本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域中HIV吞噬細胞器，主要通過人工產(chǎn)業(yè)制備HIV敏感細胞，用于體外吞噬血漿中的游離的HIV，達到治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報告，自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。

HIV是感染人類免疫細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒，直徑約120納米，大致呈球形，外膜是類脂包膜(來自宿主細胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結(jié)合，向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分。

HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集。因為CD4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等)，在細胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進入其他正常的和再生的CD4+細胞內(nèi)復制，制造更多的病毒感染細胞，使外周血CD4+T細胞持續(xù)破壞、減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細胞，整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力；HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進入宿主細胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)繁殖，這些細胞是體內(nèi)的HIV貯存庫， 可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液，然后再進入其他細胞繼續(xù)感染過程。

HIV感染后可刺激機體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另一個很重要的原因是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機理，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補體，介導ADCC效應(yīng)溶解細胞性抗原，但HIV不是細胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細胞內(nèi)被保護、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使失去感染力，但HIV無法被免疫系統(tǒng)殺滅、清除。

20世紀開始研究的血液凈化技術(shù)，是指把患者的血液引出體外并通過一種凈化裝置，除去其中某些致病物質(zhì)，凈化血液，再回輸入體內(nèi)，達到治療疾病的目的。早期的血液凈化常指血液透析技術(shù)，用于尿毒癥患者腎替代治療，隨著醫(yī)學的進步和血液凈化裝置的發(fā)展，在血液透析的基礎(chǔ)上派生出不同的血液凈化方式，如血漿置換、血液灌流、免疫吸附、血液濾過等。不同血液凈化技術(shù)的應(yīng)用，大大改善了某些疑難復雜疾病的治療，主要應(yīng)用血漿置換技術(shù)分離并清除大分子免疫復合物類致病因子以減輕、調(diào)節(jié)和治療某些免疫性疾病。20世紀80年代以來，浙大一院李蘭娟團隊開始運用血漿置換治療肝衰竭，取得了較好療效，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立了非生物型、生物型、混合型人工肝支持系統(tǒng)，以及所涉及的人工肝透析器、血液濾過器、活性炭(樹脂)吸附器、生物反應(yīng)器等人工肝支持系統(tǒng)部件的改良和創(chuàng)新。但未見以血液凈化技術(shù)清除HIV感染細胞及游離的HIV的報道。

目前艾滋病治療常用的抗病毒一線藥物是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，該藥不能殺滅HIV，存在個體差異、耐藥性、腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎、肝損傷等多種毒副作用，其他如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、細胞因子、疫苗治療、基因治療和單克隆抗體被動免疫療法等，均因為各種原因而難以普遍應(yīng)用。有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑，大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細胞后，作為自身治療性細胞回輸，但HIV也隨著HIV感染細胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖，增量T細胞的回輸也導致了增量HIV的回輸。

人類的吞噬細胞有大、小兩種，小吞噬細胞是外周血中的中性粒細胞，大吞噬細胞是血 中的單核細胞和多種器官、組織中的巨噬細胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細胞系統(tǒng)。單核細胞由骨髓中的單核細胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細胞總數(shù)的3％一8％，其體積較淋巴細胞略大，單核細胞在血液中僅停留12-24小時，然后進入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細胞，巨噬細胞是單核吞噬細胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細胞類型，具有較強的吞噬功能，游走巨噬細胞大于單核細胞數(shù)倍，壽命較長，可在組織中存活幾個月，定居的巨噬細胞有不同的名稱，在肝中為枯否細胞、在腦中為小膠質(zhì)細胞、在骨中為破骨細胞等，其表達Fc受體、C3b受體和CD14，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細胞。巨噬細胞表達的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細胞。

綜上所述，巨噬細胞表達的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細胞，最后死于CD4+T細胞大量破壞、功能喪失而致的各種疾病。

