150ml/min,如圖1,當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)進(jìn)入血漿分離器(4),分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達(dá)反應(yīng)器(8),待充滿血漿、約10分鐘,開始放出血漿,經(jīng)循環(huán)管路(10)流出,同步向反應(yīng)器(9)灌注血漿,在反應(yīng)器(8)內(nèi)的血漿將近流完時(shí),再次開始灌注血漿,此時(shí)反應(yīng)器(9)開始放出血漿,兩個(gè)并聯(lián)的反應(yīng)器(8)、反應(yīng)器(9)交替進(jìn)行。如此直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L),治療才宣告結(jié)束。如果配套電腦程序控制,整個(gè)治療過程均由電腦控制,并可隨時(shí)檢測(cè)工作狀態(tài),使用會(huì)更加方便、自動(dòng)化和安全。如圖2,當(dāng)待分離的血液進(jìn)入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時(shí),經(jīng)閥門(8)的作用,能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進(jìn)入分離器的外腔(6),然后經(jīng)血漿出口(7)流出,而不能通過微孔(3)的血細(xì)胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3,當(dāng)含有HIV(3)的血漿進(jìn)入反應(yīng)器(1)時(shí),其中的HIV(3)被固定在反應(yīng)器中的CD4+T細(xì)胞(2)結(jié)合成復(fù)合物(4)而不再往下移動(dòng),而CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(5)混合在吸附了HIV后的血漿中從CD4+T細(xì)胞的間隙流出反應(yīng)器后回輸體內(nèi),同時(shí),反應(yīng)器出口處2.5~5.0目的底徑篩網(wǎng)也能阻擋HIV病毒或更大的細(xì)菌。
四、反應(yīng)器治療功效的驗(yàn)證
為了解CD4+T細(xì)胞的功效,本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易反應(yīng)器的測(cè)試方法:取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支,分別吸取經(jīng)離心(1000r/min,5min)沉淀的CD4+T細(xì)胞至200mm刻度,接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃?zhèn)溆玫?.9%瓊脂糖C1-4B,達(dá)到約10mm長(zhǎng)刻度,置血沉架冷卻后,瓊脂糖成為半固體,能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過d另取生物樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿,各約10mL,各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管,待流經(jīng)血沉管下層的CD4+T細(xì)胞層并從血沉管內(nèi)流出后,收集流出液,稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿,根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法,上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作,以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照,最低檢測(cè)限低于5pg/ml,測(cè)定范圍0~400pg/ml,線性范圍0.5pg/ml~80pg/ml,15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD),空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050,0pg吸光度值不高于0.100,1000pg/ml吸光度不低于1.000,當(dāng)吸光度>0.12時(shí)被認(rèn)為是陽性,檢測(cè)結(jié)果(表1)說明,AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易反應(yīng)器后,部分HIV已被CD4+T細(xì)胞吸附,經(jīng)第1次濾過后,HIV總清除率為22.84%,經(jīng)第2次濾過后,總清除率為35.31%,經(jīng)第3次濾過后,總清除率為41.9%。說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會(huì)被不斷地清除,從而達(dá)到治療AIDS目的。
表1 AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易反應(yīng)器前后p24檢測(cè)結(jié)果(pg/ml)