本發(fā)明屬于殺滅魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及槐屬二氫黃酮G的新用途，尤其涉及一種槐屬二氫黃酮G在制備殺滅魚(yú)類(lèi)體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
寄生纖毛蟲(chóng)病是目前危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)疾病之一。多子小瓜蟲(chóng)是一種世界性分布的魚(yú)類(lèi)體表寄生纖毛蟲(chóng)，主要寄生于魚(yú)的皮膚，鰓和鰭，引起小瓜蟲(chóng)病，又稱(chēng)“白點(diǎn)病”，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。一些化學(xué)藥物，如孔雀石綠和汞制劑，殺蟲(chóng)效果雖然好，但是，它們毒性大，殘留高，具有“三致”作用，已經(jīng)被禁止使用。因此，急需尋找安全、高效和環(huán)境友好的新型藥物來(lái)防治小瓜蟲(chóng)病。我國(guó)中草藥植物資源豐富，具有易分解，無(wú)殘留及對(duì)環(huán)境和人安全的優(yōu)點(diǎn)。研究表明部分中草藥植物具有殺滅多子小瓜蟲(chóng)的活性物質(zhì)。因此，從中草藥中分離鑒定出用于防治魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)疾病的活性物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)安全環(huán)保漁藥的有效途徑。
槐屬二氫黃酮G(Sophoraflavanone G)是從中藥苦參(Sophora flavescens)中分離純化出的一種黃酮類(lèi)化合物。分子式為C25H28O6，分子量為424，白色粉末，易溶于甲醇和乙醇。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槐屬二氫黃酮G具有抗炎、抗菌和抗腫瘤的作用。其結(jié)構(gòu)式如下：
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種槐屬二氫黃酮G在制備殺滅魚(yú)類(lèi)體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用，特別是在制備殺滅多子小瓜蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
槐屬二氫黃酮G在制備殺滅魚(yú)類(lèi)體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
所述的魚(yú)類(lèi)體外寄生纖毛蟲(chóng)指多子小瓜蟲(chóng)(Ichthyophthirius multifiliis)。
所述的槐屬二氫黃酮G的有效濃度為2～11mg/L魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖用水。
所述的藥物的劑型優(yōu)選為藥液或粉劑。
所述的藥物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果：
(1)本發(fā)明首次將槐屬二氫黃酮G應(yīng)用于制備殺滅魚(yú)類(lèi)體外寄生蟲(chóng)藥物，特別是用于殺滅多子小瓜蟲(chóng)，在有效劑量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)殺滅寄生蟲(chóng)，達(dá)到防治多子小瓜蟲(chóng)病的效果；防治多子小瓜蟲(chóng)病效果顯著，有廣泛應(yīng)用前景。
(2)槐屬二氫黃酮G對(duì)草魚(yú)的半致死濃度(46.6mg/L)是防治多子小瓜蟲(chóng)病最低有效濃度(2mg/L)的23.3倍，對(duì)魚(yú)絕對(duì)安全；
(3)槐屬二氫黃酮G的植物來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，易獲得，無(wú)殘留、無(wú)污染、無(wú)公害、對(duì)人無(wú)毒，其提取制備工藝簡(jiǎn)單，具有廣闊應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例中用到的寄主模型魚(yú)為草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)，來(lái)源于廣州市花都區(qū)五星村魚(yú)苗場(chǎng)。寄生蟲(chóng)模型為多子小瓜蟲(chóng)(Ichthyophthirius multifiliis)，來(lái)源于廣州市花地灣花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)。
實(shí)施例1：槐屬二氫黃酮G藥物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)的殺滅作用
(1)藥液的配制：稱(chēng)取槐屬二氫黃酮G 3.84mg于1.5mL的EP管中，用20μL無(wú)水乙醇溶解，然后用蒸餾水配成2560mg/L的藥物原液，用梯度稀釋方法配成所需的測(cè)試濃度，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。以最高濃度的藥液中的無(wú)水乙醇含量(0.13％)作為標(biāo)準(zhǔn)，配制含0.13％無(wú)水乙醇的對(duì)照組處理液。
