本發(fā)明涉及醫(yī)學領域的人Rh陽性紅細胞吸附器，主要用于母胎血型不合孕婦血漿中抗胎兒紅細胞抗體及紅細胞溶解產物的清除。

背景技術：

胎兒繼承父親和母親各一半的基因成分，胎兒紅細胞可以攜帶來自父體的抗原，表現為胎兒的血型不同于母體。當胎兒的紅細胞進入母體的血液循環(huán)后，誘導母體的免疫系統(tǒng)產生抗體，抗體經過胎盤進入胎兒血液循環(huán)系統(tǒng)，結合胎兒紅細胞，使胎兒紅細胞被破壞，導致胎兒和新生兒的母胎血型不合溶血性疾病。

人類紅細胞血型有26種，包括ABO血型、Rh血型以及MN、Lew、Kell和Fya等血型，但能引起母胎血型不合溶血病的血型以Rh血型和ABO血型為最常見。Rh血型抗原是由1號染色體上3對緊密連鎖的等位基因決定的，共有6種抗原，即C和c，D和d，E和e。由于D抗原最早被發(fā)現，抗原性最強，故臨床上凡是D抗原陽性者稱為Rh陽性，無D抗原者稱為Rh陰性。Rh血型抗原的抗原性決定了溶血病的嚴重程度，D抗原可引起嚴重的溶血病，其次為E抗原，再次為C、c和e抗原，d抗原的抗原性最弱，目前尚無抗d抗體發(fā)現。在我國漢族人群中Rh陰性的頻率約為0.4％，而西北地區(qū)少數民族Rh陰性的頻率高達10％以上。

雖然ABO血型不合的發(fā)生率很高，但胎兒溶血發(fā)生率很低，即使發(fā)生溶血，癥狀亦較輕，極少發(fā)生核黃疸和水腫，妊娠期無需特殊處理。而Rh血型不合雖然少見，但其引起母胎血型不合溶血病的病情程度要重于ABO血型不合，所以對Rh血型不合的診斷及預防極其重要。Rh血型不合由于母體產生大量抗胎兒紅細胞的Rh抗體(IgG抗-D)，進入胎兒體內后破壞大量的胎兒紅細胞，使胎兒嚴重貧血、缺氧、心衰、肝臟損傷、低蛋白血癥、全身水腫、胸水、腹水甚至胎死宮內。在新生兒時期，Rh血型不合溶血較ABO血型不合出現黃疸時間早，最早出現在出生后12小時內，多數出現在24小時內。由于溶血產生的大量膽紅素不能及時從肝臟排除，使新生兒黃疸加重，大量的膽紅素滲入腦細胞而引起核黃疸，常死于嚴重貧血、心力衰竭、核黃疸，死亡率很高。

雖然Rh抗體進入胎兒體內后通過破壞胎兒的紅細胞而可引發(fā)嚴重的溶血病，但某些孕婦也能通過預先注射Rh抗體來預防入侵的Rh(D)陽性紅細胞致敏機體，進而能預防Rh溶血病的發(fā)生。由于目前大多數國家已禁止用志愿者進行D抗原免疫，多克隆Ig抗-D的來源已十分有限，而利用EB病毒轉化人B淋巴細胞分泌Ig抗-D或EB病毒轉化結合細胞融合制備Ig抗-D，因在體內使用EBV轉化的B淋巴細胞株或雜交瘤細胞株分泌的Ig抗-D仍存在很多問題，如所含的EBV有潛在的致病性；可能帶有HIV和肝炎病毒等病原體；用雜交瘤技術生產的Ig抗-D含鼠源蛋白、容易引起過敏反應、或帶有鼠的癌基因，所以通過直接在體內注射Ig抗-D來預防Rh溶血病就受到了限制。

