本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，具體為DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗及其制備方法，屬于生物疫苗技術領域。

背景技術：

豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由PRRS病毒(PRRSV)引起，以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的高度接觸性、高致死率烈性傳染病。自美國1987年報道以來，近年來己經遍布全球各個主要養(yǎng)豬國家，是被國際獸醫(yī)局(OIE)通報的動物A類烈性傳染病之一，為高發(fā)病率和高死亡率的重大傳染病。自從2006年6月起，一場被稱為“高熱病”或“無名高熱癥”的疫病在我國南方一些豬場以不同數量和規(guī)模呈災難性暴發(fā)，以后幾乎席卷全國，2006年入冬至2007年，“豬高熱病”已由急性轉為慢性持續(xù)感染，主要侵害母豬和仔豬。至今該病仍然不斷發(fā)生，是目前豬場內最難解決的重大疫病。豬藍耳病的發(fā)生給我國養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經濟損失，目前還沒有有效的藥物能對其徹底治愈，對母豬和仔豬進行免疫預防是控制豬藍耳病最為經濟有效的方法，但現行的豬藍耳病滅活疫苗和減毒活疫苗免疫應答較遲緩且效果不理想。

技術實現要素：

為彌補現有技術的不足，本發(fā)明提供一種新型的DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗及其制備方法，能有效防控豬藍耳病病毒，解決了藍耳病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經濟損失。本發(fā)明的技術方案如下：

一種DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗(10頭份)，包括以下物質：PRRSV TCID₅₀＝5×10⁵-5×10⁷，甘露糖1-20wt％，PLGA0.01-5wt％，Poly(I:C)0.01-5wt％，PLGA為本領域熟知的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。

本發(fā)明同時請求保護所述的DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟：

S1.制備PLGA納米佐劑滅活疫苗；

S2.合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

進一步的，所述的步驟S1為：

a.制備W2相：PVA加入到水中，全部溶解；

b.制備O相：PLGA加入到二氯甲烷中，全部溶解；

c.制備W1相：Poly(I:C)與PRRSV混合，溶解充分；

d.將W1相加入到O相中，進行超聲波處理得到混合物Ⅰ；

e.將混合物Ⅰ加入到W2相中，進行超聲乳化后除去二氯甲烷得到混合物Ⅱ；

f.將混合物Ⅱ離心除去上清液，保留沉淀即為PLGA納米佐劑疫苗。進一步的，所述的步驟S2為：

a.向步驟S1得到的PLGA納米佐劑疫苗中分別加入1-10wt％N-羥基琥珀酰亞胺和1-10wt％二環(huán)己基碳二亞胺溶液，混合均勻；

b.將步驟a混合均勻的液體置于透析袋中透析6-8小時，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺；

c.向經透析后的液體中加入乙二胺，用濃鹽酸調節(jié)pH至5.0，形成銨化PLGA；

d.將1-20wt％甘露糖溶解于0.1mol/L醋酸鈉溶液中，將甘露糖-醋酸鈉溶液加入到步驟c得到的銨化PLGA中，在37℃震蕩處理2天；

e.將步驟d處理后的液體離心，得到沉淀，用生理鹽水洗滌、重懸沉淀即得甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

進一步的，所述的W2相中PVA的質量分數為0.25-1.25％。

進一步的，所述超聲乳化的條件為：時間110s，0.6s/次，55％。

PLGA是無毒的生物可降解聚合物，在美國已被FDA批準上市，產品用于藥用輔料、生物醫(yī)用材料。包括藥物緩釋劑、控釋制劑載體(包括冠脈支架載藥材料)，如阿霉素緩釋劑，多肽類生物降解緩釋微球等，也用于多種疫苗載體,如HIV、乙肝、口蹄疫等。Poly(I:C)中文名字為聚肌胞苷酸，為多聚肌苷酸的共聚物，藥理研究和臨床工作證實，聚肌胞是及時高效的內源性干擾素誘導劑，又是免疫調節(jié)劑，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤作用、刺激吞噬作用和增強機體免疫功能作用。另外，大量實驗證明甘露糖可以靶向結合樹突狀細胞的甘露糖受體。故本課題擬采用甘露糖修飾PLGA納米佐劑，加入Poly(I:C)輔佐PRRSV，加快及增強對PRRSV的細胞免疫應答，以期有效防控豬藍耳病毒，解決藍耳病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經濟損失。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明利用甘露糖殘基修飾PLGA，輔以Poly(I:C)為刺激劑，制備DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗。利用甘露糖殘基修飾PLGA，旨在構建具有甘露糖受體的樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞的靶向性疫苗的輸送系統(tǒng)；加入Poly(I:C)在于增強免疫豬只免疫力，加強細胞免疫應答；采用無毒可降解材料PLGA為載體制備納米疫苗，目的在于延緩病毒的釋放時間、降低藥物的毒害性、延長藥物的半衰期。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的納米佐劑疫苗激光粒度檢測結果圖；

