本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)講涉及一種止血防粘連生物膜及其制備方法，具體來(lái)說(shuō)是以天然生物材料為原料，經(jīng)交聯(lián)、發(fā)泡、固化成型和機(jī)械壓迫制成的生物膜。用于外科和創(chuàng)傷病人的局部止血和防止臨床外科各科術(shù)后防粘連作用。

背景技術(shù)：

目前在臨床上對(duì)局部止血和術(shù)后防粘連有非常大的要求，臨床上止血產(chǎn)品繁多，劑型多樣，有液體、粉劑、凝膠劑及膜劑等等，其中天然生物止血材料以其獨(dú)特的生物可降解性優(yōu)勢(shì)在臨床止血應(yīng)用領(lǐng)域中占據(jù)主導(dǎo)地位。局部的粘連將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了手術(shù)效果和患者生活質(zhì)量，加重了患者的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。在脊髓外科，由于術(shù)后局部粘連可以引起病人以及運(yùn)動(dòng)障礙等并發(fā)癥；肌腱骨外科的局部粘連可以引起運(yùn)動(dòng)障礙；婦產(chǎn)科的粘連可引起不孕癥，所以術(shù)后防粘連在臨床上有著廣泛的用途，可以明顯減少術(shù)后并發(fā)癥以及二次手術(shù)。

在臨床領(lǐng)域中，生物組織在手術(shù)后會(huì)出現(xiàn)與組織修復(fù)無(wú)關(guān)的不良粘連，不良粘連會(huì)造成組織變形、阻塞、扭曲，引發(fā)嚴(yán)重的后果。例如，術(shù)后的不良粘連會(huì)引起疼痛或生物組織的功能障礙，在嚴(yán)重的情況下還需要進(jìn)行另外的手術(shù)用于剝離不良粘連。而且，術(shù)后產(chǎn)生不良粘連對(duì)原來(lái)疾病的再次手術(shù)也會(huì)變得十分的困難。為了防止產(chǎn)生術(shù)后的不良粘連現(xiàn)象，一般使用具有優(yōu)良生物適應(yīng)性和生物吸收性的防粘連膜來(lái)覆蓋和保護(hù)可能發(fā)生粘連的組織。

殼聚糖及其衍生物是天然高分子聚合物，屬于氨基多糖，是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一帶陽(yáng)離子電荷的堿性多糖。自然界中廣泛存在于低等生物菌類(lèi)，藻類(lèi)的細(xì)胞，節(jié)支動(dòng)物蝦、蟹、昆蟲(chóng)等的外殼中。生物相容性好、毒性低、可生物降解，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健、生物工程等領(lǐng)域。殼聚糖本身具有止血作用，同時(shí)，殼聚糖通過(guò)其與紅細(xì)胞膜之間的相互作用，主要是對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用而實(shí)現(xiàn)止血。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)公開(kāi)了多種材質(zhì)的防粘連膜，在中國(guó)專(zhuān)利CN104208758 A中提供了一種是聚乳酸類(lèi)防粘連膜，聚乳酸類(lèi)防粘連膜具有機(jī)械性能好、可生物降解和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，但也存在不可避免的缺點(diǎn)，其中最主要的問(wèn)題是植入體內(nèi)后容易變脆變硬，影響防粘連效果，因此使用受到很大的限制。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn) CN101052425A 公開(kāi)了一種包含丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物的防粘連膜，該共聚物中的丙交酯與己內(nèi)酯的摩爾比為65∶35～80∶20。在中國(guó)專(zhuān)利CN 102327651 A中提供了一種聚碳酸酯和交酯的共聚物制備的防粘連膜，與聚乳酸類(lèi)防粘連膜相比，該類(lèi)含有聚碳酸酯的混合物制成的防粘連膜的優(yōu)點(diǎn)是彈性好，但其缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度低，所用原料生物相容性差，容易引起機(jī)體免疫反應(yīng)，因此使用也受到了很大的限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)的不足，提供一種止血防粘連生物膜及其制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1. 一種止血防粘連生物膜及其制備方法，其特征在于，組分包括：羧甲基殼聚糖或羧甲基殼聚糖與明膠/膠原的混合物中的一種、保濕劑、交聯(lián)劑、發(fā)泡劑和水。以水為溶劑，各組分按質(zhì)量比為：羧甲基殼聚糖或羧甲基殼聚糖/明膠/膠原0.5%~5%；保濕劑0.5%~5%；交聯(lián)劑0.01%~1%；發(fā)泡劑0.1%~2%。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物膜的制備方法，其特征在于所述保濕劑為丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、中的一種或幾種；交聯(lián)劑為海藻酸鈉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、葡萄糖、多巴胺、透明質(zhì)酸；發(fā)泡劑為泊洛沙姆。

