本發(fā)明涉及于中醫(yī)藥研究開發(fā)利用領(lǐng)域，具體來說，涉及一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑。

背景技術(shù)：

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、飲酒折含乙醇量小于140g/周(女性＜70g/周)，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變和脂肪於積為特征的臨床病理綜合征。近年來，隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及藥物的濫用等因素的影響，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率逐年上升，并且隨著肥胖癥患兒的增多，NAFLD的患病年齡也趨于低齡化，越來越顯示出臨床治療的重要性。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前尚未統(tǒng)一，一般認(rèn)為它是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，主要有原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中又以原發(fā)性為主，包括以胰島素抵抗(insulin resistance，IR)為主的“一次打擊”和以氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞大量死亡和纖維化為主的“二次打擊”。除此，半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)、Fas、代謝性核受體、肝細(xì)胞鐵沉積、線粒體功能失調(diào)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力等也參與其中。在NAFLD的發(fā)病和疾病發(fā)展過程中，不論是“第一次打擊”，還是“第二次打擊”，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)起到了非常重要的作用。隨著游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)大量增多，肝細(xì)胞脂肪變性，并在體內(nèi)一系列活性因子的作用下，大量產(chǎn)生ROS，超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，產(chǎn)生氧應(yīng)激及大量過氧化產(chǎn)物，損傷蛋白及核酸，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，使大量肝細(xì)胞在二次打擊中死亡，刺激自身免疫系統(tǒng)，激活肝庫普弗細(xì)胞，促使纖維化的發(fā)生。NAFLD的發(fā)生就是促脂肪變性與抗脂肪變性，促炎與抗炎間不平衡的結(jié)果。

目前西醫(yī)尚未研究出高效理想的治療方法，相關(guān)藥物盡管能有效降低肝脂、血脂，但都僅治其“標(biāo)”而未治其“本”，甚至有一些藥物還表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝臟、腎臟毒性給身體健康帶來了附加的傷害。而通過大量的臨床觀察和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)NAFLD療效確切，且無明顯的毒副作用顯現(xiàn)，因此，研發(fā)防治非酒精性脂肪肝的安全綠色有效藥物就具有了重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑，以克服現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)所存在的上述不足。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑，由以下重量份數(shù)的原料制成：黑果枸杞10～50、丹參5～30、山楂5～30、澤瀉5～30。

優(yōu)選的，由以下重量份數(shù)的原料制成：黑果枸杞20、丹參15、山楂15、澤瀉15。

優(yōu)選的，所述復(fù)方制劑為湯劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或口服液。

本發(fā)明復(fù)方藥物理論依據(jù)為：黑果枸杞為茄科枸杞屬多年生灌木植物。黑果枸杞味甘、性平、清心熱，藏醫(yī)用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥。因其成熟漿果中富含紫紅色素，屬于珍稀的天然花色苷類色素資源，又稱“花青素”，具有抗氧化、激活巨噬細(xì)胞、抗衰老等作用。現(xiàn)代藥理研究證明：其提取物黑果枸杞多糖、花青素，不僅可以調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)代謝、提高機(jī)體的抗脂質(zhì)過氧化能力，同時(shí)，還可通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性而實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。

山楂，性味酸、甘微溫，入脾胃、肝經(jīng)?？芍委煾咧Y、肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，心腹刺痛、疝氣疼痛等。山楂葉總黃酮能減少非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；山楂黃酮提取物用藥可以有效地保護(hù)給藥后大鼠肝臟細(xì)胞，減少細(xì)胞因子對(duì)肝細(xì)胞的損傷程度；山楂葉總黃酮可降低糖尿病小鼠血清中血糖、總膽固醇、丙二醛、甘油三酯、大腦脂褐質(zhì)水平，升高血清高密度脂蛋白膽固醇能抑制CYP2E1活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除能力，同時(shí)能夠抑制肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、iKBamRNA和蛋白的表達(dá)，減少NF-kB的活化，從而有效防治非酒精性脂肪肝。

