本發(fā)明涉及海洋生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體講是一種褐藻多糖硫酸酯作為免疫增強劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫增強劑通常指的是在單用或與抗原同時使用時可增強機體免疫應(yīng)答的物質(zhì)，亦被稱為免疫調(diào)節(jié)劑或免疫刺激劑。免疫增強劑可通過不同的作用途徑發(fā)揮作用，如增強巨噬細胞的活性、增強抗原物質(zhì)的免疫原性和穩(wěn)定性以及促進抗體的合成與分泌等，從而增強機體的特異性和非特異性免疫應(yīng)答。隨著免疫學(xué)研究的不斷深入，開發(fā)高效、穩(wěn)定、安全的免疫增強劑越來越受到人們的重視。巨噬細胞是調(diào)節(jié)機體固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)重要的抗原遞呈細胞，在宿主對病原菌感染的防御系統(tǒng)中扮演著重要角色，被刺激后可產(chǎn)生不同的炎性介質(zhì)、細胞因子等，從而抵抗病原菌。因而本發(fā)明以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為模型，測量NO表達量，并從mRNA和蛋白表達水平上測定iNOS、TNF-α、COX-2等細胞因子的表達量，為褐藻多糖硫酸酯作為免疫增強劑的應(yīng)用提供參考依據(jù)。褐藻多糖硫酸酯是存在于所有褐藻中的細胞間多糖，又稱褐藻糖膠，其成分復(fù)雜，具有抗凝血、抗病毒、抗腫瘤等多種活性，許多生物學(xué)效應(yīng)都與它的化學(xué)組分特別是硫酸根含量密切相關(guān)。本發(fā)明所用的褐藻多糖硫酸酯具有良好的水溶性，因而應(yīng)用更加方便。以小鼠腹腔巨噬細胞為模型，測定其免疫指標及機理，從而為開發(fā)新的免疫增強劑提供可靠的依據(jù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種褐藻多糖硫酸酯作為免疫增強劑的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：一種褐藻多糖硫酸酯作為免疫增強劑的應(yīng)用。所述褐藻多糖硫酸酯為按照常規(guī)的提取方式從褐藻中提取獲得。褐藻為海帶、裙帶菜等。所述褐藻多糖硫酸酯分子量為2000-15000Da。用經(jīng)滅菌超純水溶解的所述褐藻多糖硫酸酯，得褐藻多糖硫酸酯水溶液。所述褐藻多糖硫酸酯水溶液濃度為50-200ug/mL。以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為模型，測定利用褐藻多糖硫酸酯作為免疫增強劑的活性：1)不同濃度的褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞NO表達量的影響取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。在5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做陽性對照，終濃度為1ug/mL，均設(shè)置3個復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等體積的Griess試劑，室溫避光放置10min，酶聯(lián)免疫檢測儀570nm下測吸光度，平行重復(fù)3次，代入標準曲線求出NO量。2)褐藻多糖硫酸酯細胞毒性評價取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。在5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯各100ul，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，以LPS做陽性對照，終濃度為1ug/ml，均設(shè)置3個復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去舊的培養(yǎng)基，然后每孔加入100uL濃度為0.5mg/mL的MTT溶液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，每孔加入100uL的stoppingbuffer，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，取出用酶聯(lián)免疫檢測儀于550nm測OD值。3)褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞細胞因子表達量的影響：取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。在5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的殼聚糖硫酸酯100ul，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置LPS陽性對照組，終濃度為1ug/ml，3個復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細胞上清液，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明測定細胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。