本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及銀杏雙黃酮在制備防治非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌的高發(fā)病率和高死亡率使其成為腫瘤疾病死亡的主要影響因素，由于環(huán)境污染及人們快節(jié)奏的生活方式，肺癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年增長趨勢。根據(jù)IACR預(yù)計，直至2030年，每年將有一千萬人死于肺癌，相當(dāng)于每日有2700個人死于肺癌。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞癌(SCLC)，其中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)了肺癌種類的80％以上。非小細(xì)胞肺癌根據(jù)病理組織學(xué)特性又可分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌，其中腺癌為NSCLC的主要類型。目前，治療NSCLC的臨床一線用藥主要為順鉑和酪氨酸激酶抑制劑。

順鉑自二十世紀(jì)70年代被美國FDA批準(zhǔn)上市以來，其產(chǎn)生的耐藥性及毒性反應(yīng)一直是圍繞臨床的難題，嚴(yán)重影響了五年生存率的提高。雖然酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用給肺癌的治療帶來了突破性進(jìn)展，但其藥效高度依賴于EGFR的基因型，對于EGFR基因型不明確以及明確具有野生型EGFR的NSCLC患者，療效較差，再者，與順鉑一樣會不可避免得產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找低毒高效的治療非小細(xì)胞肺癌的藥物亦是腫瘤藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

黃酮類化合物，在自然界廣泛存在，有著廣泛的生物活性和較少的毒副作用，雙黃酮類化合物是由二分子黃酮衍生物通過C-C鍵或C-O-C鍵聚合而成的二聚物。銀杏中有著較為豐富的雙黃酮物質(zhì)，其中銀杏雙黃酮(式I)為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉提取物，一直以來其功效主要被關(guān)注在治療冠心病、心絞痛、腦動脈硬化、老年性癡呆、高血壓，對銀杏雙黃酮抗腫瘤藥效的研究很少，尤其對于非小細(xì)胞肺癌療效的研究未見到報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種雙黃酮類化合物的新應(yīng)用。

具體技術(shù)方案如下：

雙黃酮類化合物在制備防治肺癌的藥物或保健品中的應(yīng)用。

在其中一些實(shí)施例中，所述雙黃酮類化合物為銀杏雙黃酮。

在其中一些實(shí)施例中，所述所述藥物或保健品中還包括有順鉑。將銀杏雙黃酮與治療肺癌常用的藥物順鉑合用作為防治非小細(xì)胞肺癌的藥物時，可起到協(xié)同增效的作用而且可以減少順鉑的毒性作用。

在其中一些實(shí)施例中，所述銀杏雙黃酮和順鉑的摩爾比為1:0.1-4。

在其中一些實(shí)施例中，所述銀杏雙黃酮和順鉑的摩爾比為1:0.9-1.1。

在其中一些實(shí)施例中，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

本發(fā)明還提供了一種防治肺癌的藥物組合物或保健品。

具體技術(shù)方案如下：

一種防治肺癌的藥物組合物或保健品，其活性成分包括有銀杏雙黃酮，或者其活性成分包括有銀杏雙黃酮和順鉑的組合物。

在其中一些實(shí)施例中，所述銀杏雙黃酮和順鉑的摩爾比為1:0.1-4。

在其中一些實(shí)施例中，所述銀杏雙黃酮和順鉑的摩爾比為1:0.9-1.1。

在其中一些實(shí)施例中，所述藥物或保健品的劑型為片劑、口服液、顆粒劑、噴霧劑、注射液、粉針劑或膠囊劑。將雙黃酮類化合物(尤其是銀杏雙黃酮)加藥學(xué)上可接受的輔料可以制備成包括片劑、口服液、注射劑、膠囊劑等臨床可接受的劑型，均具有較好的防治肺癌(尤其是非小細(xì)胞肺癌)的作用。