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉的干燥塊莖。氣微，味微苦，性味：甘，功效：利尿滲濕，泄熱，化油降脂；用于小便不利，水腫脹潰，熱淋澀痛，泄瀉尿少，痰飲暈眩，高脂血癥。近代藥理證明澤瀉具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化和活血化瘀的功效，以及降低血壓、抗高血脂和利尿等作用。并且其提取物對(duì)高膽固醇血癥的實(shí)驗(yàn)性兔有明顯的降膽固醇作用，可能與其干擾外源性膽固醇的吸收和內(nèi)源性膽固醇代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)澤瀉能降低血中低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白，進(jìn)而防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。澤瀉能抑制低蛋白飲食、乙基硫氨酸所致的脂肪肝，對(duì)各種原因引起的動(dòng)物脂肪肝均有良好效應(yīng)，對(duì)CC14所致急性肝損害減輕肝內(nèi)脂肪量，亦顯示保護(hù)作用，并能改善肝功能。

丹參，性味微寒，有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰，除煩安神功效，含丹參酮、丹參素等，有保護(hù)CC14引起的肝損傷作用。丹參有增進(jìn)一氧化氮活性，至于一氧化氮，它是一種強(qiáng)有力的血管舒張藥物，能夠調(diào)節(jié)血管的收縮與舒張，護(hù)肝降酶、促進(jìn)肝細(xì)胞再生及抗纖維化的作用，丹參的脂溶性有效成分為丹參酮類，其中丹參酮、丹參隱酮是良好的自由基清除劑，可降低血脂，增加血流量，改善肝臟微循環(huán)，減輕瘀血性缺血狀態(tài)，增強(qiáng)脂質(zhì)的代謝與排泄，能更好的抑制肝臟炎癥反應(yīng)，從而使細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇的合成、外源性膽固醇的吸收減少，改善肝臟脂肪的代謝，進(jìn)而治療脂肪肝。研究表明，丹參能夠降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)肝功能損害起到一定的保護(hù)作用。

本發(fā)明的有益效果：采用以健脾祛濕、化瘀消痰為治則，切中非酒精性脂肪肝中醫(yī)病因病機(jī)，各種原料藥合理配比，之間協(xié)同作用，具有治療非酒精性脂肪性肝病的療效，并且，本發(fā)明為純天然中藥制劑，無毒副作用，服用方便，便于患者長期服用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理光鏡觀察圖。

圖中：A正常組；B模型組；C復(fù)方黑杞液高劑量組；D復(fù)方黑杞液中劑量組；E復(fù)方黑杞液低劑量組F水飛薊素膠囊組。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑，由以下重量份數(shù)的原料制成：黑果枸杞10g、丹參5g、山楂5g、澤瀉5g。按照常規(guī)工藝制備成湯劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或口服液。

實(shí)施例二

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑，由以下重量份數(shù)的原料制成：黑果枸杞20g、丹參15g、山楂15g、澤瀉15g。按照常規(guī)工藝制備成湯劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或口服液。

實(shí)施例三

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種防治非酒精性脂肪性肝病的復(fù)方制劑，由以下重量份數(shù)的原料制成：黑果枸杞50g、丹參30g、山楂30g、澤瀉30g。按照常規(guī)工藝制備成湯劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或口服液。

為了方便理解本發(fā)明的上述技術(shù)方案，以下通過實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明的上述技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

其中，在本發(fā)明的以下實(shí)驗(yàn)例中，復(fù)方制劑采用湯劑進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)例一

(1)備藥

原料藥的用量為：黑果枸杞25g，丹參15g，山楂15g，澤瀉15g。

制備方法包括以下步驟：

將上述藥材經(jīng)冷水浸泡2h，再常規(guī)兩煎(藥材與水的重量比為1∶3)，頭煎1.5h，二煎1h，兩次水煎液混合，得到復(fù)方黑杞液中藥制劑M1。

服用方法：150ml/次，每日2次。

(2)臨床實(shí)驗(yàn)

1.研究對(duì)象及方法

1.1病例來源

選取48例非酒精性脂肪性肝病患者，其均來自某中醫(yī)院脾胃病科收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的門診和住院的病人。

1.2非酒精性脂肪性肝病的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組《非酒精性脂肪性肝病診療指南》制定的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過臨床診斷或病理組織學(xué)或影像學(xué)檢查或代謝綜合征診斷證實(shí)為非酒精性脂肪性肝病患者。