目前臨床上對母胎血型不合溶血病的治療主要有孕期血漿置換、胎兒輸血、終止妊娠和新生兒換血治療?？?D效價在32以上需考慮宮內輸血，胎兒輸血包括胎兒腹腔內輸血和胎兒血管內輸血，均具有一定風險，且無一被證實有效；新生兒高膽紅素血癥者可采用藍光照射、靜脈注射免疫球蛋白等藥物治療，必要時換血治療，換血治療仍為治療新生兒溶血病的主要方法；妊娠期間抗-D效價在64以上，需考慮血漿置換治療，孕婦血漿置換就是在體外循環(huán)通路中以濾過法分離孕婦的血細胞和血漿，去除血漿并以等量的置換液(新鮮冰凍血漿或5％白蛋白)補充回輸，每次置換量2 000～3 000ml、速度20～30ml/min、治療時間2～4h、每1～3d治療1次；或每次取孕婦全血約400ml，低溫離心后去其血漿約300ml，補充等量同型新鮮血漿，還輸自身紅細胞(RBC)。血漿置換能與被去除的血漿量成比例地降低致病抗體的滴度(效價)，從而能延長胎兒在母體內的存活和生長發(fā)育時間、能延遲終止妊娠的時間，是母胎ABO、Rh或其它血型不合的孕婦在臨床早期保胎治療上的良好選擇，具有較好的療效，也無其他不良反應。但血漿置換只能去除血液中的部分抗體，不能中止抗體的繼續(xù)產生，也不能逆轉已發(fā)生的母胎血型不合溶血病，需要不間斷地進行血漿置換才有效，僅適用于曾在妊娠20～22周前發(fā)生過胎兒水腫的孕婦，或配偶為致病抗原的純合子者，特別是在去除部份致病抗體的同時，也一同去除了大量的血漿(多種有益成份)，雖然以置換液作了補充，但無法完全補足被去除血漿及其各種有益成份，而且替補的置換液量大、費用昂貴，補充異體血漿易致傳染病和輸液反應等各種副作用，這就限制了血漿置換的普遍開展。

所以，迫切需要一種僅去除致病抗體、不去除血漿及其多種有益成份、無需使用血漿置換液的廉價、安全、無副作用的母胎血型不合溶血病的治療新方法。

技術實現要素：

為了解決久攻不克的母胎血型不合溶血病的治療問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供人Rh陽性紅細胞吸附器；另一目的是要提供吸附器的制備及應用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現的：由采供血機構按成分輸血的采集要求，制備新鮮Rh陽性“O”型濃縮紅細胞，分別在4℃和37℃的條件下以生理鹽水清洗4次，以去除紅細胞表面可能存在的免疫性抗體或天然抗體，經檢測抗原性后，取細胞沉淀裝配高生物相容性材料制成的圓柱形吸附器，至4/5，加入3.5％甘露醇紅細胞保存液，使紅細胞濃度達80％，輕搖混勻，封口，置4℃保存?zhèn)溆?，在吸附器的上下部均設置細胞篩網，頂徑為500目，底徑為50目，液體出口設置200目的細胞濾網，構成防止細胞碎片進入循環(huán)的第二道防線，液體進出口與網篩之間設置緩沖區(qū)以使體外循環(huán)的穩(wěn)定，當血漿流經吸附器時，Rh抗體被其中的Rh陽性紅細胞結合成固定的免疫復合物，被破壞的紅細胞碎片及與之結合而成的大分子免疫復合物被吸附器的篩網阻留，去除致病物質的血漿從吸附器濾出后回輸體內，以此清除血漿Rh抗體及紅細胞溶解產物。

