本發(fā)明屬于干細胞培養(yǎng)液化妝品技術領域，具體涉及一種人臍帶MSC(間充質干細胞)無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，還涉及了該干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉的制備方法和應用。

背景技術：

干細胞美容最早被應用于整形外科，整形外科中應用較多的干細胞種類是間充質干細胞、表皮干細胞、血管內皮祖細胞及前脂肪細胞等。

人間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培養(yǎng)中分泌堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF)在內的多種促進皮膚細胞再生的生長因子。這些具有生物活性的生長因子能夠有效的促進皮膚細胞的新陳代謝；促進細胞外透明質酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增強皮膚的親水性；促進表皮細胞的生長、分化和修復，使衰老死亡的細胞得以及時補充；同時能夠加速角質層修復，加速基底新老細胞更替，使肌膚回到年輕姿態(tài)。因此，將人間充質干細胞用于美容護膚得到了廣泛地關注和研究。

目前人間充質干細胞在美容領域的應用主要采用傳統(tǒng)的干細胞美容術，即直接注射干細胞針劑的方法，這種注射用干細胞的來源主要是從流產(chǎn)的胚胎中提取的，所以難免會引起免疫排斥反應，而且存在一定的倫理問題。即使是采用自體干細胞，但是在干細胞的培養(yǎng)擴增過程中會引入外源性的蛋白(胎牛血清)，也容易引起免疫排斥反應；而且液態(tài)培養(yǎng)上清在常溫保存時間很短，即使是通過冷凍干燥技術除去水分做成凍干粉，其穩(wěn)定性也不理想，必須現(xiàn)配現(xiàn)用。同時很難直接添加到各種劑型的化妝品中。這樣就在很大程度上限制了其在化妝品領域的應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，解決了現(xiàn)有美容用人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)上清液易引起免疫排斥反應、保存期限短以及在化妝品中配伍性差的問題。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉的應用，解決現(xiàn)有美容用人臍帶間充質干細胞難以直接加入化妝品的問題。

本發(fā)明所采用的一個技術方案是，一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液活性蛋白成分1～3％，磷脂15～60％，膽固醇1～12％，吐溫-80 1～25％，脂溶性抗氧化劑0.5～10％，凍干保護劑10～60％，水1～5％，以上各組分的質量總和是100％。

優(yōu)選地，磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃磷脂、氫化大豆磷脂、腦磷脂、二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂酸磷脂酰膽堿、二肉豆寇酸磷脂酰膽堿、二月桂酸磷脂酰膽堿或二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺中的一種或幾種的任意比例混合物；脂溶性抗氧化劑選自維生素E、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、泛醌或叔丁基對苯二酚中的一種或幾種的任意比例混合物；凍干保護劑選自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉籽糖、右旋糖苷、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一種或幾種的任意比例混合物。

本發(fā)明的另一個技術方案是，上述人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，制備空白脂質體懸液；

首先將磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑溶于無水乙醇，得到原料溶液；再將該原料溶液緩慢加入到含有凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中，進行水化，得到淺黃色乳濁液；然后去除乳濁液中的所有乙醇，最后對乳濁液進行超聲整粒，得到空白脂質體懸液。

步驟2，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉；

將人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液加入空白脂質體懸液，在水浴和超聲的條件下進行包封反應，包封反應結束后對產(chǎn)物進行過膜整粒，收集過膜后的產(chǎn)物，將產(chǎn)物依次經(jīng)凍融、冷凍干燥后，得到人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉。

其中，上述人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液的制備方法為：取新生兒臍帶，將靜脈內血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到原代人臍帶間充質干細胞；當細胞融合度為80％-90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養(yǎng)，取5～15代的傳代細胞繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合度80％-90％時，棄含F(xiàn)BS的培養(yǎng)上清，PBS洗滌細胞，加入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，收集無血清培養(yǎng)液。

優(yōu)選地，步驟1中磷脂、膽固醇、吐溫-80、脂溶性抗氧化劑和乙醇的質量百分比為：磷脂5～30％，膽固醇1～10％，吐溫-80 0.1～15％，脂溶性抗氧化劑0.1～5％，無水乙醇50～85％，以上各組分的質量總和是100％。

優(yōu)選地，步驟1中原料溶液與凍干保護劑的質量關系為1:1-30:1，凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中凍干保護劑的含量2-10％。

優(yōu)選地，步驟2中空白脂質體懸液中總固含量和人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液中總固含量的質量比為30:1。

