本發(fā)明涉及生物材料、組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞膜片及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚創(chuàng)傷是臨床高發(fā)疾病，可以分為急性創(chuàng)傷或者慢性創(chuàng)傷。人體對于創(chuàng)面有一定的自我修復(fù)能力，但是當(dāng)創(chuàng)面面積過大或者創(chuàng)面局部環(huán)境紊亂例如血管被破壞，血供不足時，創(chuàng)面便無法正常修復(fù)，甚至造成長期難以愈合、反復(fù)發(fā)作的創(chuàng)口。

已有廣泛的文獻(xiàn)報道了組織工程中運用人自身的細(xì)胞來修復(fù)人體組織的研究進(jìn)展，利用細(xì)胞來進(jìn)行組織修復(fù)已經(jīng)取得了一些成果，這是利用外加細(xì)胞自身參與到修復(fù)過程中，利用其生長因子和蛋白等來進(jìn)行組織的修復(fù)，但是其修復(fù)能力有限，且需要合適的支架材料作為細(xì)胞載體。

定向靜電紡絲纖維膜具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)和尺寸，在組織再生及修復(fù)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。定向靜電紡絲纖維膜被證實能夠影響細(xì)胞的定向排列及生長，但是僅作為支架材料而未涉及生物活性成份，其組織再生修復(fù)能力有限。此外，在皮膚創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域，其常被用作保護(hù)創(chuàng)面的敷料，并不具備生物活性或修復(fù)能力。

生物活性玻璃是一種硅基無機(jī)材料，在組織修復(fù)領(lǐng)域獲得了很多應(yīng)用。生物活性玻璃被證明可以促進(jìn)體內(nèi)外血管化，臨床上也出現(xiàn)了基于生物活性玻璃粉末的創(chuàng)面修復(fù)產(chǎn)品。但是由于它粉末的性質(zhì)，很難固定在創(chuàng)面位置，且其產(chǎn)生的局部堿性化學(xué)環(huán)境，會造成病人的不適。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種具有良好再生修復(fù)能力的細(xì)胞膜片及其制備方法與應(yīng)用，其具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞膜片，所述細(xì)胞膜片由定向靜電紡絲纖維膜和經(jīng)生物活性玻璃離子產(chǎn)物活化的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成。

進(jìn)一步地，所述定向靜電紡絲纖維膜由聚己內(nèi)酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)組成。

進(jìn)一步地，所述定向靜電紡絲纖維膜的納米纖維尺寸與細(xì)胞外基質(zhì)相似。

進(jìn)一步地，所述生物活性玻璃含有CaO、P₂O₅和SiO₂，所述生物活性玻璃的浸提液含有Ca、P和Si離子。

本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞膜片在制備創(chuàng)面保護(hù)輔料中的應(yīng)用，及其在制備心肌修復(fù)材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞膜片的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、利用高速旋轉(zhuǎn)滾筒收集聚己內(nèi)酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)電紡絲得到定向靜電紡絲纖維膜；

步驟2、將生物活性玻璃粉體分別加入無血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液和無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，無菌過濾收集生物活性玻璃浸提液，分別用所述無血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液和所述無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液等比例稀釋后以1：1體積比混合，得到稀釋的生物活性玻璃浸提液；

步驟3、將所述定向靜電紡絲纖維膜裁剪成適宜大小，滅菌處理后置于培養(yǎng)板，加入成纖維細(xì)胞懸浮液，用所述稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)1d，移除培養(yǎng)液，加入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液，用所述稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)3d，移除培養(yǎng)液；

步驟4、取出所述定向靜電紡絲纖維膜，制備得到由所述定向靜電紡絲纖維膜和經(jīng)生物活性玻璃離子產(chǎn)物活化的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成的所述細(xì)胞膜片。

進(jìn)一步地，所述高速旋轉(zhuǎn)滾筒的轉(zhuǎn)速為2000r/min。

進(jìn)一步地，所述稀釋的生物活性玻璃浸提液中的主要離子濃度如下：Ca：65.05±0.35μg/ml，P：28.55±0.22μg/ml，Si：1.01±0.07μg/ml。