Rh抗體是母胎Rh血型不合溶血病的致病因子，Rh(D)陽性紅細胞是Rh抗體的天然抗原，能與Rh抗體結合而將之吸附清除，本發(fā)明選取Rh陽性O型紅細胞，在低溫和室溫下以生理鹽水清洗以去除紅細胞表面的天然和免疫性血型抗體，但保留吸附Rh抗體的抗原性而不吸附抗-A和抗-B的天然抗體，繼之以3.5％甘露醇紅細胞保存液為介質裝配吸附器，易于定期保存，Rh(D)陽性紅細胞易得，制備方法簡便，以及因設置了多個極小出入口微孔的特制的吸附器篩網對紅細胞碎片和大分子抗原抗體復合物的阻擋特性，形成了Rh陽性紅細胞吸附Rh抗體和吸附器網篩機械阻擋紅細胞溶解產物的雙重凈化屏障，使流經吸附器的血漿中的Rh抗體及溶血病患者的紅細胞溶解產物被吸附清除，凈化后的血漿回輸，以此實現將Rh抗體從體內清除的治療，是一種僅去除致病性抗體和紅細胞溶解物，不去除血漿及其多種有益成份的無需血漿置換液的廉價、安全、無副作用的母胎血型不合溶血病的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據本發(fā)明提出的人Rh陽性紅細胞吸附器的應用示意圖。

圖2是根據本發(fā)明提出的血漿分離器的內部結構示意圖。

圖3是根據本發(fā)明提出的免疫吸附器的內部結構示意圖

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與2個并聯的吸附器(8)、吸附器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內腔，3是血漿分離器內腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細胞，5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是可開關的閥門。

圖3中，1是吸附器，2是位于吸附器中的Rh陽性紅細胞，3是進入吸附器的Rh抗體，4是Rh抗體被Rh陽性紅細胞結合而形成的抗原抗體免疫復合物，5為RBC碎片。

下面結合圖1、圖2和圖3，對本發(fā)明提出的人Rh陽性紅細胞吸附器的實施方案作詳細的描述。

一、Rh(D)陽性紅細胞的制備

1、Rh(D)陽性紅細胞的獲取

(1)從浙江省采供血機構購買新鮮濃縮Rh(D)陽性“O”型紅細胞；(2)提取新生兒已離體的廢棄臍帶血中的Rh(D)陽性“O”型血紅細胞。

2、主要試劑及作用

3.5％甘露醇紅細胞保存液的配方為：取甘露醇17.5g、枸櫞酸三鈉1.5g、枸櫞酸0.2g、葡萄糖7.93g、磷酸二氫鈉0.94g、腺嘌呤0.14g、氯化鈉4.97g，溶于500ml的蒸餾水中。其中甘露醇稀釋濃縮紅細胞粘稠度，增加細胞膜穩(wěn)定性，防止溶血。枸櫞酸鈉與血液或血漿中的Ca2+結合形成難以離解的可溶性的枸櫞酸鈣，使血液中Ca2+減少，從而抑制凝血過程，產生抗凝作用，而且對紅細胞有保護作用，可防止溶血的發(fā)生。枸櫞酸防止紅細胞添加劑中葡萄糖焦化，與枸櫞酸鈉形成緩沖對，調節(jié)和穩(wěn)定溶液pH。葡萄糖為紅細胞代謝的主要能量來源，正常情況下，葡萄糖的90％通過無氧酵解，10％通過磷酸戊糖途徑生成ATP，提供紅細胞能量維持其壽命。腺嘌呤可提高血液ATP在4℃貯存期間的活性水平。紅細胞對腺嘌呤的需要是特異的，它可以將腺嘌呤轉變?yōu)榱姿嵯佘?AMP)，并進一步磷酸化生成ATP，為紅細胞新陳代謝活力提供高能化合物來源，大大延長血液在4℃的保存時間。氯化鈉調節(jié)溶液滲透壓為等滲溶液，為紅細胞提供適量鈉離子。磷酸二氫鈉防止紅細胞聚集，為紅細胞能量代謝提供磷酸鹽，減緩2，3-DPG下降速度。

抗-D標準品和Rh(D)標準紅細胞購自廣州聯泰生物技術有限公司。

3、制備方法

(1)由采供血機構按成分輸血的采集要求，制備新鮮Rh陽性“O”型濃縮紅細胞，取足夠量的新鮮Rh陽性O型紅細胞，分別在4℃和37℃的條件下，以1500r/min×5min的離心速度，以等體積的生理鹽水清洗紅細胞4～5次，以去除紅細胞表面可能附著的ABO血型和Rh血型以及其他的免疫性抗體或天然抗體。

