本發(fā)明屬于生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的制備方法。
背景技術(shù)：
目前最常用的體細(xì)胞基因治療靶細(xì)胞有：骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞等，成纖維細(xì)胞是皮膚的主要細(xì)胞成分，具有合成和分泌三種纖維APSC多能細(xì)胞以及基質(zhì)的功能，在間質(zhì)的更新和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，具有十分重要的作用。成纖維細(xì)胞以其眾多的優(yōu)點(diǎn)成為一種理想的靶細(xì)胞，皮膚為人體最大的器官，成纖維細(xì)胞較容易獲取、培養(yǎng)、傳代及凍存，從而使成纖維細(xì)胞用于基因治療成為可能。
隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)于美容保養(yǎng)越來(lái)越重視，市場(chǎng)上的美容保養(yǎng)品種類(lèi)繁多。但是現(xiàn)有的精細(xì)化工護(hù)膚品大都含有鉛、汞、酒精、防腐劑、激素、香料等對(duì)肌膚有損害的物質(zhì)，在使用美容保養(yǎng)品的同時(shí)，也對(duì)皮膚造成了較大的傷害，甚至?xí)a(chǎn)生的色斑、紅血絲、過(guò)敏等問(wèn)題，對(duì)人們的生活質(zhì)量和身體健康造成了極大的威脅。
現(xiàn)有的美容保養(yǎng)品，大都通過(guò)化工方法制得，其產(chǎn)品中的有害物質(zhì)殘留較多，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生不利影響。而且現(xiàn)有產(chǎn)品大都不具有生物活性物質(zhì)，不能夠有效促進(jìn)表皮細(xì)胞的新陳代謝，改善皮膚的光澤。而且，化工護(hù)膚品中含有的部分物質(zhì)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，不適合全體人群使用。
目前市場(chǎng)上生物美容面膜對(duì)皮膚美容的作用是非常有限，僅限于保濕、美 白和控油等作用，而為了對(duì)皮膚產(chǎn)生更好地祛皺、粉刺瘢痕與疤痕修復(fù)、除斑和抗氧化等作用，利用自體皮膚成纖維細(xì)胞自身的安全性和更好的生物活性來(lái)美容抗衰，市場(chǎng)上還不能滿(mǎn)足需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的制備方法，該方法包括下述步驟：
1)切取人自體腹部皮膚，置于含有氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的PBS中漂洗，將漂洗后皮膚剪成小塊，加入含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶的DMEM中，放置過(guò)夜；
2)加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液，離心收集細(xì)胞，用DMEM洗脫后開(kāi)放培育；待培育的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無(wú)鈣鎂離子的PBS漂洗，再次加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液消化，然后加入含有人自體血清的α-MEM培養(yǎng)液吹打終止消化，按一定比例傳代培養(yǎng)，制成細(xì)胞懸液；取細(xì)胞懸液移入離心管中，離心提取自體皮膚成纖維細(xì)胞；
3)向自體皮膚成纖維細(xì)胞中加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型膠原蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、γ-氨基丁酸、維生素b12制得混合物，用于美容抗衰。
步驟1)所述的PBS中含有100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素；
步驟1)所述的漂洗后皮膚剪成0.8-1.2mm3的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質(zhì)酸酶300U/ml的DMEM中，4℃條件下放置過(guò)夜。
步驟2)所述的PBS消化液中含有按1:1比例加入的0.25％胰酶和0.02％EDTA。
步驟2)所述的α-MEM培養(yǎng)液中加入15％的人自體血清，以1:2或1:4的比例傳代培養(yǎng)48h；離心管中，4-8℃，1000rpm，10～30min條件下離心。
步驟3)所述的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為0.5-0.8mg/L、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子4.5-6mg/L、I型膠原蛋白3.5-4mg/L、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子0.2-0.35mg/L、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子1-2.5mg/L、γ-氨基丁酸0.8-1.6mg/L、維生素b12為1.2-1.6mg/L。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明利用自體皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用，并添加了一些營(yíng)養(yǎng)因子，在生物學(xué)有效期內(nèi)更好儲(chǔ)存及時(shí)使用，將對(duì)皮膚產(chǎn)生最佳的修復(fù)、再生、填充、祛斑和抗氧化等美容作用；
本發(fā)明采用生物技術(shù)培養(yǎng)制得自體皮膚成纖維細(xì)胞，產(chǎn)品中均為生物活性物質(zhì)，不含有化工制造化妝品中含有的重金屬等有毒有害物質(zhì)，確保了產(chǎn)品的使用安全性，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
一種自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的制備方法，首先手術(shù)切取3cm2人體腹部皮膚，置于含有110U/ml氨芐青霉素和110mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復(fù)3次經(jīng)過(guò)PBS漂洗后，剪棄脂肪和結(jié)締組織；