優(yōu)選地，步驟2空白脂質體懸液的質量濃度為2～10％，所述包封反應具體為在30～35℃水浴中超聲5-10min，超聲功率200-300W。

優(yōu)選地，步驟2中的凍融為-80℃冷凍1h，20℃水浴解凍，一共凍融2～10次；冷凍干燥中預凍溫度為-60℃±2℃，預凍時間6h以上，冷阱溫度為-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間24-36h。

本發(fā)明還提供了上述人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)液脂質體凍干粉在化妝品中的應用。

制備化妝品時，將上述人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉水化后，直接加入化妝品中。

本發(fā)明的有益效果是，(1)本發(fā)明所用的干細胞培養(yǎng)上清液為無血清培養(yǎng)上清，減小了干細胞用于美容中存在的免疫排斥反應；(2)采用脂質體工藝將具有多種活性細胞因子的干細胞無血清培養(yǎng)上清液包覆，進而凍干，保質期可長達三年，遠高于現(xiàn)有人間充質干細胞的保質期，解決了上清液保存期短的問題；(3)經(jīng)脂質體包覆后的干細胞無血清培養(yǎng)上清液可直接添加于乳液、霜膏、精華液、凝膠等多種劑型的化妝品，拓寬了其在化妝品領域的應用。

附圖說明

圖1是HUC和HUC-LP對L929細胞增殖影響干預培養(yǎng)1-7天倒置顯微鏡照片；

圖2是HUC和HUC-LP對L929細胞增殖影響干預培養(yǎng)1-7天OD值；

圖3是Rz和Ra結果(產(chǎn)品區(qū)、對照區(qū)與初始值的比較)比較圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于這些實施方式。

本發(fā)明的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液活性蛋白成分1～3％，磷脂15～60％，膽固醇1～12％，吐溫-80 1～25％，脂溶性抗氧化劑0.5～10％，凍干保護劑10～60％，水1～5％，以上各組分的質量總和是100％。

優(yōu)選地，磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃磷脂、氫化大豆磷脂、腦磷脂、二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂酸磷脂酰膽堿、二肉豆寇酸磷脂酰膽堿、二月桂酸磷脂酰膽堿或二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺中的一種或幾種的任意比例混合物；脂溶性抗氧化劑選自維生素E、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、泛醌或叔丁基對苯二酚中的一種或幾種的任意比例混合物；凍干保護劑選自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉籽糖、右旋糖苷、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一種或幾種的任意比例混合物。

該人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉的制備方法如下：

步驟(1)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液

取新生兒臍帶，將靜脈內血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到原代人臍帶間充質干細胞；當細胞融合度為80％-90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養(yǎng)，取5-15代傳代細胞繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合度80％-90％時，棄含F(xiàn)BS的培養(yǎng)上清，PBS洗滌細胞，加入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，收集無血清培養(yǎng)液。

步驟(2)，乙醇注入法制備空白脂質體懸液

先將磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑溶于無水乙醇，得到原料溶液，其中，磷脂、膽固醇、吐溫-80、脂溶性抗氧化劑和乙醇的質量百分比為：磷脂5～30％，膽固醇1～10％，吐溫-80 0.1～15％，脂溶性抗氧化劑0.1～5％，無水乙醇50～85％，以上各組分的質量總和是100％。磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑的總質量與無水乙醇的最佳質量比為1:1～1:6。再將該原料溶液緩慢加入到含有凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中進行水化，原料溶液與凍干保護劑的質量關系為1:1-30:1，凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中凍干保護劑的含量2-10％。水化結束得到淺黃色乳濁液；然后去除乳濁液中的所有乙醇，最后對乳濁液進行超聲整粒，超聲功率為200-300W，超聲時間為10～30min，得到空白脂質體懸液。

步驟(3)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉；

取人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液加入空白脂質體懸液，其中，空白脂質體懸液中總固含量和人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液中總固含量的質量比為30:1。在30～35℃水浴和200-300W超聲功率的條件下超聲5-10min，完成包封反應，然后對產(chǎn)物進行過膜整粒，為獲得粒徑均勻的脂質體，使產(chǎn)物依次經(jīng)過孔徑逐漸減小的多個濾膜，孔徑最小的濾膜為0.22μm濾膜，收集最后一次過膜的產(chǎn)物，再將產(chǎn)物依次經(jīng)凍融、冷凍干燥；凍融為-80℃冷凍1h，20℃水浴解凍，一共凍融2～10次；冷凍干燥中預凍溫度為-60℃±2℃，預凍時間6h以上，冷阱溫度為-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間24-36h。凍干后得到本發(fā)明人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉。