人體缺乏殺滅HIV的免疫力，體內(nèi)使用的藥物療效不佳且毒副作用大，艾滋病是久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供HIV吞噬細胞器；另一目的是要提供細胞器的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：以免疫磁珠法分離出CD14細胞，進而制備既保留原巨噬細胞特性又能無限生長的雜交瘤巨噬細胞株，選擇對HIV強吞噬性的克隆作擴增培養(yǎng)和保存，將由此制備的雜交瘤巨噬細胞株配制于細胞凍存液，以高生物相容性材料包裹而制備能防止細胞及其碎片甚至HIV濾出的、能為細胞株吞噬HIV提供場所的細胞器，與血漿分離器共同構(gòu)成體外循環(huán)裝置，血漿分離器分離的血漿經(jīng)細胞器濾出后，其中的HIV被巨噬細胞株吞噬清除，同時產(chǎn)生的抗感染巨噬細胞因子隨血漿回輸體內(nèi)，從而實現(xiàn)既清除HIV又補充所需巨噬細胞因子的艾滋病雜交瘤技術(shù)體外新療法，比局限于在體內(nèi)殺滅HIV但又難以實現(xiàn)的傳統(tǒng)療法更可行而無毒副作用。

本發(fā)明以經(jīng)典的免疫磁珠分離法分離巨噬細胞，以經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)制備巨噬細胞雜交瘤細胞株，使之既保留吞噬HIV的活性，又具有無限生長的骨髓瘤細胞特性，經(jīng)擴增后以高生物相容性材料包裹制成HIV吞噬細胞器，其中的巨噬細胞配制于細胞凍存液中，便于保存， 巨噬細胞表達的CD4分子是艾滋病毒的受體，具有天然吞噬HIV的特性，本發(fā)明模擬巨噬細胞的體內(nèi)非特異性吞噬模式，當含有HIV的血漿流經(jīng)細胞器時，HIV與巨噬細胞發(fā)生接觸而被吞噬，清除HIV后的血漿與血細胞匯合后回輸，能在治療中使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失，能有效阻斷新生的CD4+T細胞再被HIV感染，從而達到免疫重建的治療目的，與目前難以在體內(nèi)殺滅HIV和難以有效阻斷從血漿到巨噬細胞再到CD4+T細胞的循環(huán)感染途徑，且費用昂貴，藥副作用大的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄治療相比，本發(fā)明更經(jīng)濟、幾乎無藥副作用，實現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外而清除的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的HIV吞噬細胞器的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的HIV吞噬細胞器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個并聯(lián)的細胞器(8)、細胞器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細胞，5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是可開關(guān)的閥門。

圖3中，1是細胞器，2是雜交瘤巨噬細胞株，3是進入細胞器的游離的HIV，4是HIV與雜交瘤巨噬細胞株的結(jié)合物，5是雜交瘤巨噬細胞株產(chǎn)生的細胞因子。

下面結(jié)合圖1、圖2和圖3，對本發(fā)明提出的HIV吞噬細胞器的實施方案作詳細的描述。

1、原代細胞來源

(1)單個核血液細胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細胞和單核巨噬細胞。具體方法是：購買血液中心的濃縮白細胞或為科研而保存的臍帶血，取2mL標本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新 生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個核組織細胞：由浙江大學組織工程研究平臺提供。實質(zhì)上屬于來自脾臟的巨噬細胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運：在論理委員會批準和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預冷4℃的無菌密封瓶內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)運至細胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無菌。機械研磨脾臟組織，這時便有大量的組織細胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾懸混有組織細胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細胞混懸液(主要含紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等)。③脾臟組織細胞混懸液中紅細胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細胞的存活，此時，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細胞和淋巴細胞。④脾臟組織巨噬細胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細胞原液，臺盼藍染色判定活力并計數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細胞貼壁，PBS反復吹打、消化，所得細胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細胞：浙江大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實驗室備用。在論理委員會批準和患者知情同意下，取實驗診斷報告后的剩余羊水、絨毛細胞，選擇對數(shù)生長期細胞留用。

2、細胞培養(yǎng)及巨噬細胞貼壁初步分選

按常規(guī)細胞培養(yǎng)，但根據(jù)細胞性質(zhì)的不同，適當調(diào)整培養(yǎng)時間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個核血液細胞(PBMC)或單個核組織細胞(巨噬細胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h，待單個核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞(巨噬細胞以外的細胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞(主要為巨噬細胞，但還有少量其他貼壁細胞)。1 000r/min離心5min，棄上清。羊水細胞、絨毛細胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細胞生長克隆、細胞生長匯合率達到60～80％的對數(shù)生長期細胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細胞懸液，配成合適細胞濃度。

3、CD4細胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細胞免疫磁珠分選方法：細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細胞每80uLBuffer含細胞數(shù)10⁷個，每10⁷個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細胞(細胞活力檢測：細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞，計算200個細胞中活細胞的百分比)。此時分選的細胞主要為巨噬細胞。

