本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域,具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù):
腎纖維化(包括腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)是各種原因引起的腎臟損害最后階段的主要病理基礎(chǔ),腎纖維化發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,與多種因素有關(guān),其中主要與細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞的增殖和活化,血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換失衡有關(guān),腎間質(zhì)纖維化幾乎是所以原發(fā)或繼發(fā)腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑。急需研發(fā)高效低毒的抗腎纖維化藥物。
腎纖維化的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問(wèn)題,從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物,從而得到高效低毒的潛在藥物有重要價(jià)值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物,我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV,并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗腎纖維化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),其具有抗腎纖維化活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物,該組合物由化合物III和化合物IV組成,該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為80%和20%。
本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,本發(fā)明的組合物具有較好的抗腎纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制,而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 化合物Atropurpuran的制備
化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。
實(shí)施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(312mg,1.00mmol)溶于10mL苯,向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g),1,2-二溴乙烷(3.760g,20.00mmol)和6mL的50%氫氧化鈉溶液?;旌衔镌?5攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中,立即用二氯甲烷萃取兩次,合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次,再用無(wú)水硫酸鈉干燥,最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:1.0,v/v),收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg,74%)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J=6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J=35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28BrO3:419.1222;found 419.1226.
實(shí)施例3 Atropurpuran的O-(四氫吡咯基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(209mg,0.5mmol)溶于18mL乙腈當(dāng)中,向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg,2.5mmol),碘化鉀(84mg,0.5mmol)和吡咯烷(1420mg,20mmol),混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中,用等量二氯甲烷萃取2次,合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相,再用無(wú)水硫酸鈉干燥,減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:1.0,v/v),收集棕色集中洗脫帶,濃縮即得到化合物III的棕色固體(125mg,61%)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),5.15(s,1H),4.61(d,J=10.5Hz,2H),4.45(s,1H),3.83(s,1H),3.53(s,2H),2.94(s,1H),2.62(s,2H),2.46(s,4H),2.20(s,1H),2.08(d,J=6.0Hz,2H),2.00–1.91(m,3H),1.75(d,J=2.1Hz,2H),1.69(s,2H),1.62(d,J=5.5Hz,5H),1.30(s,2H),0.91(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.65(s),203.36(s),151.04(s),125.36(s),111.76(s),78.83(s),67.20(s),57.97(s),54.33(d,J=17.1Hz),47.82(s),41.00(s),34.67(s),32.79(s),29.45(s),29.22(s),26.61(s),25.14(s),24.43(s),22.40(s),20.84(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H36NO3:410.2695;found:410.2699。
實(shí)施例4 Atropurpuran的O-(1H-四氮唑基)乙基衍生物的合成