該脂質體凍干粉可添加于乳液、霜膏、面膜或水劑化妝品等一切常見形態(tài)的化妝品中。使用時，將本發(fā)明脂質體凍干粉用去離子水水化后，直接加入化妝品中，即可使用。

實施例1

制備一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其方法如下：

步驟(1)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液

人臍帶間充質干細胞提?。簾o菌條件下，取新生兒臍帶5～10cm，置臍帶保存液，4℃儲存(時間不超過8小時)。用D-Hanks液沖洗直至靜脈內無血跡。去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎至大約1mm³/塊，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)大約一個星期，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5％CO₂，即可得到原代人臍帶間充質干細胞。

收集無血清培養(yǎng)液：細胞融合度80％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養(yǎng)，取6代的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞融合度80％時，棄含10％FBS的培養(yǎng)上清，PBS(pH＝7.0)洗滌細胞三次，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集無血清培養(yǎng)液。

步驟(2)，乙醇注入法制備空白脂質體懸液

稱取以下原料組分，大豆卵磷脂3.6g，膽固醇1.2g，吐溫-80 1.0g，維生素E 0.12g，將其溶于7.5mL無水乙醇，得到原料溶液。磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑的總質量與無水乙醇的質量比為1:1。再將6.5g凍干保護劑海藻糖加入pH值為6.5的150mL磷酸鹽緩沖液中充分混合。然后將原料溶液轉移到潔凈的注射器中，通過注射器滴加到含有凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中，原料溶液與凍干保護劑的質量關系比為1.8:1，凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中凍干保護劑的含量4.3％，進行水化，水化時間30min，水化溫度35℃，得到淺黃色乳濁液。水化結束后將淺黃色乳濁液旋轉蒸發(fā)除去乙醇，水浴溫度40℃，旋轉轉速50r/min，真空度維持在0.01MPa，直到蒸發(fā)出的乙醇體積達到原料液中添加的乙醇含量時停止減壓蒸發(fā)。最后對乳濁液進行超聲整粒，超聲功率為300W，超聲時間為10min，得到空白脂質體懸液，其質量濃度為3.8％。

步驟(3)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉

取步驟(2)的空白脂質體懸液置于搖床中，在振蕩條件下將步驟(1)的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液加入懸液中，其中，空白脂質體懸液中總固含量和人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)液中總固含量的質量比為30:1。在30℃水浴和300W超聲功率的條件下超聲5min，完成包封反應。包封反應結束后使反應物依次經(jīng)過0.8μm濾膜、0.65μm濾膜、0.45μm濾膜和0.22μm濾膜，進行整粒，收集通過0.22μm濾膜的產(chǎn)物，得到粒徑均勻的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液的脂質體懸液。該脂質體懸液在-80℃冷凍1h，并在20℃水浴中解凍，如此反復凍融5次。最后將凍融產(chǎn)物放入冷凍干燥機中冷凍，預凍溫度為-60℃±2℃，預凍時間6h，冷阱溫度為-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間24h。得到最終的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉。

本實施例得到的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其中，人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液活性蛋白成分1.5％，磷脂27.9％，膽固醇9.3％，吐溫-80 7.7％，脂溶性抗氧化劑0.9％，凍干保護劑50.3％，水2.4％。

本實施例制備的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉可以在室溫下保存3年。

實施例2

制備一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其方法如下：

步驟(1)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液

人臍帶間充質干細胞提?。簾o菌條件下，取新生兒臍帶5～10cm，置臍帶保存液，4℃儲存(時間不超過8小時)。用D-Hanks液沖洗直至靜脈內無血跡。去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎至大約1mm³/塊，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)大約一個星期，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5％CO₂，即可得到原代人臍帶間充質干細胞。

收集無血清培養(yǎng)液：細胞融合度90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養(yǎng)，取10代的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞融合度90％時，棄含10％FBS的培養(yǎng)上清，PBS(pH＝7.0)洗滌細胞三次，加入無血清的F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集無血清培養(yǎng)液。

步驟(2)，乙醇注入法制備空白脂質體懸液

稱取以下原料組分，蛋黃卵磷脂10.5g，膽固醇1.5g，吐溫-80 0.35g，泛醌2g，將其溶于109mL無水乙醇，得到原料溶液。磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑的總質量與無水乙醇的質量比為1:6。再將2.0g凍干保護劑葡萄糖和2.0g甘露醇加入pH值為6.8的150mL磷酸鹽緩沖液中充分混合。然后將原料溶液轉移到潔凈的注射器中，通過注射器滴加到含有凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中，原料溶液與凍干保護劑的質量關系比為25:1，凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中凍干保護劑的含量2.7％，進行水化，水化時間40min，水化溫度35℃，得到淺黃色乳濁液。水化結束后將淺黃色乳濁液旋轉蒸發(fā)除去乙醇，水浴溫度45℃，旋轉轉速100r/min，真空度維持在0.01MPa，直到蒸發(fā)出的乙醇體積達到原料液中添加的乙醇含量時停止減壓蒸發(fā)。最后對乳濁液進行超聲整粒，超聲功率為200W，超聲時間為20min，得到空白脂質體懸液，其質量濃度為8.7％。