將皮膚剪成1.2mm3左右的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質(zhì)酸酶300U/ml的DMEM中，4℃條件下放置過(guò)夜(12h)；
按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，37℃、180rpm離心20min，血清終止；再在1000rpm離心條件下10min收集細(xì)胞；用DMEM洗脫2次后，用含有15％人自體血清的α-MEM培養(yǎng)液調(diào)定細(xì)胞密度，以每毫升4×105細(xì)胞接種，37℃，5％CO2，90％適度條件下開(kāi)放培育48h；
當(dāng)培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無(wú)鈣鎂離子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化3min；加入含有15％人自體血清的α-MEM培養(yǎng)液吹打終止消化，以1:2的比例傳代，置于37℃，5％CO2，90％適度條件下開(kāi)放培養(yǎng)48h制成細(xì)胞懸液；
取細(xì)胞懸液移入離心管中，8℃，1000rpm，30min條件下離心，提取皮膚成纖維細(xì)胞。
向自體皮膚成纖維細(xì)胞中加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型膠原蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、γ-氨基丁酸、維生素b12制得混合物，用于美容抗衰；其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為0.5mg/L、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子6mg/L、I型膠原蛋白3.5mg/L、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子0.35mg/L、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子1mg/L、γ-氨基丁酸1.6mg/L、維生素b12為1.2mg/L。
實(shí)施例2
一種自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的制備方法，首先手術(shù)切取2cm2人體腹部皮膚，置于含有100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復(fù)5次經(jīng)過(guò)PBS漂洗后，剪棄脂肪和結(jié)締組織；
將皮膚剪成0.8mm3左右的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質(zhì)酸酶300U/ml的DMEM中，放置4℃過(guò)夜；1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，37℃、180rpm空氣搖床20min，血清終止；1000rpm離心10min收集細(xì)胞；DMEM洗脫2次后，用含有15％人自體血清的α-MEM培養(yǎng)液調(diào)定細(xì)胞 密度，以每毫升2×105細(xì)胞接種，37℃，5％CO2，90％適度條件下開(kāi)放培育48h；
當(dāng)培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無(wú)鈣鎂離子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化2-3min；加入含有15％人自體血清的α-MEM培養(yǎng)液吹打終止消化，以1:4的比例傳代，置于37℃，5％CO2，90％適度條件下開(kāi)放培養(yǎng)48h制成細(xì)胞懸液；取細(xì)胞懸液移入離心管中，4℃，1000rpm，10min條件下離心，提取皮膚成纖維細(xì)胞。
向自體皮膚成纖維細(xì)胞中加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型膠原蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、γ-氨基丁酸、維生素b12制得混合物，用于美容抗衰；其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為0.8mg/L、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子4.5mg/L、I型膠原蛋白4mg/L、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子0.2mg/L、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2.5mg/L、γ-氨基丁酸0.8mg/L、維生素b12為1.6mg/L。
自體皮膚成纖維細(xì)胞用于美容抗衰的特點(diǎn)：安全，由于采用自體細(xì)胞治療，從來(lái)沒(méi)有也不可能出現(xiàn)有免疫排斥、過(guò)敏等不良事件，因而具有良好的安全性；持久，自體的新生細(xì)胞回輸至自體皮膚皺紋、凹陷性部位，因形成了自體組織而一直存活，使得效果長(zhǎng)久；健康，不破壞或刺激肌膚病理性改變來(lái)除皺，也不是異物填充，它是通過(guò)自然的增強(qiáng)皮膚功能來(lái)達(dá)到治療目的，因而屬于生理性除皺；自然，不影響受術(shù)者的面部表情肌和韌帶，新生的健康皮膚細(xì)胞恢復(fù)了皮膚的彈性，降低了表皮的色素沉積，提高了皮膚的白嫩度、光潔度和細(xì)膩度，使皮膚光滑、豐滿(mǎn)有彈性，表情形態(tài)自然和諧；
本發(fā)明干細(xì)胞液中添加多種生物因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子能剌激外胚層和內(nèi)胚層起源的各種細(xì)胞增殖遷移，加快皮膚細(xì)胞的新陳代謝，進(jìn)而增加皮膚彈性，滋潤(rùn)肌膚，消除皺紋和預(yù)防色斑，具有很好的美容功效；
本發(fā)明干細(xì)胞液中還添加γ-氨基丁酸、維生素b12、I型膠原蛋白，能夠滋潤(rùn)皮膚，使表皮細(xì)胞能夠快速健康生長(zhǎng)，補(bǔ)充其生長(zhǎng)所需的維生素等物質(zhì)。
在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
以上公開(kāi)的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒(méi)有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說(shuō)明書(shū)選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書(shū)及其全部范圍和等效物的限制。