4)褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子mRNA水平的影響將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于六孔板中，細胞接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養(yǎng)24小時后，棄去舊的培養(yǎng)基，除空白對照外，每孔加入褐藻多糖硫酸酯，使其終濃度為100ug/mL，置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中，提取RNA，并測定提取的RNA量，變性后跑瓊脂糖凝膠電泳并拍照保存。然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并用PCR儀擴增。將擴增后的產(chǎn)物進行電泳檢測并拍照保存。5)處于對數(shù)生長期的褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子蛋白表達量的影響將RAW264.7細胞接種于六孔板中，接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養(yǎng)24小時后，除空白對照外，每孔加入殼聚糖硫酸酯，使其終濃度為100ug/mL，置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中，每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震蕩，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為蛋白提取液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。煮沸變性后，以每孔40μg的核蛋白點樣，10％SDS-PAGE分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上蛋白樣品移至PVDF膜上，分別與一抗和辣根過氧化氫酶標記的二抗孵育，洗膜后加入發(fā)光劑和穩(wěn)定劑，曝光拍照。經(jīng)上述測定可見褐藻多糖硫酸酯能夠明顯促進RAW264.7細胞產(chǎn)生NO，且具有劑量依賴性。褐藻多糖硫酸酯可顯著增加RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2細胞因子的表達，且具有劑量依賴性。褐藻多糖硫酸酯可促進TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表達，且隨著時間的延長，呈先上升后下降趨勢。褐藻多糖硫酸酯可促進TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表達，且隨著時間的增加，各細胞因子的蛋白表達量也增加。本發(fā)明所具有的優(yōu)點：本發(fā)明所用褐藻多糖硫酸酯為海帶、裙帶菜等褐藻的提取物，原料天然無毒，且水溶性好，無細胞毒性。本發(fā)明充分利用了海藻資源，提高其附加值和綜合利用水平，經(jīng)濟效益顯著。本發(fā)明以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為模型，通過產(chǎn)生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2等細胞因子的多少，可快速、準確地判斷免疫活性強弱并了解其機理，且可檢測是否有細胞毒性，為新型免疫增強劑的開發(fā)提供依據(jù)。附圖說明圖1為褐藻多糖硫酸酯經(jīng)高效液相色譜圖測得分子量圖。圖2為褐藻多糖硫酸酯對于TNF-α等細胞因子在基因水平上表達量的影響圖。圖3為褐藻多糖硫酸酯對TNF-α等細胞因子在蛋白水平上表達量的影響圖。具體實施方式本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進一步說明如下。下述實施例褐藻多糖硫酸酯，可按照常規(guī)的提取方式從海帶、裙帶菜等褐藻中提取獲得。提取參考文獻為：JingWang,QuanbinZhang,ZhongshanZhang,ZhienLi.AntioxidantactivityofsulfatedpolysaccharidefractionsextractedfromLaminariajaponica.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules42(2008)127–132上述提取獲得褐藻多糖硫酸酯采用高效凝膠排阻色譜測定褐藻多糖硫酸酯的分子量。具體分析條件如下，色譜柱：TSKG4000-PWXL；流動相：0.05M的硫酸鈉溶液；流速：0.5mL/min；柱溫：40℃；檢測器：示差檢測器。樣品濃度為2％(w/v)。采用不同分子量的葡聚糖670000，410000,270000，80000，25000，12000，5000Da對凝膠色譜柱進行校準。其高效液相色譜圖如圖1，測得分子量為2000-15000Da。實施例1不同濃度的褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞NO表達量的影響(1)試驗材料及試劑：①稱取上述獲得褐藻多糖硫酸酯12.2mg，用244uL滅菌超純水將其溶解，使其濃度為50mg/mL，而后用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋為400ug/mL，然后倍比稀釋至400，200，100，50，25，12.5ug/mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)；②GriessA試劑配制：對氨基苯磺酰胺400mg溶于40mL5％的磷酸溶液中；③GriessB試劑配制：40mgN-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶于40mL超純水中；④RAW264.7細胞、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清。