步驟(3)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉

取步驟(2)的空白脂質體懸液置于搖床中，在振蕩條件下將步驟(1)的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液加入懸液中，其中，空白脂質體懸液中總固含量和人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)液中總固含量的質量比為30:1。在35℃水浴和200W超聲功率的條件下超聲10min，完成包封反應。包封反應結束后使反應物依次經(jīng)過0.8μm濾膜、0.65μm濾膜、0.45μm濾膜和0.22μm濾膜，進行整粒，收集通過0.22μm濾膜的產(chǎn)物，得到粒徑均勻的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液的脂質體懸液。該脂質體懸液在-80℃冷凍1h，并在20℃水浴中解凍，如此反復凍融2次。最后將凍融產(chǎn)物放入冷凍干燥機中冷凍，預凍溫度為-60℃±2℃，預凍時間8h，冷阱溫度為-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間36h。得到最終的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉。

本實施例得到的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其中，人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液活性蛋白成分2.5％，磷脂55.2％，膽固醇7.9％，吐溫-80 1.8％，脂溶性抗氧化劑10.5％，凍干保護劑21.0％，水1.1％。

本實施例制備的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉可以在室溫下保存3年。

實施例3

制備一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其方法如下：

步驟(1)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液

人臍帶間充質干細胞提?。簾o菌條件下，取新生兒臍帶5～10cm，置臍帶保存液，4℃儲存(時間不超過8小時)。用D-Hanks液沖洗直至靜脈內無血跡。去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎至大約1mm³/塊，加入含10％FBS的F12培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)大約一個星期，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5％CO₂，即可得到原代人臍帶間充質干細胞。

收集無血清培養(yǎng)液：細胞融合度85％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養(yǎng)，取15代的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞融合度85％時，棄含10％FBS的培養(yǎng)上清，PBS(pH＝7.0)洗滌細胞三次，加入無血清的F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)56小時，收集無血清培養(yǎng)液。

步驟(2)，乙醇注入法制備空白脂質體懸液

稱取以下原料組分，氫化大豆磷脂2.5g，膽固醇0.5g，吐溫-80 3.0g，丁基羥基茴香醚0.5g，將其溶于16.5mL無水乙醇，得到原料溶液。磷脂、膽固醇、吐溫-80和脂溶性抗氧化劑的總質量與無水乙醇的質量比為1:2。再將2.5g凍干保護劑右旋糖苷和2.5g山梨醇加入pH值為6.8的100mL磷酸鹽緩沖液中充分混合。然后將原料溶液轉移到潔凈的注射器中，通過注射器滴加到含有凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中，原料溶液與凍干保護劑的質量關系比為3.9:1，凍干保護劑的磷酸鹽緩沖液中凍干保護劑的含量5％，進行水化，水化時間40min，水化溫度35℃，得到淺黃色乳濁液。水化結束后將淺黃色乳濁液旋轉蒸發(fā)除去乙醇，水浴溫度45℃，旋轉轉速100r/min，真空度維持在0.01MPa，直到蒸發(fā)出的乙醇體積達到原料液中添加的乙醇含量時停止減壓蒸發(fā)。最后對乳濁液進行超聲整粒，超聲功率為250W，超聲時間為30min，得到空白脂質體懸液，其質量濃度為6.1％。

步驟(3)，制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉

取步驟(2)的空白脂質體懸液置于搖床中，在振蕩條件下將步驟(1)的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液加入懸液中，其中，空白脂質體懸液中總固含量和人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)液中總固含量的質量比為30:1。在35℃水浴和250W超聲功率的條件下超聲7min，完成包封反應。包封反應結束后使反應物依次經(jīng)過0.8μm濾膜、0.65μm濾膜、0.45μm濾膜和0.22μm濾膜，進行整粒，收集通過0.22μm濾膜的產(chǎn)物，得到粒徑均勻的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液的脂質體懸液。該脂質體懸液在-80℃冷凍1h，并在20℃水浴中解凍，如此反復凍融10次。最后將凍融產(chǎn)物放入冷凍干燥機中冷凍，預凍溫度為-60℃±2℃，預凍時間10h，冷阱溫度為-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間32h。得到最終的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體。