(2)取100μL大約含有600個(gè)感染性幼蟲(chóng)的蟲(chóng)液于96孔板中，另外加入100μL不同濃度的藥液，使最終濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L，各藥物濃度設(shè)置3個(gè)平行。在4×物鏡下統(tǒng)計(jì)4h內(nèi)各濃度的幼蟲(chóng)全部死亡時(shí)間(min)和第4h幼蟲(chóng)存活數(shù)，計(jì)算死亡率和半數(shù)有效濃度(EC50)。實(shí)驗(yàn)溫度保持在23±0.5℃。計(jì)算公式如下：
死亡率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組感染性幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)/對(duì)照組感染性幼蟲(chóng)個(gè)數(shù))×100％
結(jié)果顯示：槐屬二氫黃酮G在0.5mg/L濃度下，49.3min能夠使感染性幼蟲(chóng)100％致死，并隨著藥物濃度的增加，致死時(shí)間變短。
實(shí)施例2：槐屬二氫黃酮G藥物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)成蟲(chóng)的殺滅作用
(1)藥液配制同實(shí)施例1。
(2)取大約含有60個(gè)成蟲(chóng)的200μL的蟲(chóng)液于24孔板中，另外加入200μL不同濃度的藥液，使最終濃度為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。在4×物鏡下統(tǒng)計(jì)5h內(nèi)各濃度的成蟲(chóng)全部死亡時(shí)間(min)和第5h成蟲(chóng)存活數(shù),計(jì)算死亡率和半數(shù)有效濃度(EC50)。實(shí)驗(yàn)溫度保持在23±0.5℃。6h后在4×物鏡下統(tǒng)計(jì)各濃度存活成蟲(chóng)形成包囊個(gè)數(shù)，再經(jīng)過(guò)16h或者17h后，統(tǒng)計(jì)各濃度釋放的感染性幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)，計(jì)算各濃度平均每個(gè)包囊釋放出的感染性幼蟲(chóng)數(shù)。計(jì)算公式如下：
死亡率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)前成蟲(chóng)個(gè)數(shù)/實(shí)驗(yàn)后成蟲(chóng)個(gè)數(shù))×100％；
平均每個(gè)包囊釋放出感染性幼蟲(chóng)數(shù)＝各孔感染性幼蟲(chóng)數(shù)/各孔的包囊數(shù)。
結(jié)果顯示：4mg/L濃度下的槐屬二氫黃酮G可以全部殺滅成蟲(chóng)，致死時(shí)間為74.0min，并隨著藥物濃度的增加，致死時(shí)間變短。2mg/L濃度下的槐屬二氫黃酮G對(duì)成蟲(chóng)的死亡率為82.8％，并且17h后可以完全抑制包囊釋放感染性幼蟲(chóng)。
實(shí)施例3：槐屬二氫黃酮G對(duì)多子小瓜蟲(chóng)包囊的殺滅作用
(1)藥液配制同實(shí)施例1。
(2)將大約含有60個(gè)成蟲(chóng)的200μL的蟲(chóng)液加入24孔板中，靜置于23±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中6h，在4×物鏡下統(tǒng)計(jì)各孔形成包囊個(gè)數(shù)。隨后加入200μL不同濃度的藥液，使最終濃度為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。然后24孔板靜置于23±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中22h，在4×物鏡下統(tǒng)計(jì)各濃度釋放的感染性幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)，計(jì)算各濃度平均每個(gè)包囊釋放出的感染性幼蟲(chóng)數(shù)。計(jì)算公式如下：
平均每個(gè)包囊釋放出感染性幼蟲(chóng)數(shù)＝各孔感染性幼蟲(chóng)數(shù)/各孔的包囊數(shù)。
結(jié)果顯示：槐屬二氫黃酮G的濃度在2mg/L及以上，能夠完全抑制包囊釋放出感染性幼蟲(chóng)。隨著藥物濃度的降低，平均每個(gè)包囊釋放的感染性幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)增加。
實(shí)施例4：低濃度槐屬二氫黃酮G對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染力的影響
(1)藥液的配制根據(jù)實(shí)施例1的方法，配制成0.5、0.25、0.125、0.06和0mg/L的藥液各50mL。
(2)取大約含有80000個(gè)感染性幼蟲(chóng)的10mL蟲(chóng)液加入50mL燒杯中，再加入10mL藥液，混勻，使最終濃度為0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L的槐屬二氫黃酮G藥液，每一處理濃度設(shè)置3個(gè)平行，然后在23±0.5℃靜置1h。
事先準(zhǔn)備15個(gè)裝有4L曝氣自來(lái)水的水族箱，每個(gè)水族箱裝有10尾健康草魚(yú)，將被藥液處理過(guò)的感染性幼蟲(chóng)倒入各水族箱中，讓平均每尾魚(yú)8000只感染性幼蟲(chóng)感染草魚(yú)，每一處理濃度設(shè)置3個(gè)平行。感染2h后，每個(gè)水族箱曝氣自來(lái)水體積加至10L，由充氧泵供氧，實(shí)驗(yàn)溫度保持在23±0.5℃。每天觀察草魚(yú)的存活情況，如有死魚(yú)及時(shí)撈出，以免影響水質(zhì)。實(shí)驗(yàn)第七天，用150mg/L的麻醉劑(MS-222)(Sigma)麻醉草魚(yú)，記錄每尾草魚(yú)體表的白點(diǎn)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)感染率和感染強(qiáng)度。計(jì)算公式如下：