(2)抗原性檢測：①將紅細胞與抗-D標準品37℃孵育5min，離心取上清液檢測抗-D標準品效價降低數值來確定紅細胞的抗原性。具體方法是：取試管10支，分別編號1～10，第1管加入紅細胞沉淀1.0ml，其他各管加生理鹽水0.5ml，然后從第1管吸紅細胞沉淀0.5ml加入到第2管，混勻后吸0.5ml至第3管，以同樣操作稀釋至第10管，最后管吸出0.5ml棄去，每管加抗-D標準品0.5ml，37℃孵育5min，離心后輕輕混勻，以出現完全凝集、幾乎無游離細胞的最大稀釋倍數代表紅細胞的抗原性，稀釋倍數越大，抗原性越強，吸附Rh抗體的能力越強。也可以用Rh(D)標準紅細胞測定上清液抗體效價來確定紅細胞的抗原性；②用Rh(D)標準紅細胞測定上清液抗體效價，抗-D標準品效價(已知)減去上清液抗體效價即為紅細胞的抗原性(效價)。上清液抗體效價檢測方法為：取10支試管，分別編號1～10，各管加入生理鹽水1ml，取上清液1ml加入到第1管混勻后移出1ml轉至第2管，以同樣操作稀釋至第10管，最后管吸出1ml液體棄去，將稀釋好的血清40μl與Rh(D)標準紅細胞10μl混合，孵育10分鐘，離心5分鐘判讀結果，最大稀釋倍數的凝集管即為抗原性(效價)，效價應在1∶1500以上。

二、吸附器的制備

1、制備原理

本發(fā)明基于母胎Rh血型不合溶血病是因孕婦血漿中的游離Rh抗體進入胎兒血液破壞胎兒紅細胞所致，而Rh抗體能被相應的天然抗原即Rh陽性紅細胞結合吸附，以及吸附器的外殼可制成僅允許特定小分子通過的篩網以阻擋較大分子通過的機制制備。

2、制備材料

選用與人類血管內皮接近的高生物相容性材料，要求生物相容性好，無補體激活、無炎癥反應、無白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3aC5a的改變。要求通過共價、接枝、聚合等方法改進材料表面的均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影響。在吸附器內表面加親水凝膠，如固化2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程而生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，可以提高生物相容性。將某些抗凝物質固化在載體或吸附器內表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至實現無肝素化，如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，可減少過敏體質的過敏反應；將肝素共價結合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力學性能和提高吸附器內表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價固化亞油酸膜，或將共價結合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。

3、吸附器外殼的規(guī)格

制成50mm×60mm的底徑小、頂徑大的圓柱形容器，或制成方形、漏斗形，容積約200～300ml，上下部均設有細胞篩網，頂徑篩網目數為500目，底徑篩網目數為50目，液體出口處設置目數為200目的細胞濾網，構成了防止細胞碎片進入循環(huán)的第二道防線，液體進出口與網篩之間設有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

4、吸附劑的充填

取本發(fā)明制備的Rh(D)陽性紅細胞，裝入吸附器，至4/5，加入3.5％甘露醇的紅細胞保存液，使紅細胞濃度達80％，輕搖混勻，封口，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、血漿分離器的制備

1、制備原理：根據血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2制備材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結構、調節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

3規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結構、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結構等形狀；按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成分。

四、本發(fā)明的應用

需與相關構件共同組成體外循環(huán)支路。

1、體外循環(huán)支路的構件及用途

(1)吸附器：內部的Rh(D)陽性紅細胞用于清除Rh抗體；吸附器外殼進出口的網篩具有濾除RBC碎片、Rh抗體與RBC碎片形成的大分子復合物的作用。

(2)血漿分離器：用于分離血細胞和血漿。

(3)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測吸附器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是吸附器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當吸附器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。

(4)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設置。當監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