本實施例得到的包封人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉，其中，人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液活性蛋白成分1.8％，磷脂20.7％，膽固醇4.1％，吐溫-80 24.8％，脂溶性抗氧化劑4.1％，凍干保護劑41.4％，水3.3％。

本實施例制備的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體凍干粉可以在室溫下保存3年。

對本發(fā)明的脂質體凍干粉的各項性能進行檢測。

(一)MTT法考察人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體對細胞的增值能力。

采用小鼠成纖維細胞L929為靶細胞，對比對照組——人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液(HUC)，樣品組——人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體(HUC-LP)在培養(yǎng)7天中，對L929細胞增殖活力的影響，細胞活力是指總細胞群中活細胞所占的百分比，活細胞越多，光密度值(OD)就越高。通過酶標儀測定活細胞的數(shù)量，OD值越高表示活細胞數(shù)量越多。

將L929小鼠成纖維細胞接種于96孔板中，1×10⁴個/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，加入無菌過濾后的10mg/L HUC和HUC-LP 20μL，將孔板置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后取出，每孔中加入5mg/mL MTT溶液20μL孵育4h后，將孔板中液體倒出，每孔加入二甲基亞砜200μL，于37℃避光振搖15min，用酶標儀在490nm測定各孔的光密度值(OD)，每組設3個復孔。參照圖1和圖2，試驗結果顯示，HUC-LP相對于HUC可以有效的促進細胞的增殖。說明人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體有延緩細胞凋亡的作用。

(二)人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體用于化妝品中的抗衰修復功效評價。

將本發(fā)明的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)液脂質體(HUC-LP)添加到護膚霜中，對照組采用不添加HUC-LP的護膚霜，采用兩款護膚霜對42位女性進行效果測試。HUC-LP護膚霜的成分見表1。

表1 HUC-LP護膚霜成分表

護膚霜的制備方法為：A相、B相加熱至80℃后，B相緩慢加入A相，攪拌15min，加入C相后攪拌10min后均質5min(4000r/min)，降溫(緩慢，降溫速率1℃/min左右，降溫時攪拌速率不得超過500r/min)至35℃加入D相攪拌5min，降溫至30℃加入E相后降溫慢速攪拌5min后出料。

受試對象：42位無皮膚敏感史的年齡在37～55歲的女性志愿者，測試期間志愿者隨機一側半臉使用對照產(chǎn)品——不含HUC-LP的基底護膚霜，另外一側使用HUC-LP護膚霜，每天早晚各使用一次，連續(xù)使用8周，測試期間志愿者不可使用除測試產(chǎn)品及對照產(chǎn)品以外的任何護膚品。在產(chǎn)品使用前，使用4周和8周后，對兩側眼角進行皮膚快速光學成像(FOITS)，并對圖片進行分析，Rz表示皮膚平均粗糙度，Ra表示皮膚算術平均粗糙度。統(tǒng)計方法采用ANOVA，顯著性：“+”表示顯著性差異(p≤0.05)；“-”表示非顯著性差異(p＞0.05)，結果見圖3和表2。

表2 Rz和Ra統(tǒng)計結果

由圖3和表2看出，與初數(shù)始數(shù)值值)比較，產(chǎn)品使用4周后，產(chǎn)品區(qū)的Rz和Ra分別降低了6.0％和6.7％，對照區(qū)的Rz和Ra分別降低了2.7％和4.2％，產(chǎn)品使用8周后，產(chǎn)品區(qū)的Rz和Ra分別降低了10.9％和16.9％，對照區(qū)的Rz和Ra分別降低了4.9％和9.0％，與初始值比較，在產(chǎn)品使用4周及8周后，與初始值相比，產(chǎn)品區(qū)域Rz(皮膚平均粗糙度)和Ra(皮膚算術平均粗糙度)均有顯著性差異，對照區(qū)域Rz(皮膚平均粗糙度)和Ra(皮膚算術平均粗糙度)均無顯著性差異，說明含有HUC-LP的護膚霜具有顯著改善皮膚粗糙度和紋理的效果，即具有延緩衰老的功效。

在本次功效測試中，42位受試者無一有免疫排斥反應或不適感。

本發(fā)明以上描述只是部分實施例，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式。上述的具體實施方式是示意性的，并不是限制性的。凡是采用本發(fā)明的材料和方法，在不脫離本發(fā)明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，所有具體拓展均屬本發(fā)明的保護范圍之內。