發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雙黃酮類化合物(尤其是銀杏雙黃酮)具有防治肺癌(尤其是非小細(xì)胞肺癌)的作用。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，能顯著增加線粒體膜電位的降低率和活性氧簇的產(chǎn)生，增加凋亡相關(guān)蛋白及自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)A549非小細(xì)胞肺癌的凋亡；在動物模型中，銀杏雙黃酮可以顯著抑制A549荷瘤裸鼠的腫瘤生長，對A549肺癌荷瘤裸小鼠具有較好的抗腫瘤活性，并無明顯毒性；銀杏雙黃酮與臨床常用治療肺癌的藥物順鉑合用，可增加順鉑單用或銀杏雙黃酮單用的抗癌效應(yīng)并減少順鉑的毒性。雙黃酮類化合物(尤其是銀杏雙黃酮)可以用于制備預(yù)防和治療肺癌(尤其是非小細(xì)胞肺癌)的藥物或保健品。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用結(jié)果示意圖；

圖2為實(shí)施例2的銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的線粒體膜電位影響示意圖；

圖3為實(shí)施例3的銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活性氧影響示意圖；

圖4實(shí)施例4的銀杏雙黃酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的效果對比圖；

圖5為實(shí)施例5的銀杏雙黃酮對A549細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白的影響示意圖；

圖6為實(shí)施例6的銀杏雙黃酮對A549荷瘤裸小鼠的抗腫瘤活性效果圖；

圖7為實(shí)施例6的銀杏雙黃酮對A549荷瘤裸小鼠的體重影響示意圖；

圖8為實(shí)施例7的銀杏雙黃酮和順鉑合用對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用示意圖；

圖1-圖8中，Ginkgetin為銀杏雙黃酮，DDP為順鉑，G5與G10分別為濃度為5μM和10μM的銀杏雙黃酮，D5與D10分別為濃度為5μM和10μM的順鉑。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1：銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的毒性作用

1.細(xì)胞培養(yǎng)

取A549細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該1640培養(yǎng)基含10％胎牛血清、青酶素100U/ml、慶大酶素100ug/ml、1mM氨基酸和0.1mM丙酮酸鈉，培養(yǎng)箱溫度為37℃,含5％CO₂。

2.細(xì)胞毒性測定

將A549細(xì)胞種于96孔板，每孔細(xì)胞密度約3×10³個細(xì)胞，24h細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度的銀杏雙黃酮和順鉑，24h、48h、及72h后加入MTT染色，染色4h后，舍棄原有培養(yǎng)液，加入DMSO溶解，放入酶標(biāo)儀，使用570nm檢測波長測定吸光度。

對照結(jié)果參見附圖1以及表1。結(jié)果顯示銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，24、48、72小時的IC50值顯著低于非小細(xì)胞肺癌一線用藥順鉑。

表1銀杏雙黃酮對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用

實(shí)施例2：銀杏雙黃酮增加A549細(xì)胞的線粒體膜電位

A549細(xì)胞種于6孔板上，每孔細(xì)胞密度約5×10⁴個細(xì)胞，過夜讓細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的銀杏雙黃酮(5，10μM)，加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥24小時后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，消化收集細(xì)胞，加入含有終濃度為5μg/μL的JC-1的無血清培養(yǎng)基于37℃熒光標(biāo)記0.5小時，離心棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為488nm及561nm。

對照結(jié)果參見附圖2。結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮可以顯著升高A549細(xì)胞的線粒體膜電位的降低率，且顯著高于同濃度的順鉑。與腫瘤相關(guān)的各種信號通路、基因突變以及微環(huán)境等似乎都傾向于靶向線粒體功能的調(diào)節(jié)來參與腫瘤的發(fā)生進(jìn)程。線粒體作為細(xì)胞凋亡內(nèi)源途徑中心位置，其膜的穩(wěn)定性在凋亡過程中扮演著重要的角色?？鼓[瘤藥通過降低線粒體膜電位，使得線粒體外膜的通透性增加，隨之釋放出線粒體內(nèi)的凋亡因子包括細(xì)胞色素C及其他蛋白因子，凋亡因子一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就會和其他的銜接分子作用啟動凋亡，導(dǎo)致PARP的切割。

實(shí)施例3：銀杏雙黃酮增加A549細(xì)胞活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生

A549細(xì)胞種于6孔板上，每孔細(xì)胞密度約5×10⁴個細(xì)胞，過夜讓細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的銀杏雙黃酮(5，10μM)，加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥24小時后，加入含有終濃度為15μM的DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基于37℃熒光標(biāo)記0.5小時，然后棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，消化收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，檢測激發(fā)波長為488nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三次實(shí)驗(yàn)的平均值，每次平行做三個孔。