3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種止血防粘連生物膜及其制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

1) 交聯(lián)劑的制備：配制適宜濃度的海藻酸鈉水溶液，然后緩慢加入到高碘酸鈉溶液中機(jī)械攪拌，再用去離子水透析24 h ~48h，真空冷凍干燥設(shè)備對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行冷凍干燥，冷凍時(shí)間為24h，干燥時(shí)間為48 h ~72h；

2) 反應(yīng)液的制備：所述含有羧甲基殼聚糖溶液選自：羧甲基殼聚糖水溶液、羧甲基殼聚糖與明膠/膠原混合溶液中的一種；將含有羧甲基殼聚糖的溶液溶于水中，加入保濕劑和上述交聯(lián)劑攪拌反應(yīng)10 min ~90min；將發(fā)泡劑溶于水中，緩慢滴加到上述混合液中，高速攪拌發(fā)泡30 min ~90min；

3) 低溫冷凍干燥：將上述反應(yīng)液倒入模具中，-20℃~-80℃冷凍，后進(jìn)行真空干燥，干燥后為柔軟海綿體；

4) 高溫固化增塑：將凍干后的材料移入反應(yīng)釜進(jìn)行20℃~100℃高溫增塑反應(yīng)；

5) 機(jī)械壓膜：固化成型之后，將材料從反應(yīng)釜中取出，首先進(jìn)行脫模，然后機(jī)械壓迫成膜。

4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述羧甲基殼聚糖水溶液的配制方法為：按照濃度為0.5%~5%稱(chēng)取一定量的羧甲基殼聚糖，邊攪拌邊溶入水中溶解15min~120min。

5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述羧甲基殼聚糖/明膠溶液的制備方法包括：配制明膠水溶液：將醫(yī)用明膠加入蒸餾水中，30~60℃加熱獲得明膠水溶液，并在0～10℃下靜置30分鐘至2h，所述明膠水溶液的質(zhì)量濃度為0.01～20%；然后按照羧甲基殼聚糖和明膠的質(zhì)量比為100∶2～20，混合羧甲基殼聚糖水溶液和明膠水溶液，制備得到羧甲基殼聚糖和明膠的混合溶液。

6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述羧甲基殼聚糖/膠原溶液的制備方法包括：配置濃度為0.01%～2%的膠原蛋白乙酸溶液，并在0～10℃下靜置30分鐘至2小時(shí)；然后按照羧甲基殼聚糖和膠原的質(zhì)量比為100∶2～20，混合羧甲基殼聚糖水溶液和膠原水溶液，制備得到羧甲基殼聚糖和膠原的混合溶液。

7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，交聯(lián)劑制備過(guò)程中海藻酸鈉水溶液與高碘酸鈉體積比為1~10:1。

8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，發(fā)泡液低溫冷凍時(shí)間為12 h ~72h，真空干燥時(shí)間為12 h ~72h。

9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，高溫固化增塑的反應(yīng)釜選擇鼓風(fēng)干燥箱、真空干燥器、恒溫培養(yǎng)箱，高溫增塑反應(yīng)溫度為20℃~100℃，反應(yīng)時(shí)間為5h~72h。

10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，生物膜的成型方式為將柔軟海綿體進(jìn)行機(jī)械按壓成膜，生物膜的厚度在0.1~3mm。

由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1) 由于制備過(guò)程都是在水環(huán)境與方便操作的溫度下進(jìn)行，所制備過(guò)程溫和、易控，不會(huì)引起該生物膜生物相容性的降低；

2) 本發(fā)明中采用大分子交聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行生物膜的交聯(lián)，代替了小分子有毒化學(xué)試劑（如甲醛、戊二醛等）的使用，具有更好的組織相容性；