試驗方法(培養(yǎng)檢測過程中均在RPMI1640完全培養(yǎng)基中進行)：①取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106cell/mL，于96孔板每孔接種100ul。②在5％的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其終濃度分別為0,6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。LPS做陽性對照，終濃度為1ug/ml。③將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等體積(100ul)的Griess試劑(GriessA和GriessB等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫避光放置10min，以完全培養(yǎng)基加顯色劑作為空白對照，用酶聯(lián)免疫檢測儀570nm下測吸光度，平行重復(fù)3次，代入標準曲線求出NO量。④標準曲線的繪制：將1mol/L的NaNO2貯存液經(jīng)水稀釋至100μmol/L后，依次倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0umol/L濃度的NaNO2標準溶液。吸取100ul各濃度標準溶液于96孔板中，各濃度重復(fù)3孔，然后每孔加入100ulGriess試劑(GriessA和GriessB等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫避光反應(yīng)10min后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測540nm吸光度。以NaNO2標準溶液濃度為橫坐標，以O(shè)D540為縱坐標，各濃度OD值扣除培養(yǎng)基空白對照OD值后，繪制NO標準曲線為y＝0.0073x+0.00373。試驗結(jié)果，不同濃度的褐藻多糖硫酸酯增加NO表達量的結(jié)果如下：表1：不同濃度的褐藻多糖硫酸酯對NO表達量的影響褐藻多糖硫酸酯濃度(ug/mL)NO表達量(uM)01.7±1.386.2510.33±0.93112.522.93±3.092534.04±1.535039.72±2.0610043.8±0.3120047.13±2.89從上表可以看出，褐藻多糖硫酸酯能夠明顯促進細胞產(chǎn)生NO，且具有劑量依賴性。實施例2不同濃度的褐藻多糖硫酸酯細胞毒性評價(1)試驗材料及試劑:①0.5mg/mL的MTT溶液：噻唑藍用超純水配制為5mg/mL母液，避光保存，用前避光稀釋10倍；②Stoppingbuffer配制：10％(w/v)的十二烷基硫酸鈉與0.01mol/L的鹽酸配制200ml。③RAW264.7細胞、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清。(2)試驗方法(培養(yǎng)檢測過程中均在RPMI1640完全培養(yǎng)基中進行)：①取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。②在5％的CO2培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯100ul，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。LPS做陽性對照，終濃度為1ug/ml。③將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去舊的培養(yǎng)基，然后每孔加入100uL濃度為0.5mg/mL的MTT溶液。④放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，每孔加入100uLstoppingbuffer，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，取出用酶聯(lián)免疫檢測儀于550nm測OD值。(3)試驗結(jié)果：用RAW264.7細胞評價細胞毒性結(jié)果如下：表2：褐藻多糖硫酸酯的細胞毒性評價褐藻多糖硫酸酯濃度(ug/mL)細胞存活率(％)0100.44±0.626.25100.88±16.3412.5100.39±1.652598.92±2.415093.37±6.0910083.6±6.3220073.14±7.35由上表可以看出，低濃度的褐藻多糖硫酸酯無明顯的細胞毒作用，當濃度超過100ug/mL時有細胞毒性。實施例3褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞細胞因子表達量的影響：試驗材料與試劑：IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2細胞因子ELISA試劑盒試驗方法(培養(yǎng)檢測過程中均在RPMI1640完全培養(yǎng)基中進行)：①取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。②在5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯100ul，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置LPS陽性對照組，終濃度為1ug/ml，3個復(fù)孔。③將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細胞上清液，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明測定細胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。