4、CD14細胞(巨噬細胞)分選

CD14為單核細胞和巨噬細胞特有的表面標志，理論上如果從單個核組織細胞、羊水細胞及絨毛細胞中分選，則所得細胞為巨噬細胞；如果從單個核血液細胞中分選，則所得細胞包括單核細胞和巨噬細胞；但因單核細胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠不如巨噬細胞易于貼壁生長，所以在本發(fā)明的細胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來的細胞基本為巨噬細胞。

基本方法類同于CD4細胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CD14免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細胞一單核細胞結(jié)合：每1×10⁸個PBMC加入200uL偶聯(lián)CD14抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個細胞加入1～2mL預冷緩沖液，1 000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細胞懸液。(B)收集磁珠標記的單核細胞：將細胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細胞懸液加人細胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細胞分離柱，用針柱快速推動，沖出在分離柱中與CD14抗體一磁珠相結(jié)合的細胞，即為CD14+的巨噬細胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％C0：的細胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h。待單核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入 少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞。1 000r/min離心5min，棄上清。②流式細胞術(shù)法：CD14標記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細胞懸液中加入CD14+-FITC抗體100uL，4℃避光標記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細胞密度為2×107/mL。流式細胞儀分選：將制備的細胞在流式細胞儀(BD FAcsAria II，美國)上分選，根據(jù)CD14抗體的熒光強度、細胞的相對大小以及細胞的相對顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復雜性，收集CD14+的細胞。

5、CD14雜交瘤細胞株(雜交瘤巨噬細胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購自Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責任有限公司；DMSO(-甲基亞砜)為國產(chǎn)分析純試劑。

(2)骨髓瘤細胞準備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細胞株，該細胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實際應(yīng)用中考慮選擇同源細胞株，如上海復祥生物科技有限公司向ATCC細胞庫引進的NCI-H929人骨髓瘤細胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復1次。將沉淀物移入細胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進行一次傳代或擴大培養(yǎng)，融合前24小時內(nèi)調(diào)整細胞狀態(tài)，保證融合前細胞形態(tài)良好、生長旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復洗滌細胞2次。

(3)待雜交CD14細胞(巨噬細胞)準備：本發(fā)明分選的單核巨噬細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細胞融合。以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細胞融合：將CD14細胞(單核巨噬細胞)與骨髓瘤細胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細胞無顆粒狀沉淀，重復2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預熱離心管，取出后無菌條件下將預熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的雜交瘤單核巨噬細胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細胞克隆生長面積達到1/10個細胞孔時，去培養(yǎng)上清，選擇有生長狀態(tài)良好的雜交瘤細胞株的培養(yǎng)孔， 顯微鏡下標記細胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標注的位置吸取細胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細胞或培養(yǎng)上清檢測雜交瘤巨噬細胞(Mφ)株功能。具體方法如下：

①雜交瘤巨噬細胞株吞噬細菌功能檢測：將巨噬細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計數(shù)吞噬細菌和未吞噬細菌的巨噬細胞數(shù)比例，以吞噬細菌功能強的巨噬細胞作為備選陽性克隆株。

②雜交瘤巨噬細胞株吞噬HIV功能檢測：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細胞株混合培養(yǎng)后，分離細胞株，PBS清洗3次，測定經(jīng)裂解的吞噬細胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細胞株產(chǎn)生巨噬細胞因子檢測：以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測結(jié)果，挑選具有較強巨噬細胞功能的培養(yǎng)孔中的細胞克隆重復進行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復2-3輪，檢測功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細胞株的保存與復蘇：保存前12小時調(diào)整細胞生長狀態(tài)，取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細胞，適當消化后制成細胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆谩吞K前準備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然 后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細胞株的擴增

即雜交瘤巨噬細胞株的產(chǎn)業(yè)培養(yǎng)。將上述細胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復傳代擴增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細胞株10代，檢測雜交瘤巨噬細胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶內(nèi)進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備。

7、雜交瘤巨噬細胞株細胞器的制備(HIV吞噬細胞器的制備)

將本發(fā)明制備的雜交瘤巨噬細胞株，以無菌生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低速短時離心)，取細胞沉淀裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同)制成的圓柱形反應(yīng)器，至4/5，然后加細胞凍存液(含30％胎牛血清、12％二甲亞砜的1640培養(yǎng)液)，使細胞濃度達80％，輕輕搖勻，封口，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存?zhèn)溆谩＝鈨鍪褂脮r，需迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的37℃水浴中，并不斷搖動，使管中的液體迅速融化，然后以無菌生理鹽水清洗后使用。