對照結(jié)果參見附圖3，結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮可以顯著增加A549細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，且顯著高于同濃度的順鉑。ROS在腫瘤的形成及發(fā)展過程中起著十分重要的作用，細(xì)胞中氧化-還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)對于腫瘤形成是一個重要因素。誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生能增加線粒體膜電位的降低率，誘導(dǎo)線粒體通路凋亡以及DNA損傷。增加ROS亦是許多抗腫瘤藥的重要機(jī)制之一，例如順鉑，拮抗ROS的產(chǎn)生將逆轉(zhuǎn)其抗腫瘤作用。

實(shí)施例4：銀杏雙黃酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用

A549細(xì)胞種于6孔板上，每孔細(xì)胞密度約5×10⁴個細(xì)胞，過夜讓細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的銀杏雙黃酮(5，10μM)，加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥24小時后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，消化收集細(xì)胞，重懸于binding buffer，然后用PI及Annexin V染色，用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長561nm及488nm。

對照結(jié)果見附圖4，結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮能顯著增加A549細(xì)胞的凋亡，與同濃度的順鉑相比，其誘導(dǎo)凋亡的作用強(qiáng)于順鉑。

實(shí)施例5：銀杏雙黃酮對凋亡及自噬關(guān)鍵蛋白的影響

A549細(xì)胞種板貼壁后，加入不同濃度的銀杏雙黃酮(5，10μM)，加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥48小時后，連同上清液一起收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，震蕩15min，12000rcf離心10min，棄去沉淀。用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，然后稀釋至同一濃度。然后用western blot法測定凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP,c-JUN及自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)。

對照結(jié)果見附圖5，結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮能顯著增加凋亡蛋白cleaved PARP及c-JUN的表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于同濃度的順鉑。同樣，銀杏雙黃酮可以顯著增加自噬標(biāo)致物L(fēng)C3的表達(dá)，且LC3II與LC3I的比值顯著增加，其增加量顯著高于同濃度的順鉑。

實(shí)施例6：銀杏雙黃酮對A549荷瘤裸小鼠的抗腫瘤活性

將1×10⁷個A549細(xì)胞注射入裸小鼠的腋下，傳代后取瘤塊，切成約1.5mm³大小瘤塊，種植于40只試驗(yàn)裸小鼠的腋下，待腫瘤生長至80mm³左右后，采用隨機(jī)區(qū)組分組方法將動物隨機(jī)分為四組，陰性對照組，順鉑劑量組，銀杏雙黃酮組，銀杏雙黃酮與順鉑合用組，給藥量均為0.1ml/10g。順鉑組(3mg/kg)每周兩到三次注射給藥，銀杏雙黃酮(30mg/kg)每日腹腔注射給藥，銀杏雙黃酮與順鉑合用組為兩者分開給藥，給藥劑量分別與兩者單用組相同，陰性對照組每日注射相同劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥40天。每周測量腫瘤體積三次，并稱裸小鼠體重。實(shí)驗(yàn)最后一天，稱量裸小鼠體重，測定瘤塊體積，并處死裸小鼠，取瘤拍照。腫瘤體積計算公式：V＝ab²/2，其中a為腫瘤直徑，b為腫瘤橫徑。

腫瘤生長的對照結(jié)果見附圖6，結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮可以顯著抑制A549荷瘤裸鼠的腫瘤生長，對A549肺癌荷瘤裸小鼠具有較好的抗腫瘤活性，且銀杏雙黃酮與順鉑合用的抗腫瘤活性更好。

裸小鼠體重結(jié)果參見附圖7，結(jié)果顯示：銀杏雙黃酮對小鼠體重影響不大，與對照相比無顯著性差異，而順鉑給藥組體重顯著下降，自給藥第9天開始與對照組相比，顯著性降低。此結(jié)果說明，銀杏雙黃酮以30mg/kg腹腔注射40日對裸鼠無明顯毒性作用。

實(shí)施例7

將A549細(xì)胞種于96孔板，每孔細(xì)胞密度約3×10³個細(xì)胞，24h細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度的銀杏雙黃酮和順鉑，24h、48h、及72h后加入MTT染色，染色4h后，舍棄原有培養(yǎng)液，加入DMSO溶解，放入酶標(biāo)儀，使用570nm檢測波長測定吸光度。