圖2為本發(fā)明的納米佐劑疫苗的病毒釋放曲線圖；

圖3為本發(fā)明的納米佐劑疫苗紅外光譜檢測圖；

圖4為本發(fā)明硫酸苯酚法測多糖含量標準曲線圖；

圖5為本發(fā)明的納米佐劑疫苗淋巴細胞增殖結果圖；

圖6為本發(fā)明的納米佐劑疫苗ELISPOT檢測結果圖。

其中：1、甘露糖修飾PLGA納米佐劑疫苗，2、PLGA納米佐劑疫苗。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，如無特殊說明，所用原料均市售可得，作為優(yōu)選，食用小蘇打購于山東海天生物化工有限公司。按照如下表1配方制備DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗：

表1

實施例1

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制0.25wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調節(jié)適宜的轉速，調節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量0.01wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取0.01wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁵PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質加入到O相中，放入冰盒中，W1/O于新芝超聲儀1min，振幅80％，2s。

(5)把W1/O相中的物質加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀，振幅55％，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫攪拌3h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(1)稱取1wt％N-羥基琥珀酰亞胺和1wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(2)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(3)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時PH為9.0，用濃鹽酸調節(jié)其PH至5.0，形成銨化PLGA。

(4)將1wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(5)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實施例2

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制0.75wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調節(jié)適宜的轉速，調節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量0.5wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取0.1wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁶PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質加入到O相中，放入冰盒中，W1/O新芝超聲儀超聲1min，80％振幅，2s。

(5)把W1/O相中的物質加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀55％振幅，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫攪拌3h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(8)稱取3.5wt％N-羥基琥珀酰亞胺和4.5wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(9)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(10)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時PH為9.0，用濃鹽酸調節(jié)其pH至5.0，形成銨化PLGA。

(11)將5wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(12)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實施例3

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制1.25wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調節(jié)適宜的轉速，調節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量5wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取5wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁷PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質加入到O相中，放入冰盒中，W1/O新芝超聲儀超聲1min，80％振幅，2s。

(5)把W1/O相中的物質加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀55％振幅，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫攪拌3h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(8)稱取6wt％N-羥基琥珀酰亞胺和8wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(9)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(10)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時pH為9.0，用濃鹽酸調節(jié)其pH至5.0，形成銨化PLGA。

(11)將20wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(12)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實施例4-納米粒徑的檢測

取上述甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。用激光粒度分析儀測定粒徑及分布，見圖1。激光粒度儀檢測，DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗粒度為434.8nm。

實施例5-包封率、載藥量測定

包封率(EE％)＝W_包/W_藥×100％

載藥量(DL％)＝W_包/W_總×100％

式中W_藥：投入的總藥量(mg)

W_總：納米粒的總重量(mg)

W_包：納米粒中包裹的藥物量(mg)

結果：包封率約為46.9％，載藥量約為6.36％。

實施例6-安全性檢測

分別給50只小白鼠腹腔注射上述樣品，正常飼養(yǎng)一個月，觀察其生長狀況，結果未表現體溫、采食、精神等方面的異常反應。

實施例7-二喹啉甲酸法(BCA法)蛋白測定

(1)將實施例1得到的DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗離心3次后得到的沉淀加蒸餾水，定容至10ml。

(2)取3個1.5ml離心管，每個加入步驟(1)所得溶液0.5ml，離心10000rpm，10min，去上清，各加入0.1mol/L NaOH 1ml，吹散沉淀，置于37℃搖床1h，BCA法測定。

(3)取3個1.5mL離心管，編號1、2、3，每個加入步驟(2)所得溶液1.5ml，置于37℃搖床，每天取80微升，離心10000rpm，10min，BCA法測定上清蛋白含量，觀察病毒釋放曲線，結果見圖2。

實施例8-紅外光譜分析

(1)將實施例1得到的DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗冷凍干燥處理。

(2)研磨溴化鉀和DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗凍干粉直至粉狀。

(3)粉末壓片機排氣：使用時首先將手輪調節(jié)壓力絲杠頂好，并將放油閥手輪順時針擰好，不要擰的過緊，上下擺動手把，待壓力表指針向上運動后停止加壓，壓力不要過高，松開排氣閥后會聽到排氣聲，然后將排氣閥擰緊，逆時針開放油閥手輪，松開壓力絲杠。

(4)將模具放在壓片機工作空間中央位置，上下擺動手把。同時觀察壓力表示值讀數，當達到所需壓力后停止加壓，保持1min，取出壓制好的樣品。

(5)記錄數據，并整理分析，見圖3。

實施例9-硫酸苯酚法測多糖含量

精密量取D-甘露糖對照品溶液50μg/ml 0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1ml，再加3％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸4.5ml，搖勻，放置至室溫，以0管為空白，于200-650nm波長之間掃描，D-甘露糖衍生物在490nm處有最大吸收，故選擇490nm為檢測波長。在490nm處測定吸光度，以對照品濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝16.284x-0.0685(r＝0.9991)。結果表明D-甘露糖衍生物濃度在10.2～51μg/ml范圍內與吸光度呈良好線性關系，符合Lambert‐Beer定律，說明根據吸光度來計算供試品中D-甘露糖含量是可靠的。