進(jìn)一步地，每平方厘米所述定向靜電紡絲纖維膜上加入的成纖維細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量分別為3x 10⁴-4x 10⁴和4x 10⁴-5x 10⁴。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明不需額外使用特殊培養(yǎng)皿或技術(shù)手段，利用定向靜電紡絲纖維膜通過一般培養(yǎng)方法制備得到微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片，該膜片具有很高的生物活性，能夠分泌成血管相關(guān)的生長因子和蛋白如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，血管內(nèi)皮生長因子受體(KDR)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及一系列細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白(Collagen)、彈性蛋白(Elastin)、纖連蛋白(Fibronectin)來促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。在實際運用中，利用該膜片能夠促進(jìn)動物全切創(chuàng)面處膠原蛋白沉積和血管再生，并且能促進(jìn)創(chuàng)面收縮，明顯地提高創(chuàng)面修復(fù)速度，其對慢性創(chuàng)傷的修復(fù)尤其具有良好的修復(fù)效果。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。

附圖說明

圖1示出了本發(fā)明的一個較佳實施例的創(chuàng)面修復(fù)效果；

圖2示出了本發(fā)明的一個較佳實施例的創(chuàng)面收縮率結(jié)果；

圖3示出了本發(fā)明的一個較佳實施例的修復(fù)過程中血管再生情況；

圖4.示出了本發(fā)明的一個較佳實施例的膠原蛋白I在創(chuàng)面位置沉積情況。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制發(fā)明的范圍。

實施例1

1.制備定向靜電紡絲纖維膜，將質(zhì)量比為1:1的PCL和PDLLA以4.8％的質(zhì)量體積比溶解于體積比為4：1的DMF和THF中，利用靜電紡絲設(shè)備以10kv電壓、0.02ml/min流量和12cm接收距離的條件進(jìn)行電紡絲，以2000r/min旋轉(zhuǎn)的高速滾筒接收得到定向靜電紡絲纖維膜。

2.制備生物活性玻璃浸提液，分別將1g生物活性玻璃粉體加入5ml無血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液及5ml無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后無菌過濾收集，并分別用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液以1/128比例稀釋，將稀釋后浸提液以1：1體積比混合；

3.定向靜電紡絲纖維膜剪裁成2.5cm x 2.5cm大小，并于75％酒精中浸泡30分鐘進(jìn)行滅菌處理，滅菌并洗凈的定向靜電紡絲纖維膜置于培養(yǎng)板并加入2x 10⁵個成纖維細(xì)胞懸浮液，用稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)24小時，然后移除培養(yǎng)液并加入3x 10⁵個臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液，用稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)3天，移除培養(yǎng)液，取出電紡膜，制備得到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片待用；

4.在裸鼠背部制造兩個直徑1cm的創(chuàng)面，將制備的細(xì)胞膜片施加到創(chuàng)面，并設(shè)置空白組和施加0.1g rhEGF凝膠的陽性對照；

5.裸鼠靜脈注射Depomedrol(20mg/kg BW)延緩創(chuàng)面愈合，2d、7d、14d后處死裸鼠，收集創(chuàng)面樣本做切片分析。

實施例2

根據(jù)實施例1所示的方法，對不同時間點裸鼠背部的創(chuàng)面直徑進(jìn)行測量，通過公式：創(chuàng)面收縮％＝100×(初始創(chuàng)面面積—目前創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積，對創(chuàng)面收縮率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果示于圖2。

實施例3

根據(jù)實施例1所示的方法，對收集的創(chuàng)面樣本進(jìn)行CD31免疫組織化學(xué)染色，觀察到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片修復(fù)的創(chuàng)面有大量的血管再生，結(jié)果示于圖3a。圖3b示出了其定量統(tǒng)計結(jié)果。

實施例4

根據(jù)實施例1所示的方法，對收集的創(chuàng)面樣本進(jìn)行Collagen I免疫組織化學(xué)染色，觀察到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片修復(fù)的創(chuàng)面有大量的膠原蛋白沉積，結(jié)果示于圖4。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。