(5)血泵(Blood Pump)：用來推動血液循環(huán)以維持治療的順利進行，通常血泵部分往往具有轉速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉輪與凹槽間距設定要精確，并需要經常調整，根據血路泵管的情況，一般將間距設定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準；也不可太緊，否則會造成管路破裂。

(6)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當于臨床上應用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。

此外還包括溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分?？傊?，在本發(fā)明關鍵構成體系的基礎上，有望進一步發(fā)展為自動化、人性化、個性化、模塊化、自動監(jiān)測及調控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理系統(tǒng)。

2、本發(fā)明的使用方法

(1)安裝：以無菌操作連接各部件，包括血漿分離器、吸附器及各循環(huán)管路等各部。

(2)排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、吸附器及各循環(huán)管路，排除分離器、吸附器及其循環(huán)管道內的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。

(3)通液：將動脈血路管1接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內流液污染。

(4)抗凝：從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

(5)啟動：將動脈血路管(1)接通治療者的動脈血管，將靜脈管路(5)接通治療者的靜脈血管，然后打開血液泵，血流量為100～150ml/min，如圖1，當動脈血液經動脈血路管(1)進入血漿分離器(4)，分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經循環(huán)管路(7)到達吸附器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經循環(huán)管路(10)流出，同步向吸附器(9)灌注血漿，在吸附器(8)內的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時吸附器(9)開始放出血漿，兩個并聯的吸附器(8)、吸附器(9)交替進行。如圖2，當待分離的血液進入血漿分離器(1)的內腔(2)時，經閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿及其成份(5)進入分離器的外腔(6)，然后經血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細胞(4)經閥門(8)流出。如圖3，當Rh抗體(3)隨血漿進入吸附器(1)時，被吸附器中的Rh陽性紅細胞(2)結合成抗原抗體復合物(4)而不再往下移動，被破壞的紅細胞碎片(5)及與之結合而成的大分子抗原抗體復合物不能通過吸附器出口的網篩而被阻留，凈化后的血漿與血漿分離器分離出來的血細胞匯合后回輸，如此直至事先設定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結束，如果配套電腦程序控制，整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用會更加方便、自動化和安全。

五、本發(fā)明應用功效的驗證

為了驗證吸附器清除Rh抗體的功效，本發(fā)明設計了簡易的測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，吸取Rh(D)陽性紅細胞沉淀至250mm刻度，再接著吸取適量的經100℃溶化后保溫在42℃?zhèn)溆玫?.0％瓊脂糖C1-4B，瓊脂糖冷卻后成為半固體，能將紅細胞固定在管內，以此制成簡易的園柱形吸附器。另外購買浙江省中心血站的新鮮冰凍血漿200mL及Rh抗體(人抗D型血清干粉標準品，廣州聯泰生物技術有限公司)，以新鮮血漿配成1∶200、1∶300、1∶600抗體滴度，按常規(guī)Rh(抗D)滴度檢測方法(參考說明書)，進一步檢測確認上述所配制的抗體滴度是否相符，稱為濾前(Rh)抗體(滴度)，然后各取10ml濾前抗體分別注入3支血沉管的上端空管，待流經血沉管內的紅細胞后，收集流出液，稱為濾后(Rh)抗體，按常規(guī)Rh(抗D)滴度檢測方法確認滴度，再分別將濾后抗體經含有Rh(D)陽性紅細胞的血沉管中作第2次濾出，如此重復3次濾過及抗體滴度檢測，結果(表1)說明，Rh抗體濾過簡易的吸附器后，大部分Rh抗體已被相應的Rh(D)陽性紅細胞吸附，經第1次、第2次、第3次濾過后，Rh抗體的平均滴度分別從濾前的1∶367降為濾后的1∶183、1∶58、1∶29，說明隨著濾過次數的增加，Rh抗體會不斷地被Rh(D)陽性紅細胞吸附清除，從而達到降低孕婦(新生兒)血漿Rh抗體滴度而治療母胎血型不合溶血病的目的。

表1 Rh抗體濾過含有Rh(D)陽性紅細胞的吸附器前后滴度檢測結果(1/x)