1.2.1臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

明確NAFLD的診斷需符合以下3項(xiàng)條件：

①飲酒史或飲酒折合乙醇量小于140g/周(女性＜70g/周)；

②除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃?、自身免疫性肝病等可?dǎo)致脂肪肝的特定疾病；

③肝活檢組織學(xué)改變符合脂肪性肝病的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。鑒于肝組織學(xué)診斷難以獲得，NAFLD工作定義為：①肝臟影像學(xué)表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)且無其他原因可供解釋；和(或)②有代謝綜合征相關(guān)組分的患者出現(xiàn)不明原因的血清ALT和(或)AST、GGT持續(xù)增高半年以上。減肥和改善IR后，異常酶譜和影像學(xué)脂肪肝改善甚至恢復(fù)正常者可明確NAFLD的診斷。

1.2.2影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

規(guī)定具備以下3項(xiàng)腹部超聲表現(xiàn)中的兩項(xiàng)者為彌漫性脂肪肝：

(1)肝臟近場(chǎng)回聲彌漫性增強(qiáng)(“明亮肝”)，回聲強(qiáng)于腎臟；

(2)肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)顯示不清；

(3)肝臟遠(yuǎn)場(chǎng)回聲逐漸衰減。

CT診斷依據(jù)：肝臟密度普遍降低，肝/脾CT值之比小于1.0。其中，肝/脾CT比值小于1.0但大于0.7者為輕度，＜0.7但大于0.5者為中度，＜0.5者為重度脂肪肝。

1.2.3代謝綜合征的診斷

代謝綜合征組分的診斷采用改良的2005年國際糖尿病聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)，符合以下5項(xiàng)條件中3項(xiàng)者診斷為代謝綜合征：

(1)肥胖癥：腰圍＞90cm(男性)，＞80cm(女性)，和(或)BMI＞25kg/ni2；

(2)甘油三酯(TG)增高：血清TG＞1.7ramol/L，或已診斷為高TG血癥；

(3)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低：HDL-C＜1.03minol/L(男性)，＜1.29mmol/L(女性)；

(4)血壓增高：動(dòng)脈血壓＞130/85mmHg(1ramHg＝0.133kPa)或已診斷為高血壓?。?/p>

(5)空腹血糖(FPG)增高：FPG≥5.6mmol/L或已診斷為2型糖尿病。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)

符合以上診斷，且年齡介于18歲-65歲，知情同意。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)；伴有腹水、水腫、低鈉血癥等疑似肝硬化表現(xiàn)者；本次發(fā)病后已使用其他治療非酒精性脂肪肝的中西藥物者；年齡在18歲以下或65歲以上者，或?yàn)槿焉锲凇⒉溉槠趮D女；具有嚴(yán)重的原發(fā)性心血管病變、肝臟病變、腎臟病變、血液病變、肺臟疾病、糖尿病或影響其生存的嚴(yán)重疾病，如腫瘤或艾滋??；精神或法律上的殘疾患者。

1.5剔除標(biāo)準(zhǔn)

(1)剔選病例時(shí)不嚴(yán)格，將不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者納入試驗(yàn)的；

(2)受試者合并服用了本方案禁止使用的其它中西藥物，以致無法正確判定療效和安全性；

(3)受試者依從性差，對(duì)本試驗(yàn)用藥過敏者；

(4)發(fā)生嚴(yán)重不良事件、發(fā)生并發(fā)癥或特殊生理變化不宜繼續(xù)接受試驗(yàn)、自行退出者等均為無效病例；

(5)受試者在研究過程中發(fā)生了某些合并癥、并發(fā)癥或特殊生理變化，可能不宜繼續(xù)接受試驗(yàn)。

2.研究方法

2.1臨床分組

將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的48例患者，采用隨機(jī)對(duì)照分組法，分為復(fù)方黑杞液治療組和水飛薊素膠囊對(duì)照組，每組均24人。

2.2治療方案

治療組(復(fù)方黑枸杞中藥制劑M1)：復(fù)方黑杞液：黑枸杞20g、澤瀉15g、丹參15g、生山楂15g。藥材經(jīng)冷水浸泡2h，常規(guī)兩煎，頭煎1.5h，二煎1h，兩次水煎液混合，150ml/次，每日2次；