(1)標準曲線的建立，如圖4所示。

(2)疫苗中甘露糖的測定結果見表2。

表2樣品總糖含量測定結果

實施例10-DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫臨床觀察

在規(guī)?；B(yǎng)豬場取5頭母豬窩產仔豬，每窩8頭，共40頭17-22日齡仔豬，分三組，分別注射DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗2ml(含1頭份)、市售豬藍耳病減毒活疫苗2ml(含1頭份)和生理鹽水2ml，進行臨床觀察，結果：免疫納米佐劑滅活疫苗和市售減毒活疫苗豬與對照組比較，在體溫、采食、生產速度等臨床表現方面沒有明顯區(qū)別。說明免疫納米佐劑滅活疫苗和市售減毒活疫苗未表現副作用。

實施例11-淋巴細胞增殖實驗

按上述免疫一個月后采血，分離單個核淋巴細胞，用淋巴細胞增殖實驗檢測T細胞病原特異性增殖和非特異性增殖。

1)豬外周血單個核細胞的分離。將新鮮采集的豬外周靜脈血，用肝素抗凝。用1.5倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，之后按l：l比例將其沿管壁緩慢加至淋巴細胞分離液液面上，2000r/min離心20分鐘。之后細胞分為四層，第一層為血漿或者組織勻漿液層；第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞富集層；第三層為透明分離液層：第四層為紅細胞層。吸出中間環(huán)狀乳白色PBMC富集層，加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基進行漂洗，2000r/min離心10分鐘，漂洗2次后獲得PBMC。把新鮮分離的PBMC使用1ml RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。

2)豬外周血單個核細胞的染色與計數。細胞懸液與0.08wt％的臺盼藍溶液按照1:1的比例充分混勻(終濃度為0.04wt％)，之后置于倒置顯微鏡下觀察計數。

3)淋巴細胞增殖實驗

a.利用動物外周血淋巴細胞分離液提取淋巴細胞。

b.1000rpm離心10min，棄去上清，用紅細胞裂解液重懸。

c.洗滌，1000rpm離心6min，重復兩次。

d.進行細胞計數后，分別加入96孔板中，5×10⁵個/孔。

e.加入刺激物，分別為TJM-F92(MOI＝0.01)、PRRSV(MOI＝0.01)、陽性對照PHA(20μg/mL)、陰性對照LPS(10ng/mL)、空白對照，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70h。

f.加入MTT溶液10μL/孔，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4h。

g.終止孵育，小心吸去孔內液體，加入二甲亞砜100μL/孔，輕輕震蕩是充分混勻后在490nm和630nm處檢測吸光度。結果見圖5，DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫豬后，其淋巴細胞對于非特異性刺激物LPS和PHA及特異性抗原高致病性藍耳病疫苗毒株(TJM-F92)和野毒株(TJ-F10毒株)的細胞免疫反應都明顯好于市售疫苗和對照組(*p<0.05，**p<0.01)。

實施例12-ELISPOT檢測

上述試驗豬群在免疫一個月后采血，分離單個核淋巴細胞，用ELISPOT實驗檢測IFNγ分泌水平。

1)藍耳病病毒多肽池設計與合成

選用NetMHC4服務器多肽MHCI類分子結合人工神經網絡(ANN)預測。多肽序列來自于NCBI中查找的病毒蛋白氨基酸序列，利用計算機軟件進行設計，選出nm最小的，以及rank值最小的，即為最可能有效的多肽表位。

2)ELISpot檢測方法

a.取出市售已包被IFNγ抗體的PVDF膜板，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔。

b.封閉，加入含有10wt％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫孵育30min。

c.將細胞調整至2×10⁵個/孔，100μl/孔，檢測孔分別加入10μl不同濃度稀釋的病毒刺激物，陽性對照加PHA，濃度10μg/ml；陰性對照每孔加入110μl的細胞液，空白對照每孔加入110μl的RPMI-1640培養(yǎng)基；均設復孔。

d.將培養(yǎng)板放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

e.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔。

f.用含0.5％胎牛血清的PBS/HBSS稀釋生物素標記抗IFNγ至1μg/ml，100μl/孔，室溫2h。

g.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔，用含0.5％胎牛血清的PBS/HBSS稀釋堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素至1g/ml，100μl/孔，室溫2h。

h.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔，加入底物顯色15min，直至斑點出現。結果見圖6，表明DC靶向豬藍耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫豬后，其淋巴細胞對藍耳病GP5蛋白多肽池產生較強的反應，表現在產生IFNγ明顯增多(*p<0.001)。