3) 本發(fā)明使用羧甲基殼聚糖、明膠以及膠原等生物材料，足夠的成膜性與適宜的交聯(lián)保證成品的液體吸收性與生物可降解性，殼聚糖本身具有止血吸滲的作用，機(jī)械加工成膜后，提高了力學(xué)性能，防粘連性增強(qiáng)，避免了二次創(chuàng)傷，從而達(dá)到抑制疤痕、加速愈合的功效；

4) 在制備過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)冷凍溫度，溶液濃度、固化增塑時(shí)間等參數(shù)，控制生物膜的微觀結(jié)構(gòu)，從而方便的達(dá)到了控制生物膜止血速率，滿足不同應(yīng)用的要求。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

1） 交聯(lián)劑的制備：稱(chēng)取1.0 g海藻酸鈉溶于140 mL水中，向其中滴加10 mL高碘酸鈉溶液（40 mg/mL），常避光電磁攪拌反應(yīng)4小時(shí)。再向其中滴加0.200 mL乙二醇，攪拌反應(yīng)1小時(shí)后，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析24小時(shí)，期間每4小時(shí)換一次水，真空設(shè)備冷凍干燥48小時(shí)，得到醛化的海藻酸鈉固體。

2） 反應(yīng)液的制備：再稱(chēng)取1.0 g羧甲基殼聚糖溶于30 mL水中，過(guò)程中需要超聲或攪拌溶解30min，在此同時(shí)配制如下溶液：50 mg上述醛化的海藻酸鈉溶于10 mL水中；1.50 g甘油溶于1 mL水中，0.30 g泊洛沙姆407溶于9 mL水和10 mL PBS中。接下來(lái)，將配制后的甘油加入羧甲基殼聚糖溶液中，攪拌10min，最后滴加溶解后的海藻酸鈉溶液，攪拌反應(yīng)30min。最后將泊洛沙姆407溶液加入上述反應(yīng)液中，高速攪拌60min。

3）將反應(yīng)液注入到模具中，在-20℃冷凍24h，獲得羧甲基殼聚糖冷凍體，然后放入真空干燥機(jī)中，經(jīng)48h冷凍干燥處理，獲得柔軟海綿體。

4）將此海綿體放入鼓風(fēng)干燥箱中，經(jīng)24h，60℃高溫固化增塑反應(yīng)，期間保持海綿體與模具不脫落。

5）固化增塑之后，將海綿體從反應(yīng)釜中取出，首先進(jìn)行脫模，常溫下恢復(fù)30min，然后機(jī)械壓迫成膜，膜的厚度為0.5mm。

實(shí)施例2：

1） 交聯(lián)劑的制備同實(shí)施例1中1）交聯(lián)劑的制備。

2） 反應(yīng)液的制備：以水為溶劑，各組分按質(zhì)量比為：羧甲基殼聚糖：明膠：聚乙烯醇：交聯(lián)劑：泊洛沙姆407=1：1：0.5：0.03：0.3的比例進(jìn)行稱(chēng)量。首先羧甲基殼聚糖和明膠進(jìn)行混合，再依次加入交聯(lián)劑攪拌反應(yīng)30min，泊洛沙姆407反應(yīng)30min。

3） 將反應(yīng)液注入到模具中，在-40℃冷凍12h，獲得羧甲基殼聚糖/明膠冷凍體，然后放入真空干燥機(jī)中，經(jīng)48h冷凍干燥處理，獲得柔軟海綿體。

4） 將此海綿體放入真空干燥箱中，抽真空干燥，溫度為80℃，增塑反應(yīng)12h。

5） 固化增塑之后，將海綿體從反應(yīng)釜中取出，首先進(jìn)行脫模，常溫下恢復(fù)30min，然后機(jī)械壓迫成膜，膜的厚度為1 mm。

實(shí)施例3：

1） 交聯(lián)劑的制備：稱(chēng)取3g馬鈴薯淀粉溶解在25mL的氫氧化鈉溶液（1 mol/L）中，再向其中滴加10 mL DMSO和10mL異丙醇。然后向其中滴加4 mL環(huán)氧氯丙烷，排氣，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h。然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH=7，再用過(guò)量丙酮沉淀。沉淀后進(jìn)行高速離心，離心后產(chǎn)物用少量純化水溶解1h，水中透析24小時(shí)，期間每4小時(shí)換一次水，真空設(shè)備冷凍干燥48小時(shí)。