對(duì)照組：水飛薊素膠囊2粒/次，每日2次；

療程均為12周。

2.3觀察指標(biāo)

1)臨床癥狀積分改變；2)中醫(yī)癥候療效比較；3)實(shí)驗(yàn)室檢查(主要是谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、游離脂肪酸FFA、膽固醇TC、甘油三酯TG)比較；4)肝臟B超比較。

以上五項(xiàng)作為量化指標(biāo)觀察內(nèi)容，分別于治療前、停藥后對(duì)受試者作相應(yīng)指標(biāo)評(píng)定。期間做好隨訪工作，受試者不得接受其他治療。

2.4療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1綜合療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)——參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(2002試行)》、《非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見》臨床癥狀，肝功能、血脂、肝臟影像學(xué)檢查的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，擬定綜合療效判定標(biāo)準(zhǔn)如下：

臨床痊愈：臨床癥狀消失，肝功能、血脂、肝臟影像學(xué)檢查(B型超聲肝臟圖像)正常。

顯效：臨床癥狀明顯改善，肝功能異常指標(biāo)下降大于40％，血脂異常指標(biāo)下降20％-40％，中、重度B型超聲脂肪肝圖像減輕I度以上。

有效：臨床癥狀好轉(zhuǎn)，肝功能異常指標(biāo)下降20％-40％，血脂異常指標(biāo)下降10％-20％，輕、中、重度者B型超聲脂肪肝圖像較前減輕，但不及I度者。

無效：臨床癥狀、B型超聲脂肪肝圖像無改善，肝功能異常指標(biāo)下降小于20％，血脂異常指標(biāo)下降小于10％。

另肝臟B超輕、中、重度者分別記1、2、3分。

2.4.2中醫(yī)證候療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

臨床痊愈：主要癥狀、體征消失或基本消失，療效指數(shù)＞90％；

顯效：主要癥狀、體征明顯改善，療效指數(shù)為70％-89％；

有效：主要癥狀、體征明顯好轉(zhuǎn)，療效指數(shù)為30％-69％；

無效：主要癥狀、體征無明顯改善，甚或加重，療效指數(shù)＜30％。

注：計(jì)算公式(尼莫地平法)為：[(治療前積分一治療后積分)+治療前積分]X100％。

2.4.3主要癥狀的療效評(píng)價(jià)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

(1)臨床疫愈：癥狀消失或基本消失；

(2)顯效：癥狀明顯改善，減少2個(gè)級(jí)別，從重度恢復(fù)為輕度；

(3)有效：癥狀好轉(zhuǎn)，減少1個(gè)級(jí)別，從重度恢復(fù)為中度，從中度恢復(fù)為輕度；

(4)無效：癥狀無明顯改善，甚或加重。

2.4.4肝功能指標(biāo)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

臨床痊愈：肝功能恢復(fù)正常(ALT、AST、FFA)；

顯效：肝功能雖未恢復(fù)正常，ALT和/或FFA下降＞40％；

有效：肝功能雖未恢復(fù)正常，但ALT和/或FFA下降》20％；

無效：肝功能無明顯改善，甚或加重。

2.4.5血脂療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

臨床痊愈：血脂恢復(fù)正常(包括甘油三酯和總膽固醇)；

顯效：血脂雖未恢復(fù)正常，甘油三酯下降＞40％和/或總膽固醇下降》20％；

有效：血脂雖未恢復(fù)正常，甘油三酯下降＞20％但＜40％，總膽固醇下降＞10％，但＜20％；

無效：血脂無明顯降低，甚或加重。

2.4.6B超療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

臨床治愈：肝臟回聲正常，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)清晰；

顯效：B超圖像減輕1度以上；

有效：B超圖像較前減輕，但不及1度者；

無效：B超圖像無明顯改善，甚或加重。

2.5統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料：兩組間的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(Independent-SamplesTTest)，不符合正態(tài)性分布者采用秩和檢驗(yàn)；組內(nèi)治療前后自身比較采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)(Paired-SamplesTTest)，總體率之間的比較采用檢驗(yàn)。