細胞器的外形可制成漏斗形，底徑小，頂徑大，容積為200～300ml，進出口均設(shè)有細胞篩網(wǎng)，進口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當于4微米)的細胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細胞；液體進出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。當經(jīng)體外循環(huán)裝置分離的血漿流經(jīng)細胞器時，游離的HIV被相應(yīng)的雜交瘤巨噬細胞株吞噬吸附，凈化后的血漿從細胞器流出，與分離器分離的血細胞匯合后回輸體內(nèi)。本發(fā)明的HIV吞噬細胞器可以委托專業(yè)商家制備。

8、血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成分。

9、HIV吞噬細胞器的應(yīng)用

按本發(fā)明中圖1的應(yīng)用示意圖，連接血漿分離器和細胞器，構(gòu)成體外循環(huán)裝置，具體方法如下：

(1)安裝：以無菌操作連接各部件，包括血漿分離器、細胞器及各循環(huán)管路。

(2)排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、細胞器及各循環(huán)管路，排除分離器、細胞器及其循環(huán)管道內(nèi)的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。

(3)通液：將動脈血路管1接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

(4)抗凝：從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500U或20～30U/kg。

(5)啟動：將靜脈管路(5)接通艾滋病患者的靜脈血管，然后打開血液泵，血流量為100～150ml/min，如圖1，當動脈血液經(jīng)動脈血路管(1)進入血漿分離器(4)時，分離出來的血漿在血漿泵6的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達細胞器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)循環(huán)管路(10)流出，同步向細胞器(9)灌注血漿，在細胞器(8)內(nèi)的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時細胞器(9)開始放出血漿，兩個并聯(lián)的細胞器(8)、細胞器(9)交替進行。如圖2，當待分離的血液進入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時，經(jīng)閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進入分離器的外腔(6)，然后經(jīng)血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3，當含有HIV(3)的血漿進入細胞器(1)時，其中的HIV(3)被固定在細胞器中的雜交瘤巨噬細胞株(2)吞噬吸附，形成復合物(4)而不再往下移動，而雜交瘤巨噬細胞株產(chǎn)生的細胞因子(5)混合在清除了HIV后的血漿中流出細胞器后，經(jīng)圖1所示的靜脈管路(5)回輸。如此直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。如果配套電腦程序控制，整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用會更加方便、自動化和安全。

10、HIV吞噬細胞器的附加部件

圖1給出的HIV吞噬細胞器是本發(fā)明的基本構(gòu)成部份，在此基礎(chǔ)上還可以改裝以下部件，包括動靜脈壓和空氣監(jiān)測、溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分。

(1)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測細胞器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。

(2)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅(qū)動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明基本構(gòu)成體系的基礎(chǔ)上，有望進一步研發(fā)自動化治療儀器，發(fā)展為操作的人性化、治療的個性化、設(shè)計的安全性以及模塊化、自動監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理系統(tǒng)。

11、實驗驗證

為了解本發(fā)明的功效，設(shè)計了簡易細胞器的功效測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的雜交瘤巨噬細胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細胞流出但不會阻止小分子的水和化學成份之類的物質(zhì)通過。另取浙江省疾控中心等樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡易細胞器)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對檢測，按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測靈敏度、血漿長期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測結(jié)果均為陽性，說明巨噬細胞雜交瘤細胞株在此過程產(chǎn)生了MIF細胞因子。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡易細胞器前后MIF配對檢測的同時，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對檢測，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、 5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結(jié)果(表2)說明AIDS血漿濾過簡易細胞器后，部分HIV已被雜交瘤巨噬細胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有顯著的效果，說明隨著濾過次數(shù)的增加，HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過簡易細胞器前后MIF配對檢測結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過簡易細胞器前后p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，從表1和表2的結(jié)果表明，含有HIV的血漿經(jīng)本發(fā)明的HIV吞噬細胞器濾過后，其中的HIV能被細胞器中的雜交瘤巨噬細胞株吸附清除，效果顯著；與此同時，雜交瘤巨噬細胞株產(chǎn)生了具有抗感染和免疫作用的細胞因子。實驗結(jié)果說明，本發(fā)明的HIV吞噬細胞器具有顯著的功效。