結(jié)果參見附圖8，結(jié)果顯示，當(dāng)銀杏雙黃酮5μM與順鉑(1.25,2.5,5,10,20μM)合用后對A549細(xì)胞的抑制率均顯著高于兩者單用。兩藥合用的協(xié)同效應(yīng)可以用協(xié)同指數(shù)來說明，當(dāng)協(xié)同指數(shù)計算小于0.9說明兩藥合用有協(xié)同作用。對五個合用結(jié)果計算協(xié)同指數(shù)(CI)，其值均低于0.9，其中銀杏雙黃酮5μM與順鉑5μM合用的協(xié)同指數(shù)最低，說明當(dāng)銀杏雙黃酮與順鉑在摩爾比為1：1(質(zhì)量比1.89：1)時有較強(qiáng)的協(xié)同作用。

實(shí)施例8

將銀杏雙黃酮與輔料混合，輔料的用量為1-10％，過篩后，按照制備膠囊劑的常規(guī)工藝制成膠囊劑，作為防治和預(yù)防肺癌的藥物和保健品。輔料可以為：淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠。

實(shí)施例9

將銀杏雙黃酮用少量非極性溶劑及表面活性劑超聲溶解，再加入生理鹽水，裝于鹽水瓶中，密封，沸水加熱滅菌，調(diào)節(jié)pH至5，抽濾至溶液澄明，即得注射液。

實(shí)施例10

取銀杏雙黃酮提取物浸膏，噴霧制粒，干燥，整粒，即得顆粒劑，作為防治和預(yù)防肺癌的藥物和保健品。

實(shí)施例11

將PEG6000加熱熔融，用適量無水乙醇加熱溶解銀杏雙黃酮，然后與熔融的PEG6000混合，高溫?fù)]去無水乙醇，然后迅速傾倒入板上，制備薄層，低溫下冷卻固化，干燥后研細(xì)，過篩，再加入淀粉、微晶纖維素，糊精制粒，烘干，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，包衣，即得片劑，作為防治和預(yù)防肺癌的藥物和保健品。

實(shí)施例12

陳皮、檸檬酸與白糖加熱煮沸制備成糖漿液，銀杏雙黃酮用甘油超聲溶解，然后與糖漿液合并，加入谷氨酸鈉，蒸汽滅菌，制備成口服液，作為防治和預(yù)防肺癌的藥物和保健品。

實(shí)施例13

將實(shí)施例9中制得的注射液經(jīng)環(huán)糊精環(huán)化處理后，進(jìn)行噴霧干燥。將干燥后的粉末用氣流式粉碎機(jī)粉碎成10um以下的粉末，將藥物與助懸劑SPan-85加入乳勻機(jī)中研勻后加入四氟乙烷，研勻成為漿料。所得漿料過尼龍篩網(wǎng)，裝于鋁廳瓶中，壓蓋，通過蓋上閥體充入一定量二氯二氟甲烷，制備成噴霧劑，作為防治肺癌的藥物。

實(shí)施例14

將銀杏雙黃酮或其衍生物用DMSO溶解，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例15

取銀杏雙黃酮或其衍生物按常規(guī)加注射用水溶解，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例16

將銀杏雙黃酮或其衍生物，用少量乙醇、甲醇或蒸餾水溶解后，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。

實(shí)施例17

取銀杏雙黃酮或其衍生物，按制劑需要的比例加入賦形劑，制成粉劑。

實(shí)施例18

取銀杏雙黃酮或其衍生物，按制劑需要的比例加入賦形劑，制粒壓片制成片劑。

實(shí)施例19

取銀杏雙黃酮或其衍生物，按常規(guī)口服液制法制成口服液。

實(shí)施例20

取銀杏雙黃酮或其衍生物，按制劑需要的比例加入賦形劑，制成膠囊、或顆粒劑、或沖劑。

實(shí)施例21

取銀杏雙黃酮或其衍生物，按產(chǎn)品需要的比例加入食品或其它載體，制成保健品或其它功能性用品。

實(shí)施例22

將銀杏雙黃酮及與順鉑按比例(質(zhì)量比＝1.89：1)混合，使用丙二醇、聚山梨酯80、甘油等輔料制成注射粉針劑，形成聯(lián)合抗腫瘤藥物組合物。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。