3結(jié)果及分析

3.1中醫(yī)癥候臨床療效比較

治療組24例中，顯效9例，有效12例，無效3例，總有效率為87.5％；對(duì)照組24例中，顯效6例，有效10例，無效8例，總有效率66.6％。兩組總有效率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.2治療前后癥狀總積分及B超評(píng)分比較

表1兩組治療前后癥狀總積分比較

表2兩組治療前后肝臟B超評(píng)分比較

注：與同組治療前比較，1)P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較，2)P＜0.01。

3.3治療前后肝功能、血脂變化比較結(jié)果見表3

表3兩組治療前后肝功能、血脂值比較

注：與同組治療前比較，1)P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較，2)P＜0.01；3)P＜0.05。

(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)藥物

復(fù)方黑杞液：黑枸杞20g、澤瀉15g、丹參15g、生山楂15g。藥材經(jīng)冷水浸泡2h，常規(guī)兩煎，頭煎1.5h，二煎1h，兩次水煎液混合并過濾，經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥2.6g/ml的濃縮藥液，高壓滅菌后冷藏備用。水飛薊素膠囊(利加隆)(140mg*10粒)。

2.動(dòng)物

SD雌性大鼠(SPF級(jí))，體重200～220g。

3.試劑

膽固醇、脫氧膽酸鈉、丙硫氧嘧啶片、聚山梨酯-80、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總谷胱甘肽(T-GSH)測(cè)定試劑盒。

4.儀器

TGL-16G型低溫高速離心機(jī)；AMS-18型全自動(dòng)生化儀；UV-1800紫外-可見光光度計(jì)。

5.方法

稱取25g自制豬油在100℃的水浴中溶化，加入10g膽固醇并不斷攪拌，再加入5ml聚山梨酯-80使其完全溶解；將20g蔗糖加入盛有少量蒸餾水的燒杯中，加熱并攪拌至完全溶解，再依次加入2g脫氧膽酸鈉、1g丙硫氧嘧啶，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?；將兩種溶液混合，再加入5ml聚山梨酯-80，使兩種溶液充分混勻，最后加蒸餾水定容至100ml，即配制成100ml高脂高糖乳劑。保存于0～4℃冰箱以備用，使用時(shí)在37℃水浴中加熱融化。

取大鼠48只，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)3周，隨機(jī)按質(zhì)量分為6組：正常對(duì)照組、模型組、水飛薊素膠囊陽性對(duì)照組、復(fù)方黑杞液高、中、低劑量組，每組8只。除對(duì)照組給予普通飼料外，其他組灌以高脂高糖乳劑復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型，連續(xù)喂飼5周且自由飲水。各組大鼠按10ml/kg給藥干預(yù)。對(duì)照組、模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃，水飛薊素膠囊陽性對(duì)照組按4.67mg/kg/d劑量灌胃，復(fù)方黑杞液高、中、低劑量組分別按13.0、6.5、3.25g生藥/kg劑量灌胃，連續(xù)給藥8周。給藥至第8周末(標(biāo)本采集前禁食不禁水12h)，大鼠以3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。脫頸椎處死大鼠，立即摘取肝臟，4℃冰浴滅菌生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量肝臟質(zhì)量。在距離肝邊緣0.5cm處取相同部位肝右葉組織若干塊，每塊約0.5g，大小約1cm×1cm×0.5cm，一部分肝組織塊置于2ml的EP管并保存于-20℃冰箱備用，一部分肝組織塊用10％甲醛溶液固定。

6.檢測(cè)指標(biāo)

6.1肝臟指標(biāo)檢測(cè)從-20℃冰箱取出備用的肝臟組織小塊，用氯仿-甲醇提取液(1∶1)制成勻漿，勻完后用提取液定容至5ml并混勻。經(jīng)24h震蕩抽提，3000rpm離心5min得上清液，再分別按照相應(yīng)試劑盒說明書操作測(cè)定肝臟中TC、TG。用生理鹽水制成10％的肝組織勻漿液，再分別按照相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA、T-GSH。肝指數(shù)按公式(肝指數(shù)＝肝濕重/體重×100)計(jì)算求得。