試驗結(jié)果，不同濃度褐藻多糖硫酸酯對各類細胞因子表達量的影響如下：表3不同濃度褐藻多糖硫酸酯對各類細胞因子表達量的影響由上表可以看出，隨著褐藻多糖硫酸酯濃度的增加，其細胞因子表達量也增加，但當濃度為200ug/mL時，其細胞因子表達量基本不再增加，甚至下降。最高濃度的褐藻多糖硫酸酯各細胞因子表達量可達空白對照的10-20倍，表明褐藻多糖硫酸酯可顯著增加各細胞因子的表達，且具有劑量依賴性。實施例4褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子mRNA水平的影響根據(jù)細胞增殖試驗和NO試驗結(jié)果，選擇濃度50ug/mL進行試驗。(1)試驗材料及試劑①DEPC水配制：100mL超純水中加入0.1mL的DEPC，37℃放置12小時后，121高壓滅菌20分鐘。②Trizol、氯仿、異丙醇、溴化乙錠、瓊脂糖、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒(2)試驗方法(培養(yǎng)檢測過程中均在RPMI1640完全培養(yǎng)基中進行)：①細胞的培養(yǎng)和處理：將RAW264.7細胞接種于六孔板中，接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養(yǎng)24小時后，棄去舊的培養(yǎng)基，除空白對照外，每孔加入褐藻多糖硫酸酯，使其終濃度為50ug/mL，置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中。②細胞RNA提取：每管中加入1mLTrizol試劑，用移液槍吹打數(shù)次促進細胞裂解，然后置于冰上靜置10分鐘，使核蛋白充分解離。然后每管中加入100μL氯仿，小心蓋好管，充分劇烈震蕩15秒，于冰上靜置5分鐘。然后4℃12000g離心15分鐘，取上清液400μL，加入400uL異丙醇，輕輕混勻5次，室溫下靜置10分鐘。4℃12000g離心8分鐘后棄去上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇DEPC水，混勻。離心棄去上清，晾干后每管中加入30uLDEPC水溶解，然后測定提取的RNA量。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1uL的oligodT與1uL的10×dNTP混合，加一定量的RNA和DEPC水，總體積達12uL，65℃變性5分鐘，迅速轉(zhuǎn)移到冰上，按試劑盒說明書加入FSBbuffer、DTT、DEPC水，混勻，37℃水浴2分鐘，于冰上冷卻。然后每管加入1uL的M-MLVRT，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃，50min；70℃，15min。得到20uLcDNA體系，加入60uL滅菌水，置于-20℃冰箱保存。④PCR擴增：采用試劑盒進行反應(yīng)，體系如下：2×EsTaqMasterMix10uL，正向引物(10uM)1uL，反向引物(10uM)1uL，cDNA2uL，不含RNA酶的水加至20uL。PCR反應(yīng)條件如下：Program1：94℃，2min；1個循環(huán)Program2：94℃，30s；55-65℃，30s；72℃，30s；20-30個循環(huán)Program3：72℃，2min⑤電泳檢測：0.25g瓊脂糖加25mL0.5×TAE及0.5uL溴化乙錠制膠，每孔加入PCR反應(yīng)后的溶液10uL，100v，30min跑電泳。放入電泳成像系統(tǒng)，拍照保存(參見圖2)。(3)試驗結(jié)果褐藻多糖硫酸酯對于TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上表達量的影響如圖1，其中GAPDH為內(nèi)參，由圖2可以看出，褐藻多糖硫酸酯可以促進上述細胞因子的表達，隨著時間的延長，呈先上升后下降趨勢。實施例5褐藻多糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子蛋白水平表達量的影響(1)試驗材料及試劑：BCA法蛋白定量測定試劑盒、玻璃珠、蛋白裂解液、PVDF膜、對應(yīng)的一抗和二抗。(2)試驗方法①細胞的培養(yǎng)和處理：將RAW264.7細胞接種于六孔板中，接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養(yǎng)24小時后，棄去舊的培養(yǎng)基，除空白對照外，每孔加入用新鮮培養(yǎng)基配制的褐藻多糖硫酸酯2mL，濃度為50ug/mL，置于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中。②蛋白的提?。好抗芗尤?00uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震蕩，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為蛋白提取液，BCA法測定蛋白濃度。③煮沸變性后，以每孔40g的核蛋白點樣，SDS-PAGE分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上蛋白樣品移至PVDF膜上，分別與一抗和辣根過氧化氫酶標記的二抗孵育，洗膜后加入發(fā)光劑和穩(wěn)定劑，曝光拍照(參見圖3)。(3)試驗結(jié)果褐藻多糖硫酸酯對TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上表達量的影響如圖3，其中β-actin為內(nèi)參，可以看出隨著時間的增加，各細胞因子的蛋白表達量也增加。當前第1頁1 2 3