將化合物II(209mg,0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中,向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg,2.5mmol),碘化鉀(84mg,0.5mmol)和1H-四氮唑(1401mg,20mmol),混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中,用等量二氯甲烷萃取3次,合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相,再用無(wú)水硫酸鈉干燥,減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因?yàn)榛プ儺悩?gòu)作用,在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:0.8,v/v),收集黃色集中洗脫帶,再將洗脫帶濃縮,用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:0.4,v/v),依次收集兩個(gè)淡黃色的洗脫帶,濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物IV的黃色粉末(83.6mg,41%)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),9.74(s,1H),5.05(s,1H),4.61–4.48(m,3H),4.19(s,1H),4.12(s,1H),3.80(s,2H),3.75(s,1H),2.86(s,1H),2.08(s,1H),1.97(d,J=2.9Hz,2H),1.90–1.81(m,3H),1.69–1.57(m,4H),1.54(s,1H),1.25(s,2H),0.80(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.17(s),150.83(s),144.83(s),125.18(s),111.56(s),78.65(s),66.57(s),57.79(s),47.63(s),46.37(s),40.80(s),34.49(s),32.59(s),29.27(s),29.02(s),26.43(s),24.24(s),22.21(s),20.67(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C23H29N4O3:409.2240;found:409.2244。
實(shí)施例5 組合物對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響
1.1材料
貝那普利,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn);羥脯氨酸(HYP)試劑盒,南京建成生物公司;纖維連結(jié)蛋白(FN)試劑盒購(gòu)自上海生物制品所。
組合物的制備:將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的80mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的20mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物,使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:普通級(jí)Wistar大鼠,雄性,體重150-200g,SD大鼠。
1.2試驗(yàn)方法與結(jié)果
大鼠60只,隨機(jī)分6組,即假手術(shù)組、模型組、苯那普利灌胃10mg/kg組、組合物灌胃10mg/kg組、化合物III灌胃10mg/kg組、化合物IV灌胃10mg/kg組,動(dòng)物喂養(yǎng)1周,各大鼠以10%水合氯醛3.0mL/kg腹腔注射麻醉后,將大鼠右側(cè)臥位固定與手術(shù)臺(tái)上,剪毛后用碘酒、75%酒精消毒手術(shù)區(qū),行左側(cè)腹切口,逐層切開(kāi)皮膚、肌肉及腹壁各層,暴露并分離左側(cè)輸尿管,假手術(shù)組僅切開(kāi)腹腔并游離左側(cè)輸尿管,但不結(jié)扎和剪斷,其他各組大鼠用4-0絲線結(jié)扎兩道,上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下極水平,然后在兩道結(jié)扎點(diǎn)剪斷輸尿管,逐層縫合,術(shù)后10天10%水合氯醛麻醉后處死各組動(dòng)物,取血,按纖維連結(jié)蛋白測(cè)定說(shuō)明測(cè)定說(shuō)明纖維聯(lián)接蛋白(FN)。生理鹽水反復(fù)灌洗后留取左側(cè)腎臟,腎組織經(jīng)4%的多聚甲醛緩沖液固定。切取適量腎組織,按羥脯氨酸試劑盒測(cè)定說(shuō)明測(cè)定羥脯氨酸。
常規(guī)病理學(xué)檢①肉眼觀察:假手術(shù)組腎臟顏色鮮紅,表明光滑,包膜光澤,無(wú)粘連。模型對(duì)照組腎臟體積增大,顏色蒼白,表明呈顆粒狀,類似人體大白腎,少數(shù)區(qū)域腎包膜粘連。②光鏡檢查:假手術(shù)組腎單位結(jié)果清晰,腎小球囊無(wú)擴(kuò)張或炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組大片腎小管壞死,腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生,腎小管擴(kuò)張,內(nèi)有大量棕黃色遮光物質(zhì)或壞死脫落的上皮細(xì)胞,腎小球數(shù)目減少,部分腎小球纖維化并與包曼氏囊壁粘連,囊腔消失。組合物給藥組病變與模型對(duì)照組類似,但均有不同程度的形態(tài)學(xué)改善,與模型對(duì)照組比較有明顯差異。而化合物III給藥組和化合物IV給藥組與模型對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
表1組合物對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響
*p<0.05,與模型組相比較
對(duì)各組FN、HYP進(jìn)行T檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1,組合物灌胃10mg/kg顯著降低FN、HYP水平(與模型對(duì)照組比較,P<0.05);而化合物III和化合物IV灌胃10mg/kg未能顯著降低FN、HYP水平。
結(jié)論:組合物能夠顯著降低腎間質(zhì)纖維化FN、HYP水平的升高,抑制腎間質(zhì)纖維化,可以用來(lái)制備抗腎纖維化藥物?;衔颕II和化合物IV不能夠顯著降低腎間質(zhì)纖維化FN、HYP水平的升高,不能抑制腎間質(zhì)纖維化,不可以用來(lái)制備抗腎纖維化藥物。
實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物,加入制備片劑的常規(guī)輔料18克,混勻,常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物,加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克,混勻,裝膠囊制成100粒。