感染率＝(體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)/總魚(yú)數(shù))×100％；
感染強(qiáng)度＝體表白點(diǎn)總數(shù)/體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)。
結(jié)果顯示：槐屬二氫黃酮G在0.25和0.125mg/L濃度下，預(yù)處理感染性幼蟲(chóng)1h，能夠顯著降低幼蟲(chóng)的感染能力，感染強(qiáng)度和感染率顯著低于對(duì)照組。
實(shí)施例5：槐屬二氫黃酮G藥物在體殺蟲(chóng)、防病、治病效果
(1)稱(chēng)取1g的槐屬二氫黃酮G，根據(jù)實(shí)施例1的方法，配制成50000、25000、12500和0mg/L的藥液各20mL。
(2)選擇輕度感染的草魚(yú)(體表白點(diǎn)數(shù)為22.1±15.0)隨機(jī)分配到12個(gè)含有20L曝氣自來(lái)水的40L水族箱中，每個(gè)水族箱5尾已感染多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)。隨后向每個(gè)水族箱中加入10尾健康草魚(yú)混養(yǎng)。溫度保持在23±0.5℃。隨后向水族箱中加入上述配制的原藥液，混勻，使最終濃度為2、1、0.5和0mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間，每天加入與第一天體積相同的原藥液，并觀察魚(yú)的存活情況(如有死魚(yú)，及時(shí)撈出，以免影響水質(zhì))以及隨機(jī)3尾患病草魚(yú)體表白點(diǎn)數(shù)。若無(wú)白點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)組停止用藥，記錄治療時(shí)間，并用150mg/L的麻醉劑(MS-222)(Sigma)麻醉草魚(yú)，記錄每尾草魚(yú)體表的白點(diǎn)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)感染率、感染強(qiáng)度和存活率。實(shí)驗(yàn)第10天，全部實(shí)驗(yàn)組停止加藥，并統(tǒng)計(jì)感染率、感染強(qiáng)度和存活率，同時(shí)更換50％無(wú)藥液的新鮮曝氣自來(lái)水。在第25天，記錄存活草魚(yú)體表的白點(diǎn)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的感染率、感染強(qiáng)度和存活率。計(jì)算公式如下：
感染率(％)＝(體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)/總魚(yú)數(shù))×100％；
感染強(qiáng)度＝體表白點(diǎn)總數(shù)/體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)；
存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)后存活魚(yú)數(shù)/總魚(yú)數(shù))×100％。
結(jié)果顯示：槐屬二氫黃酮G在2mg/L濃度下，能夠完全預(yù)防與治療多子小瓜蟲(chóng)病，實(shí)驗(yàn)組已感染草魚(yú)與未感染草魚(yú)的感染率和感染強(qiáng)度均為0，存活率均為100％。實(shí)驗(yàn)第25天，槐屬二氫黃酮G在2mg/L濃度下，感染率和感染強(qiáng)度均為0，存活率為100％。
實(shí)施例6：槐屬二氫黃酮G對(duì)魚(yú)的急性毒性實(shí)驗(yàn)
(1)稱(chēng)取500mg的槐屬二氫黃酮G，根據(jù)實(shí)施例1的方法，配制成實(shí)驗(yàn)所需要的濃度。
(2)預(yù)實(shí)驗(yàn)：槐屬二氫黃酮G使草魚(yú)24h全部致死的濃度為70mg/L，96h不發(fā)生死亡的濃度30mg/L。
選取180尾健康草魚(yú)隨機(jī)分配到事先裝有10L曝氣自來(lái)水的18個(gè)水族箱中，溫度控制在23±0.5℃，并由充氧泵供氧。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再設(shè)置60、50、40和0mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，隨時(shí)觀察各濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的中毒情況，如發(fā)現(xiàn)草魚(yú)中毒死亡，立即撈出，以免破壞水質(zhì)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。記錄在24、48、72、和96h各個(gè)濃度組草魚(yú)的死亡數(shù)量。根據(jù)草魚(yú)死亡數(shù)及死亡時(shí)間，計(jì)算24h、48h、96h半致死濃度(LC50)和對(duì)草魚(yú)的安全濃度。
結(jié)果顯示：槐屬二氫黃酮G對(duì)草魚(yú)96h的半致死濃度為46.6mg/L；對(duì)草魚(yú)的安全濃度為11.3mg/L。其安全濃度是預(yù)防與治療有效濃度的5.6倍左右，對(duì)魚(yú)安全。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。