2）反應(yīng)液的制備：再稱(chēng)取3 g羧甲基殼聚糖溶于100 mL水中，過(guò)程中需要超聲或攪拌溶解30min，在此同時(shí)配制如下溶液：100 mg上述環(huán)氧淀粉溶于20 mL水中；3g甘油溶于10 mL水中，1 g泊洛沙姆407溶于50 mL水中。然后將配制后的甘油加入羧甲基殼聚糖溶液中，攪拌300min，最后滴加溶解后的環(huán)氧淀粉溶液，攪拌反應(yīng)1h。最后將泊洛沙姆407溶液加入上述反應(yīng)液中，高速攪拌1h。

3）將反應(yīng)液注入到模具中，在-40℃冷凍12h，獲得羧甲基殼聚糖冷凍體，然后放入真空干燥機(jī)中，經(jīng)48h冷凍干燥處理，獲得柔軟海綿體。

4）將此海綿體放入恒溫恒濕干燥箱中，經(jīng)72h，50℃高溫固化增塑反應(yīng)，期間保持海綿體與模具不脫落。

5）固化增塑之后，將海綿體從反應(yīng)釜中取出，首先進(jìn)行脫模，然后機(jī)械壓迫成膜，膜的厚度為1mm。

實(shí)施例4：

實(shí)施例1中制備的生物膜促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)：

大鼠背部脫毛劑脫毛，面積約5cm×5cm，用橡皮筋捆住四肢，呈腹臥位固定在大鼠固定板上。選擇背中部脊柱兩側(cè)各旁開(kāi)lcm，距肩胛骨以下2cm處制備創(chuàng)面。在上述制傷部位，用直徑18mm的環(huán)鉆垂直于皮膚各壓出1個(gè)圓形痕跡 (2．54cm²)，彎手術(shù)剪沿壓痕剪去全層皮膚(達(dá)深筋膜)，制成圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，止血備用。每只大鼠制備2個(gè)創(chuàng)面，即背部?jī)蓚?cè)各制備1個(gè)創(chuàng)面。

實(shí)驗(yàn)組：生物膜樣品覆蓋；陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)菌紗布覆蓋。

觀察大鼠生活狀態(tài)、愈合情況、感染情況、瘢痕形狀等。每天更換覆蓋樣品。創(chuàng)傷后第3天，5天，7天，11天，14天，分別用透明薄膜覆蓋創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣畫(huà)膜，剪膜，置分度值為0.1 mg的分析天平稱(chēng)取質(zhì)量并折算成面積，記錄各組創(chuàng)面面積，計(jì)算愈合率。愈合率=（原面積-未修復(fù)面積）/原面積×100%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

a) 行為學(xué)結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)期間，大鼠飲食、飲水情況正常，行為無(wú)異常，無(wú)皮毛異常脫落，無(wú)意外死亡現(xiàn)象。生物膜實(shí)驗(yàn)組和大鼠體重?zé)o顯著性差異。

b) 炎癥反應(yīng)：生物膜實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯紅腫，生理切片結(jié)果表明術(shù)后一周可見(jiàn)明顯炎性侵入，2周后炎性顯著下降。無(wú)菌紗布組炎癥下降不明顯。

c) 傷口出血粘連情況：無(wú)菌紗布組粘連嚴(yán)重，對(duì)傷口已經(jīng)造成二次傷害，與無(wú)菌紗布對(duì)照組相比，生物膜實(shí)驗(yàn)組換藥時(shí)滲血情況明顯小于對(duì)照組，且無(wú)任何粘連。

d) 愈合情況：切片觀察到生物膜試驗(yàn)組的創(chuàng)面明顯優(yōu)于無(wú)菌紗布組，其肉芽組織生長(zhǎng)良好，成纖維化明顯，且有毛細(xì)血管生成。

附圖1是傷口愈合情況圖，附圖2是傷口愈合率圖。