6.2肝組織病理學(xué)檢測(cè)取10％甲醛溶液固定的肝組織塊，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察，對(duì)脂肪變性程度進(jìn)行分級(jí)、評(píng)分。低倍鏡觀察含脂滴細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，若含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值＞1/3即診斷為脂肪肝；若脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值在1/3～1/2之間即診斷為輕度脂肪肝；若脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值在1/2～2/3之間即診斷為中度脂肪肝；若脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值＞2/3即診斷為重度脂肪肝。

6.3血清指標(biāo)檢測(cè)門靜脈采血分離血清，采用全自動(dòng)化分析儀測(cè)定檢測(cè)血清TC、TG、HDL-C、AST、ALT、FFA，LDL-C。按Friedwald公式(LDL-C＝TC-HDL-C-TG/2.2)計(jì)算求得。

7.結(jié)果

7.1對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血脂水平和FFA的影響與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA顯著升高，HDL-C顯著降低，表明造模成功。給藥8周后，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液各劑量組能顯著降低血清TC、TG、FFA水平和顯著升高HDL-C水平，復(fù)方黑杞液中、高劑量組能顯著降低LDL-C水平，結(jié)果見表4。

表4復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血脂和FFA水平的影響(n＝8)

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01(下同)

7.2對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝指數(shù)及肝脂質(zhì)水平的影響與正常組比較，模型組肝指數(shù)、肝臟中TC、TG水平均顯著升高。與模型組比較，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液各劑量組均能顯著降低TC、TG，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液各劑量組肝指數(shù)也有一定的下降趨勢(shì)，表明復(fù)方黑杞液能減少脂質(zhì)在肝臟中的積聚，從而減輕肝脂質(zhì)變化程度，結(jié)果見表5。

表5復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝指數(shù)及肝脂質(zhì)水平的影響(n＝8)

7.3對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT水平均顯著升高。與模型組比較，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液各劑量均能顯著降低AST水平，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液高劑量均能顯著降低ALT水平，表明復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠具有明顯的保肝作用，結(jié)果見表6。

表6復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影響(n＝8)

7.4對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝MDA、SOD以及T-GSH的影響與正常組比較，模型組SOD活性明顯下降，MDA含量顯著增加。與模型組比較，水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液各劑量組SOD、T-GSH活性有明顯的增強(qiáng)趨勢(shì)，復(fù)方黑杞液中劑量組MDA含量顯著下降，結(jié)果表明復(fù)方黑杞液具有一定的抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用，結(jié)果見表7。

表7復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝中SOD、MDA、T-GSH的影響(n＝8)

7.5對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理的影響

光鏡觀察：正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝竇正常，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞無明顯病變，呈多邊形、邊界清，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，核圓結(jié)構(gòu)清晰，位于細(xì)胞中心，細(xì)胞質(zhì)均勻豐富，肝細(xì)胞內(nèi)無脂肪滴沉積。模型組：肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝竇消失，肝細(xì)胞體積明顯增大、呈腫脹狀，出現(xiàn)彌漫性脂肪變性。肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡，細(xì)胞核偏移，部分細(xì)胞核溶解。間質(zhì)組織中有炎癥反應(yīng)，局部有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤。水飛薊素膠囊、復(fù)方黑杞液低劑量組，肝小葉不明顯，脂肪滴空泡較模型組有所減少。復(fù)方黑杞液高、中劑量組：肝小葉結(jié)構(gòu)仍可見，部分肝細(xì)胞輕度水樣變性，大部分肝細(xì)胞接近正常形態(tài)，見圖1所示。

7.6復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性情況的影響結(jié)果表明：復(fù)方黑杞液高、中、低劑量組以及水飛薊素膠囊組均能改善肝臟組織病變，與模型組比較差異有顯著性，見表8。

表8復(fù)方黑杞液對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度的影響(n＝8)

綜上所述，借助于本發(fā)明的上述技術(shù)方案，采用以健脾祛濕、化瘀消痰為治則，切中非酒精性脂肪肝中醫(yī)病因病機(jī)，各種原料藥合理配比，之間協(xié)同作用，具有治療非酒精性脂肪性肝病的療效，并且，本發(fā)明為純天然中藥制劑，無毒副作用，服用方便，便于患者長期服用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。